JP6419558B2

JP6419558B2 - 観察装置

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Publication number: JP6419558B2
Application number: JP2014246951A
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Inventors: 本田　進; 進本田
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Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2018-11-07
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Description

本発明は、観察装置に関するものである。

従来、位相変調型の空間光変調器（ＬＣＯＳ−ＳＬＭ：ＬｉｑｕｉｄＣｒｙｓｔａｌＯｎＳｉｌｉｃｏｎ − ＳｐａｔｉａｌＬｉｇｈｔＭｏｄｕｌａｔｏr）を備えた観察装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。

特許文献１に記載の観察装置は、ＬＣＯＳと、２枚のガルバノミラーと、これら２枚のガルバノミラーを瞳リレーするリレー光学系とを備え、ＬＣＯＳによって変調したレーザ光の波面をリレー光学系により２枚のガルバノミラーを介して対物光学系の入射瞳位置に正確にリレーし、集光性能を低下させることなくＬＳＭ（ＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）として観察できるようにしている。

特許文献２の観察装置は、ＬＣＯＳによりレーザ光の波面を変調する照明光路と、２次元スキャナによりレーザ光を走査させる照明光路とを備え、これら各照明光路のレーザ光を標本に同時に照射することで、ＬＣＯＳによるパターン照明と２次元スキャナによるＬＳＭとしての観察とを同時に行えるようにしている。

特開２０１２−１５０２３８号公報特開２０１１−０９９９８６号公報

しかしながら、特許文献１に記載の観察装置は、ＬＣＯＳによりパターン照明するものではない。また、特許文献２に記載の観察装置は、ＬＣＯＳによる照明光路と２次元スキャナによる照明光路とが別々のため、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察を実現することはできないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、１つのＬＣＯＳにより、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と所望のパターン照明とを実現することができる観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられた照明光を集光して標本に照射する対物レンズと、該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光の波面を変調可能な空間光変調素子と、該空間光変調素子と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光を２次元的に走査可能な走査部と、該走査部により走査された前記照明光が照射されることによって前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、前記標本における前記対物レンズの光軸方向の焦点位置を調整する焦準部と、前記焦点位置における収差の補正および前記標本における所望の照明パターンの形成を行うように、前記空間光変調素子を制御する制御部とを備え、前記対物レンズと前記走査部と前記空間光変調素子とが同一の光路上に配され、前記制御部が、前記走査部による前記照明光の走査を停止させ、かつ、前記標本を光刺激する場合は、前記空間光変調素子により前記標本において所望の照明パターンが形成されるように前記照明光の波面を変調させ、前記標本を観察する場合は、前記空間光変調素子により前記焦点位置における収差を補正するように前記照明光の波面を変調させて前記走査部により前記標本上で前記照明光を走査させる観察装置を提供する。

本発明によれば、焦準部により標本における対物レンズの光軸方向の焦点位置を調整することで、標本における深さ方向の観察位置を変更することができる。この場合において、制御部により標本内の屈折率分布等によって発生する収差を補正するように制御された空間光変調素子によって波面が変調された照明光を走査部により走査させて対物レンズにより標本に照射することで、標本の所望の深さ位置を精度よく観察することができる。

また、制御部により標本において所望の照明パターンが形成されるように制御された空間光変調素子によって波面が変調された照明光を対物レンズにより標本に照射することで、標本の所望の複数の照射位置を同時に光刺激することができる。
したがって、制御部による空間光変調素子の制御に従い、１つの空間光変調素子によって、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と所望のパターン照明とを実現することができる。

上記発明においては、前記対物レンズと前記走査部と前記空間光変調素子とが同一の光路上に配され、前記制御部が、前記所望の照明パターンを形成するための前記空間光変調素子の制御を前記走査部による前記照明光の走査が停止している期間に行う。

このように構成することで、標本におけるパターン照明を形成する位置を固定することができる。したがって、標本の複数の照射位置に同時に精度よく光刺激を与えることができる。
上記発明においては、前記制御部が、さらに、前記対物レンズの焦点位置の深さ方向の位置情報に基づいて、前記対物レンズの焦点位置における収差を補正するように、前記空間光変調素子を制御することとしてもよい。

上記発明においては、前記空間光変調素子と前記走査部との間の光路における前記標本と共役な位置に挿脱可能に配され、前記制御部により前記所望の照明パターンを形成するように制御された前記空間光変調素子によって波面が変調された前記照明光に含まれる０次光を除去する０次光除去部材を備えることとしてもよい。

空間光変調素子により波面変調が施された照明光の軸中心には、波面変調の影響を受けない０次光が含まれる。そのため、標本における刺激光中の０次光が照射される位置付近は、所望の強度分布で光刺激することができないことになる。

そこで、標本に光刺激を与える場合は、光路に０次光除去部材を挿入して照明光に含まれる０次光を除去すれば、所望しない照明パターンによる光刺激を防ぐことができる。一方、ＬＳＭとして標本を観察する場合は、光路から０次光除去部材を外せば、０次光除去部材の影響を受けることなく精度よく収差補正を行うことができる。

本発明は、光源から発せられた照明光を集光して標本に照射する対物レンズと、該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光の波面を変調可能な空間光変調素子と、該空間光変調素子と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光を２次元的に走査可能な走査部と、前記標本における前記対物レンズの光軸方向の焦点位置を調整する焦準部と、前記焦点位置における収差の補正および前記標本における所望の照明パターンの形成を行うように、前記空間光変調素子を制御する制御部と、前記空間光変調素子と前記走査部との間の光路を２つに分岐する光路分岐部と、該光路分岐部により分岐された２つの光路を前記走査部と前記対物レンズとの間で合成する光路合成部とを備え、前記対物レンズの瞳位置と前記空間光変調素子とが前記２つの光路においてそれぞれ光学的に共役な位置関係を有する観察装置である。

このように構成することで、収差補正を行いながらＬＳＭとして標本を観察する場合は、光路分岐部により分岐された光路の内の走査部が配置されている光路において照明光を走査して標本に照射し、標本を光刺激する場合は、光路分岐部により分岐された光路の内の走査部が配置されていない光路において走査部を介さずに標本にパターン照明すればよい。

この場合において、空間光変調素子の制御と走査部の動作とを連動させる必要がなくなるので、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と標本の光刺激との切り替えの迅速化を図ることができる。

上記発明においては、前記光路分岐部より分岐された光路の内の前記走査部が配置されていない光路における前記標本と共役な位置に配され、前記制御部により前記所望の照明パターンを形成するように制御された前記空間光変調素子によって波面が変調された前記照明光に含まれる０次光を除去する０次光除去部材を備えることとしてもよい。

このように構成することで、光路に対して０次光除去部材を挿脱することなく、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と所望の照明パターンによる標本の光刺激とを迅速に切り替えることができる。

上記発明においては、前記光路分岐部が、前記標本と共役な位置に配置され、前記空間光変調素子からの前記照明光の光路を０次光を含む一部の前記照明光の光路と０次光を含まない一部の前記照明光の光路とに分岐し、前記走査部が、前記０次光を含む一部の前記照明光の光路に配置されていることとしてもよい。

このように構成することで、対物レンズの焦点位置における収差の補正と標本における所望の照明パターンの形成とで制御部による空間光変調素子の制御を切り替えることなく、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と所望のパターン照明とを実現することができる。

本発明によれば、１つのＬＣＯＳにより、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての観察と所望のパターン照明とを実現することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。本発明の第２実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。本発明の第２実施形態の一変形例に係る観察装置の全体構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る観察装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１００は、図１に示すように、レーザ光（照明光）を発生する光源１と、光源１から発せられたレーザ光をオンオフするＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ−ＯｐｔｉｃＭｏｄｕｌａｔｏｒ）２と、ＡＯＭ２を通過したレーザ光の波面を略平面波に変換するビーム変換光学系３と、略平面波に変換されたレーザ光の波面を変調する波面変調部５と、レーザ光を２次元的に走査させるスキャナ（走査部）７と、標本Ｓにレーザ光を照射する一方、標本Ｓにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ９と、対物レンズ９により集光された標本Ｓからの蛍光をレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー１１と、ダイクロイックミラー１１により分岐された蛍光を検出する光電子増倍管（ＰｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒＴｕｂｅ）のような検出器１３とを備えている。

また、この観察装置１００は、波面変調部５とスキャナ７との間に配置された第１リレー光学系１５と、スキャナ７の内部に設けられた第２リレー光学系１７と、スキャナ７とダイクロイックミラー１１との間に配置された第３リレー光学系１９と、ダイクロイックミラー１１と検出器１３との間に配置された第４リレー光学系２１と、第１リレー光学系１５によりリレーされるレーザ光から０次光をカットするマスク（０次光除去部材）２３と、対物レンズ９を光軸方向に沿って移動させる焦準機構（焦準部）２５と、ＡＯＭ２、波面変調部５、スキャナ７およびマスク２３の制御等を行う制御装置（制御部）２７と、１光子刺激用の可視レーザ光源部２９とを備えている。

光源１は、例えば、多光子励起を生じさせる近赤外域の超短パルスレーザ光源（ＩＲパルスレーザ光源）である。
ＡＯＭ２は、制御装置２７からの指令により、光源１から発せられた超短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光とする。）をオンオフするようになっている。

波面変調部５は、ビーム変換光学系３により略平面波に変換されたレーザ光を反射するプリズム３１と、プリズム３１により反射されたレーザ光を反射してプリズム３１に戻す反射型のＬＣＯＳ（ＬｉｑｕｉｄＣｒｙｓｔａｌＯｎＳｉｌｉｃｏｎ、空間光変調素子）３３とを備えている。

プリズム３１は、ビーム変換光学系３からのレーザ光をＬＣＯＳ３３に向けて反射する一方、ＬＣＯＳ３３から戻されたレーザ光をビーム変換光学系３側とは反対側に向けて、ビーム変換光学系３からのレーザ光の光路と同軸の光路に沿って反射するようになっている。

ＬＣＯＳ３３は、制御装置２７からの指令により、その表面形状を任意に変化させることができるセグメントタイプのＭＥＭＳによって構成されている。このＬＣＯＳ３３は、プリズム３１からのレーザ光を反射する際に、その表面形状に従う形態にレーザ光の波面を変調するようになっている。以下、ＬＣＯＳ３３において、入射したレーザ光に波面の変調を付与する領域を変調領域という。

また、ＬＣＯＳ３３は、変調領域の表面形状に応じて、例えば、対物レンズ９の焦点位置においてレーザ光を１点に集光させたり、所望の３次元的な照明パターンを形成させたりすることができるようになっている。ＬＣＯＳ３３の変調領域の表面形状は、各種光学系の収差や標本Ｓにおける屈折率分布等を考慮して、予め算出あるいは測定しておくことができる。また、ＬＣＯＳ３３は、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

スキャナ７は、互いに対向して配された２枚の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを備えている。このスキャナ７は、制御装置２７からの指令により、２枚の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを相互に直交する軸線回りにそれぞれ揺動させて、ラスタスキャン動作によりレーザ光を偏向するようになっている。これにより、スキャナ７は、揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂの揺動動作に応じて、標本Ｓ上でレーザ光を２次元的に走査させることができるようになっている。

一方の揺動ミラー３５Ａの揺動速度は、他方の揺動ミラー３５Ｂの揺動速度に対して十分に速く設定されている。高速側の揺動ミラー３５Ａは標本Ｓ上におけるＸ方向の走査のために使用され、低速側の揺動ミラー３５Ｂは標本Ｓ上におけるＸ方向に直交するＹ方向の走査のために使用される。これら揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂは、図示しないモータにより互いに軸線回りに揺動させられるようになっている。

ダイクロイックミラー１１は、光源１からのレーザ光を対物レンズ９に向けて反射する一方、対物レンズ９からの蛍光を検出器１３に向けて透過させるようになっている。
検出器１３は、検出した蛍光の強度情報を出力するようになっている。検出器１３から出力された蛍光の強度情報とその検出時のスキャナ７によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて、図示しないＰＣ（ＰｅｒｓｏｎａｌＣｏｍｐｕｔｅｒ）等により、標本Ｓの２次元的な蛍光画像を生成することができる。

第１リレー光学系１５は、波面変調部５のＬＣＯＳ３３上の像をスキャナ７の揺動ミラー３５Ａ上にリレーするようになっている。
第２リレー光学系１７は、揺動ミラー３５Ａと揺動ミラー３５Ｂとの間に配置され、揺動ミラー３５Ａ上の像を揺動ミラー３５Ｂ上にリレーするようになっている。
第３リレー光学系１９は、揺動ミラー３５Ｂ上の像を対物レンズ９の瞳位置にリレーするようになっている。
したがって、ＬＣＯＳ３３の表面位置、揺動ミラー３５Ａの表面位置および揺動ミラー３５Ｂの表面位置は、いずれも対物レンズ９の入射瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

また、第１リレー光学系１５、第２リレー光学系１７、第３リレー光学系１９および第４リレー光学系２１は、いずれも複数のレンズにより構成されている。例えば、第３リレー光学系１９は、瞳投影レンズ３７と結像レンズ３９とにより構成されている。

マスク２３は、第１リレー光学系１５おけるレーザ光の光路上の標本Ｓと共役な位置に挿脱可能（ＩＮ／ＯＵＴ）に配置されている。
焦準機構２５は、対物レンズ９を光軸方向に沿って移動させることで、標本Ｓにおける対物レンズ９の光軸方向の焦点位置を調整することができるようになっている。

可視レーザ光源部２９は、可視レーザ光を発生する可視レーザ光源６１と、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏ−ＯｐｔｉｃＴｕｎａｂｌｅＦｉｌｔｅｒ）６３と、ＡＯＴＦ６３を通過したレーザ光の波面を略平面波に変換するビーム変換光学系６５と、略平面波に変換されたレーザ光を反射する反射ミラー６７と、反射ミラー６７により反射されたレーザ光を光源１からのレーザ光の光路に合流させるダイクロイックミラー６９とを備えている。

制御装置２７は、ＡＯＭ２、スキャナ７のモータ、マスク２３、ＬＣＯＳ３３、ＡＯＴＦ６３等を制御するＣＰＵ（図示略）と、このＣＰＵを作動するプログラムと、ＣＰＵに入力する各種信号等を記憶するメモリとを備えている。

制御装置２７は、ＣＰＵによるプログラムの実行により、ＡＯＭ２に対してオンオフ切り替え指令信号を出力してレーザ光のオンオフの切り替えを制御するようになっている。また、制御装置２７は、ＣＰＵによるプログラムの実行により、スキャナ７のモータに対して角度指令信号を出力して、各揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂの揺動角度を制御するようになっている。また、制御装置２７は、ＣＰＵによるプログラムの実行により、マスク２３に対して挿脱指令信号を出力して、レーザ光の光路への挿入および光路からの脱離を制御するようになっている。

また、制御装置２７は、ＣＰＵによるプログラムの実行により、ＬＣＯＳ３３に対して形状指令信号を出力して、予め設定された表面形状となるように変調領域を制御するようになっている。また、制御装置２７は、対物レンズ９の焦点位置における収差を補正したり、標本Ｓにおける所望の照明パターンを形成したりするように、ＬＣＯＳ３３を制御するようになっている。

例えば、標本Ｓを多光子励起観察する場合は、制御装置２７は、レーザ光の光路からマスク２３を脱離するとともにスキャナ７の各揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを揺動させ、対物レンズ９の焦点位置において１点に集光するようにレーザ光の波面を変調する表面形状をＬＣＯＳ３３に設定するようになっている。ＬＣＯＳ３３の変調領域の表面形状は、各種光学系の収差や標本Ｓにおける屈折率分布等を考慮して予め算出あるいは測定されている。

焦準機構２５により対物レンズ９の光軸方向の焦点位置を変更した場合は、制御装置２７は、焦準機構２５から読み出される標本Ｓの表面を基準とした対物レンズ９の焦点位置の深さ方向の位置情報に基づいて、対物レンズ９の焦点位置における収差を補正するように、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状を変化させるようになっている。

また、標本Ｓを光刺激する場合は、制御装置２７は、レーザ光の光路にマスク２３を挿入するとともにスキャナ７の各揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを停止させ、標本Ｓに所望の照明パターンを形成するようにレーザ光の波面を変調する表面形状をＬＣＯＳ３３に設定するようになっている。

このように構成された観察装置１００の作用について説明する。
まず、本実施形態に係る観察装置１００により標本Ｓを多光子励起観察する場合は、制御装置２７が、レーザ光の光路からマスク２３を脱離するとともに、スキャナ７を駆動して揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを揺動させる。また、制御装置２７は、標本Ｓにおける深さ方向の任意の観察位置に応じて予め設定された表面形状をＬＣＯＳ３３に設定し、光源１からレーザ光を発生させる。

光源１から発せられたレーザ光は、ＡＯＭ２およびビーム変換光学系３を介して略平面波として波面変調部５に入射する。波面変調部５においては、レーザ光がプリズム３１により反射されてＬＣＯＳ３３に入射し、ＬＣＯＳ３３により波面が変調されてプリズム３１に戻され、プリズム３１により第１リレー光学系１５に向けて反射される。

そして、レーザ光は、第１リレー光学系１５によりリレーされてスキャナ７に入射し、揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂおよび第２リレー光学系１７を介して出射される。スキャナ７においては、高速側の揺動ミラー３５Ａが揺動させられることにより、揺動ミラー３５Ａによって反射されたレーザ光がＸ方向に走査される。そして、揺動ミラー３５ＡによるＸ方向の１走査ラインが走査されるごとに低速側の揺動ミラー３５Ｂが揺動させられることにより、揺動ミラー３５Ｂによって反射されたレーザ光がＹ方向に走査されてＸ方向の走査ラインが切り替えられる。これにより、レーザ光が２次元的に走査される。

スキャナ７により走査されたレーザ光は、第３リレー光学系１９によりリレーされてダイクロイックミラー１１により反射され、対物レンズ９により集光されて標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ７の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂの動作に応じて標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査される。

レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ９により集光されてダイクロイックミラー１１を透過し、第４リレー光学系２１によりリレーされて検出器１３により検出される。すなわち、標本Ｓからの蛍光は、スキャナ７に戻されずに検出器１３により検出される（ノンデスキャン検出方式）。

これにより、検出器１３から出力される蛍光の強度情報とスキャナ７によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて、ＰＣ等によって標本Ｓにおける深さ方向の任意の観察位置の２次元的な画像を生成することができる。ＰＣにより生成された画像は図示しないモニタ等に表示することで、標本Ｓを多光子励起観察することができる。

続いて、焦準機構２５により標本Ｓにおける対物レンズ９の光軸方向の焦点位置を調整し、標本Ｓにおける観察位置を深さ方向の次の断面に変更する。この場合、標本Ｓ内の屈折率分布等によって対物レンズ９の焦点がずれるので、制御装置２７により、焦準機構２５からの前記位置情報に基づき、標本Ｓ内の屈折率分布等によって発生する収差を補正するようにＬＣＯＳ３３が制御される。

そして、変調領域の表面形状が変更されたＬＣＯＳ３３により、対物レンズ９の焦点位置における収差を補正するようにレーザ光の波面が変調され、そのレーザ光がスキャナ７により走査されて対物レンズ９により標本Ｓに照射される。これにより、標本Ｓにおける深さ方向の次の断面を精度よく多光子励起観察することができる。

同様にして、焦準機構２５により標本Ｓにおける観察位置を深さ方向に変更する度に、制御装置２７により、対物レンズ９の焦点位置における収差を補正するようにＬＣＯＳ３３が制御される。したがって、標本Ｓにおける深さ位置が異なる各断面を精度よく多光子励起観察することができる。

次に、本実施形態に係る観察装置１００により標本Ｓを多光子パターン刺激する場合は、制御装置２７が、レーザ光の光路上にマスク２３を挿入するとともに、スキャナ７の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂをノーマル位置に固定する。また、制御装置２７は、標本Ｓにおける所望の照明パターンの形成を行うようにレーザ光の波面を変調する表面形状をＬＣＯＳ３３に設定して、光源１からレーザ光を発生させる。

光源１から発せられて、波面変調部５のＬＣＯＳ３３により波面が変調されたレーザ光は、第１リレー光学系１５によりリレーされてマスク２３により０次光がカットされる。そして、レーザ光は、スキャナ７により反射されるとともに第２リレー光学系１７によりリレーされ、第３リレー光学系１９およびダイクロイックミラー１１を介して対物レンズ９により標本Ｓに照射される。

これにより、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状に応じて標本Ｓにおける所望の位置に所望の照明パターンが形成され、その照明パターンに従って標本Ｓが光刺激される。例えば、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状に応じて、標本Ｓにおける所望の複数箇所を同時に多光子パターン刺激することができる。

ユーザは、制御装置２７により、光源１、ＡＯＭ２、ＬＣＯＳ３３、マスク２３およびスキャナ７等の制御を切り替えて、光刺激を与えた標本Ｓの画像を取得することにより、多光子パターン刺激による標本Ｓの反応を多光子励起観察することができる。

一方、本実施形態に係る観察装置１００により標本Ｓを１光子パターン刺激する場合は、光源１に代えて、可視レーザ光源６１からレーザ光を発生させる。可視レーザ光源６１から発せられたレーザ光は、ＡＯＴＦ６３、ビーム変換光学系６５および反射ミラー６７を介して、ダイクロックミラー６９により光源１からのレーザ光の光路に合流される。光源１からのレーザ光の光路に合流した可視レーザ光源６１からのレーザ光は、多光子パターン刺激の場合と同様にして標本Ｓに照射される。

これにより、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状に応じて標本Ｓにおける所望の位置に所望の照明パターンが形成され、その照明パターンに従って標本Ｓが光刺激される。ユーザは、制御装置２７により、光源１、ＡＯＭ２、ＬＣＯＳ３３、マスク２３およびスキャナ７等の制御を切り替えて、光刺激を与えた標本Ｓの画像を取得することにより、１光子パターン刺激による標本Ｓの反応を多光子励起観察することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る観察装置１００によれば、制御装置２７によるＬＣＯＳ３３の制御に従い、１つのＬＣＯＳ３３によって、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての多光子励起観察と所望のパターン照明とを実現することができる。また、標本Ｓを多光子パターン刺激または１光子パターン刺激する場合に、スキャナ７の駆動を停止することで、標本Ｓにおけるパターン照明を形成する位置を固定し、精度よく光刺激を与えることができる。

また、ＬＣＯＳ３３により波面変調が施されたレーザ光の軸中心には波面変調の影響を受けない０次光が含まれているため、標本Ｓにおける０次光の照射位置付近は本来は所望の強度分布で光刺激することができないが、マスク２３によりレーザ光に含まれる０次光を除去することで、所望しない照明パターンによる光刺激を防ぐことができる。なお、標本Ｓを多光子励起観察する場合は、光路からマスク２３を外すことで、マスク２３の影響を受けることなく精度よく収差補正を行うことができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る観察装置について説明する。
本実施形態に係る観察装置２００は、図２に示すように、波面変調部５とスキャナ７との間の光路を２つに分岐する分岐ダイクロイックミラー（光路分岐部）４１、分岐ダイクロイックミラー４１により分岐された２つの光路をスキャナ７と対物レンズ９との間で合成する合成ダイクロイックミラー（光路合成部）４２とを備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る観察装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

分岐ダイクロイックミラー４１は、波面変調部５と第１リレー光学系１５との間の光路上に配置されている。この分岐ダイクロイックミラー４１は、ある波長域のレーザ光を第１リレー光学系１５に向けて透過させる一方、他の波長域のレーザ光を反射することにより、レーザ光の光路を分岐するようになっている。

合成ダイクロイックミラー４２は、第３リレー光学系１９の瞳投影レンズ３７と結像レンズ３９との間の光路上に配置されている。この合成ダイクロイックミラー４２は、分岐ダイクロイックミラー４１を透過してきたある波長域のレーザ光を結像レンズ３９に向けて透過させる一方、分岐ダイクロイックミラー４１により反射された他の波長域のレーザ光を結像レンズ３９に向けて反射することにより、レーザ光の光路を合成するようになっている。

分岐ダイクロイックミラー４１により反射された他の波長域のレーザ光の光路には、分岐ダイクロイックミラー４１からのレーザ光をリレーする第５リレー光学系４３と、第５リレー光学系４３によりリレーされたレーザ光を反射する反射ミラー４５，４６と、反射ミラー４６からのレーザ光を集光して合成ダイクロイックミラー４２に入射させる瞳投影レンズ４７とが配置されている。

瞳投影レンズ４７は、第３リレー光学系１９の結像レンズ３９と第６リレー光学系４９を構成するようになっている。第５リレー光学系４３および第６リレー光学系４９は、ＬＣＯＳ３３上の像を対物レンズ９の瞳位置にリレーするようになっている。マスク２３は、第１リレー光学系１５のレンズ間に代えて、第５リレー光学系４３のレンズ間の光路上に挿入されたままになっている。
制御装置２７は、標本Ｓを多光子励起観察する場合も多光子パターン刺激または１光子パターン刺激する場合も、スキャナ７を駆動させたままにしておくようになっている。

このように構成された観察装置２００の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置２００により、標本Ｓを多光子励起観察する場合は、制御装置２７が、スキャナ７を駆動して揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを揺動させるとともに、標本Ｓにおける深さ方向の任意の観察位置に応じて予め設定された表面形状をＬＣＯＳ３３に設定する。そして、制御装置２７は、ＡＯＭ２を制御し、分岐ダイクロイックミラー４１を透過する波長域のレーザ光を光源１から出射させる。

光源１から出射されたレーザ光は、ビーム変換光学系３および波面変調部５を介して分岐ダイクロイックミラー４１を透過し、第１リレー光学系１５および第２リレー光学系１７を介してスキャナ７により２次元的に走査される。スキャナ７により走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ３７を介して合成ダイクロイックミラー４２を透過し、結像レンズ３９およびダイクロイックミラー１１を介して対物レンズ９により標本Ｓに照射される。

これにより、第１実施形態と同様に、標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出器１３により検出してＰＣにより画像を生成し、標本Ｓを多光子励起観察することができる。
焦準機構２５により標本Ｓにおける対物レンズ９の深さ方向の焦点位置を変更した場合は、第１実施形態と同様に、制御装置２７により、焦準機構２５からの前記位置情報に基づき、標本Ｓ内の屈折率分布等によって発生する収差を補正するようにＬＣＯＳ３３が制御される。

これにより、変調領域の表面形状が変更されたＬＣＯＳ３３によって対物レンズ９の焦点位置における収差を補正するように波面が変調されたレーザ光がスキャナ７によって走査されて対物レンズ９により標本Ｓに照射されることで、標本Ｓにおける深さ方向の異なる断面を精度よく多光子励起観察することができる。

次に、本実施形態に係る観察装置２００により標本Ｓを多光子パターン刺激する場合は、制御装置２７が、スキャナ７の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを揺動させたまま、標本Ｓにおける所望の照明パターンの形成を行うようにレーザ光の波面を変調する表面形状をＬＣＯＳ３３に設定する。そして、制御装置２７は、ＡＯＭ２を制御し、分岐ダイクロイックミラー４１によって反射される波長域のレーザ光を出射させる。

光源１から発せられて、波面変調部５のＬＣＯＳ３３により波面が変調されたレーザ光は、分岐ダイクロイックミラー４１により反射される。そして、レーザ光は、第５リレー光学系４３によりリレーされるとともにマスク２３により０次光がカットされ、反射ミラー４５，４６を介して瞳投影レンズ３７により集光される。

瞳投影レンズ４７により集光されたレーザ光は、合成ダイクロイックミラー４２により反射されて、結像レンズ３９およびダイクロイックミラー１１を介して対物レンズ９により標本Ｓに照射される。
これにより、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状に応じて標本Ｓにおける所望の位置に所望の照明パターンを形成し、その照明パターンに従って標本Ｓを多光子パターン刺激することができる。

一方、本実施形態に係る観察装置２００により標本Ｓを１光子パターン刺激する場合は、制御装置２７が、ＡＯＭ２に代えて、ＡＯＴＦ６３を制御し、分岐ダイクロイックミラー４１によって反射される波長域のレーザ光を出射させる。可視レーザ光源６１から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー６９により光源１からのレーザ光の光路に合流した後は、多光子パターン刺激の場合と同様にして標本Ｓに照射される。これにより、ＬＣＯＳ３３における変調領域の表面形状に応じて形成される所望の照明パターンに従って標本Ｓを１光子パターン刺激することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る観察装置２００によれば、収差補正を行いながらＬＳＭとして標本Ｓを多光子励起観察する場合は、分岐ダイクロイックミラー４１により分岐された光路の内のスキャナ７が配置されている光路において、スキャナ７によりレーザ光を走査して標本Ｓに照射すればよい。また、標本Ｓを多光子パターン刺激または１光子パターン刺激する場合は、分岐ダイクロイックミラー４１により分岐した光路の内のスキャナ７が配置されていない光路において、スキャナ７を介さずに標本Ｓにパターン照明すればよい。

この場合において、ＬＣＯＳ３３の制御とスキャナ７の駆動およびマスク２３の挿脱とを連動させる必要がないので、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての多光子励起観察と標本Ｓの多光子パターン刺激または１光子パターン刺激との切り替えの迅速化を図り、多光子励起観察と光刺激のタイムラグを短縮することができる。

本実施形態においては、光路分岐部，光路合成部として分岐ダイクロイックミラー４１，４３Ｂを例示して説明したが、これに代えて、光路分岐部および光路合成部としてそれぞれハーフミラーを採用することとしてもよい。

本実施形態は以下のように変形することとしてもよい。
すなわち、第２実施形態においては、光路分岐部として分岐ダイクロイックミラー４１を採用したが、一変形例では、例えば、図３に示されるように、光路分岐部として、波面変調部５により波面の変調が施されたレーザ光の内、０次光を含む一部のレーザ光のみが通過可能な貫通孔を有する環状ミラー５１を採用することとしてもよい。

環状ミラー５１は、例えば、中央に前記貫通孔を有する円環形状に形成されたものであればよい。また、環状ミラー５１は、標本Ｓと共役な位置に配置され、波面変調部５からのレーザ光の内、軸中心に含まれる０次光とその周りの一部のレーザ光を貫通孔によりスキャナ７に向けて通過させ、０次光とその周りの一部のレーザ光を含まないさらにその外側のレーザ光を反射するようになっていればよい。

また、第１リレー光学系１５を２つのレンズにより構成し、これら２つのレンズの間における対物レンズ９の結像位置と共役な位置に環状ミラー５１を配置することとすればよい。また、第５リレー光学系４３に代えて、第１リレー光学系１５の一方のレンズを共有して第７リレー光学系５３を構成するレンズ５５を採用することとすればよい。また、光路合成部として、合成ダイクロイックミラー４２に代えて、ハーフミラー５７を採用することとすればよい。さらに、反射ミラー４５，４６間の光路上に、レーザ光の通過と遮断を切り替え可能なシャッタ５９を配置することとすればよい。

このようにすることで、波面変調部５により波面を変調したレーザ光の光路は、環状ミラー５１により、０次光を含む一部のレーザ光の光路と、０次光を含まない一分のレーザ光の光路とに分岐される。そして、環状ミラー５１を通過した０次光を含む一部のレーザ光がスキャナ７により標本Ｓ上で２次元的に走査され、環状ミラー５１により反射された０次光を含まない一部のレーザ光がスキャナ７を介さずに標本Ｓに照射される。

したがって、対物レンズ９の焦点位置における収差の補正と標本Ｓにおける所望の照明パターンの形成とを行う場合において、制御装置２７によるＬＣＯＳ３３の制御およびＡＯＭ２の制御を切り替える必要がなく、同一のレーザ光により、収差補正を行いながらのＬＳＭとしての多光子励起観察と所望のパターン照明とを実現することができる。この場合、シャッタ５９により、標本Ｓを多光子パターン刺激または１光子パターン刺激する間はレーザ光を通過させ、標本Ｓの画像を取得する間はレーザ光を遮断して多光子パターン刺激または１光子パターン刺激を停止することとすればよい。なお、本変形例においては、多光子パターン刺激または１光子パターン刺激用のレーザ光から０次光を除去する機能を環状ミラー５１が兼ねるので、０次光除去部材としてのマスクを採用する必要がない。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、上記各実施形態においては、スキャナ７の揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂ間に第２リレー光学系１７を配置することとしたが、揺動ミラー３５Ａ，３５Ｂを近接して配置し、第２リレー光学系１７を用いないこととしてもよい。

１光源
７スキャナ（走査部）
９対物レンズ
２３マスク（０次光除去部材）
２５焦準機構（焦準部）
２７制御装置（制御部）
３３ＬＣＯＳ（空間光変調素子）
４１分岐ダイクロイックミラー（光路分岐部）
４２合成ダイクロイックミラー（光路合成部）
５１環状ミラー（光路分岐部）
５７ハーフミラー（光路合成部）
１００，２００観察装置
Ｓ標本

Claims

光源から発せられた照明光を集光して標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光の波面を変調可能な空間光変調素子と、
該空間光変調素子と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光を２次元的に走査可能な走査部と、
該走査部により走査された前記照明光が照射されることによって前記標本から発せられる光を検出する光検出部と、
前記標本における前記対物レンズの光軸方向の焦点位置を調整する焦準部と、
前記焦点位置における収差の補正および前記標本における所望の照明パターンの形成を行うように、前記空間光変調素子を制御する制御部とを備え、
前記対物レンズと前記走査部と前記空間光変調素子とが同一の光路上に配され、
前記制御部が、前記標本を光刺激する場合は、前記走査部による前記照明光の走査を停止させ、かつ、前記空間光変調素子により前記標本において所望の照明パターンが形成されるように前記照明光の波面を変調させ、前記標本を観察する場合は、前記空間光変調素子により前記焦点位置における収差を補正するように前記照明光の波面を変調させて前記走査部により前記標本上で前記照明光を走査させる観察装置。
前記制御部が、さらに、前記対物レンズの焦点位置の深さ方向の位置情報に基づいて、前記対物レンズの焦点位置における収差を補正するように、前記空間光変調素子を制御する請求項１に記載の観察装置。
前記空間光変調素子と前記走査部との間の光路における前記標本と共役な位置に挿脱可能に配され、前記制御部により前記所望の照明パターンを形成するように制御された前記空間光変調素子によって波面が変調された前記照明光に含まれる０次光を除去する０次光除去部材を備える請求項１または請求項２に記載の観察装置。
光源から発せられた照明光を集光して標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光の波面を変調可能な空間光変調素子と、
該空間光変調素子と光学的に共役な位置に配置され、前記対物レンズにより前記標本に照射される照明光を２次元的に走査可能な走査部と、
前記標本における前記対物レンズの光軸方向の焦点位置を調整する焦準部と、
前記焦点位置における収差の補正および前記標本における所望の照明パターンの形成を行うように、前記空間光変調素子を制御する制御部と、
前記空間光変調素子と前記走査部との間の光路を２つに分岐する光路分岐部と、
該光路分岐部により分岐された２つの光路を前記走査部と前記対物レンズとの間で合成する光路合成部とを備え、
前記対物レンズの瞳位置と前記空間光変調素子とが前記２つの光路においてそれぞれ光学的に共役な位置関係を有する観察装置。
前記光路分岐部より分岐された光路の内の前記走査部が配置されていない光路における前記標本と共役な位置に配され、前記制御部により前記所望の照明パターンを形成するように制御された前記空間光変調素子によって波面が変調された前記照明光に含まれる０次光を除去する０次光除去部材を備える請求項４に記載の観察装置。
前記光路分岐部が、前記標本と共役な位置に配置され、前記空間光変調素子からの前記照明光の光路を０次光を含む一部の前記照明光の光路と０次光を含まない一部の前記照明光の光路とに分岐し、
前記走査部が、前記０次光を含む一部の前記照明光の光路に配置されている請求項４に記載の観察装置。