JP4939855B2 - 照明装置およびレーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、照明装置およびレーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、レーザ走査型顕微鏡として、例えば、特許文献１に開示されているものがある。
この特許文献１のレーザ走査型顕微鏡は、試料の観察および走査のための２つのレーザ光の光路を合成するもので、操作用レーザ光の合焦半径を変更するためのズーム光学系を操作用レーザ光の光路に備えている。ズーム光学系の作動により、操作用レーザ光の合焦半径を縮小または拡大することとしている。
特開２００２−８２２８７号公報

しかしながら、ズーム光学系の作動による操作用レーザ光の合焦半径の変更には、ズーム光学系を構成する各種光学部品の移動を伴うため、相当の時間（数１００ｍｓｅｃ程度）を要し、試料の早い反応（数μｓｅｃ程度）を観察することができないという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光束径の異なる複数のレーザ光を短時間で切り替えて照射することができる照明装置およびレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光束径の異なる複数のレーザ光の光路を合成する光路合成手段と、該光路合成手段により光路を合成されたレーザ光の光軸に交差する方向の光束位置を調節する光束位置調節手段と、該光束位置調節手段により位置調節されたレーザ光を試料に集光させる集光手段とを備え、光束径が小さい方のレーザ光を、光束径が大きい方のレーザ光の開口数よりも小さな開口数をなして試料に照射することにより、合焦位置において前記光束径が大きい方のレーザ光よりも広い領域に照射する照明装置を提供する。

本発明によれば、光束径の異なる複数のレーザ光が、光路合成手段により同一の光路に合成されるので、合焦半径の異なる複数のレーザ光を同時にあるいは極めて短時間で切り替えて、集光手段により試料に集光させることができる。レーザ光の光束位置をその光軸に交差する方向に調節する光束位置調節手段は、十分に高速に動作することができ、合焦半径の異なるレーザ光を試料の異なる位置に照射することが可能となる。

上記発明においては、光路合成手段により合成される前の複数の光路に設けられ、各光路を個別に開閉するシャッタ手段と、該シャッタ手段と前記光束位置調節手段とを同期して作動させることにより、前記光束径の異なる複数のレーザ光を、試料上の光軸に交差する方向の異なる位置に切り替えて照射させる制御手段とを備えることとしてもよい。
制御手段の作動によりシャッタ手段と光束位置調節手段とを同期させることで、不必要な部分にレーザ光を照射することなく、試料上の離れた領域に異なる合焦半径のレーザ光を短時間で切り替えて照射することができる。

また、上記発明においては、前記試料を光軸方向に移動させる移動手段を備え、前記制御手段が、前記シャッタ手段、前記光束位置調節手段および前記移動手段を同期して作動させることとしてもよい。
このようにすることで、光軸方向に離れた試料上の異なる領域にも異なる合焦半径のレーザ光を短時間で切り替えて照射することができる。試料を移動させる移動手段による移動量はズーム光学系におけるレンズの移動量と比較して極めて微小なものである。このため、試料を光軸方向に高速に移動させて、レーザ光の照射位置を光軸方向に短時間で切り替えることができる。

また、上記発明においては、前記レーザ光が超短パルスレーザ光からなることとしてもよい。
このようにすることで、合焦位置の極めて薄い範囲のみにおける光子密度を増大させて、光軸方向に限られた範囲に光刺激等の照明を行うことができる。特に、照明位置の光軸方向移動を伴う場合には効果的である。

また、上記発明においては、前記光路合成手段により合成される前の複数の光路に、各光路におけるレーザ光の光束径を調節する光束径調節手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、光束径調節手段の作動により、レーザ光の光束径を予め調節しておくことができ、所望の合焦半径のレーザ光を試料に照射することが可能となる。

また、上記発明においては、前記光路合成手段により合成される前の複数の光路に、各光路におけるレーザ光の合焦位置を調節する合焦位置調節手段が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、合焦位置調節手段の作動により、異なる光束径のレーザ光の合焦位置を予め異ならせておくことが可能となり、さらに高速に照射位置を切り替えることができる。

また、本発明は上記いずれかの照明装置を備え、前記光路合成手段により合成される前の複数の光路のいずれかに、集光手段および光束位置調節手段を介して戻る試料からの光を検出する光検出手段が備えられているレーザ走査型顕微鏡を提供する。
照明装置の作動により、光束径の異なるレーザ光を短時間で切り替えて照明し、それに対する試料の状態を光検出手段により検出する。レーザ光のいずれかを観察用照明光として使用し、光束位置調節手段を光走査手段として使用することで、光束位置調節手段により試料から戻る光をデスキャンして画像形成することも可能となる。

また、本発明は、上記いずれかの照明装置と、観察用照明光源と、該観察用照明光源から発せられた観察用照明光を光軸に交差する方向に走査する光走査手段と、該光走査手段により走査された観察用照明光の光路と、前記照明装置から出射されたレーザ光の光路とを合成する第２の光路合成手段と、該第２の光路合成手段により合成された観察用照明光および／またはレーザ光を試料に照射し、試料において発生した観察光を集光する対物レンズと、該対物レンズ、前記第２の光路合成手段および光走査手段を介して同一光路を戻る観察光を検出する光検出手段とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察用照明光源から発せられた観察用照明光が、光走査手段により走査され対物レンズにより試料に照射される。試料において発生した観察光は、対物レンズおよび光走査手段を介して同一光路を戻り光検出手段により検出されることで観察画像が形成される。観察用照明光の光路には第２の光合成手段により照明装置からの光束径の異なる複数のレーザ光の光路が合成されるので、照明装置からの合焦半径の異なる複数のレーザ光を試料に照射しつつ、観察画像を取得することができる。

また、本発明は、上記いずれかの照明装置と、超短パルスレーザ光を出射する観察用照明光源と、該観察用照明光源から発せられた超短パルスレーザ光を光軸に交差する方向に走査する光走査手段と、該光走査手段により走査された超短パルスレーザ光の光路と、前記照明装置から出射されたレーザ光の光路とを合成する第２の光路合成手段と、該第２の光路合成手段により合成された超短パルスレーザ光および／またはレーザ光を試料に照射し、試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出手段とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察用照明光源から発せられた超短パルスレーザ光が、光走査手段により走査され対物レンズにより試料に集光される。試料においては、超短パルスレーザ光の集光位置において多光子励起効果による多光子蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズにより集光され光検出手段により検出されることで多光子蛍光画像が形成される。観察用照明光の光路には第２の光合成手段により照明装置からの光束径の異なる複数のレーザ光の光路が合成されるので、照明装置からの合焦半径の異なる複数のレーザ光を試料に照射しつつ、対物レンズの焦点面に沿う鮮明な蛍光画像を取得することができる。

本発明によれば、光束径の異なる複数のレーザ光を短時間で切り替えて照射することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る照明装置およびレーザ走査型顕微鏡について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る照明装置は、光刺激用照明装置１であって、図１に示されるように、レーザ走査型顕微鏡２に備えられている。

本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２は、図１に示されるように、試料Ａを搭載するステージ３と、本実施形態に係る光刺激用照明装置１と、観察用照明装置４と、これらの照明装置１，４の光路を合成するビームスプリッタ（第２の光路合成手段）５と、光路を合成された照明装置１，４からの光を集光して略平行光にする結像レンズ６と、略平行光にされた光を集光して試料Ａに照射する対物レンズ７と、対物レンズ７により集光された試料Ａから戻る多光子蛍光を分岐するダイクロイックミラー８と、分岐された多光子蛍光を検出する光検出器９とを備えている。図中、符号１０は集光レンズである。

前記ステージ３には、例えば、圧電素子等からなるアクチュエータ（図示略）が備えられ、搭載した試料Ａを上下方向に微小移動させることができるようになっている。
光検出器９は、例えば、光電子増倍管である。

光刺激用照明装置１は、超短パルスレーザ光Ｌ_１を出射する第１のレーザ光源１１と、群速度分散を補償するプリチャーパ１２と、光束径を絞るビーム整形光学系１３と、超短パルスレーザ光Ｌ_１を２つの光路に分岐するハーフミラー１４と、分岐された各光路に設けられ各光路を個別に開閉する音響光学素子（シャッタ手段：ＡＯＭ１，ＡＯＭ２）１５，１６と、各光路を通過する超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の光束径を調節するズーム光学系からなる光束径調節手段１７と、各超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の合焦位置を調節する合焦位置調節手段１８と、一方の光路に設けられ偏光方向を９０°回転させるλ／２板１９と、２つの光路を合成する偏光ビームスプリッタ２０と、該偏光ビームスプリッタ２０により合成された光路に配置され、光路を合成された超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の光軸に直交する方向の光束位置を２次元的に調節するガルバノミラーからなるスキャナ（光束位置調節手段）２１と、超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を集光させて中間像を結像させる瞳投影レンズ２２とを備えている。図中、符号２３はミラーである。

前記観察用照明装置４は、超短パルスレーザ光Ｌ_２を出射する第２のレーザ光源２４と、プリチャーパ２５と、ビーム整形光学系２６と、音響光学素子（ＡＯＭ）２７と、ビームエキスパンダからなる光束径調節手段２８、超短パルスレーザ光Ｌ_２の合焦位置を調節する合焦位置調節手段２９と、ガルバノミラーからなるスキャナ３０と、瞳投影レンズ３１とを備えている。
上記光刺激用照明装置１の２つの音響光学素子１５，１６およびスキャナ２１、観察用照明装置４の音響光学素子２７およびスキャナ３０、およびステージ３にはコントローラ（制御手段）３２が接続され、これらの装置を同期して制御するようになっている。

プリチャーパ１２，２５は、例えば、それぞれ一対のプリズム１２ａ，１２ｂ，２５ａ，２５ｂとミラー１２ｃ，２５ｃとから構成されている。あるいはグレーティング対により構成されていてもよい。プリズム１２ａ，１２ｂ，２５ａ，２５ｂどうしの間隔あるいはグレーティングどうしの間隔を調節することで、波長ごとの光路長を調節して、レーザ光源１１，２４から対物レンズ７に至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。

なお、図１においては、プリチャーパ１２，２５を通過した超短パルスレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２は、ミラー３３と重なる位置を通過するように示されているが、超短パルスレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光束位置は、ミラー３３に対して紙面に直交する方向にずれており、ミラー３３に入射されることなく通過するようになっている。
また、ビーム整形光学系１３，２６は、例えば、両凸レンズ１３ａ，２６ａと平凹レンズ１３ｂ，２６ｂとを組み合わせたガリレオ型のビームエキスパンダにより構成されている。

このように構成された本実施形態に係る光刺激用照明装置１およびレーザ走査型顕微鏡２の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２を用いて試料Ａを観察する場合には、光刺激用照明装置１の２つの光束径調節手段１７を操作して、各光路を通過する超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の光束径を調節し、合焦位置調節手段１８を操作して、各光路を通過する超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の対物レンズ７による合焦位置を光軸方向に調節しておく。そして、ステージ３上に試料Ａを固定する。

この状態で、２つのレーザ光源１１，２４を作動させて超短パルスレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を出射させ、コントローラ３２を作動させて、音響光学素子１５，１６、スキャナ２１，３０およびステージ３を制御する。
具体的には、コントローラ３２は、観察用照明装置４の音響光学素子２７を開状態とし、スキャナ３０を作動させることにより、第２のレーザ光源２４から出射された超短パルスレーザ光Ｌ_２を試料Ａに配置された対物レンズ７の焦点面上において２次元的に走査させる。

超短パルスレーザ光Ｌ_２はプリチャーパ２５により光学系全体の群速度分散を補償された後、ビーム整形光学系２６により音響光学素子２７の有効範囲内に漏れなく入射可能な光束径に絞られた状態で音響光学素子２７を通過させられる。そして、光束径調節手段２８により、所望の光束径に変換された後、スキャナ３０によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ３１を介してビームスプリッタ５により反射され、結像レンズ６および対物レンズ７により集光され、試料Ａに照射される。

試料Ａにおいては、超短パルスレーザ光Ｌ_２の集光位置において多光子励起効果が発生し、多光子蛍光が発せられる。発生した多光子蛍光は、対物レンズ７および結像レンズ６を介して同一光路を戻る途中で、ダイクロイックミラー８により反射されて、集光レンズ１０により集光された後に光検出器９により検出される。光検出器９における多光子蛍光の強度信号とスキャナ３０による超短パルスレーザ光Ｌ_２の走査位置情報とを対応づけて記憶しておくことにより、対物レンズ７の焦点面に沿う極めて薄い領域の鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。

また、コントローラ３２は、光刺激用照明装置１のスキャナ２１を作動させて光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の照射位置を設定した状態で、音響光学素子１５，１６を開状態とすることにより、第１のレーザ光源１１から発せられた超短パルスレーザ光Ｌ_１を分岐した超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を試料Ａに照射させる。これにより、スキャナ２１によって設定された光軸に交差する方向の所定の位置、および、合焦位置調節手段１８により設定された光軸方向の所定の位置に、光束径調節手段１７により設定された所定の光束径の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２が合焦されて、試料Ａの特定部位に光刺激を与えることができる。

この場合において、本実施形態によれば、光刺激用照明装置１において刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１の光路が２つに分岐され、それぞれの光路に設けられた光束径調節手段１７により別個の光束径を有する超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を試料Ａに合焦させることができる。図中破線で示されるように光束径の大きな超短パルスレーザ光Ｌ_１１は、大きな開口数をなして試料Ａに照射されるので、合焦位置においては極めて小さい合焦半径を有し、微小領域の刺激を行うことができる。また、図中実線で示されるように、光束径の小さな超短パルスレーザ光Ｌ_１２は、小さな開口数をなして試料Ａに照射され、合焦位置においては比較的大きな合焦半径を有している。このため、比較的広い領域を一度に刺激することができる。

また、実線で示される超短パルスレーザ光Ｌ_１２はλ／２板を通過させられることにより、その偏光方向を９０°回転させられる。したがって、偏光ビームスプリッタ２０において全て反射される。一方、破線で示される超短パルスレーザ光Ｌ_１１は、偏光ビームスプリッタ２０を全て透過する。これにより、光束径の異なる２つの超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の２つの光路が、効率よく合成されることになる。

この場合において、本実施形態によれば、コントローラ３２が、各光路に設けられている音響光学素子１５，１６を択一的にオンオフさせるだけで、超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の合焦半径を切り替えて試料Ａに照射することができ、光学系を移動させる従来のものと比較すると、瞬時に切り替えることができるという利点がある。

特に、例えば、図２に示される脳の神経細胞のような場合に、異なる光束径の光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の照射位置Ａ_１，Ａ_２が試料Ａの深さ方向にのみ異なる場合には、スキャナ２１を作動させることなく、各光路に設けられた合焦位置調節手段１８により、合焦位置を予め設定しておくだけで済む。また、異なる光束径の光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の照射位置が光軸に交差する方向にも異なる場合には、各光路に設けられた合焦位置調節手段１８により、合焦位置を予め設定しておき、スキャナ２１を作動させるだけで、瞬時に切り替えることができる。

また、試料Ａの観察中に、深さ方向に異なる位置に光刺激を与えたい場合には、コントローラ３２は、図３に示されるように、ステージ３を作動させることにより、試料Ａを上下方向に移動させることができる。ステージ３は圧電素子により微動するだけで済むので、試料Ａの移動を瞬時に行うことができ、光学系を移動させる従来のものと比較すると、光刺激を与える深さ方向位置を瞬時に切り替えることができる。

これらの場合において、コントローラ３２は、音響光学素子１５，１６、スキャナ２１，３０およびステージ３を同期させて作動させる必要がある。すなわち、２つの光路を通過してきた光束径の異なる２つの超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射する場合、単一のスキャナ２１によって位置調整を行うので、深さ方向のみ異なる同一位置に照射する場合を除き、択一的に照射する必要がある。したがって、一方の音響光学素子１５（１６）を開状態としたときには他方の音響光学素子１６（１５）を閉状態として、一方の超短パルスレーザ光Ｌ_１１（Ｌ_１２）のみを試料Ａに照射させる。

また、開状態とされた音響光学素子１５（１６）に応じて、当該音響光学素子１５（１６）を通過した超短パルスレーザ光Ｌ_１１（Ｌ_１２）が所望の照射位置に照射されるように、スキャナ２１およびステージ３を同期して作動させる。これにより、２つの光路を通過してきた光束径の異なる２つの超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を、光軸方向および／または光軸に交差する方向に異なる２以上の位置で合焦させることができる。

さらに、観察用照明装置４から発せられる超短パルスレーザ光Ｌ_２の試料Ａにおける走査平面に対し、光刺激用照明装置１による光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の深さ方向の照射位置が一義的に設定されていない場合、すなわち、ステージ３の作動により光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の深さ方向位置を変更する場合には、観察用照明装置４の音響光学素子２７と光刺激用照明装置１の音響光学素子１５，１６とを択一的に開閉する。これは、光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の深さ位置を変更するためにステージ３を上下に移動したときに、観察用照明装置４による超短パルスレーザ光Ｌ_２の照射位置がずれて、異なる深さの多光子蛍光画像が取得されてしまうのを防止するためである。

このように、本実施形態に係る照明装置１およびレーザ走査型顕微鏡２によれば、刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１を２つの光路に分岐して、それぞれの光路を通過する超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の光束径を個別に調節できる。したがって、音響光学素子１５，１６により瞬時に択一的に切り替えて、あるいは同時に、光束径の異なる超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２により試料Ａに光刺激を与えることができるという利点がある。その結果、試料Ａの早い反応を逃すことなく観察することができるという利点がある。

また、本実施形態に係る照明装置１およびレーザ走査型顕微鏡２によれば、各光路に設けた合焦位置調節手段１８により、２つの光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２および観察用の超短パルスレーザ光Ｌ_２の合焦位置を予め個別に設定できる。したがって、音響光学素子１５，１６，２７の切替だけで、あるいは、スキャナ２１，３０を同期して作動させるだけで、複数の光束径を有する光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２により試料Ａの特定部位に光刺激を与えつつ、観察を行うことができる。

なお、本実施形態においては、観察用照明装置４により単一の観察平面を照明中に、異なる深さ位置に光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射する場合について説明したが、これに代えて、観察用照明装置４により照明する観察平面を変化させながら、同一あるいは異なる深さ位置に光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射する場合に適用することとしてもよい。
この場合には、図４に示されるように、観察平面を変更するためにステージ３位置を切り替えても、光刺激用照明装置１による光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射する際には、ステージ３を同一の高さ位置に配置するように移動させることとすればよい。

これにより、同一深さ位置に光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射しながら異なる観察平面の多光子励起画像を取得して３次元的な観察を行うことが可能となる。また、ステージ３の移動量を調節することにより異なる深さ位置に光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を照射しながら３次元的な観察を行うことができる。

また、本実施形態に係る照明装置１およびレーザ走査型顕微鏡２においては、超短パルスレーザ光Ｌ_２を照射する多光子励起型のレーザ走査型顕微鏡２について説明したが、これに限定されるものではなく、例えば、図５に示されるように、共焦点型のレーザ走査型顕微鏡２′に適用することとしてもよい。

図５に示される例では、第２のレーザ光源４１から発せられたレーザ光Ｌ_３がビーム整形光学系２６により光束径を絞られた状態で音響光学素子２７を透過し、光束径調節手段２８および合焦位置調節手段２９を介して、光束径および合焦位置を調節された後にスキャナ３０により２次元的に走査される。そして、瞳投影レンズ３１により集光された後、結像レンズ６および対物レンズ７を介して試料Ａに照射される。

試料Ａのレーザ光Ｌ_３の集光位置において発生した蛍光は、対物レンズ７、結像レンズ６、瞳投影レンズ３１およびスキャナ３０を介して同一光路を戻る途中でダイクロイックミラー４２により分岐されて、集光レンズ４３により集光され、共焦点ピンホール４４を通過して光検出器４５により検出される。スキャナ３０によるレーザ光Ｌ_３の走査位置と光検出器４５により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な共焦点蛍光画像を取得することができる。

この場合においても、コントローラ３２の作動により音響光学素子１５，１６，２７、スキャナ２１，３０およびステージ３を同期制御することにより、光束径の異なる２つの超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２を瞬時に切り替えて、試料Ａの異なる位置および範囲に光刺激を与えながら、共焦点蛍光画像を取得することができる。

なお、図５には、結像レンズ６を透過して戻る蛍光をレーザ光Ｌ_３から分岐するダイクロイックミラー８と、集光レンズ１０と、分岐された蛍光を検出する光検出器９とが設けられているが、これは、光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２の照射により、試料Ａにおいて発生する多光子蛍光を検出する場合に使用するものである。この場合には、観察用照明装置４０からのレーザ光Ｌ_３による蛍光の他に、光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１１，Ｌ_１２による多光子蛍光を検出して多光子蛍光画像を取得することが可能となる。

また、本実施形態においては、光路を瞬時に切り替えるためのシャッタ手段として音響光学素子１５，１６，２７を採用したが、これに代えて、メカニカルシャッタを採用することとしてもよい。また、本実施形態においては、光刺激用の超短パルスレーザ光Ｌ_１を２つの光路に分岐する場合について説明したが、これに代えて、３以上の複数の光路に分岐することとしてもよい。

本発明の一実施形態に係る照明装置およびレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡により観察する試料の一例を示す図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡における音響光学素子、スキャナおよびステージの動作の一例を示すタイミングチャートである。 図１のレーザ走査型顕微鏡における音響光学素子、スキャナおよびステージの動作の他の例を示すタイミングチャートである。 図１の照明装置およびレーザ走査型顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 試料
Ｌ_１１，Ｌ_１２ 超短パルスレーザ光（レーザ光）
Ｌ_２ 超短パルスレーザ光（観察用照明光）
Ｌ_３ レーザ光（観察用照明光）
１，４０ 光刺激用照明装置（照明装置）
２，２′ レーザ走査型顕微鏡
３ ステージ（移動手段）
５ ビームスプリッタ（第２の光路合成手段）
７ 対物レンズ
１５，１６，２７ 音響光学素子（シャッタ手段）
１７，２８ 光束径調節手段
１８，２９ 合焦位置調節手段
２０ 偏光ビームスプリッタ（光路合成手段）
２１ スキャナ（光束位置調節手段）
２２ 瞳投影レンズ（集光手段）
２４，４１ 第２のレーザ光源（観察用照明光源）
３０ スキャナ（光走査手段）
３２ コントローラ（制御手段）
４５ 光検出器（光検出手段）

Claims (11)

1. 光束径の異なる複数のレーザ光の光路を合成する光路合成手段と、
   該光路合成手段により光路を合成されたレーザ光の光軸に交差する方向の光束位置を調節する光束位置調節手段と、
   該光束位置調節手段により位置調節されたレーザ光を試料に集光させる集光手段とを備え、
   光束径が小さい方のレーザ光を、光束径が大きい方のレーザ光の開口数よりも小さな開口数をなして試料に照射することにより、合焦位置において前記光束径が大きい方のレーザ光よりも広い領域に照射する照明装置。
2. 光路合成手段により合成される前の複数の光路に設けられ、各光路を個別に開閉するシャッタ手段と、
   該シャッタ手段と前記光束位置調節手段とを同期して作動させることにより、前記光束径の異なる複数のレーザ光を、試料上の光軸に交差する方向の異なる位置に切り替えて照射させる制御手段とを備える請求項１に記載の照明装置。
3. 前記光路合成手段により合成される前の複数の光路に、各光路におけるレーザ光の光束径を調節する光束径調節手段が備えられている請求項１または請求項２に記載の照明装置。
4. 光路合成手段により合成される前の複数の光路に設けられ、各光路を個別に開閉するシャッタ手段と、
   該シャッタ手段と前記光束位置調節手段とを同期して作動させることにより、前記光束径の異なる複数のレーザ光を、試料上の光軸に交差する方向の異なる位置に切り替えて照射させる制御手段とを備え、
   前記光路合成手段により合成される前の複数の光路に、各光路におけるレーザ光の光束径を調節する光束径調節手段が備えられている請求項１に記載の照明装置。
5. 前記試料を光軸方向に移動させる移動手段を備え、
   前記制御手段が、前記シャッタ手段、前記光束位置調節手段および前記移動手段を同期して作動させる請求項２から請求項４のいずれかに記載の照明装置。
6. 前記レーザ光が超短パルスレーザ光からなる請求項１から請求項５のいずれかに記載の
   照明装置。
7. 前記光路合成手段により合成される前の複数の光路に、各光路におけるレーザ光の合焦位置を調節する合焦位置調節手段が備えられている請求項１から請求項６のいずれかに記
   載の照明装置。
8. 単一のレーザ光源からのレーザ光を前記複数のレーザ光に分岐する分岐手段を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の照明装置。
9. 請求項１から請求項８のいずれかに記載の照明装置を備え、
   前記光路合成手段により合成される前の複数の光路のいずれかに、集光手段および光束位置調節手段を介して戻る試料からの光を検出する光検出手段が備えられているレーザ走査型顕微鏡。
10. 請求項１から請求項８のいずれかに記載の照明装置と、
    観察用照明光源と、
    該観察用照明光源から発せられた観察用照明光を光軸に交差する方向に走査する光走査手段と、
    該光走査手段により走査された観察用照明光の光路と、前記照明装置から出射されたレーザ光の光路とを合成する第２の光路合成手段と、
    該第２の光路合成手段により合成された観察用照明光および／またはレーザ光を試料に
    照射し、試料において発生した観察光を集光する対物レンズと、
    該対物レンズ、前記第２の光路合成手段および光走査手段を介して同一光路を戻る観察
    光を検出する光検出手段とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
11. 請求項１から請求項８のいずれかに記載の照明装置と、
    超短パルスレーザ光を出射する観察用照明光源と、
    該観察用照明光源から発せられた超短パルスレーザ光を光軸に交差する方向に走査する光走査手段と、
    該光走査手段により走査された超短パルスレーザ光の光路と、前記照明装置から出射されたレーザ光の光路とを合成する第２の光路合成手段と、
    該第２の光路合成手段により合成された超短パルスレーザ光および／またはレーザ光を
    試料に照射し、試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
    該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出手段とを備えるレーザ走査型顕微鏡。

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