JP4722464B2 - 全反射蛍光照明装置 - Google Patents

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡によるコンフォーカル画像（ＬＳＭ画像）と蛍光顕微鏡による全反射蛍光画像（エバネッセント蛍光画像）を選択的に取得できる顕微鏡装置に付加される全反射蛍光照明装置に関するものである。

最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっている。これら生体細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するものとして、細胞膜およびその近傍からのエバネッセント蛍光画像を取得する蛍光顕微鏡が注目されるようになっている。

このようなエバネッセント照明を採用したものとして、例えば、特許文献１に開示された全反射蛍光観察と通常の蛍光観察の切換えを可能とした照明切換装置が知られている。

図２は、このような照明切換装置の概略構成を示すもので、２台のレーザ光源２０１、２０２は出射端に、液晶シャッタ、またはＡＯＴＦなどに代表される電気的シャッタ２０３，２０４を設け、これら電気的シャッタ２０３、２０４を全反射蛍光観察と通常の蛍光観察を切換えるためのシャッタコントローラ２０５によって開閉制御するようにしている。電気的シャッタ２０３には光ファィバ２０６が接続され、電気的シャッタ２０４には光ファイバ２０７が接続されている。

光ファィバ２０６が構成する第１光伝送部の光軸Ｏ′上には、照明光学系であるコリメートレンズ２０９、視野絞り２１０、集光レンズ２１１が設けられ、観察光路との交点にはダイクロイックミラー２１２が設けられ、また、ダイクロイックミラー２１２で折り返された光軸は、観察光路の光軸Ｏと一致しており、観察光路上には対物レンズ２１３が配置され、対物レンズ２１３の先には、標本２１４を載置したカバーガラス２１５が配置されている。これにより、第１光伝送部から発せられたレーザ光は、コリメートレンズ２０９、集光レンズ２１１の作用によって対物レンズ２１３の瞳面中心にレーザスポットを結び、対物レンズ２１３を出射するレーザ光は標本２１４を通常の蛍光観察照明で照明する。

また、光ファイバ２０７は、平行移動可能な全反射マイクロプリズム２０８と組合せることで第２光伝送部を構成しており、この第２光伝送部から発せられたレーザ光は、コリメートレンズ２０９、集光レンズ２１１の作用によって対物レンズ２１３の瞳面中心から規定量離れた位置（全反射マイクロプリズム２０８の位置によって決まる位置）にレーザスポットを結び、対物レンズ２１３を出射するレーザ光は、標本２１４に臨界角以上で入射するため全反射蛍光観察照明となる。

一方、特許文献２に開示されたようにコンフォーカル画像（ＬＳＭ画像）と全反射蛍光画像（エバネッセント画像）を選択的に取得できる顕微鏡装置も知られている。

図３は、このような顕微鏡装置の概略構成を示すもので、光源３００は、レーザ光源３０１、集光レンズ３０２、光ファイバ３０３から構成され、レーザ光源３０１から発せられた光を光ファイバ３０３を介してスキャンユニット３１０に導くようになっている。スキャンユニット３１０は、コリメートレンズ３１１、ダイクロイックミラー３１２と、これらが構成する透過光路上に配置されるガルバノミラーなどのスキャナ３１３、さらにダイクロイックミラー３１２の反射光路上に配置される吸収フィルタ３１４、コンフォーカルピンホール３１５、集光レンズ３１６、ホトマルなどの受光素子３１７を有し、スキャナ３１３により標本３２５上にレーザ光（励起光）を２次元走査し、標本３２５から発せられる微弱な蛍光を受光素子３１７で検出するようになっている。また、スキャナ３１３で偏向されるレーザ光の光路上に、結像レンズ３２１、対物レンズ３２２、および顕微鏡本体３２３のステージ３２４上の標本３２５が配置され、さらに、スキャナ３１３と対物レンズ３２２の間に、レンズ収納手段３３０が設けられている。レンズ収納手段３３０には、第１投影光学系として瞳投影レンズ３３１と、第２投影光学系として対物像投影レンズ群３３２とダイクロイックミラー３３３がスキャナ３１３で偏向されるレーザ光の光路上に切換え可能に配置され、光路上に第１投影光学系を挿入すると通常の蛍光照明（ＬＳＭ照明）、第２投影光学系を挿入すると全反射蛍光照明（エバネッセント照明）となるようにしている。そして，全反射蛍光照明の場合、標本３２５から発せられた蛍光は最終的に高感度ＣＣＤカメラ３４０で受光され、画像を構築する。
特開２００４−２９５１２２号公報 特開２００３−３０７６８２号公報

しかしながら、特許文献１に開示されるものは、最初に視野絞り２１０を全開にし、通常の蛍光照明、もしくは全反射蛍光照明を用いて標本全体を観察して標本２１４の全体像を捕らえ、その後に、標本２１４上の観察を行いたい細部のみに照明光を当てるために視野絞り２１０の位置、および開口径の大きさを調整して、標本２１４上の細部を観察するといった手順を踏む必要がある。ところが，一般的に蛍光標本は、照射時間に比例して退色が進んでしまうため、これらの一連の人為的な作業を短時間にかつ正確に行わなければならず、仮に、この作業に失敗してしまうと、標本の褪色が進んでしまい、最悪の場合には標本が使い物にならなくなってしまうという問題を生じる。

また、特許文献２に開示されたものは、光ファイバ３０３から出射するレーザビームのＮＡとスキャンユニット３１０内のコリメートレンズ３１１の焦点位置が一定であるため、スキャナ３１３に入射するビーム径を可変できない。全反射蛍光観察の場合、照野は対物レンズ３２２の瞳面に集光するスポットのＮＡと対物レンズ３２２の焦点距離から決まる、言い換えれば、レーザ光の光束径と対物レンズ３２２の倍率によって照野の大きさが決まるため、視野絞りを設けていない特許文献２のものは、同一の対物レンズ３２２を使用した状態で照野の大きさを可変させたり、照明範囲の単位面積あたりの光密度を可変させたりすることは不可能であった。

さらに、蛍光の褪色を利用して細胞内のものの動きを観察するための手法であるＦＬＩＰやＦＲＡＰなどの場合は、瞬間的に標本上のある領域のみを褪色させる必要があり、一般的に高出力のレーザ光源などを組合わせて強力な励起光を確保するという手段を講じる。しかし、高出力のレーザ光源はサイズが大きく、高価であり、かつ消費電力が大きいといったことから、装置がコンパクトに構成できない、安価な装置として提供できない、ランニングコストが高いといった問題を有している。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、取得画像から任意の指定領域にのみ全反射蛍光照明光を速やかに照射可能で、かつ照射光の強度を任意に可変できる顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様による全反射蛍光照明装置は、レーザ光を対物レンズの瞳面に集光し、標本を全反射蛍光照明することが可能であって、モニタに接続された顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置において、前記レーザ光の照射を停止した後に、前記モニタ上に映し出された標本像上で、照明する領域の大きさ、および位置を指定する照明領域指定手段と、前記照明領域指定手段により指定された照明領域にのみ照明光を照射するための照明領域制御手段と、を有したことを特徴としている。

本発明の第２の態様による全反射蛍光照明装置は、レーザ光を、対物レンズの瞳面上であって光軸外の所定位置に集光し、標本を全反射蛍光照明することが可能な顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置において、前記対物レンズの瞳面に集光する光のＮＡを可変する第１の光学手段と、前記対物レンズの瞳面上の前記所定位置に入射する光の光軸を傾ける第２の光学手段と、を具備し、前記第２の光学手段が操作されることによって、前記対物レンズの瞳面に入射する光の光軸が傾けられ、全反射蛍光照明される前記標本の照明領域の位置が、光軸に対して垂直な面内で移動することを特徴としている。

本発明によれば、取得画像から任意の指定領域にのみ全反射蛍光照明光を速やかに照射可能で、かつ照射光の強度を任意に可変できる顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置を提供できる。

以下、本発明の一実施の形態を図面に従い説明する。

図１は、本発明の一実施の形態にかかる全反射蛍光照明装置の概略構成を示している。なお、図１は、本発明の全反射蛍光照明装置を倒立型顕微鏡装置に適用した例を示している。

図において、１１はレーザ光源で、このレーザ光源１１から発せられるレーザビーム（レーザ光）の光路上には、集光レンズ１２が配置され、この集光レンズ１２の焦点位置に光ファイバ１３の入射端１３ａが配置されている。集光レンズ１２は、レーザ光源１１からのレーザビームを集光して光ファイバ１３の入射端１３ａに入射する。

光ファイバ１３の出射端１３ｂから出射されるレーザビームの光路上には、照明領域制御手段を構成するコリメートレンズユニット１４が配置されている。コリメートレンズユニット１４は、光ファイバ１３の出射端１３ｂから出射されるレーザビームの光路上に沿ってコリメートレンズ１４ａ、第１の光学手段としてのアフォーカルズームレンズ１４ｂ、第２の光学手段としてのビームシフタ１４ｃが配置されている。コリメートレンズ１４ａは、光ファイバ１３から出射されるレーザビームを平行光とするものである。アフォーカルズームレンズ１４ｂは、コリメートレンズ１４ａと光軸をともにする最低２枚のレンズを有するズーム光学系から構成されるもので、これらレンズを図示ａの光軸方向に移動させることで、後述する対物レンズ５の瞳面５ａに集光するレーザビームのＮＡを可変可能にしている。ビームシフタ１４ｃは、１枚以上の平行平面板ガラスからなるもので、光軸を中心に図示ｂ、ｃ方向に動かすことで、アフォーカルズームレンズ１４ｂ以降の光軸を２次元方向に移動可能にし、対物レンズ５の瞳面５ａに集光するレーザビームの光軸を瞳面５ａの法線に対して傾けることを可能としている。

コリメートレンズユニット１４は、スキャンユニット２０に取付けられている。スキャンユニット２０は、コリメートレンズユニット１４から出射されるレーザビームの光路上に、ダイクロイックミラー２１が配置されている。ダイクロイックミラー２１は、コリメートレンズユニット１４からのレーザビームを励起光として反射し、後述する標本Ｓからの蛍光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー２１のレーザ光源１１側から見たレーザビームの反射光路上には、ガルバノミラーユニット２２と瞳投影レンズ２３と結像レンズ２４とが配置されている。ガルバノミラーユニット２２は、平面内の光を２次元方向（ＸＹ方向）に走査するためのもので、回転可能な不図示の２個のガルバノミラーを有している。また、この場合のガルバノミラーユニット２２は、レーザビームを１次元方向にのみ偏向できるようにもなっている。

ダイクロイックミラー２１の標本Ｓ側から見た透過光路上には焦点検出手段を構成する共焦点レンズ２５と共焦点ピンホール２６が配置されている。共焦点ピンホール２６は、共焦点レンズ２５の焦点位置に配置され、不図示の電動機構により開口径を可変可能な構成となっている。共焦点ピンホール２６の通過光路上には、ダイクロイックミラー２７が配置されている。ダイクロイックミラー２７は、波長毎に光路を分岐するもので、一方の波長を反射し、他方の波長を透過させる特性を有したものが用いられている。

ダイクロイックミラー２７の反射光路上には、バリアフィルタ２８ａと、ホトマルなどに代表される微弱な光を検出するための検出器２９ａが配置され、また、透過光路には、バリアフィルタ２８ｂと、ホトマルなどに代表される微弱な光を検出するための検出器２９ｂが配置されている。

瞳投影レンズ２３と結像レンズ２４の間の光路上には、照明方法切換装置３０が配置されている。この照明方法切換装置３０は、後述する全反射照明光学系４０に光を導くためのミラーキューブ３１が光路上に装脱可能に設けられている。

照明方法切換装置３０のミラーキューブ３１の反射光路上には、全反射照明光学系４０が配置されている。全反射照明光学系４０は、ミラーキューブ３１の反射光路上にリレーレンズ４１ａ、折返しミラー群４２が配置され、折返しミラー群４２で折り返された光路上にリレーレンズ４１ｂと他の照明領域制御手段としての電動視野絞り４３が配置されている。これにより、ミラーキューブ３１から反射したレーザビームは、リレーレンズ４１ａを介して折返しミラー群４２に入射し、この折返しミラー群４２で折り返されたレーザビームは、リレーレンズ４１ｂ、電動視野絞り４３を介して再びミラーキューブ３１に入射するようになっている。ここで、リレーレンズ４１ａ、４１ｂは、瞳投影レンズ２３と結像レンズ２４を組合せることで、ガルバノミラーユニット２２の近接ガルバノ位置（ガルバノミラーの中間位置）を標本Ｓと共役位置関係にするものである。折返しミラー群４２は、不図示の駆動源を有する案内機構上で、リレーレンズ４１ａ、および４１ｂの光軸方向（図示ｄ方向）に移動可能になっている。電動視野絞り４３は、標本Ｓと共役な位置に配置されるとともに、不図示の駆動源により２次元方向に移動可能で、かつ開口径の大きさが可変できるようになっている。

スキャンユニット２０には、顕微鏡本体、ここでは倒立顕微鏡本体１が接続されている。そして、スキャンユニット２０の結像レンズ２４より出射されるレーザビームの光路上には、倒立顕微鏡本体１内のキューブカセット４が配置されている。キューブカセット４には、全反射ミラー４ａとダイクロイックミラー４ｂが格納されている。

これら全反射ミラー４ａとダイクロイックミラー４ｂは、選択的に光路に挿入されるものである。このうちの全反射ミラー４ａは、走査型レーザ顕微鏡観察の際に、光路に挿入されるもので（図面ではこの状態を示している。）、結像レンズ２４より出射されるレーザビームを標本Ｓ側に反射し、標本Ｓからの光を再びスキャンユニット２０側に反射するような特性を有している。ダイクロイックミラー４ｂは、全反射蛍光観察の際に、光路に挿入されるもので、結像レンズ２４より出射されるレーザビームを標本Ｓ側に反射し、標本Ｓからの光を透過するような特性を有している。

キューブカセット４の全反射ミラー４ａ（ダイクロイックミラー４ｂ）の反射光路には、対物レンズ５が配置されている。

対物レンズ５の集点位置には、蛍光標識された標本Ｓが配置されている。標本Ｓは、ステージ３上に配置された不図示のシャーレに貼り付けられたカバーガラス２に固定されている。この場合、シャーレ内には標本Ｓを保護するための液体、例えば水が満たされている。また、対物レンズ５とカバーガラス２の間には、エバネッセント照明を行うために全反射角度を大きくして高いＮＡでエバネッセント照明による蛍光観察を行なうとともに、走査型レーザ顕微鏡照明による蛍光観察を行なうために不図示のイマージョンオイルが充填されている。

キューブカセット４のダイクロイックミラー４ｂを透過した光路上には、光路折り返しミラー６が配置されている。また、光路折り返しミラー６で折り返された光路上には、結像レンズ７ａを内蔵する鏡筒７が配置されている。

鏡筒７上には、ＣＣＤカメラ８が設けられている。ＣＣＤカメラ８は、撮像面８ａを有し、この撮像面８ａが結像レンズ７ａの焦点に位置するように配置されている。

ＣＣＤカメラ８には、モニター９が接続されている。モニター９は、ＣＣＤカメラ８で撮像した画像を表示するようにしている。

５０は、制御手段としての照明領域制御装置で、この照明領域制御装置５０は、モニター９、レーザ光源１１、コリメートレンズユニット１４、ガルバノミラーユニット２２および全反射照明光学系４０と電気的に接続され、モニター９上で指定した領域のみに照明光を照射するためにコリメートレンズユニット１４内のアフォーカルズームレンズ１４ｂとビームシフタ１４ｃの制御、スキャンユニット２０内のガルバノミラーユニット２２の不図示のガルバノミラーの制御、全反射照明光学系４０内の電動視野絞り４３および折返しミラー群４２の制御などを行うものである。また、通常の全反射蛍光観察モード（以下、通常モード）とＦＬＩＰやＦＲＡＰなど光刺激を与えて観察するモード（以下、光刺激モード）の各モードを選択するためのスイッチ５１が用意されている。

次に、このように構成した実施の形態の作用を説明する。

まず、全反射蛍光照明による全反射蛍光観察を行う場合を説明する。

この場合、照明方法切換装置３０のミラーキューブ３１を光路上に配置し、また、キューブカセット４内のダイクロイックミラー４ｂを光路上に配置する。

この状態から、レーザ光源１１から励起光として作用するレーザビームが発せられると、レーザビームは、集光レンズ１２を透過して光ファイバ１３の入射端１３ａに入射される。入射端１３ａに入射されたレーザビームは、光ファイバ１３を透過し、光ファイバ１３の出射端１３ｂから発散光となってコリメートレンズユニット１４に導かれる。

コリメートレンズユニット１４に導かれたレーザビームは、コリメートレンズ１４ａで平行光に変換され、アフォーカルズームレンズ１４ｂ、およびビームシフタ１４ｃを透過する。このとき、レーザビームは、アフォーカルズームレンズ１４ｂで適当な大きさのビーム径に変換され、ビームシフタ１４ｃの角度に対応して光軸をシフトした状態になって、スキャンユニット２０に導かれる。

スキャンユニット２０内に導かれたレーザビームは、励起光としてダイクロイックミラー２１で反射した後、ガルバノミラーユニット２２に入射する。この場合、ガルバノミラーユニット２２は、全反射蛍光観察の際には、不図示のガルバノミラーを任意の角度で固定している。

ガルバノミラーユニット２２を出射したレーザビームは、瞳投影レンズ２３を透過し、照明方法切換装置３０に入射し、ミラーキューブ３１で反射し、全反射照明光学系４０に導かれる。

全反射照明光学系４０内に導かれたレーザビームは、リレーレンズ４１ａを透過した後、折返しミラー群４２で反射し、他のリレーレンズ４１ｂを透過し、電動視野絞り４３に入射する。この場合、折返しミラー群４２を、不図示の案内機構によりリレーレンズ４１ａ（４１ｂ）の光軸方向に移動させることで、標本Ｓとガルバノミラーユニット２２が共役な位置関係となるように調整し、レーザビームのスポットが、常に対物レンズ５の瞳面５ａに正しく結ぶようにしている。また、電動視野絞り４３は、全開の状態に設定されている。

電動視野絞り４３を通過した光は、再び、照明方法切換装置３０内のミラーキューブ３１で反射されて、瞳投影レンズ２３と結像レンズ２４を結ぶ光軸上に戻され、結像レンズ２４を透過し、キューブカセット４に導かれる。

キューブカセット４では、ダイクロイックミラー４ｂが光路上に配置されているので、キューブカセット４に導かれレーザビームは、ダイクロイックミラー４ｂで反射し、対物レンズ５の瞳面５ａの周辺付近に集光される。

対物レンズ５の瞳面５ａに集光したレーザビームは、対物レンズ５から平行光として出射され、所定の角度で斜め方向からカバーガラス２の標本側界面に照射される。この角度は、レーザビームが標本側界面で全反射を起こす角度に設定されている。この時、レーザビームのごく一部がカバーガラス２の標本側界面から標本Ｓ側へにじみ出す。この境界からにじみ出た光がエバネッセント光で、標本Ｓの深さ方向へにじみ出す量は光源の波長程度となる。

これにより、標本Ｓは、カバーガラス２の標本側界面の数１００ｎｍ以下の僅かな領域に染み出したエバネッセント光で励起され、蛍光を発する。

標本Ｓから発せられた蛍光は、対物レンズ５で取り込まれた後、キューブカセット４内のダイクロイックミラー４ｂを透過し、光路折返しミラー６で反射し、結像レンズ７ａを介してＣＣＤカメラ８の撮像面８ａ上に標本Ｓの像として結像する。この像は、ＣＣＤカメラ８によって光電変換されて、モニター９上に映し出される。

照明領域制御装置５０は、モニター９上に映し出された標本Ｓの全体像の取り込みを行い、取り込みが完了し次第、レーザ光源１１を制御してレーザビームの出射を停止する。

次に、通常モードで使用する場合を説明する。

この場合、照明領域制御装置５０のスイッチ５１を通常モードにセットする。次に、モニター９上に映し出された標本Ｓの全体像から観察を行いたい範囲を指定する。この場合、モニター９上で指定領域をマークし、マーク領域のピクセル座標から、マーク領域の中心座標と、マーク領域に外接する円の大きさを読み出す。次に、マーク領域中心のピクセル座標を電動視野絞り４３の位置情報に変換し、マーク領域に外接する円の大きさを電動視野絞り４３の開口径の大きさ情報に変換する。そして、これらの情報により電動視野絞り４３を制御し、選択領域の中心と電動視野絞り４３の中心が共役な関係となるように電動視野絞り４３の位置を自動調整するとともに、指定範囲のみを照明できるサイズに電動視野絞り４３の開口径の大きさを設定する。

この状態で、再びレーザ光源１１からレーザビームを発生すると、上述したと同様に対物レンズ５を介して標本Ｓが全反射蛍光照明されるようになるが、この場合、モニター９上の選択領域に対応して電動視野絞り４３の位置と開口径の大きさが設定されているので、指定領域に対応する標本Ｓ上のみが全反射蛍光照明され、指定領域からの蛍光が結像レンズ７ａを介してＣＣＤカメラ８で撮像され、モニター９に表示されるようになる。

なお、このような全反射蛍光観察において、対物レンズ５を異なる倍率のものに切換えた場合、瞳面５ａの位置が動いてしまうことがある。このような場合は、折返しミラー群４２を、リレーレンズ４１ａ（４１ｂ）の光軸方向に移動して光路長を可変させて、レーザビームのスポットが、対物レンズ５の瞳面５ａに正しく結ぶように調整する。

また、上述では、ガルバノミラーユニット２２の不図示のガルバノミラーを任意の角度で固定した場合を述べているが、ガルバノミラーの角度を変更してレーザビームの１次元の偏向方向を調整し、対物レンズ５からカバーガラス２の標本側界面に入射するレーザビームの角度を可変することにより、全反射蛍光照明範囲を深さ方向に可変することができる。

次に、光刺激モードを使用する場合を説明する。

この場合、照明領域制御装置５０のスイッチ５１を光刺激モードにセットする。

次に、モニター９上に映し出された標本Ｓの全体像から光刺激を与えたい範囲を指定する。この場合、コリメートレンズユニット１４内のビームシフタ１４ｃにより光軸を２次元方向に移動し、レーザビームの強度中心を指定領域の中心に一致させるように調整し、アフォーカルズームレンズ１４ｂにより対物レンズ５の瞳面５ａに集光するレーザビームのＮＡを可変してレーザビームにより選択範囲のみを照明できるように調整する。

この状態で、レーザ光源１１からレーザビームが発生すると、上述したと同様に対物レンズ５を介して標本Ｓが全反射蛍光照明されるようになるが、この場合、光刺激を与えたい指定範囲に対応してビームシフタ１４ｃによる光軸調整と、アフォーカルズームレンズ１４ｂによるレーザビームのＮＡ調整が行われているので、指定領域に対応する標本Ｓ上のみが全反射蛍光照明（光刺激）されるようになる。この場合、照明領域の大小に関わらず光ファイバ１３から導入されるレーザビームの全光量が標本Ｓに照射されるので、標本Ｓの極部分（小さな領域）を強い強度で照射できる。

その後、モニター９上で標本Ｓの全体像が観察できる状態にビームシフタ１４ｃとアフォーカルズームレンズ１４ｂの設定を戻し、さらに標本Ｓ全体に全反射蛍光照明を行った画像を取得すると、光刺激に対応する反応の様子を観察することができる。

ところで、生体細胞の機能解析では、上述した細胞全体の観察の他に、さらに細胞内の１分子の観察を行なうような場合がある。このような場合は、コリメートレンズユニット１４内のビームシフタ１４ｃにより光軸を２次元方向に移動させ、レーザビームの強度中心を観察対象位置に一致させるように調整し、この状態で、アフォーカルズームレンズ１４ｂにより対物レンズ５の瞳面５ａに集光するレーザビームのＮＡを可変して照明領域を絞り込む。

このようにすると、照明領域を絞り込まれた標本Ｓ上の観察対象位置の光の照明密度を著しく上昇させ、微小領域を高い強度で照明できるので、細胞内の１分子の観察を行なうことができる。この他にも、ズーム光学系を使って光密度を上げる場合、光刺激だけでなく、より明るい全反射蛍光観察像を取得したい場合に使用できる。 次に、走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光観察を行う場合を説明する。

この場合、照明方法切換装置３０内のミラーキューブ３１が光路から退避させ、また、キューブカセット４内の全反射ミラー４ａを光路上に配置する。

この状態から、レーザ光源１１からレーザビームが発せられると、このレーザビームは、集光レンズ１２を透過して光ファイバ１３の入射端１３ａに入射し、光ファイバ１３を透過して、出射端１３ｂから発散光となってコリメートレンズユニット１４に導かれる。

コリメートレンズユニット１４に導かれたレーザビームは、コリメートレンズ１４ａで平行光に変換され、アフォーカルズームレンズ１４ｂ、およびビームシフタ１４ｃを透過し、ガルバノミラーユニット２２に入射する。スキャンユニット２０内に導かれたレーザビームは、ダイクロイックミラー２１で反射し、ガルバノミラーユニット２２に入射し、平面内で２次元走査され、瞳投影レンズ２３、結像レンズ２４を透過し、全反射ミラー４ａで反射して、対物レンズ５を介して標本Ｓに照射される。

標本Ｓから発せられた蛍光は、対物レンズ５で取り込まれた後、キューブカセット４内の全反射ミラー４ａで反射し、結像レンズ２４、瞳投影レンズ２３、ガルバノミラーユニット２２を介して、ダイクロイックミラー２１に導かれる。そして、ダイクロイックミラー２１を透過した後、共焦点レンズ２５によって、共焦点ピンホール２６上に集光し、対物レンズ５の焦点面から発せられた蛍光のみが共焦点ピンホール２６を通過する。共焦点ピンホール２６を通過した蛍光は、ダイクロイックミラー２７で２光路に分岐され、ダイクロイックミラー２７を透過した蛍光は、バリアフィルタ２８ａで標本Ｓ表面で反射した励起光が遮断されて検出器２９ａで受光され、また、ダイクロイックミラー２７を反射した蛍光は、バリアフィルタ２８ｂで標本Ｓ表面で反射した励起光が遮断されて検出器２９ｂで受光される。そして、これら検出器２９ａ，２９ｂに受光された蛍光は、受光光量に応じた電気信号に光電変換され、不図示の画像処理装置に転送される。画像処理装置では、連続的に転送されるこれら電気信号から、走査型レーザ顕微鏡照明による標本Ｓの共焦点蛍光画像を構築する。

従って、このようにすれば、レーザビームを対物レンズ５の瞳面５ａに集光させ、標本Ｓを全反射蛍光照明した状態で、一旦標本Ｓの全体像を取得し、全体像取得が完了したら、レーザビームの照射を停止し、先に取得した標本Ｓの全体像上で観察および測定を行いたい領域を指定し、この指定領域にのみ照明光を照射するために電動視野絞り４３により位置と開口径の大きさを決定し、その後、再びレーザビームを標本に照射するようになっており、標本Ｓ上で観察を行いたい範囲を指定すると、照明領域制御装置５０によって、指定領域に対応する電動視野絞り４３の位置および開口径の大きさが自動的に設定できるので、標本Ｓ上の所望する領域にのみ全反射蛍光照明を行う一連の作業が素早く行なうことができ、標本Ｓの蛍光の褪色を最小限に抑えることができる。

また、照明領域制御装置５０に設けられるスイッチ５１の切換えのみで、通常モードと光刺激モードを選択できるため、１台の装置で様々な観察方法に対応できるので、大きなフットプリントを必要としないため、顕微鏡システム全体がコンパクトに構成できる。

また、アフォーカルズームレンズ１４ｂを調整し、対物レンズ５の瞳面５ａに集光する光のＮＡを可変させることで、全反射蛍光照明の照野の大きさを変化させることができ、また、ビームシフタ１４ｃを調整し、対物レンズ５の瞳面５ａに入射する光の光軸を傾けることで、全反射蛍光照明の照野を平面内に移動させることができるようになっている。

光刺激モードや細胞内の１分子の観察の場合、これらアフォーカルズームレンズ１４ｂとビームシフタ１４ｃによって、全反射照明領域の大きさと中心位置を任意に調整することで、電動視野絞り４３の絞り中心の移動と、開口径を可変させるのと同じように照明領域を調整できる。さらに、視野絞り式と異なり、レーザ光源１１の出力を無駄にしないので、照明領域を小さくするにしたがって単位面積あたりの光密度を上昇させることが可能となるため、光刺激や画像のＳ／Ｎ比向上が可能になる。このことは、レーザ光源１１として高出力のレーザを使用する必要がないことでもあり、高出力のレーザは価格、およびランニングコストが高いのが一般的であるため、高出力のレーザを使う必要がないということは、維持費がかからず、かつ安価な装置が提供できるといった効果も発生する。

一方、アフォーカルズームレンズ１４ｂを可変させることなく、電動視野絞り４３の絞り中心の移動と開口径を可変させることで、対物レンズ５の瞳面５ａに集光する光のＮＡを可変させることなく全反射照明範囲を指定することができる。この場合、全反射照明範囲において、単位面積あたりの光密度を一定に保つことが可能である。従って、蛍光の褪色具合が照明範囲の大きさに依存しないため、大きさの違う複数の領域を定量的に観察することが可能になる。このことは、蛍光の発光量を元に測定を行うアプリケーションにおいては測定結果の信頼性が向上するといった効果もある。

さらに、走査型レーザ顕微鏡と視野絞り内蔵型の全反射蛍光照明装置を組合せることで、視野絞りの位置、および開口径の大きさにより平面方向の全反射照明範囲を、ガルバノミラーユニット２２でのガルバノミラーの角度を任意の位置で固定することで、全反射照明の深さ方向の全反射蛍光照明範囲を可変することができるので、コンパクトな装置に仕立てることができる。

さらに、電動視野絞り４３によって標本Ｓ上の指定領域のみ全反射蛍光照明を行うモードと、アフォーカルズームレンズ１４ｂおよびビームシフタ１４ｃを調整することによって標本Ｓ上の指定領域のみで全反射蛍光照明を行うモードを選択できるので、指定領域に照射する照明光の単位面積あたりの光密度を変化させることも可能となり、定量的な観察（測定）と定性的な観察（測定）の使い分けが容易に行える。

さらに、走査型レーザ顕微鏡照明による共焦点蛍光観察において、対物レンズ５の瞳径に対してレーザビーム径が小さい場合は、対物レンズ５によって標本Ｓ上に集光するレーザスポットが大きくなるため、ＬＳＭ画像の横分解能が劣化し、逆に、対物レンズ５の瞳径に対してレーザビーム径が大きい場合は、対物レンズ５内レーザビームのケラレが生じるため、レーザ光源１１の出力を十分に生かすことができないことがある。しかし、アフォーカルズームレンズ１４ｂによって対物レンズ５の瞳径とレーザビーム径を一致させるようにすることで、ＬＳＭ観察においてもこれらの問題を回避できるといった効果も生まれる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、必ずしもコリメートレンズユニット１４のビームシフタ１４ｃは必要ではなく、ステージ３を電動で動かす機構を採用し、標本Ｓの全体像から選択した領域に対し、照野を移動するのではなく、固定された照野中心に標本Ｓを移動する方式としてもよい。この場合、対物レンズ５の瞳面５ａに集光するレーザビームの光軸を瞳面５ａの法線に対して傾けることがないため、対物レンズ５内で励起光のケラレにくい構造となり、全反射蛍光照明領域の照野の欠けが発生しにくくなるといった効果が得られる。

また、必ずしもレーザ光源１１は、１本である必要はなく、波長の異なる複数本のレーザ、および複数のレーザ光軸を同軸化するレーザコンバイナと、１本の対物レンズで使用波長ごとに折返しミラー群４２の位置を複数箇所記憶できる全反射照明光学系４０とを組合せてもよい。この場合、対物レンズ５の収差の影響を排除できるため、各波長ごとに最適な全反射蛍光照明が実現できるといった効果も生まれる。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の一実施の形態にかかる全反射蛍光照明装置の概略構成を示す図。 従来の照明切換装置の一例の概略構成を示す図。 従来のＬＳＭ画像とエバネッセント画像を選択的に取得できる顕微鏡装置の概略構成を示す図。

符号の説明

１…倒立顕微鏡本体、２…カバーガラス
３…ステージ、４…キューブカセット
４ａ…全反射ミラー、４ｂ…ダイクロイックミラー
５…対物レンズ、５ａ…瞳面
５１１…先端レンズ、６…光路折り返しミラー
７…鏡筒、７ａ…結像レンズ
８…ＣＣＤカメラ、８ａ…撮像面
９…モニター、１１…レーザ光源
１２…集光レンズ、１３…光ファイバ
１３ａ…入射端、１３ｂ…出射端
１４…コリメートレンズユニット、１４ａ…コリメートレンズ
１４ｂ…アフォーカルズームレンズ、１４ｃ…ビームシフタ
２０…スキャンユニット、２１…ダイクロイックミラー
２２…ガルバノミラーユニット、２３…瞳投影レンズ
２４…結像レンズ、２５…共焦点レンズ
２６…共焦点ピンホール、２７…ダイクロイックミラー
２８ａ、２８ｂ…バリアフィルタ、２９ａ、２９ｂ…検出器
３０…照明方法切換装置、３１…ミラーキューブ
４０…全反射照明光学系、４１ａ．４１ｂ…リレーレンズ
４２…折返しミラー群、５０…照明領域制御装置、５１…スイッチ、

Claims (10)

1. レーザ光を対物レンズの瞳面に集光し、標本を全反射蛍光照明することが可能であって、モニタに接続された顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置において、
   前記レーザ光の照射を停止した後に、前記モニタ上に映し出された標本像上で、照明する領域の大きさ、および位置を指定する照明領域指定手段と、
   前記照明領域指定手段により指定された照明領域にのみ照明光を照射するための照明領域制御手段と、を有したことを特徴とする全反射蛍光照明装置。
2. 前記照明領域制御手段は、前記照明領域指定手段により指定された領域に合わせて視野絞りの大きさ、および位置を制御することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光照明装置。
3. 前記照明領域制御手段は、対物レンズの瞳面に集光する光のＮＡを可変するための第１の光学手段、および対物レンズの瞳面上の光軸外の所定位置に入射する光の光軸を傾けるための第２の光学手段であり、前記照明領域指定手段により指定された領域に合わせて前記第１の光学手段、および第２の光学手段を制御することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光照明装置。
4. 前記第１の光学手段は、ズーム光学系であることを特徴とする請求項３記載の全反射蛍光照明装置。
5. 前記第２の光学手段は、前記レーザ光を発する光源と、前記対物レンズと、の間の平行光束上に配置された、回転可能な平行平面ガラスであることを特徴とする請求項３記載の全反射蛍光照明装置。
6. 平面内の光を走査するためのガルバノミラーと、前記ガルバノミラーと標本を共役な位置関係とするためのリレー光学系と、共通光路上に光学素子を挿脱することで走査型レーザ顕微鏡観察と全反射蛍光照明観察を切換えることが可能な光路切換え手段を具備し、
   前記ガルバノミラーを任意の角度に固定することで深さ方向の全反射蛍光照明範囲を可変できることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の全反射蛍光照明装置。
7. 前記照明領域制御手段は、全反射蛍光照明観察時に照明範囲の単位面積あたりの光密度を一定にして照射領域を規定するモードと、光密度を上昇させ照射領域を規定するモードを選択可能にする手段を有していることを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光照明装置。
8. 平面内の光を走査するためのガルバノミラーと、
   前記ガルバノミラーと前記標本とを共役な位置関係とする為のリレー光学系と、
   共通光路上に光学素子を挿脱することで、走査型レーザ顕微鏡観察と全反射蛍光照明観察とを切換える光路切換え手段と、
   を具備し、
   前記視野絞りは、全反射蛍光照明観察光路に配置されていることを特徴とする請求項２に記載の全反射蛍光照明装置。
9. レーザ光を、対物レンズの瞳面上であって光軸外の所定位置に集光し、標本を全反射蛍光照明することが可能な顕微鏡に付加される全反射蛍光照明装置において、
   前記対物レンズの瞳面に集光する光のＮＡを可変する第１の光学手段と、
   前記対物レンズの瞳面上の前記所定位置に入射する光の光軸を傾ける第２の光学手段と、
   を具備し、
   前記第２の光学手段が操作されることによって、前記対物レンズの瞳面に入射する光の光軸が傾けられ、全反射蛍光照明される前記標本の照明領域の位置が、光軸に対して垂直な面内で移動する
   ことを特徴とする全反射蛍光照明装置。
10. 前記第２の光学手段は、前記レーザ光を発する光源と、前記対物レンズと、の間の平行光束上に配置された、回転可能な平行平面ガラスであることを特徴とする請求項９記載の全反射蛍光照明装置。

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