JP5006694B2

JP5006694B2 - 照明装置

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Description

本発明は、照明装置に関し、特に、顕微鏡に装備され、試料を照明する照明装置に関するものである。

従来、顕微鏡用照明装置としては、例えば、特許文献１〜特許文献３に開示されたものが知られている。
特許文献１の照明装置は、ＣＣＤイメージャのサイズや、接眼レンズの観察視野に照明光の照射範囲を合わせるために、対物レンズの瞳への光源像の投影倍率を可変にするものである。
また、特許文献２の照明装置は、対物レンズに平行光で入射するスポット照明と、対物レンズの瞳面に集光させて試料の広い範囲を照明する面照明とを切り替えるものである。
さらに、特許文献３の照明装置は、全反射照明顕微鏡において、視野絞りを開閉することで照明範囲を可変にするものである。
特開２００２−２５０８６７号公報特開２００３−１８５９２８号公報特開２００４−２９５１２２号公報

しかしながら、特許文献１および特許文献２に開示されている照明装置は、イメージャのサイズや観察可能範囲に対応する領域の大きさに合わせて照明範囲を変更することはできるものの、試料である細胞の特定部位や１個の細胞全体のように観察対象の大きさに合わせて照明範囲を変更することができるものではない。
特許文献３に開示されている照明装置は、視野絞りの調節により対物レンズに入射する光の開口数を変更することで照明範囲を変更しているので、視野絞りにより光束の一部が遮断されて光量の損失が生ずるという問題がある。

蛍光励起や光刺激においては、観察している細胞の特定部位（例えば、核）の大きさや１つの細胞全体、複数の細胞のように、大きさが異なる観察対象あるいは刺激対象に合わせて効率よく照明したいという要求がある。特に、光刺激は強い照明光を必要とするので、光源として光量が不足しがちとなるＬＥＤ光源やＬＤ光源を採用する場合には、効率のよい照明を行うことが強く要求されている。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の核などの試料の特定部位あるいは１つの細胞全体、複数の細胞というように観察対象の大きさに合わせて照明範囲を任意に変更することができ、かつ、観察対象あるいは刺激対象を効率よく照明することができる照明装置を提供することを目的としている。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の参考例としての発明は、顕微鏡に装備される照明装置であって、対物レンズの瞳面に集光する照明光の開口数を変更するための１以上のレンズを備える照明装置を提供する。
本発明によれば、１以上のレンズの作動により、対物レンズの瞳面に光が集光され、かつ、その光の開口数が変更される。その結果、略平行な光を試料に照射することが可能となり、かつ、開口数の調節により、試料内の観察対象の大きさに合わせた任意の範囲に照射することが可能となる。また、１以上のレンズにより光の開口数を調節するので、視野絞りにより調節する場合のように、光束の一部が遮断されて光量の損失が生ずることがなく、光源からの光を無駄にすることなく効率的に照射することができる。

上記照明装置においては、前記１以上のレンズが、光軸方向に移動可能であり、このレンズの光軸方向の移動により前記瞳面に集光する照明光の開口数を変更することとしてもよい。
このようにすることで、１以上のレンズを光軸方向に移動させて、対物レンズの瞳位置に集光する光の開口数を連続的に調節することが可能となる。

上記照明装置においては、前記１以上のレンズを複数組備え、各レンズ組が選択的に交換されることにより、前記瞳面に集光する照明光の開口数が変更されることとしてもよい。
このようにすることで、１以上のレンズ組を選択的に交換して、対物レンズの瞳位置に集光する光の開口数を段階的に切り替え、調節観察範囲内に配される試料の特定部位に対し、予め定められた複数の大きさの光を簡易に照射することが可能となる。

本発明は、顕微鏡に装備され観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置であって、対物レンズの瞳面に集光する照明光の開口数を変更するための１以上のレンズと、前記照明光を前記対物レンズの瞳面に集光させて面照明を行う第１の状態と、前記照明光を前記対物レンズの瞳面にほぼ平行な光束として入射させてスポット照明を行う第２の状態とを切り替える切替手段と、前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備え、前記１以上のレンズの少なくとも１つが光軸方向に移動可能であり、このレンズの光軸方向の移動により前記瞳面に集光する照明光の開口数を変更する照明装置を提供する。
上記照明装置においては、前記切替手段が、前記１以上のレンズを前記照明光の光路に対して挿脱することとしてもよい。

上記照明装置においては、前記切替手段が、前記照明光を前記瞳面に集光させる第１の光路と前記瞳面にほぼ平行な光束として入射させる第２の光路の一方を選択することとしてもよい。
上記照明装置においては、前記１以上のレンズを複数組備え、各レンズ組が選択的に交換されることにより、前記瞳面に集光する照明光の開口数が変更されることとしてもよい。
上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段を備えることとしてもよい。

上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面の光軸方向位置に合わせて照明光の前記瞳面への集光位置を光軸方向に調整する集光位置調整手段を備えることとしてもよい。
上記照明装置においては、前記スポット照明を行う第２の状態において、前記照明スポットを標本上で２次元走査するための走査手段を備えることとしてもよい。

上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段として機能することとしてもよい。
上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記瞳面に集光する照明光の光軸を光路に対して垂直な方向へ移動させる光軸移動手段として機能することとしてもよい。

上記照明装置においては、前記対物レンズの瞳と前記走査手段とを光学的に共役にするリレー光学系と、前記走査手段より光源側に配置され、略平行な光束である照明光を前記走査手段に集光するとともに、この走査手段に向けて射出される照明光の開口数を可変する集束光学系とを備え、前記１以上のレンズは、前記集束光学系を含み、前記切替手段は、前記集束光学系を光路に挿入することにより前記第１の状態に切り替え、該集束光学系を光路からはずすことにより前記第２の状態に切り替えることとしてもよい。

上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記照明光を所定の角度に偏向することにより、前記面照明の標本への照射位置を調整することとしてもよい。

上記照明装置において、前記走査手段よりも光源側に配置され、略平行な光束である照明光の光束径を調節する光束径調節手段と、前記走査手段と前記対物レンズの物体面とを光学的に共役にするリレー光学系を有する第１の光路と、前記走査手段と前記対物レンズの瞳面とを光学的に共役にするリレー光学系を有する第２の光路とを備え、前記１以上のレンズは、前記光束径調節手段を含み、前記切替手段が前記第１の光路を選択することにより、前記面照明を行う第１の状態に切り替え、前記第２の光路を選択することにより前記スポット照明を行う第２の状態に切り替えることとしてもよい。

上記照明装置は、前記走査手段に入射する照明光の光軸をオフセットする光軸シフト手段を備え、前記面照明を行う第１の状態において、前記光軸シフト手段は前記照明光が前記走査手段に入射する際の光軸をオフセットすることにより、前記面照明の標本への照射位置を調整することとしてもよい。

上記照明装置においては、前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段が前記照明光を所望の角度に偏向することにより、前記面照明の標本への照射角度を調整することとしてもよい。

上記照明装置においては、前記スポット照明を行う第２の状態において、前記瞳面に入射するほぼ平行な光束の光束径を調整する光束径調節手段を備えることとしてもよい。

上述の照明装置において、前記照明光を発する光源は、発光ダイオードまたはレーザダイオードの少なくともいずれか一方であることとしてもよい。

本発明は、標本の光刺激のために用いられる上記照明装置と、観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明は、標本の光刺激のために用いられる上記照明装置と、観察用照明光を射出する光源と、多数の共焦点開口を有するとともに、回転することにより該観察用照明光を標本上で走査するディスク走査手段と、観察用照明光の走査により生ずる標本からの光を前記ディスクを介して検出する検出手段とを備えるディスク走査型共焦点顕微鏡を提供する。

本発明は、標本の光刺激のために用いられ、観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置と、観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、前記対物レンズと前記顕微鏡走査手段の間に設けられるとともに、前記顕微鏡走査手段から射出されるレーザ光と前記照明装置からの照明光とを合成する合成手段と、観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段とを備え、前記照明装置は、光刺激用の照明光を標本上で走査する走査手段と、前記対物レンズの瞳と前記走査手段を光学的に共役にするリレー光学系と、前記走査手段によりも光源側に配置され、前記対物レンズの瞳面に集光する前記光刺激用の照明光の開口数を変更するための１以上のレンズを有し、前記光刺激用の照明光を前記走査手段に集光するとともに、この走査手段へ向けて射出される照明光の開口数を可変とする集束光学系と、前記集束光学系を光路に対して挿入することにより、標本を面照明する第１の状態と、前記集束光学系を光路から外すことにより標本をスポット照明する第２の状態とに切り替える切替手段と、前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備え、前記走査手段は、前記第１の状態のときに、前記面照明光の標本への照射位置を調整し、前記第２の状態のときに前記照明スポットを標本上で走査する走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明は、標本の光刺激のために用いられ、観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置と、観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、前記対物レンズと前記顕微鏡走査手段の間に設けられるとともに、前記顕微鏡走査手段から射出されるレーザ光と前記照明装置からの照明光とを合成する合成手段と、観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段とを備え、前記照明装置は、１以上のレンズを有し、略平行な光束である照明光の光束径を調節する光束径調節手段と、光束径調節手段からの照明光が入射する走査手段と、走査手段と対物レンズの物体面を光学的に共役にするリレー光学系を有する第１の光路と、前記走査手段と前記対物レンズの瞳面とを共役にするリレー光学系を有する第２の光路と、前記第１の光路を選択することにより標本を面照明する第１の状態と、前記第２の光路を選択することにより標本をスポット照明する第２の状態とに切り替える切替手段と、前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、細胞の核などの試料の特定部位あるいは１つの細胞全体、複数の細胞というように観察対象の大きさに合わせて照明範囲を任意に変更することができ、かつ、観察対象あるいは刺激対象を効率よく照明することができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る照明装置について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る照明装置１は、図１に示されるように、レーザ走査型顕微鏡２に備えられる光刺激用の照明装置１である。

図１のレーザ走査型顕微鏡２は、観察用光学系３と、光刺激用の照明装置１と、これらの光路を合流させるダイクロイックミラー（合成手段）４と、該ダイクロイックミラー４により合流された光路に配置される結像レンズ５、ミラー６および対物レンズ７を備えている。

観察用光学系３は、観察用のレーザ光Ｌ１を発生する第１のレーザ光源８と、該第１のレーザ光源８から発せられたレーザ光Ｌ１を導く光ファイバ９と、該光ファイバ９の先端から射出されたレーザ光Ｌ１を略平行光に変換する第１のコリメートレンズ１０と、略平行光となったレーザ光Ｌ１を２次元的に走査する第１の走査部（顕微鏡走査手段）１１と、該第１の走査部１１により走査されたレーザ光Ｌ１を集光して中間像を結像させる第１の瞳投影レンズ１２と、該第１の瞳投影レンズ１２および第１の走査部１１を介して戻る蛍光Ｆをレーザ光Ｌ１から分岐するダイクロイックミラー１３と、分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ１４と、該集光レンズ１４により集光された蛍光Ｆの通過を制限するピンホール部材１５と、蛍光Ｆに含まれてくるレーザ光Ｌ１を遮断するバリアフィルタ１６と、蛍光Ｆを検出する光検出器（検出手段）１７とを備えている。

第１のレーザ光源８には、観察用のレーザ光Ｌ１のオンオフおよび波長選択を行う音響光学素子（ＡＯＴＦ）１８が備えられている。
第１の走査部１１は、例えば、相互に直交する軸線周りに揺動可能に支持された２枚のガルバノミラー１１ａ，１１ｂを対向させて構成されている。２枚のガルバノミラー１１ａ，１１ｂの揺動角度を調節することで、試料における観察用のレーザ光Ｌ１の照射位置を光軸に交差する方向に２次元的に移動させることができるようなっている。
ピンホール部材１５は、対物レンズ７の焦点面と光学的に共役な位置関係に配置されている。

本実施形態に係る光刺激用の照明装置１は、刺激用のレーザ光Ｌ２を発生する第２のレーザ光源１９と、該第２のレーザ光源１９から発せられたレーザ光Ｌ２を導く光ファイバ２０と、該光ファイバ２０の先端から射出されたレーザ光Ｌ２を略平行光に変換する第２のコリメートレンズ２１と、略平行光となったレーザ光Ｌ２を光軸に交差する方向に２次元的に移動させる第２の走査部（走査手段）２２と、該第２の走査部２２により移動されたレーザ光Ｌ２を集光して中間像を結像させる第２の瞳投影レンズ２３と、前記第２のコリメートレンズ２１と第２の走査部２２との間の光路に挿脱可能に設けられる照射領域調節ユニット（集束光学系）２４と、照射領域調節ユニット２４を光路に対して挿脱する不図示の切替装置（切替手段）を備えている。

第２のレーザ光源１９にも、刺激用のレーザ光Ｌ２のオンオフおよび波長選択を行う音響光学素子（ＡＯＴＦ）２５が備えられている。
第２の走査部２２は、第１の走査部１１と同様に、２枚のガルバノミラー２２ａ，２２ｂにより構成されている。

照射領域調節ユニット２４は、前記第２のコリメートレンズ２１と第２の走査部２２との間の光路に挿入された状態で、光軸方向に沿って移動可能に設けられる１以上のレンズ２４ａ，２４ｂを備えている。これにより、図２に示されるように、第２のコリメートレンズ２１からの略平行のレーザ光Ｌ２を第２の走査部２２のガルバノミラー２２ａとガルバノミラー２２ｂとの略中間位置に集光させるとともに、１以上のレンズ２４ａの移動により、集光位置を一定に維持しながら、その開口数を変化させることができるようになっている。
本実施形態では、レンズ２４ｂは固定配置され、レンズ２４ａが図２の実線の位置と破線の位置との間を移動することでレーザ光Ｌ２の開口数を調節するようになっている。

第２の走査部２２において、ガルバノミラー２２ａとガルバノミラー２２ｂとの略中間位置は、対物レンズ７の瞳面と光学的に共役な位置関係に配置されているので、照射領域調節ユニット２４が光路に挿入されると、レーザ光Ｌ２は、図４に実線で示されるように、対物レンズ７の瞳面に集光され、試料Ａに対して略平行な光束となって照射されるようになっている。
一方、照射領域調節ユニット２４が光路から離脱させられた状態では、図１に破線で示されるように、レーザ光Ｌ２は略平行光を維持したまま第２の走査部２２の揺動角度により位置調節されるので、図４に破線で示されるように、対物レンズ７の瞳面に所定の光束径の略平行なレーザ光Ｌ２として入射され、対物レンズ７の焦点面に集光させられるようになっている。
図中、符号２６，２７はミラー、符号２８は試料Ａを搭載するステージである。
また、照明装置１において、例えば、結像レンズ５、第２の瞳投影レンズ２３は、対物レンズ７の瞳と第２の走査部２２とを光学的に共役にするリレー光学系として機能する。

このように構成された本実施形態に係る照明装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る照明装置１を備えたレーザ走査型顕微鏡２を用いて試料Ａを観察する場合には、ステージ２８上に試料Ａを配置し、該試料Ａの上方に対物レンズ７を配置して、第１のレーザ光源８から観察用のレーザ光Ｌ１を射出させる。観察用のレーザ光Ｌ１は、音響光学素子１８によりそのオンオフ状態の切り替えおよび波長選択が行われ、光ファイバ９を介して伝播される。光ファイバ９の先端から射出された観察用のレーザ光Ｌ１は、第１のコリメートレンズ１０により略平行光とされ、ミラー２６およびダイクロイックミラー１３により反射された後、第１の走査部１１により２次元的に走査されて瞳投影レンズ１２およびダイクロイックミラー４を透過し、結像レンズ５により略平行光に変換され、ミラー６により反射されて対物レンズ７に入射される。

対物レンズ７に入射されたレーザ光Ｌ１は、対物レンズ７によりその焦点面に集光される。したがって、焦点位置に配置された試料Ａにレーザ光Ｌ１が集光されることにより、試料Ａ内部に存在する蛍光物質が励起され、蛍光Ｆが発生する。

試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、レーザ光Ｌ１とは逆の経路を辿って戻る。すなわち、対物レンズ７により集光された後、ミラー６、結像レンズ５、ダイクロイックミラー４、瞳投影レンズ１２および第１の走査部１１を介して戻り、ダイクロイックミラー１３によってレーザ光Ｌ１から分岐される。

分岐された蛍光Ｆは、集光レンズ１４により集光され、ピンホール部材１５を通過可能な対物レンズ７の焦点面近傍からの蛍光Ｆのみがバリアフィルタ１６によりレーザ光Ｌ１を除去された後に光検出器１７により検出される。第１の走査部１１を構成するガルバノミラー１１ａ，１１ｂの揺動角度に対応して決定される試料Ａ上の２次元位置と光検出器１７により検出された蛍光Ｆの強度とを対応づけて記録していくことにより、対物レンズ７の焦点面に広がる試料Ａ内部の２次元的な蛍光画像を取得することができる。

一方、光刺激用の照明装置１を作動させることにより、刺激用のレーザ光Ｌ２がレーザ光源１９から射出され、光ファイバ２０を介して伝播された後にコリメートレンズ２１により略平行光とされる。
ここで、照射領域調節ユニット２４を光路から離脱させた場合について説明する。この場合には、コリメートレンズ２１により略平行光とされたレーザ光Ｌ２は、そのまま、第２の走査部２２に入射され（図１中に破線で示す。）、角度調節された状態で瞳投影レンズ２３に入射される。これにより、レーザ光Ｌ２は中間像を結像してダイクロイックミラー４により反射され、結像レンズ５により略平行光とされた状態で対物レンズ７に入射される。

したがって、刺激用のレーザ光Ｌ２は、対物レンズ７により集光されて、その焦点面に焦点を結ぶ。走査部２２の揺動角度の調節により、焦点を結ぶ位置を観察視野内で２次元的に調整できる。その結果、刺激用のレーザ光Ｌ２は、図４に破線で示されるように、対物レンズ７の焦点面上の点Ｐにおいて最も光子密度が高いスポット照明光となり、試料Ａに対して強い光刺激を与えることができる。この方式は、例えば、核等、細胞の小さな特定部位に光刺激を与える用途に適している。ただし、焦点面から光軸方向にずれた領域にも光が円錐状に通過するため、弱い光ではあるが狙った位置以外にも光刺激が加えられてしまうという欠点がある。また、核等の特定部位でも光走査部により走査して刺激領域を拡大させる必要がある場合もあり、この場合は、走査に時間を要し、試料の早い反応を捕らえるには不向きである。

一方、照射領域調節ユニット２４を第２のコリメートレンズ２１と第２の走査部２２との間の光路に挿入した場合（図２中に実線で示す。）には、コリメートレンズ２１により略平行光とされた刺激用のレーザ光Ｌ２は、照射領域調節ユニット２４の作動により、第２の走査部２２に集光され、瞳投影レンズ２３により略平行光に変換される。その後、ダイクロイックミラー４により反射されて結像レンズ５により、対物レンズ７の瞳面に集光される。したがって、刺激用のレーザ光Ｌ２は、図４に実線で示されるように、対物レンズ７により略平行光に変換され、所定の面積を持つ面照明光として試料Ａに照射される。

このようにすることで、試料Ａの所定の面積に対し、深さ方向に沿って略同一の照射領域で光刺激を与えることができるので、狙った位置以外に光が照射されることがない。また、図４の破線の方式に比べて、例えば、１つの細胞の指定領域や１つの細胞全体に走査することなく一度に光刺激を与えることができ、試料の早い反応を捕らえることができる。
照射領域調節ユニット２４は、１以上のレンズ２４ａを光軸方向に移動させることにより、図２に示されるように、集光位置を対物レンズ７の瞳面に維持したまま、刺激用のレーザ光Ｌ２の対物レンズ７の瞳面に入射する開口数を変化させることができる。したがって、照射領域調節ユニット２４を作動させて１以上のレンズ２４ａを光軸方向に移動させることにより、試料Ａに対して照射される刺激用のレーザ光Ｌ２の光束径（面照明の照射領域の大きさ）を変化させることができる。

すなわち、試料Ａである細胞の特定部位（例えば、核や細胞の指定領域）のみに光刺激を与えたい場合には、対物レンズ７の瞳面に入射される刺激用のレーザ光Ｌ２の開口数を小さくする。これにより、対物レンズ７から射出される刺激用のレーザ光Ｌ２の光束径を細くして、細胞内のある部分等、微細な範囲のみに光刺激を与えることができる。また、例えば、試料Ａである１つの細胞全体や複数の細胞に光刺激を与えたい場合には、対物レンズ７の瞳面に入射される刺激用のレーザ光Ｌ２の開口数を大きくする。これにより、対物レンズ７から射出される刺激用のレーザ光Ｌ２の光束径を拡大させて、比較的広い範囲に試料Ａの深さ方向に強度分布の少ない面照明で均一な光刺激を与えることができる。試料Ａの比較的広い範囲を同時に光刺激でき、試料の早い反応を捕らえることができる。

この場合において、本実施形態によれば、照射領域調節ユニット２４を構成する１以上のレンズ２４ａを光軸方向に移動させて刺激用のレーザ光Ｌ２の開口数を変化させるので、視野絞りを用いて開口数を変化させる場合に比べて、レーザ光Ｌ２の損失を少なくすることができる。したがって、刺激用のレーザ光Ｌ２の強度低下を防止することができる。特に、レーザ光源１９としてＬＥＤ光源やＬＤ光源を用いている場合に、効果的である。

また、本実施形態によれば、照射領域調節ユニット２４を光路に挿脱することにより、試料Ａの１点に集光するスポット光による光刺激と、それよりも広い範囲の照射領域を有し試料Ａの深さ方向に強度分布を持たない面照明による光刺激とを切り替えることができる。これにより、用途に応じて、異なる態様の光刺激を行いながら、試料Ａの状態を観察することができる。また、照射領域調節ユニット２４全体を光軸方向に移動させることにより、瞳面位置が光軸方向に異なる対物レンズ７に交換した場合にも、刺激用のレーザ光Ｌ２を対物レンズ７の瞳面に集光させるように調節することができる。

また、第２の走査部２２の揺動により、対物レンズ７の瞳面に集光する光の中心角度を変化させて、刺激用のレーザ光Ｌ２の照射位置を移動することができる（図３の破線参照。）。これにより、例えば、隣の細胞をブリーチすることができる等、光刺激を与える位置を自由に選択することができる。また、図１の破線のように、対物レンズ７に平行光で入射させて試料面の集光位置を走査するスポット照明の走査部２２の機能を面照明の照射位置を移動する機能と兼用でき、安価で多機能を実現できる。

なお、本実施形態に係る光刺激用の照明装置１においては、光路内に挿入した照射領域調節ユニット２４の１以上のレンズ２４ａを光軸方向に移動させることにより、対物レンズ７の瞳面に集光される刺激用のレーザ光Ｌ２の開口数を連続的に変化させることとしたが、これに代えて、焦点位置が同じで、倍率の異なる複数のレンズ組（図示略）を用意し、いずれかのレンズ組を選択的に光路内に配置するようにして、開口数を段階的に変化させることとしてもよい。
照射範囲の大きさが予め定められている用途では、レンズ組の切り替えにより、簡易かつ迅速に、所望の照射範囲の光刺激を行うことができるので、効果的である。

次に、本発明の第２の実施形態に係る照明装置３０について、図５〜図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る照明装置３０も、光刺激用の照明装置３０である。
なお、観察用光学系については、第１の実施形態と同様であるので図示および説明を省略する。また、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る照明装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る照明装置３０は、図５に示されるように、第２のコリメートレンズ２１と第２の走査部２２との間の光路に光束径を変更するための光束径調節ユニット（光束径調節手段）３１と、光軸に直交する軸線回りに揺動可能な平行平面板（光軸シフト手段）３２とを備えている。
光束径調節ユニット３１は、該光束径調節ユニット３１を構成する１以上のレンズを光軸方向に移動させることにより、光束径を連続的に変化させることができるようになっている（アフォーカルズーム光学系）。

また、照明装置３０は、瞳投影レンズ２３とダイクロイックミラー４との間の光路に挿脱可能に設けられた三角プリズム３３と、三角プリズム３３を該光路に対して挿脱する不図示の切替装置（切替手段）を備えている。
また、照明装置３０は、該三角プリズム３３が切替装置によって光路内に挿入されたときに、該三角プリズム３３により反射された刺激用のレーザ光Ｌ２を迂回させる結像位置調節部３４と、折り返されたレーザ光Ｌ２を略平行光に変換するコリメートレンズ３６とを備えている。

結像位置調節部３４は、三角プリズム３３の一斜面３３ａにより反射された刺激用のレーザ光Ｌ２を他の斜面３３ｂに向けて折り返すための２枚のミラー３５ａ，３５ｂを備えている。結像位置調節部３４は図５の矢印の方向に移動可能になっている。

三角プリズム３３が光路内から離脱させられた場合には、図６に示されるように、光束径調節ユニット３１により光束径を調節された刺激用のレーザ光Ｌ２が、第２の走査部２２により２次元方向に位置調整された状態で瞳投影レンズ２３により中間像を結像させられ、その後、ダイクロイックミラー４により反射され、結像レンズ５により略平行光に変換された状態で、対物レンズ７に入射される。したがって、刺激用のレーザ光Ｌ２は、図７に破線で示されるように、対物レンズ７によりその焦点面に集光されるスポット照明光となり、焦点面に配される１点Ｐに強い光刺激を与えることができる。

光束径調節ユニット３１の作動により、対物レンズ７に入射される略平行光の状態のレーザ光Ｌ２の光束径を細い平行光に変換することによって、図７に実線で示されるように、試料Ａの深さ方向に強度分布が少なく、照射面積がやや大きいスポット照明光として刺激用のレーザ光Ｌ２を照射することが可能となる。

次に、三角プリズム３３を光路内に挿入した場合について説明する。
この場合には、図５に示されるように、瞳投影レンズ２３により集光された刺激用のレーザ光Ｌ２が、三角プリズム３３の一斜面３３ａにより反射され、中間像を結像するとともに、結像位置調節部３４の２つのミラー３５ａ，３５ｂによって光路を折り返された後、コリメートレンズ３６により略平行光とされる。そして、略平行光とされた刺激用のレーザ光Ｌ２は、三角プリズム３３の他の斜面３３ｂにより反射されて、ダイクロイックミラー４、結像レンズ５およびミラー６を介して、対物レンズ７の瞳面に集光される。

したがって、図８に実線で示されるように、試料Ａに対して、所定の照射面積を有し、試料Ａの深さ方向に強度分布の少ない均一な強度分布の面照明として刺激用のレーザ光Ｌ２を照射することができる。また、この状態で光束径調節ユニット３１を作動させることにより、瞳投影レンズ２３へ入射するビーム径が変化して、対物レンズ７の瞳面７ａに入射するレーザ光Ｌ２の開口数が変化する。

光束径調節ユニット３１は、移動レンズ３１ａと固定レンズ３１ｂとを備えている。移動レンズ３１ａを図示のように移動させて、ビームの平行度を保ったまま光束径を変更する。したがって、試料Ａに照射する刺激用のレーザ光Ｌ２の照射範囲の大きさを変化させることができる（図９参照。）。
また、刺激用レーザ光Ｌ２による光刺激位置を移動させたい場合には、光束径調節ユニット３１に隣接して配置されている平行平面板３２を揺動させることにより対応することができる。この平行平面板３２を揺動させると、対物レンズ７の瞳面７ａに集光する光の中心角度が変化するので照射位置の移動が可能となる（図１０の破線参照。）。

さらに、本実施形態に係る照明装置３０によれば、第２の走査部２２を構成するガルバノミラー２２ａ，２２ｂの内の一方のガルバノミラー２２ｂ（２２ａ）を揺動させることにより、図５，図８中に破線で示されるように、対物レンズ７の瞳面７ａへの刺激用のレーザ光Ｌ２の集光位置をシフトさせることができる。そして、対物レンズ７の瞳面７ａの外縁近傍までレーザ光Ｌ２の集光位置をシフトさせることにより、略平行光であるレーザ光Ｌ２を所定の角度で斜め方向から試料Ａの下面に配置されているカバーガラス２８ａの試料側界面に照射することができる。

この角度は、レーザ光Ｌ２が試料側界面で全反射を起こす角度に設定されている。このとき、レーザ光Ｌ２のごく一部がカバーガラス２８ａの試料側後界面から試料Ａ側ににじみ出す。この境界からにじみ出したレーザ光Ｌ２がエバネッセント光で、試料Ａの深さ方向へにじみ出す量は光源の波長程度となる。

これにより、試料Ａは、カバーガラス２８ａの試料側界面の数１００ｎｍ以下のわずかな領域に染み出したエバネッセント光により光刺激される。
また、エバネッセント光による光刺激位置を移動させたい場合には、光束径調節ユニット３１に隣接して配置されている平行平面板３２を揺動させることにより対応することができる。また、図５の結像位置調節部３４の２枚の反射ミラー３５ａ，３５ｂを矢印方向に移動させることにより、対物レンズの瞳面に集光する光軸方向位置を調節することができる。したがって、瞳位置が異なる対物レンズに交換しても刺激用レーザ光を対物レンズの瞳面に集光させるように調節することができる。

なお、光束径調節ユニット３１として、該光束径調節ユニット３１を構成する１以上のレンズを光軸方向に移動させる方式のものを例示したが、これに代えて、異なる複数のレンズ組を用意し、交換可能に支持するレンズ交換部（図示略）の作動により、用途に合わせてレンズ組を交換することとしてもよい。

なお、上記各実施形態においては、ガルバノミラー１１ａ，１１ｂからなる第１の走査部１１によりレーザ光Ｌ１を走査するレーザ走査型顕微鏡２，４０を例示したが、これに代えて、図１１に示されるように、水銀ランプ４１、励起フィルタ４２、コンフォーカルディスク４３およびＣＣＤ素子４４を備えた観察用光学系４５を有する走査型顕微鏡４０に適用することとしてもよい。このようにすることで、高速に画像取得することができ、試料の早い反応を観察することが可能となる。
また、上記各実施形態においては、光刺激用の照明装置１，３０の場合を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではない。

本発明の第１の実施形態に係る照明装置を備えたレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。図１のレーザ走査型顕微鏡の光刺激用照明装置を示す図である。図１のレーザ走査型顕微鏡の光刺激用照明装置において、走査部の揺動による照射位置の調整を示す図である。図１のレーザ走査型顕微鏡の対物レンズにおける光束の状態を示す模式図である。本発明の第２の実施形態に係る光刺激用照明装置を示す図である。図５の光刺激用照明装置において、三角プリズムを光路から離脱させた場合を示す図である。図６の状態に設定されたときの対物レンズにおける光束の状態を示す模式図である。図５の状態に設定されたときの対物レンズにおける光束の状態を示す模式図である。図５の光刺激用照明装置において、光束径調節ユニットの作動による照射範囲の調整を示す図である。図５の光刺激用照明装置において、平行平面板の作動による照射位置の調整を示す図である。図１のレーザ走査型顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。

符号の説明

Ｌ２レーザ光（光）
１，３０照明装置
２，４０走査型顕微鏡（顕微鏡）
７対物レンズ
２２第２の走査部
２４ａレンズ
３２平行平面板

Claims

顕微鏡に装備され観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置であって、
対物レンズの瞳面に集光する照明光の開口数を変更するための１以上のレンズと、
前記照明光を前記対物レンズの瞳面に集光させて面照明を行う第１の状態と、前記照明光を前記対物レンズの瞳面にほぼ平行な光束として入射させてスポット照明を行う第２の状態とを切り替える切替手段と、
前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備え、
前記１以上のレンズの少なくとも１つが光軸方向に移動可能であり、
このレンズの光軸方向の移動により前記瞳面に集光する照明光の開口数を変更する照明装置。
前記切替手段が、前記１以上のレンズを前記照明光の光路に対して挿脱する請求項１に記載の照明装置。
前記切替手段が、前記照明光を前記瞳面に集光させる第１の光路と前記瞳面にほぼ平行な光束として入射させる第２の光路の一方を選択する請求項１に記載の照明装置。
前記１以上のレンズを複数組備え、各レンズ組が選択的に交換されることにより、前記瞳面に集光する照明光の開口数が変更される請求項１から請求項３のいずれかに記載の照明装置。
前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面の光軸方向位置に合わせて照明光の前記瞳面への集光位置を光軸方向に調整する集光位置調整手段を備え、
前記集光位置調整手段は、瞳位置が異なる複数の対物レンズのそれぞれの瞳位置に合わせて調整される請求項１から請求項４のいずれかに記載の照明装置。
前記スポット照明を行う第２の状態において、前記照明スポットを標本上で２次元走査するための走査手段を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の照明装置。
前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段として機能する請求項６に記載の照明装置。
前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記瞳面に集光する照明光の光軸を光路に対して垂直な方向へ移動させる光軸移動手段として機能する請求項６に記載の照明装置。
前記対物レンズの瞳と前記走査手段とを光学的に共役にするリレー光学系と、
前記走査手段より光源側に配置され、略平行な光束である照明光を前記走査手段に集光するとともに、この走査手段に向けて射出される照明光の開口数を可変する集束光学系とを備え、
前記１以上のレンズは、前記集束光学系を含み、
前記切替手段は、前記集束光学系を光路に挿入することにより前記第１の状態に切り替え、該集束光学系を光路からはずすことにより前記第２の状態に切り替える請求項６に記載の照明装置。
前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段は、前記照明光を所定の角度に偏向することにより、前記面照明の標本への照射位置を調整する請求項９に記載の照明装置。
前記走査手段よりも光源側に配置され、略平行な光束である照明光の光束径を調節する光束径調節手段と、
前記走査手段と前記対物レンズの物体面とを光学的に共役にするリレー光学系を有する第１の光路と、
前記走査手段と前記対物レンズの瞳面とを光学的に共役にするリレー光学系を有する第２の光路と
を備え、
前記１以上のレンズは、前記光束径調節手段を含み、
前記切替手段が前記第１の光路を選択することにより、前記面照明を行う第１の状態に切り替え、前記第２の光路を選択することにより前記スポット照明を行う第２の状態に切り替える請求項６に記載の照明装置。
前記走査手段に入射する照明光の光軸をオフセットする光軸シフト手段を備え、
前記面照明を行う第１の状態において、前記光軸シフト手段は前記照明光が前記走査手段に入射する際の光軸をオフセットすることにより、前記面照明の標本への照射位置を調整する請求項１１に記載の照明装置。
前記面照明を行う第１の状態において、前記走査手段が前記照明光を所望の角度に偏向することにより、前記面照明の標本への照射角度を調整する請求項１１に記載の照明装置。
前記スポット照明を行う第２の状態において、前記瞳面に入射するほぼ平行な光束の光束径を調整する光束径調節手段を備える請求項１に記載の照明装置。
前記照明光を発する光源が発光ダイオードまたはレーザダイオードの少なくともいずれか一方である請求項１から請求項１４のいずれかに記載の照明装置。
標本の光刺激のために用いられる請求項１から請求項１５のいずれかに記載の照明装置と、
観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、
観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、
観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段と
を備える走査型レーザ顕微鏡。
標本の光刺激のために用いられる請求項１から請求項１５のいずれかに記載の照明装置と、
観察用照明光を射出する光源と、
多数の共焦点開口を有するとともに、回転することにより該観察用照明光を標本上で走査するディスク走査手段と、
観察用照明光の走査により生ずる標本からの光を前記ディスクを介して検出する検出手段と
を備えるディスク走査型共焦点顕微鏡。
標本の光刺激のために用いられ、観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置と、
観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、
観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、
前記対物レンズと前記顕微鏡走査手段の間に設けられるとともに、前記顕微鏡走査手段から射出されるレーザ光と前記照明装置からの照明光とを合成する合成手段と、
観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段と
を備え、
前記照明装置は、
光刺激用の照明光を標本上で走査する走査手段と、
前記対物レンズの瞳と前記走査手段を光学的に共役にするリレー光学系と、
前記走査手段によりも光源側に配置され、前記対物レンズの瞳面に集光する前記光刺激用の照明光の開口数を変更するための１以上のレンズを有し、前記光刺激用の照明光を前記走査手段に集光するとともに、この走査手段へ向けて射出される照明光の開口数を可変とする集束光学系と、
前記集束光学系を光路に対して挿入することにより、標本を面照明する第１の状態と、前記集束光学系を光路から外すことにより標本をスポット照明する第２の状態とに切り替える切替手段と、
前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備え、
前記走査手段は、前記第１の状態のときに、前記面照明光の標本への照射位置を調整し、前記第２の状態のときに前記照明スポットを標本上で走査する走査型レーザ顕微鏡。
標本の光刺激のために用いられ、観察視野内の所望の一部分のみを照明する照明装置と、
観察用レーザ光を射出するレーザ光源と、
観察用レーザ光を標本上で二次元走査する顕微鏡走査手段と、
前記対物レンズと前記顕微鏡走査手段の間に設けられるとともに、前記顕微鏡走査手段から射出されるレーザ光と前記照明装置からの照明光とを合成する合成手段と、
観察用レーザ光の走査により生じる標本からの光を検出する検出手段と
を備え、
前記照明装置は、
１以上のレンズを有し、略平行な光束である照明光の光束径を調節する光束径調節手段と、
光束径調節手段からの照明光が入射する走査手段と、
走査手段と対物レンズの物体面を光学的に共役にするリレー光学系を有する第１の光路と、
前記走査手段と前記対物レンズの瞳面とを共役にするリレー光学系を有する第２の光路と、
前記第１の光路を選択することにより標本を面照明する第１の状態と、前記第２の光路を選択することにより標本をスポット照明する第２の状態とに切り替える切替手段と、
前記面照明を行う第１の状態において、前記瞳面に集光する照明光の中心角度を変化させる照射位置移動手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。