JP6146985B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、観察光学系の光路（以下、観察系光路という。）と刺激光学系の光路（以下、刺激系光路という。）とを有するレーザ走査型顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。また、レーザ光源からのレーザ光の光束を変換する光束径変換光学系と、分岐した２つの光路にそれぞれ配置された２つの走査光学系とを備える顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載の顕微鏡装置は、光源から発せられるレーザ光が平行光であることを前提とした構成となっている。

特許第４８０４７２６号公報 特開平１０−２０６７４２号公報

しかしながら、一般的に、レーザ光を完全に平行光にすることは困難であり、特許文献１の技術と特許文献２の技術とを組み合わせて、観察系光路と刺激系光路とを有する１レーザ２スキャナシステムにおいて光束径変換光学系を共用した構成を実現しようとすると、下記の不都合がある。すなわち、観察系光路を用いる場合と刺激系光路を用いる場合とでレーザ光の波長を同じにしても、観察系光路と刺激系光路とを切替えると、対物レンズの瞳位置において、観察系光路と刺激系光路とでレーザ光の波面に相違が生じ、これらの光路間で焦点位置がずれてしまうという不都合がある。

本発明は、観察系光路と刺激系光路とでレーザ光の波面が一致し、焦点位置にずれがない顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズにより照射するレーザ光を標本上で走査させる走査部を含む複数の光学素子からなり、これら複数の光学素子により互いに異なる光路を形成する２つの走査光学系と、該２つの走査光学系の光路を切替可能な光路切替部と、前記２つの走査光学系に入射させる前記レーザ光の光束径を変換可能な光束径変換光学系とを備え、前記２つの走査光学系が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に前記走査部が配され、前記複数の光学素子により前記光束径変換光学系から前記走査部までの光路長が互いに等しくなるように前記光路が形成されている顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光は、光束径変換光学系によりその光束径が変換された後、光路切替部により切替えられる互いに光路が異なる２つの走査光学系のいずれかの走査部によって走査されて、対物レンズにより標本に照射される。２つの走査光学系においては、走査部を含む複数の光学素子により、光束径変換光学系から走査部までの光路長が互いに等しくなるように光路が形成されている。

これにより、２つの走査光学系のレーザ光の波長を同じにした場合は、これら２つの走査光学系の光路を切替えても、対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の波面を一致させて、２つの走査光学系間で焦点位置がずれるのを防ぐことができる。また、２つの走査光学系の光路を切替える際の光束径変換光学系の調整を不要にすることができる。

さらに、２つの走査光学系のレーザ光の波長を異なるものにした場合でも、対物レンズとレーザ光の波長を変更したときに光束径変換光学系を調整するための調整テーブルが２つの走査光学系に共通の１つで済む。したがって、調整テーブルを作成するための調整時間を短縮できるとともに、調整テーブルを記憶させるメモリの容量を抑えることができる。

上記発明においては、前記光束径変換光学系が、前記レーザ光の光束径を変換することにより前記対物レンズの瞳位置における前記レーザ光の波面を変化させることとしてもよい。
光束径変換光学系がレーザ光の光束径の調節に伴ってレーザ光の波面を変化させるような簡易な構成であっても、２つの走査光学系の相対的な焦点位置ずれを生じさせずに観察を行うことができる。
上記発明においては、前記光束径変換光学系が、２つのレンズ間の光軸方向の距離を変化させることによりレーザ光の光束径を拡大または縮小するガリレオ式またはケプラー式のビームエキスパンダであってもよい。
このように構成することで、２つのレンズの光軸方向の距離間隔を変化させるだけの簡易な操作で、２つの走査光学系に入射させるレーザ光の光束径を変換することができる。
上記発明においては、前記対物レンズとレーザ光の波長を変更した場合に前記光束径変換光学系を調整するための調整テーブルが、前記２つの走査光学系で共通であってもよい。
このように構成することで、調整テーブルを作成するための調整時間を短縮することができるとともに、調整テーブルを記憶させるのに必要なメモリの容量を抑えることができる。

本発明によれば、観察系光路を用いる場合と刺激系光路を用いる場合とで、レーザ光の波面を一致させて焦点位置のずれを防ぐことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置を示す概略構成図である。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置（顕微鏡装置）について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置１００は、図１に示されるように、レーザ光（照明光）を発するレーザ光源１と、標本Ｓにレーザ光を照射させる顕微鏡本体１０と、レーザ光源１から発せられたレーザ光の強度変調を行うＡＯＭ（音響光学素子）３と、ＡＯＭ３を通過したレーザ光の光束径を変換可能な光束径変換光学系５と、互い異なる光路を形成して顕微鏡本体１０にレーザ光を入射させる複数のレンズやミラー（共に光学素子）からなる観察走査光学系（走査光学系）２０および刺激走査光学系（走査光学系）３０と、観察走査光学系２０の光路と刺激走査光学系３０の光路とを切替可能な光路切替第１ＤＭ（ダイクロイックミラー、光路切替部）７および光路切替第２ＤＭ（ダイクロイックミラー、光路切替部）９とを備えている。

顕微鏡本体１０は、標本Ｓが載置されるステージ１１と、観察走査光学系２０の光路または刺激走査光学系３０の光路を介して入射されるレーザ光を集光して略平行光にする結像レンズ１３と、結像レンズ１３により略平行光にされたレーザ光を反射する反射ミラー１５と、反射ミラー１５により反射されたレーザ光を標本Ｓに照射する対物レンズ１７と、複数の対物レンズ１７を切替可能に保持するレボルバ１９とを備えている。

光束径変換光学系５は、例えば、ガリレオ式またはケプラー式のビームエキスパンダーであり、光軸方向に移動可能な２つのレンズ６Ａ，６Ｂを備えている。この光束径変換光学系５は、レンズ６Ａ，６Ｂ間の光軸方向の距離を変化させることにより、レーザ光の光束径を拡大または縮小することができるようになっている。光束径変換光学系５によりレーザ光の光束径を変換すると、対物レンズ１７の瞳位置におけるレーザ光の波面が変化することとしてもよい。

観察走査光学系２０は、レーザ光を標本Ｓ上で走査させるスキャナ（走査部）２５を有する観察スキャンユニット２２を備えている。観察スキャンユニット２２は、スキャナ２５の他、入射されたレーザ光を反射してスキャナ２５に入射せる一方、標本Ｓからスキャナ２５を介して戻る蛍光を透過させるダイクロイックミラー（光学素子）２３（以下、単にＤＭ２３という。）と、スキャナ２５により走査されたレーザ光を集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ２７と、ＤＭ２３を透過した蛍光を検出するディテクタ２９とを備えている。

スキャナ２５は、レーザ光を反射する揺動可能な一対のガルバノミラー２６Ａ，２６Ｂにより構成され、これらガルバノミラー２６Ａ，２６Ｂの揺動角度を変化させることにより、レーザ光源１からのレーザ光を標本Ｓ上で２次元的（ＸＹ方向）に走査させることができるようになっている。このスキャナ２５は、対物レンズ１７の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

刺激走査光学系３０は、レーザ光を順に反射する４つの反射ミラー（光学素子）３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄと、反射ミラー３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄからのレーザ光を標本Ｓ上で走査させるスキャナ（走査部）３５を有する刺激スキャンユニット３２とを備えている。

刺激スキャンユニット３２は、スキャナ３５の他、入射されたレーザ光を反射してスキャナ３５に入射させる反射ミラー（光学素子）３３と、スキャナ３５により走査されたレーザ光を集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ３７とを備えている。

スキャナ３５は、観察スキャンユニット２２のスキャナ２５と同様に、レーザ光を反射する揺動可能な一対のガルバノミラー３６Ａ，３６Ｂにより構成され、これらガルバノミラー３６Ａ，３６Ｂの揺動角度を変化させることにより、レーザ光源１からのレーザ光を標本Ｓ上で２次元的（ＸＹ方向）に走査させることができるようになっている。また、スキャナ３５も、対物レンズ１７の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

これらの観察走査光学系２０および刺激走査光学系３０は、反射ミラー３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄ、反射ミラー３３およびＤＭ２３により、光束径変換光学系５からそれぞれのスキャナ２５，３５までの光路長が互いに等しくなるように光路が形成されている。

光路切替第１ＤＭ７は、観察走査光学系２０および刺激走査光学系３０の前段の光路上に挿脱可能に設けられている。レーザ光を観察走査光学系２０を通過させる場合は、光路に光路切替第１ＤＭ７を挿入して、光束径変換光学系５からのレーザ光を光路切替第１ＤＭ７により観察走査光学系２０に向けて反射させるようになっている。一方、レーザ光を刺激走査光学系３０を通過させる場合は、光路から光路切替第１ＤＭ７を外して、光束径変換光学系５からのレーザ光を通過させるようになっている。

光路切替第２ＤＭ９は、観察走査光学系２０および刺激走査光学系３０の後段の光路上に挿脱可能に設けられている。レーザ光を観察走査光学系２０を通過させる場合は、光路から光路切替第２ＤＭ９を外して、観察走査光学系２０を通過したレーザ光を通過させるようになっている。一方、レーザ光を刺激走査光学系３０を通過させる場合は、光路に光路切替第２ＤＭ９を挿入して、刺激走査光学系３０を通過したレーザ光を光路切替第２ＤＭ９により顕微鏡本体１０に向けて反射させるようになっている。

このように構成されたレーザ走査型顕微鏡装置１００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置１００を用いて標本Ｓを観察するには、まず、観察走査光学系２０を用いて標本Ｓの２次元画像を取得する。具体的には、光路に光路切替第１ＤＭ７を挿入する一方、光路から光路切替第２ＤＭ９を外し、レーザ光源１からレーザ光を発生させる。

レーザ光源１から発せられたレーザ光は、ＡＯＭ３により強度変調が行われ、光束径変換光学系５によりその光束径が調整された後、光路切替第１ＤＭ７により反射されて観察走査光学系２０の観察スキャンユニット２２に入射される。観察スキャンユニット２２に入射されたレーザ光は、ＤＭ２３により反射されてスキャナ２５により走査され、瞳投影レンズ２７を介して顕微鏡本体１０に入射される。

顕微鏡本体１０に入射されたレーザ光は、結像レンズ１３により集光されて平行光にされた後、反射ミラー１５により反射されて対物レンズ１７により標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ２５のガルバノミラー２６Ａ，２６Ｂの揺動角度の変化に従い、標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査される。

標本Ｓにおいてレーザ光が照射されることにより蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ１７により集光されて、反射ミラー１５、結像レンズ１３、瞳投影レンズ２７、スキャナ２５を介して光路を逆方向に戻る。そして、蛍光は、ＤＭ２３を透過してディテクタ２９により検出される。これにより、ディテクタ２９により検出された蛍光の輝度情報に基づいて、図示しない画像構築部により標本Ｓの２次元画像を構築し、構築した画像を図示しないモニタに表示することで、ユーザは画像上で標本Ｓを観察することができる。

次に、刺激走査光学系３０を用いて標本Ｓを光刺激する。具体的には、まず、光路から光路切替第１ＤＭ７を外す一方、光路に光路切替第２ＤＭ９を挿入し、レーザ光源１からレーザ光を発生させる。

レーザ光源１から発せられたレーザ光は、ＡＯＭ３、光束径変換光学系５を通過した後、刺激走査光学系３０の反射ミラー３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄを介して刺激スキャンユニット３２に入射される。刺激スキャンユニット３２に入射されたレーザ光は、反射ミラー３３により反射されてスキャナ３５により走査され、瞳投影レンズ３７を介して出射される。

刺激スキャンユニット３２から出射されたレーザ光は、光路切替第２ＤＭ９により反射されて、顕微鏡本体１０に入射される。顕微鏡本体１０に入射されたレーザ光は、結像レンズ１３、反射ミラー１５を介して対物レンズ１７により標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ３５のガルバノミラー３６Ａ，３６Ｂの揺動角度の変化に従い、標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査されて、標本Ｓが刺激される。

このようにして、光路切替第１ＤＭ７および光路切替第２ＤＭ９により観察走査光学系２０の光路と刺激走査光学系３０の光路とを切替えながら、標本Ｓの光刺激による反応を画像上で観察することができる。

この場合において、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置１００によれば、観察走査光学系２０および刺激走査光学系３０が、光束径変換光学系５から各スキャナ２５，３５までの光路長が互いに等しい光路を有することで、観察走査光学系２０を用いる場合と刺激走査光学系３０を用いる場合とでレーザ光の波長を同じにした場合は、これら２つの走査光学系２０，３０の光路を切替えても、対物レンズ１７の瞳位置におけるレーザ光の波面を一致させて、２つの走査光学系２０，３０間で焦点位置がずれるのを防ぐことができる。また、この場合は、観察走査光学系２０の光路と刺激走査光学系３０の光路とを切替える際に、光束径変換光学系５の調整を不要にすることができる。すなわち、２つのレンズ６Ａ，６Ｂを光軸方向に移動させなくて済む。

また、観察走査光学系２０を用いる場合と刺激走査光学系３０を用いる場合とでレーザ光の波長を異なるものにした場合でも、対物レンズ１７とレーザ光の波長を変更したときに光束径変換光学系５を調整するための調整テーブルが２つの走査光学系２０，３０に共通の１つで済む。したがって、調整テーブルを作成するための調整時間を短縮できるとともに、調整テーブルを記憶させるメモリ（図示略）の容量を抑えることができる。
さらに、光束径変換光学系５がレーザ光の光束径の調節に伴ってレーザ光の波面を変化させるような簡易な構成であっても、２つの走査光学系２０，３０の相対的な焦点位置ずれを生じさせずに観察を行うことができる。

本実施形態においては、観察走査光学系２０および刺激走査光学系３０が、反射ミラー３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄ、反射ミラー３３およびＤＭ２３により、光束径変換光学系５からそれぞれのスキャナ２５，３５までの光路長が互いに等しくなるように光路が形成されていることとしたが、２つの走査光学系２０，３０がレンズやミラー等の複数の光学素子により互いに光路長が等しくなるように光路が形成されていればよく、各走査光学系２０，３０の光学素子の数や配置は上記実施形態に限定されるものではない。

５ 光束径変換光学系
７ 光路切替第１ＤＭ（光路切替部）
９ 光路切替第２ＤＭ（光路切替部）
１７ 対物レンズ
２０ 観察走査光学系（走査光学系）
２５，３５ スキャナ（走査部）
３０ 刺激走査光学系（走査光学系）
１００ レーザ走査型顕微鏡装置（顕微鏡装置）

Claims (4)

1. レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
   該対物レンズにより照射するレーザ光を標本上で走査させる走査部を含む複数の光学素子からなり、これら複数の光学素子により互いに異なる光路を形成する２つの走査光学系と、
   該２つの走査光学系の光路を切替可能な光路切替部と、
   前記２つの走査光学系に入射させる前記レーザ光の光束径を変換可能な光束径変換光学系とを備え、
   前記２つの走査光学系が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に前記走査部が配され、前記複数の光学素子により前記光束径変換光学系から前記走査部までの光路長が互いに等しくなるように前記光路が形成されている顕微鏡装置。
2. 前記光束径変換光学系が、前記レーザ光の光束径を変換することにより前記対物レンズの瞳位置における前記レーザ光の波面を変化させる請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記光束径変換光学系が、２つのレンズ間の光軸方向の距離を変化させることによりレーザ光の光束径を拡大または縮小するガリレオ式またはケプラー式のビームエキスパンダである請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記対物レンズとレーザ光の波長を変更した場合に前記光束径変換光学系を調整するための調整テーブルが、前記２つの走査光学系で共通である請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。

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