JP5590963B2 - 光学装置および走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、光学装置および走査型顕微鏡に関するものである。

従来、光源と対物レンズとの間に光源から発せられる照明光に任意の波面変換を付与する波面変調素子を配置し、その波面変調素子を用いて、対物レンズによって集光する照明光の波面を補正する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
また、対物レンズを機械的に光軸方向に移動させて、標本内部の各面における光学像を順次取り込んでいくことにより、標本の３次元画像を作成するレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。

特許文献１の方法において、波面変調素子の収差補正の作用を有効に機能させるためには、波面変調素子を対物レンズの入射瞳面またはこれと光学的に共役な位置に配置することが好ましい。もし、波面変調素子が対物レンズの入射瞳面と共役な位置に配置されていないとすると、収差が発生して対物レンズの性能を発揮することができないことになる。

特開平１１−１０１９４２号公報 特開２００５−２４６４２号公報

しかしながら、特許文献２のように標本の３次元画像を作成する場合に、対物レンズを機械的に光軸方向に移動させると、その入射瞳位置が変動して波面変調素子と対物レンズの入射瞳面との共役な関係が維持できなくなるため、対物レンズの集光性能が劣化して高精度の観察を行うことができないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、対物レンズが光軸方向に移動しても、照射光を精度よく集光することができる光学装置および走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、照射光の波面を変調する波面変調部と、該波面変調部により波面が変調された照射光を標本に集光する対物レンズと、該対物レンズを光軸方向に移動させる対物移動機構と、前記波面変調部により変調された波面を対物レンズにリレーするリレー光学系と、前記対物移動機構による前記対物レンズの移動に伴う光路長の増減を補償するように前記対物レンズと前記リレー光学系との間の光路長を調整する光路長調整部とを備え、該光路調整部は、少なくとも２つのミラーを有し、前記光路長を調整する前後で、前記２つのミラーを互いに異なる方向に移動した位置に配置する光学装置を提供する。

本発明によれば、波面変調部により波面が変調された照射光は、リレー光学系によって対物レンズによりリレーされ、対物レンズに入射される前に光路長調整部を通過させられる。対物移動機構の作動により対物レンズが光軸方向に移動させられると、光路長調整部が対物レンズとリレー光学系との間の光路長を調整して、対物レンズの移動に伴う光路長の増減を補償するので、波面変調部と対物レンズの入射瞳位置とを光学的に共役な状態に維持することができる。これにより、対物移動機構によって対物レンズを光軸方向の種々の位置に移動しても、集光性能を劣化させることなく、照射光を精度良く集光させることができ、標本の鮮明な３次元画像を取得することができる。

上記発明においては、前記光路長調整部が、光路長の異なる複数の光路長調整ユニットと、前記対物移動機構による対物レンズの移動量に基づいて、いずれかの前記光路長調整ユニットを選択的に光路上に配置するユニット切替機構とを備えていてもよい。
このようにすることで、照射光の集光位置を対物レンズの光軸方向に変化させるために、対物レンズを光軸方向に移動させたときには、ユニット切替機構の作動により、対物レンズの移動量に対応する光路長調整ユニットを選択的に光路上に配置することで、対物レンズの移動に伴って光路長が増減してもこれを補償して、波面変調部と対物レンズの入射瞳位置とを光学的にほぼ共役な状態に維持することができる。

また、上記発明においては、前記光路長調整部が、前記対物移動機構による対物レンズの移動量に基づいて、前記対物レンズと前記リレー光学系との間の光路長を連続的に調整してもよい。
このようにすることで、対物レンズの光軸方向の位置を任意の位置に移動しても、光路長調整部によって光路長を補償して、集光性能を劣化させることなく、照射光を精度良く集光させることができる。

本発明によれば、対物レンズが光軸方向に移動しても、照射光を精度よく集光することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る光学装置を示す模式図である。 図１の光学装置の光路長調整ユニットの変形例を示す図であり（ａ）光路長が長い場合、（ｂ）光路長が短い場合をそれぞれ示している。 図２の光路長調整ユニットに、多光子蛍光観察の場合に用いられる偏光ビームスプリッタの透過率特性を示すグラフである。 図２の光路長調整ユニットに、一光子蛍光観察の場合に用いられる偏光ビームスプリッタの透過率特性を示すグラフである。 図１の光学装置の光路長調整ユニットの他の変形例を示す図である。 図１の光学装置の光路長調整ユニットの他の変形例を示す図である。 図１の光学装置の光路長調整ユニットの他の変形例を示す図である。 図１の光学装置の光路長調整ユニットの他の変形例を示す図である。 図１の光学装置の変形例を示す模式図である。 図１の光学装置の他の変形例を示す模式図である。 図１の光学装置の他の変形例を示す模式図である。

本発明の一実施形態に係る光学装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る光学装置１は走査型顕微鏡であって、図１に示されるように、励起光、刺激光等の照射光を発生する光源装置２と、該光源装置２から射出された照射光によって標本Ａを観察する顕微鏡本体３とを備えている。

光源装置２は、レーザ光Ｌを発生するレーザ光源４と、該レーザ光源４から発せられたレーザ光Ｌをコリメートするコリメートレンズ５とを備えている。

顕微鏡本体３は、光源装置２から発せられたレーザ光Ｌの波面を変調する波面変調部６と、波面変調部６により波面が変調されたレーザ光Ｌをリレーする第１のリレー光学系９および第２のリレー光学系１０と、これら第１および第２のリレー光学系９，１０の間に配置され、レーザ光Ｌを２次元的に走査するスキャナ１１と、第２のリレー光学系１０によってリレーされたレーザ光Ｌを通過させる光路長調整部１２と、該光路長調整部１２を通過したレーザ光Ｌを標本Ａに集光する対物レンズ１３と、標本Ａにおいて発生し、対物レンズ１３により集光され、レーザ光Ｌから分岐された蛍光Ｆ等の観察光を検出する光検出器１４とを備えている。

波面変調部６は、レーザ光源４から発せられたレーザ光Ｌを反射して迂回させるプリズム７と、該プリズム７によって反射されたレーザ光Ｌを反射し、その際に、レーザ光Ｌの波面を変調してプリズム７に戻す反射型の液晶デバイス（ＬＣＯＳ：Liquid-Crystal on Silicon）８とを備えている。液晶デバイス８は、多くの画素に分かれていて、各画素毎にシリコン基板とこれに対向する透明基板との間に液晶分子を挟み込み、鏡面状のシリコン基板の背面に液晶分子に電圧を加えるための電極が形成された構造を有している。

液晶デバイス８は、電極に加える電圧を制御して入射光の位相を変えることによって、液晶分子の配向方向と一致した偏光方向の入射光に対して、自在に位相を変調することができるようになっている。
すなわち、レーザ光源４から射出されたレーザ光Ｌは液晶デバイス８の液晶分子の配向方向と一致する偏光方向を有することにより、液晶デバイス８によってその波面が変調されて反射される。液晶デバイス８によりレーザ光Ｌに付与する波面変調は、例えば、レーザ光源４から後述する対物レンズ１３に至る種々の光学素子において発生する収差を補償して、対物レンズ１３の前方にレーザ光Ｌを精度よく集光させるように行われるものである。

第１のリレー光学系９によって波面変調部６の液晶デバイス７とスキャナ１１とが光学的に共役な位置関係に配置され、第２のリレー光学系１０によってスキャナ１１と対物レンズ１３の入射瞳位置とが光学的に共役な位置に配置されている。
スキャナ１１は、例えば、異なる軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー１１ａ，１１ｂを備え、入射されるレーザ光Ｌを２次元的に走査することができるようになっている。

光路長調整部１２は、複数の光路長調整ユニット１５と、該光路長調整ユニット１５のいずれかを選択的に対物レンズ１３の光軸上に配置するターレット１６と、該ターレット１６を制御する制御部１７とを備えている。各光路長調整ユニット１５は、第２のリレー光学系１０から射出されたレーザ光Ｌを反射するミラー１８と、該ミラー１８によって反射されたレーザ光Ｌを反射して対物レンズ１３に入射させる一方、対物レンズ１３によって集光された蛍光Ｆを透過させるダイクロイックミラー１９とを備えている。図中、符号１６ａはモータである。

各光路長調整ユニット１５は、ミラー１８およびダイクロイックミラー１９の少なくとも一方の配置を異ならせている。これにより、対物レンズ１３の光軸上に配置する光路長調整ユニット１５を切り替えることで、第２のリレー光学系１０から光路長調整ユニット１５の出口までの光路長を切り替えることができるようになっている。図中、符号２１は集光レンズである。

対物レンズ１３には、該対物レンズ１３の光軸方向位置を変更するための対物移動機構２０が設けられている。対物移動機構２０は、例えば、直動モータである。光路長調整部１２の制御部１７は、対物移動機構２０による対物レンズ１３の光軸方向位置の切替信号を受けて、対応する光路長調整ユニット１５を選択し、選択された光路長調整ユニット１５を対物レンズ１３の光軸上に配置するようになっている。

制御部１７には、例えば、対物レンズ１３の光軸方向位置と光路長調整ユニット１５の種類とを対応づけて記憶した対応テーブルが備えられており、対物レンズ１３の光軸方向位置が設定されると、この対応テーブルから対応する光路長調整ユニット１５が選択されるようになっている。これにより、対物レンズ１３の移動によって対物レンズ１３の入射瞳位置が変動しても、スキャナ１１から対物レンズ１３の入射瞳位置までの光路長の変化を抑えるように補償することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る光学装置１の作用について以下に説明する。
レーザ光源４から発せられたレーザ光Ｌは、波面変調部６に入射され、プリズム７によって反射されて液晶デバイス７に入射される。レーザ光Ｌの偏光方向を液晶分子の配向方向に水平に設定しておくことにより、レーザ光Ｌの波面が液晶デバイス７によって変調される。

光源装置２により生成されたレーザ光Ｌが顕微鏡本体３に入射されると、第１のリレー光学系９によってリレーされ、スキャナ１１によって２次元的に走査され、第２のリレー光学系１０によってリレーされ、光路長調整部１２を通過させられた後に、対物レンズ１３によって標本Ａに集光される。このとき、液晶デバイス７、スキャナ１１および対物レンズ１３の入射瞳位置は相互に光学的に共役な位置関係に配置されているので、液晶デバイス７によって変調された波面は対物レンズ１３の入射瞳位置に正確にリレーされ、対物レンズ１３によって標本Ａにレーザ光Ｌを精度よく集光することができる。

また、レーザ光Ｌの集光位置において発生した蛍光Ｆ等の観察光は、対物レンズ１３によって集光されて光路長調整部１２内に備えられた光路長調整ユニット１５のダイクロイックミラー１９を通過して光検出器１４により検出される。レーザ光Ｌが標本Ａに精度よく集光されることにより、標本Ａの鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。

この場合において、標本Ａのさらに深い位置あるいはさらに浅い位置の蛍光画像を取得するために、対物移動機構２０によって対物レンズ１３を光軸方向に移動させると、制御部１７がその移動量に応じた光路長調整ユニット１５を選択し、ターレット１６を回転させて、選択された光路長調整ユニット１５を対物レンズ１３の光軸上に配置する。これにより、対物レンズ１３の移動による光路長の変動分（増減）を補償して、第２のリレー光学系１０から対物レンズ１３の入射瞳位置までの光路長をほぼ一定に維持することができる。つまり、対物レンズ１３を光軸方向に移動させても、液晶デバイス７を対物レンズ１３の入射瞳面と光学的にほぼ共役な位置に配置した状態を維持することができる。

このように、本実施形態に係る光学装置１によれば、対物レンズ１３を光軸方向に移動させても、標本Ａの深さ方向に異なる複数の位置において照射光を精度よく集光することができる。したがって、蛍光観察を行う場合には、標本Ａの３次元的な蛍光観察を精度よく行うことができるという利点がある。特に、照射光の波面が変調されている場合には、波面変調部６と対物レンズ１３の入射瞳位置との共役関係の有無が標本Ａにおける照射光の集光精度に影響を与えやすいが、本実施形態に係る光学装置１によれば、その共役関係を良好に維持することができる。したがって、波面変調部６により照射光の波面が変調された場合であっても、標本Ａに照射光を精度よく集光させて、標本Ａの３次元的な蛍光観察を精度よく行うことができる。

なお、本実施形態においては、光路長調整ユニット１５として、ミラー１８とダイクロイックミラー１９との組み合わせからなるものを採用したが、これに限定されるものではなく、図２に示されるように、偏光ビームスプリッタ２２、λ／４板２３およびミラー２４の組み合わせからなるものを採用してもよい。
この場合、偏光ビームスプリッタ２２としては、多光子蛍光観察の場合には、図３に示されるもの、一光子蛍光観察の場合には、図４に示されるように、それぞれ波長依存性のある透過率特性を有するものを採用すればよい。

すなわち、例えば、多光子蛍光観察の場合、レーザ光ＬとしてＰ偏光を有するものを使用し、第２のリレー光学系１０から光路長調整ユニット１５に入射させると、Ｐ偏光からなるレーザ光Ｌは偏光ビームスプリッタ２２を透過した後、λ／４板２３を通過して円偏光となり、ミラー２４によって折り返されて再度λ／４板２３を通過させられることによりＳ偏光となる。これにより、レーザ光Ｌは、偏光ビームスプリッタ２２によって反射されて対物レンズ１３に入射され、対物レンズ１３によって標本Ａに集光され、集光位置に存在する蛍光物質を励起して蛍光Ｆを発生させる。

発生した蛍光Ｆは、Ｐ偏光およびＳ偏光の両偏光成分を含んでいるが、レーザ光Ｌの波長に対して十分に低い波長を有しているので、図３に示される透過率特性を有する偏光ビームスプリッタ２２を透過して集光レンズ２１によって集光され光検出器１４により検出されるようになる。
このように、偏光ビームスプリッタ２２とミラー２４との相対位置を異ならせることにより、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、第２のリレー光学系１０から対物レンズ１３の入射瞳位置までの光路長の異なる光路長調整ユニット１５が構成されている。

また、ミラー１８とダイクロイックミラー１９とによって構成された光路長調整ユニット１５に代えて、図５に示されるように、プリズム２５の一面に反射膜２５ａを形成し、他の一面にダイクロイック膜２５ｂを形成することにより構成された光路長調整ユニット１５を採用してもよい。

また、複数の光路長調整ユニット１５とこれら光路長調整ユニット１５を選択的に光軸上に配置するターレット１６とにより、光路長を段階的に切り替える光路長調整部１２に代えて、図６〜図８に示されるように、光路長を連続的に調整する光路長調整部１２を採用してもよい。
この光路長調整部１２は、第２のリレー光学系１０から射出されたレーザ光Ｌを反射するプリズム２６と、該プリズム２６により反射されたレーザ光Ｌを折り返してプリズム２６に再入射させるミラー２７と、該ミラー２７とプリズム２６との相対距離を連続的に変化させるミラー移動部２８とを備えている。符号２８ａはモータである。

制御部１７は、対物レンズ１３を光軸方向に移動させる対物移動機構２０による対物レンズ１３の移動量に応じて、ミラー移動部２８によってミラー２７を移動させることにより、光路長を連続的に変化させて、第２のリレー光学系１０から対物レンズ１３の入射瞳位置までの光路長を一定に維持することができる。これにより、対物レンズ１３を光軸方向に移動させても、液晶デバイス７を対物レンズ１３の入射瞳面と光学的に共役な位置に配置した状態が維持されるので、標本Ａの深さ方向に異なる複数の位置において照射光をより高精度に集光することができる。

ここで、プリズム２６とミラー２７に代えて、図７に示されるように、ミラー１８およびダイクロイックミラー１９をそれぞれ移動させるモータ１８ａ，１９ａを備える光路長調整部１２を採用してもよい。

また、図８に示されるように、図２に示した偏光ビームスプリッタ２２を有する構造の光路長調整部１２において、モータ２４ａによってミラー２４を連続的に移動させることにより、光路長を連続的に変化させることにしてもよい。

また、本実施形態においては光学装置１として、走査型顕微鏡を例示したが、これに代えて、図９に示されるように、対物レンズ１３によって標本Ａに照射するレーザ光Ｌの位相パターンを液晶デバイス７で形成し、そのホログラム像を標本Ａに投影するホログラム投影装置であってもよい。

この光学装置１としてのホログラム投影装置は、波面変調部６と光路長調整部１２との間に単一のリレー光学系１０を備えている点で、２つのリレー光学系９，１０とスキャナ１１とを備えている図１の走査型顕微鏡と相違している。また、液晶デバイス７で形成される位相パターンの例としては、標本Ａに単一の集光点を形成するための位相パターンと、標本Ａの焦点面内や光軸方向に複数の集光点を形成するための位相パターンとが挙げられる。そして、その位相パターンは、対物レンズ１３の入射瞳位置にリレーされる。

このようにすることで、レーザ光源４から発せられたレーザ光Ｌは、液晶デバイス７により設定された位相パターンに対応した波面に変調されて対物レンズ１３の入射瞳位置にリレーされ、標本Ａの所望の位置あるいは領域を刺激する。このとき、標本Ａ内で刺激される位置または領域は、液晶デバイス７により形成された位相パターンを標本Ａに投影して得られるホログラム像に対応している。

そして、刺激された位置または領域から発生した蛍光Ｆ等の観察光は光検出器１４により検出され、蛍光観察が行われる。この際に、対物レンズ１３を光軸方向に移動させて刺激位置を標本Ａの深さ方向に調節しても、リレー光学系１０から対物レンズ１３の入射瞳位置までの光路長を一定に維持することにより、液晶デバイス７を対物レンズ１３の入射瞳面と光学的にほぼ共役な位置に配置した状態を維持することができる。

このように、本変形例に係るホログラム投影装置によれば、対物レンズ１３を光軸方向に移動させても、位相パターンに基づいて標本Ａに投影されたホログラム像に従って、照射光を用いて標本Ａの所望の位置あるいは領域を精度よく刺激することができる。

なお、図１０に示されるように、ホログラム投影装置として、観察用の励起光Ｅを照射する他の光源３０を備える構成を採用してもよい。
光源３０は水銀灯、キセノンランプあるいはＬＥＤのような広帯域の照射光を発生する光源部３１と、該光源部３１から発せられた照射光の内、特定の波長帯域の励起光Ｅのみを選択的に透過する励起フィルタ３２と、該励起フィルタ３２を透過した励起光Ｅを反射し、蛍光Ｆおよびレーザ光源４からのレーザ光Ｌを透過するダイクロイックミラー３３とを備えている。図中符号３４はレンズ、符号３５は蛍光Ｆを透過しそれ以外の波長の光を遮断する吸収フィルタである。

このようにすることで、レーザ光源４から発せられたレーザ光Ｌの波面を変調して標本Ａの所望の位置あるいは領域を精度よく刺激しつつ、光源３０からの励起光Ｅを標本Ａの所定領域に照射して蛍光物質を励起し、発生した蛍光を撮影して蛍光観察を行うことができる。

また、図１１に示されるように、観察用の照明光学系３６として、レーザ光源３７と、スキャナ３８と、リレー光学系３９とを備えるものを用意し、レーザ光源３７から射出され、スキャナ３８によって走査され、リレー光学系３９によりリレーされたレーザ光Ｌ１を、ダイクロイックミラー４０によって、リレー光学系１０と光路長調整部１２との間の光路に合流させることにしてもよい。図中、符号４１はコリメートレンズである。

スキャナ３８と対物レンズ１３の焦点位置とは光学的に共役な位置関係に配置されている。これにより、レーザ光源４からのレーザ光Ｌを用いて標本Ａの所望の位置あるいは領域を精度よく刺激しながら、照明光学系３６から導いたレーザ光Ｌ１を標本Ａ上で走査して、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

また、他の光源３０または照明光学系３６が、ホログラム投影装置に代えて走査型顕微鏡に設けられることとしてもよい。

Ａ 標本
Ｌ レーザ光（照射光）
１ 光学装置
２ 光源装置
３ 顕微鏡本体
６ 波面変調部
９ リレー光学系（第１のリレー光学系）
１０ リレー光学系（第２のリレー光学系）
１２ 光路長調整部
１３ 対物レンズ
１５ 光路長調整ユニット
１６ ターレット（ユニット切替機構）
２０ 対物移動機構

Claims (6)

1. 照射光の波面を変調する波面変調部と、
   該波面変調部により波面が変調された照射光を標本に集光する対物レンズと、
   該対物レンズを光軸方向に移動させる対物移動機構と、
   前記波面変調部により変調された波面を対物レンズにリレーするリレー光学系と、
   前記対物移動機構による前記対物レンズの移動に伴う光路長の増減を補償するように前記対物レンズと前記リレー光学系との間の光路長を調整する光路長調整部とを備え、
   該光路調整部は、少なくとも２つのミラーを有し、前記光路長を調整する前後で、前記２つのミラーを互いに異なる方向に移動した位置に配置する光学装置。
2. 前記光路長調整部が、光路長の異なる複数の光路長調整ユニットと、前記対物移動機構による対物レンズの移動量に基づいて、いずれかの前記光路長調整ユニットを選択的に光路上に配置するユニット切替機構とを備える請求項１に記載の光学装置。
3. 前記光路長調整部が、前記対物移動機構による対物レンズの移動量に基づいて、前記対物レンズと前記リレー光学系との間の光路長を連続的に調整する請求項１に記載の光学装置。
4. 前記光路長調整部は、前記２つのミラーの各々を互いに直交する方向に独立に駆動するモータを備え、前記光路長を調整する前後で、前記２つのミラーを互いに直交する方向に移動した位置に配置する請求項３に記載の光学装置。
5. 前記リレー光学系の光軸と前記対物レンズの光軸とが、互いに直交しており、
   前記２つのミラーのうちの一方は、前記リレー光学系から該リレー光学系の光軸と前記対物レンズの光軸との交点を越えた位置に配置され、前記リレー光学系からの照射光を、前記交点の前記対物レンズとは反対側において前記対物レンズの前記光軸と交わるように反射し、
   前記２つのミラーのうちの他方は、前記交点の前記対物レンズとは反対側において前記対物レンズの光軸上に配置され、前記一方のミラーからの照射光を前記対物レンズへ向かって反射する請求項１から請求項４のいずれかに記載の光学装置。
6. 請求項１から請求項５のいずれかに記載の光学装置と、
   光検出器と、
   前記対物レンズによって集光された前記標本からの光を前記光検出器に集光する集光レンズとを備える走査型顕微鏡。

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