JP4414722B2

JP4414722B2 - レーザー顕微鏡

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Publication number: JP4414722B2
Application number: JP2003355165A
Authority: JP
Inventors: 大介西脇
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2023-10-15
Also published as: US7187494B2; US20050174631A1; JP2005121796A

Description

本発明は、レーザー走査型顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）とを切り替え可能又は同時使用可能なレーザー顕微鏡に関する。

生物学や医学等の分野において、生体組織や細胞上で蛍光染色を施した蛋白質や遺伝子等を検出するための手段として、特に近年、遺伝子の解析や細胞内構造の解明等にレーザー走査型顕微鏡が用いられている。
図４は従来の代表的なレーザー走査型顕微鏡の一構成例を示す概略構成図である。
図４に示すレーザー走査型顕微鏡では、レーザー光源１から発せられたレーザー光は、波長選択素子２で反射され、偏向手段３ａ，３ｂを介してＸＹ方向に走査するように偏向された後に、瞳投影光学系４、結像光学系５を通り、ミラー２３ａで反射され、結像対物レンズ６を通過して標本７へスポット状に照射される。標本７上に照射されたスポットは、制御装置４０により駆動制御される偏向手段３ａ，３ｂを介してＸＹ平面（光軸に対して垂直な平面）内を走査する。レーザー光の照射により励起された標本７からは蛍光が発せられる。蛍光は、対物レンズ６、ミラー２３ａ、結像光学系５、瞳投影光学系４、走査手段３ａ，３ｂを経由し、波長選択素子２を透過してコンフォーカルアパ−チャ８位置に集光される。そして、コンフォーカルアパーチャ８を通過した蛍光が検出器９で検出される。
なお、図４の顕微鏡では、回転板やスライダ等の切り換え部材２４を介してミラー２３ａとダイクロイックミラーなどの波長選択素子２３ｂとを切り換えることができるようになっている。波長選択素子２３ｂに切り換えた場合、標本７から発せられた蛍光は、対物レンズ６、波長選択素子２３ｂ、バリアフィルタ２７、結像レンズ２８を通り、２次元検出器３０で検出され、または観察光学プリズム２９を介して目視によって観察される。これにより、通常の蛍光観察を行うことができる。

また、近年、生体の細胞膜の機能解析をするために全反射蛍光顕微鏡が使用されるようになってきている。
図５は従来の代表的な全反射蛍光顕微鏡の一構成例を示す概略構成図である。
図５に示す全反射蛍光顕微鏡では、レーザー光源１から発せられたレーザー光は、照明光学系２２を通り、ダイクロイックミラーなどの波長選択素子２３ｂで反射され、対物レンズ６の瞳位置３２において光軸から偏心した位置に集光される。集光されたレーザー光は、対物レンズ６を介して標本７に対し所定の入射角度をもって照射される。所定の入射角度をもって標本７に照射されたレーザー光は、カバーガラス１０と標本７との界面で全反射される。このときカバーガラス１０と標本７の界面から標本７側にエバネッセント光がしみだし、このエバネッセント光によって標本７を励起する。標本７は励起されることで蛍光を発する。標本７から発生した蛍光は、対物レンズ６によって集光され、波長選択素子２３ｂを透過し、バリアフィルタ２７によって蛍光のみが透過し、結像レンズ２８を通り、２次元検出器３０で検出され、または観察光学プリズム２９を介して目視によって観察される。
そして、全反射蛍光顕微鏡では、レーザー光源１の射出位置を照明光学系の光軸から偏心させる、あるいは光路内に別個にオフセット機構を導入してレーザー光を偏心させることによって、対物レンズ６の瞳位置３２上においてレーザー光が集光する光軸からの偏心位置を調整し、標本７へ照射する角度を変化させ、カバーガラス１０と標本７の界面からのエバネッセント光のしみだし深さを調整することができるようになっている。
ここで、エバネッセント光の強度は界面から遠ざかるほど急激に弱くなる。本願では、その強度が界面での強度の１／ｅになる界面からの距離をしみだし深さとする。

しかるに、近年、医学、生物学等の分野においては、レーザー走査型顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡の両方が必要となっている。
しかし、これらの２台の顕微鏡を揃えておき、同じ試料に対してレーザー走査型顕微鏡観察と全反射蛍光顕微鏡観察を行うのにこれら２つの顕微鏡を取りかえるのでは、時間がかかる上、コスト高となる。
そこで、従来、このようなレーザー走査型顕微鏡観察と全反射蛍光顕微鏡観察とを切り替えて使用することができるようにした顕微鏡が、例えば、次の特許文献１に提案されている。
特開２００３−２９１５３号公報

特許文献１に記載の顕微鏡は、図６に示すように、レーザー光源１と、レーザー光源１から発せられたレーザー光を走査するレーザー走査装置としての偏向手段３ａ，３ｂと、このレーザー光を対物レンズ６を介して標本７上に照射して、標本７から蛍光を発生させるための照射光学系２２（瞳投影光学系４，結像光学系５）と、標本７からの蛍光を検出する検出手段９を備えている。そして、このレーザー光を対物レンズ６の瞳位置３２と共役な位置に集光させる集光レンズ１８と、レーザー光に対して平行に所定の距離だけ偏心させ、対物レンズ６の中心から偏心させた位置にレーザー光を入射させるとともに、対物レンズ６で屈折させて標本７に対してレーザー光を斜めに入射させ、標本７に接するように配置された透明でかつ標本７に接する面が平坦なカバー材、または標本７が接するように保持された透明でかつ標本７に接する面が平坦な標本保持部材１０と標本７との界面でこのレーザー光を全反射させるオフセット手段１９と、集光レンズ１８とオフセット手段１９とをそれぞれ単体もしくは一体にしてレーザー光の光路上に入れる第１の位置と光路上から外す第２の位置とに挿脱可能な挿脱手段２０とをさらに備えている。また、ミラー２３ａと、ダイクロイックミラー２３ｂ及びバリアフィルタ２７とが、回転板２４に設けられており、光路上にいずれかが選択的に切り換えられるになっている。
そして、挿脱手段２０を光路上に挿入することにより、全反射蛍光顕微鏡観察を行うことができ、挿脱手段２０を光路上から外すことにより、レーザー走査型顕微鏡観察を行うことができるようになっている。

即ち、全反射蛍光顕微鏡観察を行う場合、挿脱手段２０を光路上に挿入するとともに、回転板２４を介してダイクロイックミラー２３ｂ及びバリアフィルタ２７を光路上にセットする。
レーザー光源１から発せられたレーザー光は、集光レンズ１８、オフセット手段１９、波長選択素子２、偏向手段３ａ，３ｂ、瞳投影光学系４を通り、ダイクロイックミラー２３ｂで反射され、結像光学系５を経て、対物レンズ６の瞳位置３２において光軸から偏心した位置に集光される。集光されたレーザー光は、対物レンズ６を介して標本７に対し所定の入射角度をもって照射される。所定の入射角度をもって標本７に照射されたレーザー光は、カバーガラス１０と標本７との界面で全反射される。このときカバーガラス１０と標本７の界面から標本７側にエバネッセント光がしみだし、このエバネッセント光によって標本７を励起する。標本７は励起されることで蛍光を発する。標本７から発生した蛍光は、対物レンズ６によって集光され、結像光学系５を経て、ダイクロイックミラー２３ｂを透過し、バリアフィルタ２７によって蛍光のみが透過し、２次元検出器３０で検出される。または、観察光学プリズム２９、バリアフィルタ２７を介して蛍光のみが目視によって観察される。

一方、レーザー走査型顕微鏡観察を行う場合、挿脱手段２０を光路上から外すとともに、回転板２４を介してミラー２３ａを光路上にセットする。
レーザー光源１から発せられたレーザー光は、波長選択素子２で反射され、図示省略した制御装置により駆動制御される偏向手段３ａ，３ｂを介してＸＹ方向に走査するように偏向された後に、瞳投影光学系４、ミラー２３ａで反射され、結像光学系５、対物レンズ６を通過して標本７へスポット状に照射される。標本７上に照射されたスポットは、偏向手段３ａ，３ｂを介してＸＹ平面（光軸に対して垂直な平面）内を走査する。レーザー光の照射により励起された標本７からは蛍光が発せられる。蛍光は、対物レンズ６、結像光学系５、ミラー２３ａ、瞳投影光学系４、走査手段３ａ，３ｂを経由し、波長選択素子２を透過してコンフォーカルアパーチャ８に集光される。そして、コンフォーカルアパーチャ８を通過した光が検出器９で検出される。

しかし、特許文献１に記載の顕微鏡では、レーザー走査型顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切り替える場合に、レーザー走査型顕微鏡の偏向手段３ａ，３ｂを所定の位置に固定し、オフセット手段１９のようなオフセット機構を挿入した後、オフセット機構を用いてレーザー光を偏心させるため手間がかかる。加えて、オフセット機構を駆動するための装置が別途必要となる。
また、顕微鏡においては、使用する対物レンズごとに瞳位置が異なる。特許文献１に記載の顕微鏡では、瞳位置が異なる複数の対物レンズを用いる場合におけるレーザー走査型顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡への切り替え手段については提案されていない。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、レーザー走査型顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡へと、新たなオフセット機構と駆動装置を必要とすることなく安価かつ迅速に切り替えることができ、しかも、瞳位置の異なる複数の対物レンズに対応して切り替えることができる顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明によるレーザー顕微鏡は、レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光を偏向する偏向手段と、対物レンズを介して前記レーザー光を標本に照射する照射手段と、前記標本から発した蛍光を検出する検出手段と、光路に挿脱可能に配置されていて前記対物レンズの瞳位置で前記レーザー光の主光線が光軸に対して略平行になるように該レーザー光を集光させる集光レンズと、を有しており、前記偏向手段は、前記集光レンズを光路から外したときには、前記レーザー光を前記標本面上で走査させ、前記集光レンズを光路に挿入したときには、前記レーザー光を前記対物レンズの瞳中心から偏心させるようにしたメインスキャナと、前記レーザー光源と同様に構成されたレーザー光源と、前記偏向手段と同様に構成された偏向手段と、前記照射手段と同様に構成された照射手段と、前記検出手段と同様に構成された検出手段と、及び前記集光レンズと同様に構成された集光レンズと、を有しているサブスキャナと、を備えたことを特徴としている。

本発明によれば、それぞれのスキャナをレーザー走査型顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡との構成のいずれかにすることで、多用な顕微鏡観察を同時に行うことが可能になる。

実施例の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本発明のレーザー顕微鏡によれば、レーザー走査型顕微鏡に集光レンズを光路に挿脱するだけで全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）に切り替えることができ、従来のように、新たなオフセット機構と駆動装置が必要なく安価に全反射蛍光顕微鏡が構築できる。
また、本発明のレーザー顕微鏡のように、光束の偏心を走査型顕微鏡に備えられている走査手段（偏向手段）で行うようにすれば、エバネッセント光のしみだし深さの変更、全反射蛍光顕微鏡観察と通常蛍光観察の切り替えを高速に行うことができる。
また、本発明のレーザー顕微鏡によれば、エバネッセント観察時の蛍光像と、通常蛍光観察時の蛍光像の強度比を取るようにすることで、観察している標本の深さ方向の情報を得ることができる。
また、本発明のレーザー顕微鏡のように、対物レンズを光軸方向に移動可能にすれば、瞳位置の異なる複数の対物レンズにも対応できる。

以下、本発明の実施例について図面を用いて説明する。
図１は本発明による顕微鏡の実施例１を示す概略構成図であり、(a)はレーザー走査型顕微鏡使用時、(b)は全反射蛍光顕微鏡使用時の状態を示している。
本実施例の顕微鏡は、図４で示したレーザー走査型顕微鏡の構成に加えて、集光レンズとしてのレンズユニット３１ａ，３１ｂを光路内（図４では瞳投影光学系４と結像光学系５との間、結像光学系５と対物レンズ６との間の２箇所）に挿脱可能に具備して構成されている。
レンズユニット３１ａ，３１ｂは、光路内に挿入されたときに、レーザー光を対物レンズ６の瞳位置３２に主光線が光軸に対して略平行になるように集光させるようになっている。また、レンズユニット３１ａ，３１ｂは、光路内に挿入されたときに、照射手段（瞳投影光学系４及び結像光学系５）の瞳位置が偏向手段３ａ，３ｂの位置に一致するようになっている。
偏向手段３ａ，３ｂは、照射手段の瞳位置にあるため、制御装置４０を介してレーザー走査型顕微鏡と同様にレーザー光をＸＹ方向へ走査させるように偏向することによって、対物レンズ６の瞳位置３２に集光する光線の光軸からの偏心量を変化させることが可能となっている。

対物レンズ６の瞳位置３２は、対物レンズによって異なるため、複数の対物レンズに対応するためにはレーザー光の主光線が光軸に対して略平行となるように集光する光軸方向の位置を異なる対物レンズに応じて変える必要がある。
本実施例の顕微鏡では、レンズユニット３１ａ，３１ｂが光軸方向に移動可能であり、これによってレーザー光の集光する位置を光軸方向に移動させることが可能となっている。

このように構成された本実施例の顕微鏡では、レーザー走査型顕微鏡として使用する場合には、レンズユニット３１ａ，３１ｂを光路から取り外すとともに、ミラー２３ａを光路上にセットすると、図４に示した従来のレーザー走査型顕微鏡と同様の作用、機能を奏する。

全反射蛍光顕微鏡として使用する場合には、光路内にレンズユニット３１ａ，３１ｂを挿入するとともに、波長選択素子２３ｂを光路上にセットする。
レンズユニット３１ａ，３１ｂを挿入した場合、レーザー光源１から発せられたレーザー光は、波長選択素子２によって反射され、制御装置４０により駆動制御される偏向手段３ａ，３ｂによってＸＹ方向に偏向された後、瞳投影光学系４、結像光学系５、波長選択素子２３ｂ、レンズユニット３１ａ，３１ｂを経て、対物レンズ６の瞳位置３２において光軸に対して偏心した位置に集光される。
集光されたレーザー光は対物レンズ６によって標本７に入射角度をもって照射される。入射角度をもって標本７に照射されたレーザー光は、カバーガラス１０と標本７との界面で全反射される。このとき、カバーガラス１０と標本７の界面から標本７側にエバネッセント光がしみだし、このエバネッセント光によって標本７を励起する。標本７は励起されることで蛍光を発する。標本７から発生した蛍光は、対物レンズ６によって集光され、波長選択素子２３ｂを透過し、バリアフィルタ２７によって蛍光のみが透過し、結像レンズ２８を通り、２次元検出器３０で検出され、または観察光学プリズム２９を介して目視によって観察される。
このとき、偏向手段３ａ，３ｂの角度を変化させることによって対物レンズ６の瞳位置３２におけるレーザー光の集光位置を光軸に対して垂直方向に移動することができる。従って、レンズユニット３１ａ，３１ｂを挿入した場合において、対物レンズ６の瞳位置３２におけるレーザー光の集光位置が光軸の周辺になるような傾斜角度でもって偏向手段３ａ，３ｂで偏向すればレーザー光の標本７への入射角が可変の全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。また、対物レンズ６の瞳位置３２におけるレーザー光の集光位置が光軸に近い位置になるような傾斜角度でもって偏向手段３ａ，３ｂで偏向した場合には、標本７とカバーガラス１０との間で全反射が起きず、標本上の光軸近傍範囲において通常の蛍光観察を行うことができる。このときには、スペックルノイズを解消する手段を併用することが望ましい。

図２は本発明の実施例２にかかるレーザー顕微鏡の全反射蛍光顕微鏡として使用する場合の概略構成図であり、(a)は複数の集光レンズで一つの光路折り曲げレンズユニットを構成した例、(b)は複数のレンズユニットで一つの光路折り曲げレンズユニットを構成した例を示している。
実施例１では、集光レンズ（レンズユニット３１ａ，３１ｂ）を瞳投影光学系４と結像光学系５との間、結像光学系５と対物レンズ６との間の２箇所に挿入可能に構成した。しかし、顕微鏡によっては、集光レンズを挿入するスペースを設けることが難しい場合がある。
そこで、実施例２では、集光レンズを配置するスペースを光路を折り曲げることで確保し、そのスペースにレンズ３１ａ，３１ｂを配置して集光レンズユニットを構成している。
なお、集光レンズは、図２(a)に示すように、一つのレンズユニット３１”で構成し、光路に挿脱可能にしても良いし、図２(b)に示すように、複数のレンズユニット３１，３１’を構成し、一方のレンズユニット３１’のみを光路に挿脱可能にしてもよい。

即ち、図２(a)の例では、レンズユニット３１”は、ミラー３３ａと集光レンズ３１ｂと、ミラー３３ｂと、集光レンズ３１ａｃと、ミラー３３ｄとで構成されており、光路に挿脱可能になっている。
そして、レンズユニット３１”を光路に挿入するとともに、波長選択素子２３ｂを光路上にセットすると、図１(b)の状態と同様に、全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。一方、レンズユニット３１”を光路から外すとともに、ミラー２３ａを光路上にセットすると、図１(a)の状態と同様に、レーザー走査型顕微鏡として使用することができる。

図２(b)の例では、レンズユニット３１’は、ミラー３３ａと、集光レンズ３１ｂと、ミラー３３ｄとで構成され、光路に挿脱可能になっている。レンズユニット３１は、ミラー３３ｂと、ミラー３３ｃと、集光レンズ３１ｂとで構成され、固定配置されている。レンズユニット３１’を光路に挿入すると、ミラー３３ａと集光レンズ３１ｂと、ミラー３３ｂと、集光レンズ３１ａｃと、ミラー３３ｄとで一つの折り曲げ光路が形成されるようになっている。
そして、レンズユニット３１’を光路に挿入するとともに波長選択素子２３ｂを光路上にセットすると、図１(b)の状態と同様に、全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。一方、レンズユニット３１’を光路から外すとともに、ミラー２３ａを光路上にセットすると、図１(a)の状態と同様に、レーザー走査型顕微鏡として使用することができる。

図３は本発明の第３実施例にかかるレーザー顕微鏡の概略構成図である。
実施例３のレーザー顕微鏡は、実施例１の構成に加えて、光源１〜波長選択素子２３ｂまでの光学部材で構成したサブスキャナ５０を有している。なお、図３の例では説明の便宜上、サブスキャナ５０以外の光源１〜波長選択素子２３ｂ（ミラー２３ａ）、コンフォーカルアパーチャ８、及び検出器９までの光学部材の構成をメインスキャナと呼ぶこととする。
このように構成すれば、それぞれのスキャナをレーザー走査型顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡との構成のいずれかにすることで、多用な顕微鏡観察を同時に行うことが可能になる。

例えば、メインスキャナにおいて、レンズ３１ａ，３１ｂを光路に挿入することで、全反射蛍光顕微鏡観察をしながら、サブスキャナ５０において、レンズ３１ａ，３１ｂを光路から外し、かつ、光源１からレーザー光を間欠的に射出することで、被検物の微小領域に光刺激を与えた観察をすることができる。
また、その場合にサブスキャナ５０の光源を、例えば、１００フェムト秒程度の超短パルスで、近赤外の波長を持ち、１００ＭＨｚ程度の繰り返し周波数を持つパルスレーザー光源で構成すれば、多光子による光刺激と全反射蛍光顕微鏡観察とを同時に行うことができる。

また、例えば、サブスキャナ５０において、レンズ３１ａ，３１ｂを光路に挿入することで、全反射蛍光顕微鏡観察をしながら、メインキャナにおいて、レンズ３１ａ，３１ｂを光路から外すことで、レーザー走査型顕微鏡観察をすることができる。
また、その場合にメインスキャナの光源を、例えば、１００フェムト秒程度の超短パルスで、近赤外の波長を持ち、１００ＭＨｚ程度の繰り返し周波数を持つパルスレーザー光源で構成すれば、多光子のレーザー走査型顕微鏡観察と全反射蛍光顕微鏡観察とを同時に行うことができる。

また、例えば、メインスキャナ、サブスキャナ５０の両方において、レンズ３１ａ，３１ｂを光路に挿入し、レーザー光源１の波長を異なるものとすることで、異なる２波長での全反射蛍光顕微鏡観察が可能となる。
また、その場合には、メインスキャナとサブスキャナ５０のそれぞれに偏向手段３ａ，３ｂが設けられているので、それぞれの偏向手段３ａ，３ｂを介してメインスキャナによるエバネッセント光のしみだし深さと、サブスキャナによるエバネッセント光のしみだし深さとを独立に変化させることが可能である。

本発明による顕微鏡の実施例１を示す概略構成図であり、(a)はレーザー走査型顕微鏡使用時、(b)は全反射蛍光顕微鏡使用時の状態を示している。本発明の実施例２にかかるレーザー顕微鏡の全反射蛍光顕微鏡として使用する場合の概略構成図であり、(a)は複数の集光レンズで一つの光路折り曲げレンズユニットを構成した例、(b)は複数のレンズユニットで一つの光路折り曲げレンズユニットを構成した例を示している。本発明の第３実施例にかかるレーザー顕微鏡の概略構成図である。従来の代表的なレーザー走査型顕微鏡の一構成例を示す概略構成図である。従来の代表的な全反射蛍光顕微鏡の一構成例を示す概略構成図である。従来のレーザー走査型顕微鏡観察と全反射蛍光顕微鏡観察とを切り替え可能な顕微鏡の一構成例を示す概略構成図である。

符号の説明

１レーザー光源
２波長選択素子
３ａ，３ｂ偏向手段
４瞳投影光学系
５結像光学系
６対物レンズ
７標本
８コンフォーカルアパーチャ
９検出器
１０カバーガラス（標本保持部材）
１８集光レンズ
１９オフセット手段
２０挿脱手段
２２照明光学系
２３ａミラー
２３ｂ波長選択素子（ダイクロイックミラー）
２４切り換え部材
２７バリアフィルタ
２８結像レンズ
２９観察光学プリズム
３０２次元検出器
３１，３１’、３１” レンズユニット
３１ａ，３１ｂレンズユニット（レンズ）
３２対物レンズの瞳位置
４０制御手段
５０サブスキャナ

Claims

レーザー光源と、前記レーザー光源から発せられるレーザー光を偏向する偏向手段と、対物レンズを介して前記レーザー光を標本に照射する照射手段と、前記標本から発した蛍光を検出する検出手段と、光路に挿脱可能に配置されていて前記対物レンズの瞳位置で前記レーザー光の主光線が光軸に対して略平行になるように該レーザー光を集光させる集光レンズと、を有しており、前記偏向手段は、前記集光レンズを光路から外したときには、前記レーザー光を前記標本面上で走査させ、前記集光レンズを光路に挿入したときには、前記レーザー光を前記対物レンズの瞳中心から偏心させるようにしたメインスキャナと、
前記レーザー光源と同様に構成されたレーザー光源と、前記偏向手段と同様に構成された偏向手段と、前記照射手段と同様に構成された照射手段と、前記検出手段と同様に構成された検出手段と、及び前記集光レンズと同様に構成された集光レンズと、を有しているサブスキャナと、を備えたことを特徴とするレーザー顕微鏡。