JP5259154B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、走査型のレーザ顕微鏡として、画像取得時間を短縮するためにマルチポイント走査方式のものが知られている（特許文献１、特許文献２参照。）。
特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、ニポウディスクとマイクロレンズアレイとを用いる方式のものである。また、特許文献２に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、マイクロレンズアレイやレーザダイオードアレイにより多点のスポット光を形成し、該スポット光をガルバノミラーのような２組の偏光器により走査する方式のものである。

これら特許文献１，２に開示されている走査型レーザ顕微鏡によれば、多点の走査点を同時に標本上において走査させることにより、単一の走査点を走査させる場合と比較して短時間に標本の同一範囲を走査させることができる。

特開平５−６０９８０号公報 特開平１０−３１１９５０号公報

しかしながら、特許文献１，２に開示されている走査型レーザ顕微鏡はマイクロレンズアレイ等によって多重点光源を構成しているので、同時に走査する走査点の数、位置あるいは間隔等を変更することが困難であるという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、同時に走査する走査点の数、位置あるいは間隔等を光量ロスなく自由に変更することができ、画像取得時間の短縮だけでなく、用途に応じた観察をフレキシブルに行うことができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光の光路に配置され、結晶に加える振動の周波数を変化させることによりレーザ光の進行方向を変更可能な音響光学偏向素子と、該音響光学偏向素子の結晶に対して同時に複数の周波数の振動を加える周波数制御部と、前記レーザ光源からのレーザ光を集光して標本上にスポット光を生成する対物レンズと、前記レーザ光源からのレーザ光を直交する２方向に偏向することにより、前記標本上のスポット光からなる走査点を２次元走査する光走査手段とを備え、前記音響光学偏向素子、前記光走査手段、前記対物レンズの瞳位置が、光学的に共役な位置に配置されている走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が音響光学偏向素子を通過する際に偏向される。音響光学偏向素子には、周波数制御部により結晶に対して同時に複数の周波数の振動が加えられるので、音響光学偏向素子から出射されるレーザ光は周波数に応じた変更角度で複数方向に偏向されることにより複数に分割される。分割されたレーザ光は対物レンズによって標本上に集光されてスポット光を生成し、光走査手段によって２次元走査されることにより、標本上の所定の範囲に照射され、標本中の蛍光物質を励起し、あるいは標本の特定範囲に光刺激を与えることができる。この場合に、周波数制御部によって結晶に加える振動の周波数を調節することにより、同時に走査する走査点の数、位置あるいは間隔を光量ロスなくフレキシブルに自由に変更することができる。

また、この場合に、本発明によれば、音響光学偏向素子、光走査手段、対物レンズの瞳位置が、光学的に共役な位置に配置されているので、音響光学偏向素子により分割された全てのレーザ光を対物レンズの瞳の中心に通過させることができ、解像度よく観察することができる。

上記発明においては、前記音響光学偏向素子と前記対物レンズとの間の光路に、前記標本からの戻り光とレーザ光とを分岐するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分岐された前記標本からの戻り光を検出する光検出器とを備えていてもよい。

また、上記発明においては、前記音響光学偏向素子により異なる方向に偏向される複数のレーザ光の偏向方向が、前記光走査手段により走査される直交する２方向の内の副走査方向に一致し、前記ビームスプリッタにより分岐された標本からの戻り光の光路上に、標本上の複数の走査点から発する戻り光を通過させる共焦点ピンホールが備えられ、前記光検出器が、各走査点から発せられ、共焦点ピンホールを通過した戻り光を個別に検出するように複数備えられていてもよい。

また、上記発明においては、前記各検出器により取得された画像をつなぎ合わせて１つの画像を合成する画像処理手段を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記周波数制御部が、前記光走査手段の走査範囲の変更に応じて、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する振動の周波数を調節することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記共焦点ピンホールが、マトリックス状に配置された複数の微小素子を備え、複数の走査点と結像関係にある範囲の微小素子を有効にする微小素子アレイであってもよい。
また、上記発明においては、前記光検出器が、１次元検出器または２次元検出器であり、複数の走査点と結像関係にある位置のピクセルにより各走査点からの戻り光を検出することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記光検出器が２次元検出器であり、前記共焦点ピンホールが、複数の走査点と結像関係にある位置の複数のピクセルを各走査点に対応して有効にすることにより構成されていてもよい。

また、上記発明においては、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の周波数の振動の大きさおよび数に対応付けて、共焦点ピンホールとして作用させるために有効とする微小素子の範囲を設定することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の周波数の振動の大きさおよび数に対応付けて、光検出器上の検出に使用するピクセルを設定することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記周波数制御部は、副走査方向に生成される走査点の間隔が、前記１次元検出器のピクセル列または前記２次元検出器の副走査方向に対応するピクセル列の間隔と一致するように、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の振動の周波数を調節して、前記標本に対してほぼライン状の照明を行うとともに、前記光検出器が、標本の複数の走査点からのライン状の戻り光を同時に検出することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記ビームスプリッタと共焦点ピンホールとの間に配置された倍率可変レンズを備え、該可変倍率レンズが、前記画像取得範囲に応じて、その倍率を可変制御されることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記音響光学偏向素子が、前記光走査手段の主走査方向と副走査方向の両方に光線を分割させることとしてもよい。

また、上記発明においては、副走査方向にレーザ光を偏向させる第１の音響光学偏向素子と、主走査方向にレーザ光を偏向させる第２の音響光学偏向素子とを備え、標本上にマトリクス状に複数の走査点を形成することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記周波数制御部が、前記２つの音響光学偏向素子のそれぞれに複数の周波数の振動を印加することにより分割された複数のレーザ光により標本上に形成されるスポット光を、相互に隣接または一部重ねてマクロスポットを形成し、形成したマクロスポットの大きさを変化させるように、前記音響光学偏向素子に印加する振動の周波数の数および／または間隔を調節することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記レーザ光源と音響光学偏向素子との間に前記対物レンズの瞳に入射するビーム径を可変するビーム径可変光学系を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記２つの音響光学偏向素子と前記対物レンズとの間の光路に、前記標本からの戻り光とレーザ光とを分岐するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分岐された前記標本からの戻り光を検出する光検出器とを備えていてもよい。

また、上記発明においては、前記レーザ光源が、異なる波長の刺激用レーザ光および観察用レーザ光を発振し、前記周波数制御部が、前記音響光学偏向素子に各レーザ光の波長に対応する周波数の振動を同時に印加して、各レーザ光の走査点を標本上の異なる位置に形成し、前記光検出器が、観察用レーザ光の走査点から発せられた戻り光を検出することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記周波数制御部が、前記刺激用レーザ光の照射位置および前記観察用レーザ光の照射位置を切り替えるように、前記音響光学偏向素子に印加する振動の周波数を変更することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記周波数制御部が、前記光走査手段による走査にかかわらず、前記刺激用レーザ光の照射位置を静止させるように、前記音響光学偏向素子に加える振動の周波数を走査することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記周波数制御部が、前記標本上に形成される複数のマトリクス状のスポット光のＸ方向の間隔およびＹ方向の間隔をそれぞれ等間隔となるように前記音響光学偏向素子に加える振動の周波数を調節し、前記光走査手段が、前記スポット光の間隔に応じた主走査方向および副走査方向の走査範囲にスポット光を走査させ、前記各スポット光の結像位置に共焦点ピンホールが配置されていてもよい。

また、上記発明においては、前記光検出器により個別に取得された画像をつなぎ合わせて表示する表示手段を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記レーザ光源が、多光子励起観察用の近赤外パルスレーザ光源であってもよい。

本発明によれば、同時に走査する走査点の数、位置あるいは間隔等を光量ロスなく自由に変更することができ、画像取得時間の短縮だけでなく、用途に応じた観察をフレキシブルに行うことができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光を発振するレーザ光源２と、該レーザ光源２からのレーザ光を偏向する音響光学偏向素子３と、該音響光学偏向素子３により偏向されたレーザ光を２次元走査する近接ガルバノミラー（光走査手段）４と、該近接ガルバノミラー４により２次元走査されたレーザ光を標本Ａ上に集光する対物レンズ５とを備えている。

音響光学偏向素子３と近接ガルバノミラー４との間には、投影レンズ６が配置されている。また、近接ガルバノミラー４と対物レンズ５との間には、瞳投影レンズ７および結像レンズ８が配置されている。さらに、投影レンズ６と近接ガルバノミラー４との間の光路上には、標本Ａから戻る蛍光を分岐する励起ダイクロイックミラー（ビームスプリッタ）９が配置され、該励起ダイクロイックミラー９により分岐された蛍光の光路には、集光レンズ１０、倍率可変レンズ１１、共焦点レンズ１２、共焦点ピンホール１３、分光ダイクロイックミラー１４、バリアフィルタ１５および光検出器（光電子増倍管）１６が配置されている。

また、音響光学偏向素子３、近接ガルバノミラー４および倍率可変レンズ１１には制御装置（周波数制御部）１７が接続されている。制御装置１７は、音響光学偏向素子３において結晶に加える振動の周波数を調節し、近接ガルバノミラー４によるレーザ光の走査範囲、走査速度および走査方向を調節し、倍率可変レンズ１１による倍率を調節するようになっている。

レーザ光源２はＡｒレーザ（４８８ｎｍ）２ａとＤＰＳＳ（５６０ｎｍ）２ｂとを備え、各レーザ光源２ａ，２ｂからのレーザ光は、合成ダイクロイックミラー２ｃにより光路合成されている。
図中、符号１８は周波数発生器、符号１９はミラー、符号２０は対物レンズ５の瞳である。

音響光学偏向素子３、近接ガルバノミラー４および対物レンズ５の瞳２０は光学的に共役な位置に設定されている。音響光学偏向素子３と近接ガルバノミラー４とは投影レンズ６により、近接ガルバノミラー４と対物レンズ５の瞳２０は瞳投影レンズ７と結像レンズ８とによりそれぞれ共役な位置に設定されている。ここで、近接ガルバノミラー４は、レーザ光をＸ方向に偏向させる第１ミラーと、これと直交するY方向に偏向させる第２ミラーとを備え、両ミラーの間にリレー光学系を備えずに、できる限り近づけて配置したものである。近接ガルバノミラー４の２つのミラーのほぼ中間位置が、対物レンズ５の瞳２０と共役な位置関係となっている。

音響光学偏向素子３は、図２に示されるように、レーザ光を入射させる結晶３ａ、該結晶３ａに加える高周波振動を発生させるトランスデューサ３ｂとを備えている。矢印Ｂは高周波の進行方向を示している。結晶３ａに加える高周波振動の周波数を変化させることで、レーザ光の偏向角度を変化させるもので、複数の周波数の高周波振動を同時に加えることにより、入射されたレーザ光を紙面に沿う方向（Ｙ方向）に分割するようになっている。
図１および図２に示される例では、音響光学偏向素子３には、５種類の周波数の高周波振動が加えられており、レーザ光が５本に分割されるようになっている。

音響光学偏向素子３による偏向方向は、近接ガルバノミラー４による副走査方向と一致している。近接ガルバノミラー４の主走査方向は紙面に直交する方向である。
音響光学偏向素子３の結晶３ａに印加する振動の周波数ｆと偏向角θとの関係は以下の式により表される。
θ＝λ×ｆ／Vａ
ここで、Ｖａは、結晶の音速である。

したがって、異なる周波数ｆ１，ｆ２，ｆ３，ｆ４，ｆ５を同時に結晶３ａに印加することにより、図２に示されるように、偏向角θ１，θ２，θ３，θ４，θ５の複数方向にレーザ光を１次光として分割できるようになっている（図１では、音響光学偏向素子に入射するレーザ光と、出射するレーザ光の中心光線が平行になっているが、実際には、図２のように若干曲がっている。したがって、図１は、図２の周波数ｆ３の偏向角θ３の方向を光軸中心に一致させて示している。）。

５方向に分割されたレーザ光は、対物レンズ５により５点のスポット光からなる走査点を標本Ａ上に形成し、近接ガルバノミラー４により、図３に示されるように、主走査方向と副走査方向に走査されるようになっている。走査領域は、副走査（Ｙ）方向に５分割されるので、１枚の画像を取得する速度は、単一の走査点によって同一の走査領域全体を走査する場合の５倍になっている。

標本Ａ上の５点の走査点より発する蛍光は、励起ダイクロイックミラー９により検出光路２１に導かれ、集光レンズ１０および倍率可変レンズ１１により複数の離間する方向に導かれ、それぞれの光路に配置された共焦点レンズ１２、共焦点ピンホール１３、分光ダイクロイックミラー１４およびバリアフィルタ１５を介して、光検出器１６により同時に検出されるようになっている。（これらの検出光の位置は、近接ガルバノミラー４によりディスキャンされるので、近接ガルバノミラー４で走査しても方向、位置ともに変化しない。）

これらの１０個の光検出器１６には、図示しない画像処理装置および表示装置が接続されていて、これらの光検出器１６により取得される画像をつなぎ合わせて１枚の画像を合成し、表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、レーザ光源２から出射されたレーザ光が音響光学偏向素子３に加える振動の周波数に応じた数、位置および間隔の複数のレーザ光に分割されて標本Ａに同時に照射されるので、複数の走査点によって同時に標本Ａを励起することができ、画像取得時間を短縮することができる。

また、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、画像取得時間を短縮する必要がない標本Ａの場合であって、光刺激など強いレーザパワーが必要な場合は、制御装置１７が、音響光学偏向素子３に加える振動の周波数として、周波数ｆ３のみを加えることで、走査点を１点のみとし、５つの検出光路２１の内の中心の光路のみが検出に使用される。このようにすることで、５等分されていたレーザ光の光量が、単一の光路に集約されるので光量に余裕を持たせることができる。また、観察用途で使用する場合には、高周波振動の振幅を減じることで光強度を調光することができる。

また、サンプリング解像度（画像ピクセル数）を変えずに近接ガルバノミラーの振り角の大きさを小さくすることで拡大画像を取得する、ガルバノズーム機能を使用する場合について説明する。例えば、ガルバノズーム２倍（すなわち、画像取得範囲を面積比で１／４にする）の場合には、図４に示されるように、制御装置１７が、音響光学偏向素子３に加える振動の周波数（ｆ１′，ｆ２′，ｆ３，ｆ４′，ｆ５′）を変更し、分割する角度を光軸（偏向角θ３）に対して半分にする。このようにすることで標本Ａ上においても、５つのスポット光が、副走査方向に半分の間隔で並ぶことになる。そして、近接ガルバノミラー４の振り角を、主走査方向、副走査方向共に半分にする。

このときの音響光学偏向素子３でのレーザ光の偏向方向は、図４に示すようになる。光軸中心に一致する周波数ｆ３はそのまま印加し、周波数ｆ１′，ｆ２′，ｆ４′，ｆ５′は、周波数ｆ３に対しての偏向角の差が、図２に対して半分になるように周波数を設定する。

また、このとき、検出光路２１に配されている倍率可変レンズ１１の倍率を変更する。各走査点から発せられる蛍光は、倍率可変レンズ１１の倍率の変更により、画像取得範囲の変更前の光路と同一の光路上に乗り、図５（ａ）に示されるように、それぞれの光路に配置された共焦点レンズ１２、共焦点ピンホール１３、分光ダイクロイックミラー１４およびバリアフィルタ１５を介して、光検出器１６により、同時に検出される。これにより、図５（ｂ）に示されるように、図３の１／４の走査範囲に対して、レーザ光を走査して観察することができる。

また、上記において半分にされた画像取得範囲を上方にシフトする場合は、図６（ｂ）に示すように、副走査主方向の走査範囲を上方にずらせば良い。このときの倍率可変レンズ１１の位置は上記と同じでよく、近接ガルバノミラー４によりディスキャンされるので、図６（ａ）に示されるように、５個の走査点は検出光路２１の５つの光路に乗ってくる。
図５（ａ）および図６（ａ）においては、結像レンズ８による１次像位置から標本Ａ側を省略して示している。

上記説明においては、走査点の数が１点および５点の場合の例を示しているが、走査点の数は、１点から５点までの任意の数を選択することができる。その場合、倍率可変レンズ１１の倍率を、走査点の間隔に応じて、検出光が５本の検出光路２１のどこかに一致するようにし、さらに、副走査方向の走査の中心位置を、画像全域を走査できるように設定する必要がある。

このように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、同時走査点数に応じて光量が分割されるので、走査点数変更時の光量損失がなく有効利用ができる。したがって、光刺激の時など、１点のみに強い光をあてるような場合でも、大型光源を用意する必要がない。従来のマイクロレンズアレイ方式は１点のみの照射でも光量が複数個所に分岐されるので１点の光量が極めて低く、光刺激に利用することができなかった。

また、サンプリング解像度を変えずに、近接ガルバノミラー４の振り角変更により画像取得範囲を変更（すなわちガルバノズーム機能を使用）しても、走査点間隔を変えることで全ての点を観察に利用できる。これにより、対物レンズ５の開口数により決まる光学的な解像度を実現しつつ、走査速度を保つことが可能となる。従来のマイクロレンズアレイとガルバノミラーとを用いる方式ではガルバノミラーによりズームを行うと画像取得範囲外に走査点がはみ出してしまうので実質的に走査点数が減り、走査速度が遅くなっていた。また、無意味な光を標本に照射してしまうので、蛍光の退色や標本ダメージを余分に生じさせていた。

さらに、光検出器１６の数の範囲内で同時走査点の数を任意に可変できる。したがって、解像度と標本Ａの動きに合わせて、最適走査点に設定できる。また、レーザ光の分岐は対物レンズ５の瞳２０と共役位置にある音響光学偏向素子３により行われるので、分岐した全てのレーザ光を対物レンズ５の瞳２０の中心に通過させることができ、解像度よく観察することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、レーザ光源２として、波長４８８ｎｍのＡｒレーザ２ａと、波長５６０ｎｍのＤＰＳＳ２ｂとを同時に発振させることとしてもよい。この場合に、波長４８８ｎｍおよび５６０ｎｍのレーザ光は同軸で音響光学偏向素子３に入射するが、偏向角θ１〜θ５に偏向させる周波数範囲が重ならないようにすることができる。したがって、１０種類の周波数の振動を結晶３ａに印加することにより、波長４８８ｎｍ、５６０ｎｍのレーザ光をそれぞれ５方向に同軸に出射させることができる。

波長４８８ｎｍのレーザ光により励起される蛍光は分光ダイクロイックミラー１４において反射されて１ＣＨの光検出器１６により検出され、波長５６０ｎｍのレーザ光により励起される蛍光は分光ダイクロイックミラー１４を透過し、２ＣＨの光検出器１６で検出される。
画像取得範囲に対応する検出光路２１の倍率可変レンズ１１の位置は上記と同じパターンでよい。
このようにすることで多重染色標本でも上記と同様の効果を得ることができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３０について、図７〜図１１を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３０は、図７に示されるように、検出光路２１にマトリクス状に配置された複数の微小ミラーを備える微小ミラーアレイからなるデジタルミラーデバイス３１（以下、ＤＭＤ３１という。）およびラインセンサ（１次元の検出器）３２を備えている。励起ダイクロイックミラー９において反射された検出光路２１に配置されている集光レンズ１０により、標本Ａ上の複数の走査点からの蛍光はＤＭＤ３１上に結像され、ＤＭＤ３１とラインセンサ３２とはリレーレンズ３３によって結像関係に配置されている。

ＤＭＤ３１上には図８に示されるように、複数の微小ミラー３１ａがマトリクス状に配置されており、それぞれの微小ミラー３１ａの方向を切り替える（ＯＮ／ＯＦＦ）ことができるようになっている。微小ミラー３１ａをＯＮにすると、光線は光軸上を進み、ＯＦＦにすると、光軸から大きく外れ、図示しないトラップ機構に導かれるようになっている。図８は説明の便宜上、反射光路ではなく、透過光路を直進する状態を微小ミラー３１ａのＯＮ状態としている。

このＤＭＤ３１は、微小ミラー３１ａまたは微小ミラー３１ａ群をＯＮにすることで、光路上に導かれる光線を選択し、共焦点ピンホールとして機能させることができるようになっている。
ラインセンサ３２のピクセル列の方向と音響光学偏向素子３によるレーザ光の分割方向とは、いずれも近接ガルバノミラー４の副走査方向（Ｙ方向）に一致している。

音響光学偏向素子３により分割されるレーザ光は、図中に３本記載されているが、必要な画像取得時間、解像度、光量、画像取得範囲に応じて、自由に設定可能である。
音響光学偏向素子３に印加する振動の周波数の値に応じて分割されるレーザ光の進行方向は変化するが、共焦点ピンホールに対応するＤＭＤ３１およびラインセンサ３２ともに、レーザ光の分割方向（Ｙ方向、副走査方向）に連続的に複数の微小ミラー３１ａまたはピクセルが配列されているので、標本Ａ面に形成される複数の走査点（スポット光）と共役な位置にあるＤＭＤ３１内の微小ミラー３１ａ、およびラインセンサ３２のピクセルを選択することで対応できるようになっている。

また、近接ガルバノミラー４による走査中には、蛍光は近接ガルバノミラー４によりディスキャンされるので、ＤＭＤ３１およびラインセンサ３２上に結像している光は移動しない。したがって、ＤＭＤ３１の微小ミラー３１ａや、ラインセンサ３２の有効ピクセルを走査に合わせて切り換えていく必要はない。

図９に、Ａ）５点走査、Ｂ）１０点走査、Ｃ）ライン走査、Ｄ）近接ガルバノミラー４の振り角を半分にして画像取得範囲を１／４にする５点走査（ガルバノズーム２Ｘ）のそれぞれにおけるラインセンサ３２での走査点のパターン、ＤＭＤ３１内のＯＮにする微小ミラー３１ａ、ラインセンサ３２上で検出に使用するピクセル（有効ピクセル）をそれぞれ示す。

Ｂ）の１０点走査にすることにより、５点走査の場合と比較すると、１点あたりの光量は減少するが、副走査方向の走査範囲が半分になるので画像取得時間は半分になる。
Ｃ）のように、標本Ａ面上の隣り合うスポット光のスポット径が重なるような間隔の周波数の振動を多数、音響光学偏向素子３に印加することで、標本Ａ上においてライン状のレーザ光を走査することが可能である。

この場合には、分割方向（副走査方向）に存在する微小ミラー３１ａの列およびラインセンサ３２の全ピクセルが検出時に使用される。また、近接ガルバノミラー４は副走査方向（Ｙ方向）に固定され、主走査方向（Ｘ方向）のみ走査する。すなわち、Ｙ方向を走査せず、Ｘ方向の１回の走査で画像取得でき、画像取得時間を大幅に短縮することができる。

ただし、１点あたりの光量はかなり落ちるので光量に余裕がある場合およびＹ方向の共焦点効果がなく、Ｙ方向のピクセル分解能が、ラインセンサ３２のピクセル数により制限されるので、分解能的な問題がない場合にのみ適用できる。

Ｄ）のように、５点走査で、サンプリングの解像度を変えずに画像取得範囲を１／４にする場合は、音響光学偏向素子３に印加する振動の周波数の大きさを変えて、５個の走査点の間隔を半分にする。この場合には、検出に使用するＤＭＤ３１上でＯＮになる微小ミラー３１ａの位置およびラインセンサ３２のピクセル位置も、走査点の変更に応じて、間隔を半分に設定する。

上記ラインセンサ３２としては、フォトダイオードアレイ、マルチチャンネルホトマルチプライヤおよび１次元の撮像素子が使用可能である。また、上記のＤＭＤ３１の他に、液晶素子も使用できる。液晶素子はアレイ状に配置された各領域の透過、遮断を制御でき、透過型なので、反射型となるＤＭＤ３１より配置が簡略化できるという利点がある。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３０によれば、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の効果に加えて、標本Ａ上の走査点の数および位置の変化に応じて、検出側の検出点の数および位置も、共焦点ピンホールとして使用するＤＭＤ３１内の微小ミラー３１ａの位置の選択、ラインセンサ３２内の検出に使用する有効ピクセルの選択により、フレキシブルに対応できる。したがって、画像取得時間、解像度、画像取得範囲を考慮して走査点数、走査点間隔を自由に設定でき、かつ、ライン走査も可能であるという利点がある。

また、分割数の制限はラインセンサ３２のピクセル数以下まで対応可能である。ライン走査時のライン方向のピクセル解像度はラインセンサ３２のピクセル数により制限される。
さらに、第１の実施形態において必要であった倍率可変レンズ１１が不要となり、光学系がシンプルになり、性能が向上し、安価となる。

なお、ＤＭＤ３１内の選択する微小ミラー３１ａを走査点１点に対して１枚とすると、ＤＭＤ３１上に形成されるスポット光の径がＤＭＤ３１の微小ミラー３１ａより大きい場合には、光量を大きく損失してしまう。このような場合には、図１０のようにスポット径Ｃ内に含まれる複数の微小ミラー３１ａ（図１０では５×５＝２５枚）を１つの走査点に対応する微小ミラー３１ａ群として使用すればよい。ライン走査の場合は５列の微小ミラー３１ａを選択すればよい。

また、共焦点効果を犠牲にしてでも明るい蛍光画像を取得した場合には、図１１に示されるように、ＤＭＤ３１上に形成されるスポット径Ｃより広い範囲の微小ミラー３１ａを選択することも可能である。図１１では９×９＝８１枚の微小ミラー３１ａをＯＮにしており、スポット径Ｃの１．５倍強の範囲の光を検出できる。

また、逆に、より高い共焦点効果を得るために明るさを犠牲にして、選択する微小ミラー３１ａの範囲を小さくすることも可能である。例えば、２×２＝４枚を選択すれば、スポット径Ｃの半分以下の面積となり、共焦点効果を高めることができる。

このようすることで、ＤＭＤ３１上にできるスポット径Ｃに応じて微小ミラー３１ａ群の大きさを可変することで、共焦点効果と蛍光画像の明るさとのバランスを図ることができる。
そして、蛍光画像の明るさと共焦点効果とのバランスを容易に図ることができ、暗い標本Ａに対しては、Ｓ／Ｎ比優先、明るい標本Ａに対しては解像度（共焦点効果）優先の設定を簡単に行うことができる。

また、図７のＤＭＤ３１の位置にＣＣＤのような２次元の光検出器（図示略）を配置し、リレーレンズ３３をなくしてもよい。この場合、バリアフィルタ１５は、ＣＣＤの前段に配置する。
この場合には、標本Ａ上の走査点と結像関係にある位置に配置されたピクセルを共焦点ピンホールおよび光検出器として使用することとすればよい。

このようにすることで、上述と同様に、スポット径Ｃに対応する範囲にある複数のピクセルの出力の合算値を１つの走査点の検出出力とすることにより、共焦点ピンホールと光検出器の機能の両方をＣＣＤに持たせることが可能となる。
これにより、共焦点ピンホールとしてのＤＭＤ３１が不要となり、また、リレーレンズ３３も不要となるので安価かつ省スペースの走査型レーザ顕微鏡３０を提供することができる。

次に、本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡４０について、図１２〜図１５を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡４０は、第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３０と比較すると、音響光学偏向素子３を主走査方向（Ｘ方向）にも分割できるように２個配置し、それぞれの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙを第２投影レンズ４１により光学的に共役に配置している点、および、ラインセンサ３２の代わりに２次元検出器であるＣＣＤ４２を用いている点において相違している。

Ｘ方向の音響光学偏向素子３Ｘに複数の周波数の振動を印加するとレーザ光が１次光としてＸ方向に複数に分割され、Ｙ方向の音響光学偏向素子３Ｙに複数の周波数の振動を印加すると、Ｘ方向に分割されたレーザ光のそれぞれがさらにＹ方向に複数に分割されるようになっている。したがって、標本Ａ上に複数のスポット光が、マトリクス状に配列されるようになっている。

スポット光の数および間隔は、Ｘ、Ｙ方向共に、Ｘ、Ｙ方向の音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数の大きさおよび数によって決まる。これらのスポット光の集合は、近接ガルバノミラー４および対物レンズ５を介して、標本Ａ上の複数位置に同時に照射されるようになっている。

同時に照射された複数の走査点は、近接ガルバノミラー４により副走査方向および主走査方向に走査され、標本Ａから発する蛍光は、走査点と結像関係にあるＤＭＤ３１の微小ミラー３１ａを介してＣＣＤ４２のピクセルにより検出される。検出光は近接ガルバノミラー４によりディスキャンされるので、ＤＭＤ３１およびＣＣＤ４２上では、スポット光は動かない。

波長４０５ｎｍおよび４８８ｎｍは、音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに対して使用する振動の周波数領域が重ならない波長である。したがって、波長４０５ｎｍおよび４８８ｎｍで２次元面内の任意の位置にマトリクス状の照明を同時に行うことができる。

図１３に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡４０を使用した各種観察方法および各々の観察での検出光路２１の設定（ＤＭＤ３１内でＯＮにする微小ミラー３１ａおよびＣＣＤ４２上で検出に使用するピクセル（有効ピクセル））を示す。

Ａ）１領域観察（４８８ｎｍ）＋１領域刺激（４０５ｎｍ）、Ｂ）１点観察（４８８ｎｍ）＋１点マクロ刺激（４０５ｎｍ）、Ｃ）領域観察（４８８ｎｍ）＋１点マクロ刺激（４０５ｎｍ）、Ｄ）１点マクロ観察（４８８ｎｍ）＋１点マクロ刺激（４０５ｎｍ）＋１点ミクロ刺激（４０５ｎｍ）である。

Ａ）は２つの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに波長４０５ｎｍのレーザ光を回折させる周波数の振動と、波長４８８ｎｍのレーザ光を回折させる周波数の振動を印加し、走査点を２個作り、１点は観察、１点は刺激に用いる。ＤＭＤ３１上でＯＮにする微小ミラー３１ａおよびＣＣＤ４２で検出に使用するピクセルは観察走査点と結像関係にある位置のものが選択される。近接ガルバノミラー４は１個なので刺激領域と観察領域のスキャンサイズは同じに制限されるが、刺激用の４０５ｎｍと観察用の４８８ｎｍの偏向角を異ならせることにより、図のように２つの光で別の領域を走査することができる。

Ｂ）は２つの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに波長４８８ｎｍのレーザ光を回折させる周波数の振動を１種類印加し、波長４８８ｎｍのレーザ光の観察用スポット光を１点、標本Ａ上の任意の位置に形成し、波長４０５ｎｍのレーザ光を回折させる周波数の振動を、スポット光４３ａが隣接するように３種類ずつかけて、３×３の刺激用スポット光４３ａを標本Ａ上の任意の位置に形成する。これにより、刺激用の１個のマクロスポット光４３は９個のスポット光４３ａで構成されるので、標本の広い領域に対して同時に光刺激を与えることができる（図１４参照。）。なお、１点観察、１点刺激なので、近接ガルバノミラーは走査を行わず停止させた状態とする。

ＤＭＤ３１内でＯＮにする微小ミラー３１ａおよびＣＣＤ４２で検出に使用するピクセルは、観察走査点と結像関係にある１箇所（領域）のものが選択される。刺激と観察で波長が異なることが前提であるが、１点のマクロ刺激を行いながら１点の観察を行うことが可能となる。また、マクロ刺激用のマクロスポット光４３の大きさは２つの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数の数で調節できる。これにより、刺激を与える標本Ａの範囲に応じてマクロ刺激用のマクロスポット光４３を形成することができる。

Ｃ）はＢ）と同様の周波数の振動を印加し、１個の観察用スポット光（４８８ｎｍ）と、１個の刺激用のマクロスポット光（４０５ｎｍ、スポット光９個で構成）４３を形成するものである。領域観察の為に近接ガルバノミラー４を、主走査方向および副走査方向に走査する。この時、刺激用マクロスポット光４３が動かないように、刺激用マクロスポット光４３を形成するために音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数を、ガルバノミラーの走査方向と逆方向にスキャンする。これにより、刺激と観察で波長が異なることが前提であるが１点のマクロ刺激を行いつつ領域観察を行うことが可能となる。

上記Ａ）、Ｂ）、Ｃ）の観察で刺激と観察の場所を切り替えることも可能である。音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数を変更することで実現でき、高速切替が可能となる。

Ｄ）は、３×３の隣接する９個のスポット光からなる、観察用のマクロスポット光（４８８ｎｍ）と、同じ形状の刺激光用のマクロスポット光（４０５ｎｍ）を形成し、１点のマクロ刺激を行いながら、１点のマクロ観察を行うものである。検出に使用するＤＭＤ３１内のＯＮにする微小ミラー３１ａおよびＣＣＤ４２の有効ピクセルは、観察用のマクロスポット光の大きさに対応して広めの範囲を選択する。マクロ観察の範囲は２つの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数の数により調節でき、狭い範囲から広い範囲の１点観察が可能である。なお、近接ガルバノミラーは停止させた状態とする。

また、この状態から波長４０５ｎｍのレーザ光によるマクロ刺激を、異なる場所での１点のミクロ刺激に高速に切り替えることができる。このとき、音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する刺激光（４０５ｎｍ）に対応する振動の周波数は、３個から１個に切り替え、周波数もミクロ刺激を行う標本Ａ上の位置に対応する周波数とする。切り替えは音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙの切替速度に依存するので近接ガルバノミラー４での切り替えより高速に行うことができる。

このように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡４０によれば、２つの音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙを用いることで任意の大きさのマクロスポットを容易に作成でき、刺激を与えたり、観察する範囲に応じて、刺激用スポット光および観察用スポット光の大きさをフレキシブルに設定したりすることができるという利点がある。
また、マクロ刺激とミクロ刺激を異なる場所に交互に高速に切り替えて行うことができる。

波長が異なれば、２次元方向に波長毎に同時に走査点を設定でき、標本Ａ上で、視野内に散らばっている観察したい範囲を絞って、同時に、観察したり、刺激したりすることができる。
また、刺激と観察の波長が異なることが前提だが、２組の音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに加える振動の周波数を近接ガルバノミラー４の走査方向とは逆方向に走査することにより、領域を観察しつつ、固定された１点の刺激を継続することができる。

なお、図１５のＡ）に示されるように、２組の音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙにそれぞれ５個の周波数の振動を印加し、等間隔に２５点の走査点を形成してもよい。このようにすると、これらの走査点に画像取得範囲を２５分割し、小区画を近接ガルバノミラー４により２５点同時に走査することができる。２５点より発する蛍光は共焦点ピンホールとして機能するＤＭＤ３１を介して2次元検出器であるＣＣＤ４２により同時に検出される。選択される微小ミラー３１ａおよび検出ピクセルも図１５の通りである。

２５点は近接ガルバノミラー４によりディスキャンされるので、ＤＭＤ３１の微小ミラー３１ａ上での結像位置およびＣＣＤ４２における結像位置は動かない。
また、図１５のＢ）に示されるように、近接ガルバノミラー４の振り角を半分にして、ズーム２Ｘにしてもよい。

このようにすることで、Ｙ方向のライン数だけでなく、Ｘ方向の検出走査点の数が１／５になるので、さらに高速に画像取得することができる。また、近接ガルバノミラー４によるズーム時も形成した多点を全て使用でき、光量ロスがないという利点もある。

次に、本発明の第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡５０について、図１６を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡４０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡５０は、波長７２０ｎｍのレーザ光を発振するＩＲパルスレーザ光源５１ａと、波長９５０ｎｍのレーザ光を発振するＩＲパルスレーザ光源５１ｂとを備える。波長７２０ｎｍのパルスレーザ光は、標本Ａに２光子励起による光刺激（Ｃａｇｅｄなど）を与え、波長９５０ｎｍのパルスレーザ光は、標本Ａに２光子励起による蛍光（蛍光蛋白であるＧＦＰ、ＹＦＰ）を発生させる。

２光子励起は光子密度が高い集光点でのみ蛍光が発生するので、共焦点ピンホールがなくてもＺ方向の解像度を確保できる。そこで、近接ガルバノミラー４に蛍光を戻さずに、対物レンズ５と結像レンズ８との間に配置したダイクロイックミラー５２（ＩＲパルスレーザ光は反射し、蛍光は透過する特性を持つ）により導かれる光路にも光検出器５３を配置している（ノンディスキャン検出と呼ばれ、散乱する蛍光も効率よく収集できる）。この場合、光検出器５３と対物レンズ５の瞳２０は光検出器５３へのリレーレンズ５４により共役になっている。図中、符号５５はバリアフィルタである。

このダイクロイックミラー５２は図示しない全反射ミラーと切替可能になっている。全反射ミラーに切り替えることにより、ＤＭＤ３１を介して、ＣＣＤ４２で検出する検出光路２１に切り替えることができる。
波長７２０ｎｍ、９５０ｎｍのレーザ光に対して音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙに印加する振動の周波数領域が重なっていなければ、図１３のＡ）、Ｂ）の観察および刺激を、本実施形態においても同様に行うことができ、多光子検出に適したノンディスキャン検出も可能である。

このように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡５０によれば、多光子励起による刺激および観察においても、上記第３の実施形態と同様の効果が得られるとともに、ノンディスキャン検出による明るい観察が可能となる。

なお、本実施形態においては、波長７２０ｎｍ、９５０ｎｍのレーザ光の光路を合成する前の７２０ｎｍの光路にビーム径を縮小することにより標本Ａ上のスポット径を光学的に大きくするビームエクスパンダを設けてもよい。
このようにすることで、マクロ刺激の時に、光学的なスポット径を大きくでき、印加する振動の周波数の数を少なくして、重なり合うスポット径の範囲を広くすることができる。また、音響光学偏向素子３Ｘ，３Ｙによるスポット光の重ね合わせでは、ＸＹ方向にのみしかスポット径が大きくならないが、ビームエクスパンダにより光学的にスポット径を大きくすると、Ｚ方向にも刺激光量の分布が広がるので、ＸＹＺ方向で大きなスポットを形成することができる。

本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡に使用される音響光学偏向素子の構造とその作用を示す図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡により標本上において走査されるスポット光の動きを示す図である。 図２の音響光学偏向素子に、異なる周波数の高周波振動を加えた場合のレーザ光の偏向角を示す図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡により標本上のより狭い範囲にスポット光を走査する場合について示す（ａ）一部を省略した光路図、（ｂ）スポット光の動きをそれぞれ示す図である。 図５の狭い範囲に走査されるスポット光をシフトする場合について示す（ａ）一部を省略した光路図、（ｂ）スポット光の動きをそれぞれ示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 図７の走査型レーザ顕微鏡に備えられるＤＭＤの反射面を示す正面図である。 図７の走査型レーザ顕微鏡によるスポット光の走査パターンと、ＤＭＤおよびラインセンサにおいて使用する微小ミラーおよび有効ピクセルの位置とをそれぞれ場合分けして示す図である。 図８のＤＭＤにおいて、１点のスポット光に対して複数の微小ミラーをＯＮにする場合を示す図である。 図８のＤＭＤにおいて、１点のスポット光に対して、該スポット光より広い範囲の微小ミラーをＯＮにする場合を示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 図１２の走査型レーザ顕微鏡によるスポット光の走査パターンと、ＤＭＤおよびＣＣＤにおいて使用する微小ミラーおよび有効ピクセルの位置とをそれぞれ場合分けして示す図である。 図１３のＢ）〜Ｄ）において行われるマクロ刺激の場合の刺激用スポット光を示す拡大図である。 図１３と同様に、走査型レーザ顕微鏡によるスポット光の走査パターンと、ＤＭＤおよびＣＣＤにおいて使用する微小ミラーおよび有効ピクセルの位置とをそれぞれ場合分けして示す図である。 本発明の第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 標本
１，３０，４０，５０ 走査型レーザ顕微鏡
２ レーザ光源
３ 音響光学偏向素子
３ａ 結晶
３Ｘ 音響光学偏向素子（第２の音響光学偏向素子）
３Ｙ 音響光学偏向素子（第１の音響光学偏向素子）
４ 近接ガルバノミラー（光走査手段）
５ 対物レンズ
９ 励起ダイクロイックミラー（ビームスプリッタ）
１１ 倍率可変レンズ
１３ 共焦点ピンホール
１６ 光検出器
１７ 制御装置（周波数制御部）
１８ 周波数発生器（周波数制御部）
２０ 瞳
３１ ＤＭＤ（微小素子アレイ）
３１ａ 微小ミラー（微小素子）
３２ ラインセンサ（１次元検出器）
４２ ＣＣＤ（２次元検出器）
５１ａ，５１ｂ ＩＲパルスレーザ光源（近赤外パルスレーザ光源）

Claims (23)

1. レーザ光源と、
   該レーザ光源からのレーザ光の光路に配置され、結晶に加える振動の周波数を変化させることによりレーザ光の進行方向を変更可能な音響光学偏向素子と、
   該音響光学偏向素子の結晶に対して同時に複数の周波数の振動を加える周波数制御部と、
   前記レーザ光源からのレーザ光を集光して標本上にスポット光を生成する対物レンズと、
   前記音響光学偏向素子からのレーザ光を直交する２方向に偏向することにより、前記標本上のスポット光からなる走査点を２次元走査する光走査手段とを備え、
   前記音響光学偏向素子、前記光走査手段、前記対物レンズの瞳位置が、光学的に共役な位置に配置されている走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記音響光学偏向素子と前記対物レンズとの間の光路に、前記標本からの戻り光とレーザ光とを分岐するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分岐された前記標本からの戻り光を検出する光検出器とを備える請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記音響光学偏向素子により異なる方向に偏向される複数のレーザ光の偏向方向が、前記光走査手段により走査される直交する２方向の内の副走査方向に一致し、
   前記ビームスプリッタにより分岐された標本からの戻り光の光路上に、標本上の複数の走査点から発する戻り光を通過させる共焦点ピンホールが備えられ、
   前記光検出器が、各走査点から発せられ、共焦点ピンホールを通過した戻り光を個別に検出するように複数備えられている請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記各検出器により取得された画像をつなぎ合わせて１つの画像を合成する画像処理手段を備える請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記周波数制御部が、前記光走査手段の走査範囲の変更に応じて、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する振動の周波数を調節する請求項１から請求項４のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記共焦点ピンホールが、マトリックス状に配置された複数の微小素子を備え、複数の走査点と結像関係にある範囲の微小素子を有効にする微小素子アレイである請求項３から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記光検出器が、１次元検出器または２次元検出器であり、複数の走査点と結像関係にある位置のピクセルにより各走査点からの戻り光を検出する請求項２から請求項６のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. 前記光検出器が２次元検出器であり、前記共焦点ピンホールが、複数の走査点と結像関係にある位置の複数のピクセルを各走査点に対応して有効にすることにより構成されている請求項２から請求項６のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
9. 前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の周波数の振動の大きさおよび数に対応付けて、共焦点ピンホールとして作用させるために有効とする微小素子の範囲を設定する請求項６から請求項８のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
10. 前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の周波数の振動の大きさおよび数に対応付けて、光検出器上の検出に使用するピクセルを設定する請求項７から請求項９のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
11. 前記周波数制御部は、副走査方向に生成される走査点の間隔が、前記１次元検出器のピクセル列または前記２次元検出器の副走査方向に対応するピクセル列の間隔と一致するように、前記音響光学偏向素子の結晶に印加する複数の振動の周波数を調節して、前記標本に対してほぼライン状の照明を行うとともに、
    前記光検出器が、標本の複数の走査点からのライン状の戻り光を同時に検出する請求項７に記載の走査型レーザ顕微鏡。
12. 前記ビームスプリッタと共焦点ピンホールとの間に配置された倍率可変レンズを備え、
    該可変倍率レンズが、前記画像取得範囲に応じて、その倍率を可変制御される請求項３または請求項４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
13. 前記音響光学偏向素子が、前記光走査手段の主走査方向と副走査方向の両方に光線を分割させる請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
14. 副走査方向にレーザ光を偏向させる第１の音響光学偏向素子と、主走査方向にレーザ光を偏向させる第２の音響光学偏向素子とを備え、標本上にマトリクス状に複数の走査点を形成する請求項１３に記載の走査型レーザ顕微鏡。
15. 前記周波数制御部が、前記２つの音響光学偏向素子のそれぞれに複数の周波数の振動を印加することにより分割された複数のレーザ光により標本上に形成されるスポット光を、相互に隣接または一部重ねてマクロスポットを形成し、形成したマクロスポットの大きさを変化させるように、前記音響光学偏向素子に印加する振動の周波数の数および／または間隔を調節する請求項１４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
16. 前記レーザ光源と音響光学偏向素子との間に前記対物レンズの瞳に入射するビーム径を可変するビーム径可変光学系を備える請求項１５に記載の走査型レーザ顕微鏡。
17. 前記２つの音響光学偏向素子と前記対物レンズとの間の光路に、前記標本からの戻り光とレーザ光とを分岐するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分岐された前記標本からの戻り光を検出する光検出器とを備える請求項１４から請求項１６のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
18. 前記レーザ光源が、異なる波長の刺激用レーザ光および観察用レーザ光を発振し、
    前記周波数制御部が、前記音響光学偏向素子に各レーザ光の波長に対応する周波数の振動を同時に印加して、各レーザ光の走査点を標本上の異なる位置に形成し、
    前記光検出器が、観察用レーザ光の走査点から発せられた戻り光を検出する請求項１７に記載の走査型レーザ顕微鏡。
19. 前記周波数制御部が、前記刺激用レーザ光の照射位置および前記観察用レーザ光の照射位置を切り替えるように、前記音響光学偏向素子に印加する振動の周波数を変更する請求項１８に記載の査型レーザ顕微鏡。
20. 前記周波数制御部が、前記光走査手段による走査にかかわらず、前記刺激用レーザ光の照射位置を静止させるように、前記音響光学偏向素子に加える振動の周波数を走査する請求項１８に記載の走査型レーザ顕微鏡。
21. 前記周波数制御部が、前記標本上に形成される複数のマトリクス状のスポット光のＸ方向の間隔およびＹ方向の間隔をそれぞれ等間隔となるように前記音響光学偏向素子に加える振動の周波数を調節し、
    前記光走査手段が、前記スポット光の間隔に応じた主走査方向および副走査方向の走査範囲にスポット光を走査させ、
    前記各スポット光の結像位置に共焦点ピンホールが配置されている請求項１７に記載の走査型レーザ顕微鏡。
22. 前記光検出器により個別に取得された画像をつなぎ合わせて表示する表示手段を備える請求項２１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
23. 前記レーザ光源が、多光子励起観察用の近赤外パルスレーザ光源である請求項１から請求項２２のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。

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