JP2007506146A - 共焦点レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

本発明は共焦点レーザ走査顕微鏡に関し、その顕微鏡は、物体面（１１）内に配列された多数のスポット（３０）に励起放射を合焦する励起ビーム経路と、ピンホール遮断部（１４．２）によってマルチチャネル検出器（１５．２）上にスポット（３０）を共焦点的に撮像する検出ビーム経路と、物体面（１１）内に配置された物体と前記スポット（３０）との間の二次元相対移動を行わせる走査ユニット（４、５、３７）とを備える。走査ユニット（４、５、３７）は、前記相対移動の間、スポット（３０）を第１方向（３２）に沿って移動させ、これによって前記スポット（３０）により物体（３４）の帯状領域を走査し、次いでスポット（３０）を第２方向（３３）に沿って移動させ、第１方向（３２）に沿った新たな移動によって隣接する帯状領域を続いて走査する。

Description

本発明は共焦点レーザ走査顕微鏡に関し、励起放射を物体平面内に位置する多数のスポットに合焦する励起ビーム路と、ピンホール遮断部（Pinholeblenden）によってマルチチャネル検出器上にスポットを共焦点的に撮像する検出ビーム路と、物体平面内に位置する物体とスポットとの間で二次元相対移動を行わせる走査ユニットとを備えている。

数個のスポットの同時走査を行うレーザ走査顕微鏡検査は、物体の走査を加速することができる。米国特許第６２６２４２３号は前述の形式の共焦点レーザ走査顕微鏡について記載しており、ニプコーディスク上に配置されたマイクロレンズアレイを、拡大レーザビームによって照明する。レンズアレイによって発生した部分的ビームのスポットを、微小対物レンズによって物体平面内に撮像し、スポットによって出射された蛍光放射線を、微小対物レンズによって取り込み、ビームスプリッタを介してＣＣＤ受光部まで誘導する。ニプコーディスクの１回の回転により、ＣＣＤ二次元センサは点状に照明され、こうして完全な画像信号を取り込む。ディスク上に約１００個の個別のレンズ用いることにより、非常に素早い物体の走査が可能となる。分解能は、画素数およびＣＣＤ二次元センサの画素サイズによって予め決定され、不変である。また、ニプコーディスクを生産しその上にマイクロレンズを正確に位置付けることは、技術的に複雑であり、したがって費用がかかる。

前述の形式の更に別の共焦点レーザ走査顕微鏡が米国特許第６０２８３０６号から公知である。この中に記載されている装置では、レーザ光源およびマイクロレンズアレイを用いて、数個のスポットを備えたスポット配列(Spotverteilung)を物体内に撮像する。遮断アレイ(Blendenarray)によって、スポットを共焦点的に撮像する。ｘ／ｙビームスキャナが、検査面を走査し、一実施形態では、隣接するスポット間の距離と同様の経路長にわたってスポットを移動させる。これによって、小さなビーム偏向を用いて、大きな表面積を走査することが可能となる。何故なら、隣接する個々のスポットの各々は小領域を走査し、これらの領域全てが一体となって、走査面が完成するからである。この装置の欠点は、マイクロメータ範囲の許容度で、個々のスポットの小走査領域が継ぎ目なく互いに突き合わなければならないことである。用途によっては、放射線のクロストークが、蛍光体の脱色や飽和という影響を及ぼす場合もある。
米国特許第６２６２４２３号明細書 米国特許第６０２８３０６号明細書

本発明の目的は、物体の素早い走査を可能にする、前述の形式のレーザ走査顕微鏡を提供することである。

物体面内に配列された多数のスポットに励起放射を合焦する励起ビーム経路と、ピンホール遮断部によってマルチチャネル検出器上にスポットを共焦点的に撮像する検出ビーム経路と、物体面１１内に配置された物体と前記スポットとの間の二次元相対移動を行わせる走査ユニットとを備えている共焦点レーザ走査顕微鏡において、走査ユニットが、前記相対移動の間、スポットを第１方向に沿って移動させ、これによってスポットにより物体の帯状領域（Streifen）を走査し、次いでスポットを第２方向に沿って移動させ、第１方向に沿った新たな移動によって隣接する帯状領域を続いて走査することによって、前述の目的を達成する。

このように、本発明によれば、物体を帯状領域単位で走査し、各帯状領域を横切って全スポットを誘導することによってこれを検知する。前述の米国特許第６０２８３０６号とは対照的に、検知する物体面は、互いに継ぎ目なく合体されなければならずしかも各々が単一のスポットによって検知される、別個の単一スポット領域には分割されず、全スポットが一体となって、帯状領域からの蛍光放射線を検出する。続いて、好ましくは第１方向に直交する第２方向にスポットを移動させることによって、物体の次の帯状領域を撮像する。このように、物体面を帯状領域に分割し、全スポットを各帯状領域上に誘導する。

スポットパターンの発生は、励起ビーム経路に配列され検出には用いられない微小レンズアレイによって行うと便利であり、微小レンズアレイにより、スポットを直線状または矩形または正方形状に配列する。ピンホール遮断部は、勿論、スポットパターンに合わせて適合化し、直線状微小レンズアレイには、直線状の遮断部が用いられ、矩形または正方形スポットパターンには、対応する遮断部のアレイを備える。ピンホール遮断部は、励起ビーム経路には配置せず、例えば、マルチチャネル検出器の前に配列すると有利である。何故なら、こうすれば、干渉する励起放射の反射が起こらないからである。このように、スポットを発生し検出するために、別個の回折抑制物体を設け、励起および検出ビーム経路双方の一部である中央遮断ユニットを省略することができる。

隣接するスポット間でクロストークを防止するためには、隣接するスポット間に、スポットの直径に対して、大きな距離を設定すると便利である。好ましくは、この距離は少なくともスポットの直径の１０倍とするとよい。

スポットパターンを第１方向に対して傾かせ、スポットが、前記方向に対して垂直に、スポットの直径以下の距離を有するようにすれば、本発明による顕微鏡によって行われる走査には、隣接するスポット間に大きな距離を実現することは、特に容易となる。一方、この実施形態では、第１方向に沿った移動の間に物体の帯状領域を連続的に全スポットによって確実に走査し、他方では殆どあらゆるサイズの距離を隣接するスポット間に確実に設定可能とする。

スポットパターンの、走査ユニットが相対的にビームを移動させる第１方向に対する傾いた位置付け即ち傾斜した位置付けは、励起ビーム経路において光スポットを発生する素子、例えば、前述の微小レンズアレイを、ピンホール遮断部およびマルチチャネル検出器と同様に、第１方向に対してビーム経路内における光軸を中心に回転させることによって、光学走査ユニットにおいて達成することができる。

特に好ましくは、本発明による顕微鏡は、隣接するスポット間の距離よりは遥かに長い、第１方向に沿った移動の経路を用いるので、米国特許第６０２８３０６号に関して述べた問題、即ち、小領域を継ぎ目無く合体することが回避される。

以下に、一例として、そして図面を参照して本発明について更に詳しく説明する。
図１は、ビームによって物体を走査する、光ビームスキャナを備えた従来のレーザ走査顕微鏡を示す。レーザ１の放射線は、光学構成２による顕微鏡の要件に合わせて、ウェスト位置およびビーム断面のようなビームパラメータについて適応化されている。励起または照明放射線は、スプリッタ３によって主ビーム内に結合され、ビームスキャナ４および５に誘導される。ビームスキャナは、互いに密接して隣接し、ビーム路の瞳の直近に配置されている。図に示すように、これらの回転軸は互いに垂直であり、別個に制御することができる。

続いて配置されている走査光学部品６は、スキャナによって生ずる異なるビーム偏向全てに対して、画像面７内にスポット画像を発生する。チューブレンズ８が放射線をアパーチャ面９に集め、次いで、対物レンズ１０は、サイズを縮小したスポット画像を物体面１１内に発生する。

蛍光励起の場合、サンプルの一部が、各スポット蛍光毎に放射線を出射し、励起放射に対してより長い波長に向かって、放射線を移動させる。この放射線は、再度対物レンズ１０によって集められ、前述の構造を通って同じ道を逆方向に進む。

ビームスキャナ４および５を２回通過するので、スキャナの後に検出されるビームの移動は中性化され、静止放射線ビームがもう１回得られる。
ビームスプリッタ３は、蛍光放射線を検出ビーム経路に分離する。干渉フィルタ１２が、ビーム経路内に未だ残っている可能性がある、短い方の波長の励起放射の成分を分離する。

ピンホール面１３において、レンズ１３が、物体面１１において丁度照明した蛍光物体点のスポット画像を発生する。検出器５は、この場合単一点受光部であり、ピンホール面１３の後ろに配置されており、放射線の強度に応じたビデオ信号を供給し、接続されている評価ユニットによって画像信号に変換される。構造検査用の構成では、物体１１によって反射された放射線が取り込まれ、スプリッタ３は波長選択、二色性ビームスプリッタではなく、単純な中性ビームスプリッタである。すると、出射フィルタ(Emissionsfilter)１２を省略することができる。ピンホール遮断部のサイズによって、検出する物体構造のサイズを設定することができ、遮断部の直径を短くする程、物体面における深さ判別を高めることができる。即ち、遮断部の直径が深さ領域を設定し、ここから、画像発生のための放射線を取り出す。こうして、他の深さ領域からの干渉放射線成分を排除する。これは、レーザ走査顕微鏡検査の、従来の光顕微鏡検査に対する決定的な利点である。

図２は、以下に記載する変更を除いて、図１の構造に対応する共焦点マルチチャネルレーザ走査顕微鏡を示す。この装置はマルチチャネル動作のために装備される。この目的のために、レンズアレイ１６をできるだけ完全かつ均一に照明するように平行レーザビームは望遠鏡２．２によって適切に拡大される。レンズアレイ１６の外形形状、そのチャネルの数および分布は、例えば、８×８の個別受光部を有する型番Ｈ７５４６やＨ７２６０、あるいは１×３２の個別受光部を備えた線形配列された検出器アレイのような、ハママツ社（Firma Hamamatsu）のマルチアノード光電子倍増管といった、採用する検出器アレイによって異なる。第１の場合では、８×８のマイクロレンズを備えたレンズアレイ（正方形配列）が必要である。第２の場合では、１列に３２個のマイクロレンズを備えた線形アレイ（ライン）が必要である。レンズアレイ１６の個々のレンズは、十分に均一な焦点距離を有し、例えば、リソグラフ法で製造した場合である。

レーザビーム用拡大光学部品２．２は、それぞれのレンズアレイ１６の照明に適した寸法となっている。これに関して、照明の均質性を遵守しなければならない。あるいは、対応するホログラフ光学素子（ＨＯＥ）を用いて照明を改善することができる。

拡大し平行化したビームは、レンズアレイ１６によって、複数の部分ビームに分割される。レンズシステム１７および１８の機能は、単一のレンズでも実現することができるが、こうして形成された個々のスポットを、共通のアパーチャ画像に変換する。共通アパーチャ画像は、密接に隣接したビームスキャナ４および５の間に位置付けると有利である。各スポットに１つずつの光束から成る、扇状平行化光束が、アパーチャ画像によって出射される。スキャナのミラーサイズは、最大偏向条件においても全ての光束をカバーするように決められている。走査光学部品は、光束を取り込み、スポット分布、即ち、数個の個々のスポットの配列を発生する。この配列は、画像面７内において、スキャナの移動と共に移動する。好ましくは、画像面７内に固定のまたは調節可能な遮断配列７を配置する。前記配列は、走査すべき区域に正確に印を付けて、測定範囲のために所望の画像領域の外側に位置するスポットが物体場(objektfeld)に到達せず、蛍光脱色、蛍光飽和、またはサンプルにおけるその他の非可逆的変化を生ずることができないようにしている。

スポット分布は、チューブレンズ８および対物レンズ１９によって、サイズを縮小して、物体面１１内に撮像される。物体面内に位置する蛍光構造またはサンプルは、移動するスポット分布によって励起され、通常波長が長い蛍光放射線を出射する。この放射線は、励起放射と同じ経路を逆に進み、光学構成を通過して、主カラースプリッタまで達する。スキャナを２回通過することにより、ビームの移動はこのために相殺され(descannt)、即ち、中和されるので、スキャナ４と検出器との間の部分に静止ビームが形成される。検出器は、ここでは、検出器アレイ１５．２として設けられている。

二色性ビームスプリッタ３は、検出ビーム経路を励起ビーム経路から分離し、出射フィルタ１２が励起光の反射残余を遮断する。レンズ系１８および１３は、検出器アレイ１５．２の直前に位置する、更に別の画像面内に合焦させることができる。共焦点ピンホールアレイ１４．２が、この画像面内に配置されている。これを、レンズアレイ１６が発生するスポット分布の位置に調節し、ピンホール遮断部１４と同様に作用して、物体面１１に取り付けられているサンプルの異なる深さレベルからの光を分離する。検出器アレイ１５．２の個々のチャネルは、スキャナの移動と結合されている各スポットと同時に連動して、時間可変信号を供給し、これらの信号が電子的評価によって結合され、画像を形成する。

図３は、レンズアレイ１６、検出器アレイ１５．２、およびピンホールアレイ１４．２の線形（直線）配列に対するスポット分布を示す。これは、走査する区域３４に対する走査動作を示す。走査動作の開始点は、例えば、区域３４の右側にある、傾いたスポット列の位置とする。走査が開始すると、第１スキャナがスポット列を方向３２に沿って移動させ、スポット３０を、帯状の物体場上に移動させる。この後に、第２スキャナがアクティブとなり、全てのスポット３０を方向３３に沿って移動させる。次に、第１スキャナが逆行して３２の方向に移動し、第２の隣接する帯状領域を撮像する。区域全体を走査するように、これを続ける。このように、各スポット３０は経路３１上を移動し、全ての経路３１が合同して１つの帯状領域をカバーする。方向３２の走査長は、区域の長さによって決められ、方向３２に沿ったスポット分布の長さだけ延長される。明確化のため、スポットの列は、対応する区域３４の寸法よりもかなり大きめに示されている。

スポットの直径が１μｍであり、１０個の個別のスポットがあると仮定すると、直径よりも１０倍長いスポット距離に対するスポット列の長さは、１００μｍとなる。画像面内において遮断部７を用いると、区域３４に隣接する横方向区域を照明から保護することができる。

図４に更に詳細に示すように、スポット３０は、方向３２または経路３１に対して、それぞれ、傾斜している直線３４上に配置されている。スポットの半径３５は、対物レンズ１０の分解能に一致するように、寸法が決められている。所与の波長および回折を制限した光学設計では、前記分解能は、逆開口数(reziproke numerische Apertur)のみによって決定される。走査動作によって分解能を最大限活用するために、スポット３０は、走査方向３２または経路３１に対して垂直に投射する距離３６を有する。その距離は、スポット半径３５のサイズ以下である。距離３６は、隣接するスポット３０間のクロストークによって決定され、撮像機能（点拡散機能ＰＳＦ）から計算する。図３にしたがって設定する傾斜３４の角度は、アークタンジェント（スポット半径／スポット距離）に対応する。スポット距離がスポットの直径の１０倍に等しい場合、ａｒｃｔａｎ（１／２０）＝２．８６゜となる。レンズアレイ１６は、方向３２または経路３１に対してほぼこの角度だけ傾斜して設定されている。

図５は、正方形スポットアレイに対する走査の移動３２．５および３３．５を示す。この図には、スポットアレイ３０．５は詳細に示されていない。ここでは、先に示した傾斜が、個々のスポットの間にも設定されており、ここではアレイ傾斜として表されており、傾斜した画像をサンプル区域３４全域において走査する。

図６は、ｘ／ｙテーブルスキャナを備えた構成を示す。光学構造は、ここでは、光顕微鏡と同様となっている。スポット分布の画像は、受光部１５．２の前方に位置する画像面内で発生され、この面内に、共焦点ピンホールアレイ１４．２が配置されている。サンプルの移動は、図３および図５における、それぞれ、３２および３３または３２．５および３３．５と同様の、指示された方向に、ｘ／ｙ走査テーブルによって行われる。スポット数が多い場合、得られる光出力に限界があるため走査を低速で行わなければならないが、このような構成は、更に大きなサンプル区域３４でも迅速に感知するためには有利である。

ビームで物体を走査する従来のレーザ走査顕微鏡を示す。 物体を数個のビームで走査する、本発明によるレーザ走査顕微鏡を示す。 スポットラインに対するスポット分布および走査移動を示す模式図。 互いに対する隣接スポットの位置を示す模式図。 正方形スポット分布に対する走査移動を示す。 図２に類似するが、テーブルトップ走査ユニットを備えているレーザ走査顕微鏡を示す。

Claims (5)

1. 物体面（１１）内に配列された多数のスポット（３０）に励起放射を合焦する励起ビーム経路と、ピンホール遮断部（１４．２）によってマルチチャネル検出器（１５．２）上にスポット（３０）を共焦点的に撮像する検出ビーム経路と、物体面（１１）内に配置された物体と前記スポット（３０）との間の二次元相対移動を行わせる走査ユニット（４、５、３７）とを備えている共焦点レーザ走査顕微鏡において、前記走査ユニット（４、５、３７）は、前記相対移動の間、前記スポット（３０）を第１方向（３２）に沿って移動させ、これによって前記スポット（３０）により物体（３４）の帯状領域を走査し、次いで前記スポット（３０）を第２方向（３３）に沿って移動させ、前記第１方向（３２）に沿った新たな移動によって隣接する帯状領域を続いて走査することを特徴とする共焦点レーザ走査顕微鏡。
2. 前記例示放射線を合焦する微小レンズアレイ（１６）を備えており、該アレイが線状または矩形配列の微小レンズから成り、線状または矩形スポットパターン（３０．５）を生ずることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡。
3. 前記スポットパターン（３０．５）を前記第１方向（３２）に対して傾かせ、前記スポット（３０）が、前記第１方向（３２）に対して垂直に、前記スポットの直径以下だけ互いに離間するようにしたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡。
4. 前記物体面（１１）における隣接するスポット間の距離は、少なくとも前記スポットの直径の１０倍に等しいことを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の顕微鏡。
5. 前記第１方向（３２）に沿った移動の経路が、隣接するスポット（３０）間の距離よりも大きいことを特徴とする先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の顕微鏡。

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