JP4633386B2 - 走査型レーザ顕微鏡及びそれを用いたデータ取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、光源からの光を走査して試料に照射し、試料で発生する検出光をスペクトル分散してそのスペクトル分散された光を検出する走査型レーザ顕微鏡及びそれを用いたデータ取得方法に関するものである。

顕微鏡の分野では、有機化合物である蛍光試薬やＧＦＰに代表される蛍光タンパ質のラインナップの増加などに伴ない、さまざまな蛍光を同時に検出することが望まれている。

そこで、従来、特許文献１に開示されるように光分散手段と多チャンネル検出器を利用したものが提案されている。この特許文献１のものは、スペクトル分散手段として、回折格子が用いられ、試料から発せられた光を回折格子によりスペクトル分散し、そのスペクトル分散された検出光を多チャンネル検出器としてラインセンサに入射させ、１度のスキャンで多くの波長範囲の蛍光の分光データを取得できるようにしている。
特開２００３−１８５５８２号公報

ところが、多チャンネル検出器としてラインセンサを用いたものは、例えば、蛍光検出で必用とされる波長域を４００〜８００ｎｍとし、ラインセンサとして４０分割のものを使用すれば、１つの受光ピクセルで約１０ｎｍの範囲で蛍光を検出できることになるが、ラインセンサの分割数が多くなると、各受光ピクセルでの検出感度の低下を招き易くなり実用的でなくなる。このため、実用レベルで考えると波長分解能は高いといえない。つまり、ラインセンサを用いたものは、スペクトルの波長分解能が光学的な分解能によらずラインセンサの分割数のみによって決定されるため、より高い波長分解能を得ることができない。

このことから、例えば、退色が顕著な標本を１回の標本スキャンで多くの波長範囲のデータを取るような場合は極めて有効であるが、波長分解能が必要な詳細な解析については使用しずらいという問題があった。

このような問題を解決するものとして、検出光をスペクトル分散素子によりスペクトルに分散させ、これにより形成されるスペクトル列位置の近傍に波長領域を取り出すスリットを配置し、このスリットを介して取り出された光を検出器で検出することで、任意の波長範囲のデータ検出するような検出方法が考えられている。

このような検出方法によれば、スリット幅のステップを、例えば２〜３ｎｍの波長に相当する幅に設定すれば高波長分解能の検出が可能となる。

しかし、このような検出方法では、２〜３ｎｍの高い波長分解能の検出ができるものの、１回の標本スキャンについては１つの波長範囲のデータしか取得することができない。

このことから、例えば複数の波長範囲の中から特定の波長範囲の詳細データを取得したいような場合、何回もの標本スキャンを繰り返し、その中から目的とする波長範囲の詳細データを確保しなければならず、効率的なデータの検出が難しいという問題がある。また、このように何回もの標本スキャンを繰り返したのでは、退色などが顕著な標本については正確なデータが取れなくなってしまうという問題も生じる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、解析の目的に合わせて検出光の波長分解能を最適なものに設定でき、効率的なデータ検出を可能とした走査型レーザ顕微鏡及びそれを用いたデータ取得方法を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、前記レーザ光が照射される前記標本からの検出光を結像する共焦点レンズ及び該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った前記検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、前記走査手段により前記レーザ光を２次元走査しながら、前記標本の同じ領域について該スペクトル領域選択手段により選択するスペクトル領域を変更して該スペクトル領域選択手段で選択された該スペクトルを検出する動作を複数回繰り返す第１の検出手段と、複数の検出チャンネルを有し、該複数の検出チャンネルによって前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルのスペクトル領域ごとの強度を前記走査手段による１回の２次元走査で同時に検出する第２の検出手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを選択的に前記第１の検出手段または第２の検出手段に導入するスペクトル導入手段と、を具備し、前記スペクトル領域選択手段は、前記第２の検出手段が有する１つの前記検出チャンネルが検出するスペクトル領域より狭いスペクトル領域を選択可能であることを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段を回転可能にし、該スペクトル分散手段の回転により前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを前記第１の検出手段または第２の検出手段に選択的に導入するようにしたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記スペクトル導入手段は、前記第１の検出手段または第２の検出手段を選択的に前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルの光路上に移動させることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルの光路に挿脱される反射部材を有し、該反射部材の光路への挿脱に応じて前記スペクトルを前記第１の検出手段または第２の検出手段に導入するようにしたことを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記第１の検出手段または第２の検出手段の近傍に前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを結像させるスペクトル結像手段を有することを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載の発明において、前記スペクトル分散手段は、反射面を凹面にした回折格子ミラーからなることを特徴としている。

請求項７記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルを優先的に前記第２の検出手段に導入し、該第２の検出手段の検出結果を待って前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルを前記第１の検出手段に導入するようにしたことを特徴としている。

請求項８記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、前記レーザ光が照射される前記標本からの検出光を結像する共焦点レンズ及び該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記検出光を波長ごとに分光し複数チャンネルの光路に分割する光路分割手段と、前記複数チャンネルのうち一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させる第１のスペクトル分散手段と、該第１のスペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段とを有し、前記走査手段により前記レーザ光を２次元走査しながら、前記標本の同じ領域について該スペクトル領域選択手段により選択する該スペクトル領域を変更して該スペクトル領域選択手段で選択された該スペクトルを検出する動作を複数回繰り返す第１のチャンネル検出手段と、前記複数チャンネルのうち他の一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させる第２のスペクトル分散手段と、複数の検出チャンネルとを有し、該複数の検出チャンネルによって該第２のスペクトル分散手段で分散されたスペクトルのスペクトル領域ごとの強度を前記走査手段による１回の２次元走査で同時に検出する第２のチャンネル検出手段と、を具備し、前記スペクトル領域選択手段は、前記第２のチャネル検出手段が有する１つの前記検出チャンネルが検出するスペクトル領域より狭いスペクトル領域を選択可能であることを特徴としている。
請求項９記載の発明は、標本をレーザ光により２次元走査し、標本から発生する検出光を共焦点検出するとともにその波長特性をレーザ走査位置ごとに取得する、レーザ走査型顕微鏡を用いたデータ取得方法であって、レーザ光を２次元的に走査しながら標本に照射し、この２次元走査により発生する標本からの検出光をスペクトル分散させ、この分散された検出光を複数の検出チャンネルを有する検出手段によって検出して、検出光の波長範囲ごとの強度である波長特性を取得し、取得された波長特性に基づいて詳細測定を行うべき注目波長範囲を設定し、レーザ光を再度２次元的に走査しながら標本に照射して標本から発生する検出光をスペクトル分散させ、スペクトル分散された検出光から、設定された注目波長範囲において所定のスペクトル領域を選択してその光量を前記検出手段とは異なる光検出器により検出し、前記選択するスペクトル領域を１回の２次元走査ごとにずらしながら２次元走査を複数回おこなって光量検出することで、注目波長範囲の波長特性を取得することを特徴としている。

本発明は、解析の目的に合わせて検出光の波長分解能を最適なものに設定でき、効率的
なデータ検出を可能とした走査型レーザ顕微鏡及びそれを用いたデータ取得方法を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図において、１は観察用励起レーザ光源として観察用励起レーザ光を発振するレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、レーザ光源として４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と、５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ３を有している。アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。ここでのダイクロイックミラー５は、４８８ｎｍのレーザ光を反射し、５４３ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦとする）６が配置されている。ここでのＡＯＴＦ６は、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長のレーザ光の選択を行うことが可能になっている。

ＡＯＴＦ６の出射端には、シングルモードファイバ７の入射端が接続されている。シングルモードファイバ７の出射端には、スキャナユニット８が接続されている。スキャナユニット８は、シングルモードファイバ７のの出射側に、ＡＯＴＦ６からのレーザ光を平行光にするコリメートレンズ９が配置されている。

コリメートレンズ９の平行光の光路上には、光路分割手段としてビームスプリッタユニット１０が配置されている。ビームスプリッタユニット１０は、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ、１０ｃが同心円状に配置されている。また、ビームスプリッタユニット１０は、モータ１０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ、１０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ１０ａと１０ｂと１０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ１０ａは、全ての波長域にわたり反射率２０％、透過率８０％の特性を有し、ビームスプリッタ１０ｂは、４８８ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ１０ｃは、４１８８ｎｍと５４３ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過するような特性を有している。

なお、図示例では、ビームスプリッタ１０ａが光路上に位置決めされている。

ビームスプリッタユニット１０の反射光路には、走査手段としてＸＹスキャナミラー１１が配置されている。このＸＹスキャナミラー１１は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１１ａ、１１ｂを有し、これらのミラー１１ａ、１１ｂにより後述する標本１５上の観察用励起レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

ＸＹスキャナミラー１１により２次元走査されたレーザ光の光路上には、観察用励起レーザ光の走査光学系を構成する瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４が配置されている。この場合、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査された観察用励起レーザ光は、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５の焦点位置に結像され、また、標本１５から発生された蛍光（検出光）は、観察用励起レーザ光と逆の光路をたどって対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介してビームスプリッタユニット１０まで戻るようになっている。

ビームスプリッタユニット１０の透過光路上には、反射ミラー１６が配置されている。この反射ミラー１６の反射光路上には、検出光学系として共焦点レンズ１７と共焦点絞り（ピンホール）２２が配置されている。この場合、共焦点レンズ１７の集光位置に共焦点絞り２２が配置されている。共焦点絞り２２には、駆動装置２２ａが設けられている。この駆動装置２２ａは、共焦点絞り２２の共焦点絞り径を、対物レンズ１４の瞳径により決まるスポット径に適したものにするためのものである。

共焦点絞り２２を通過した光路上には、コリメートレンズ２３が配置されている。コリメートレンズ２３は、共焦点絞り２２を通過して拡散される光を平行光に変換するものである。

コリメートレンズ２３からの平行光は、スキャナユニット８内の分光ユニット２４に入射される。分光ユニット２４は、コリメートレンズ２３からの平行光の光路上にスペクトル分散手段としてミラー面が回折格子である回折格子ミラー２５が配置されている。この回折格子ミラー２５は、スペクトル導入手段を構成する不図示のステッピンングモータを使用して回折格子面を図示の回転方向２５ａに回転可能になっていて、回折格子により分散した各波長の蛍光の反射方向を変えることができるようになっている。

回折格子ミラー２５より反射される第１の光路Ｆ上には、集光レンズ２６が配置されている。集光レンズ２６は、回折格子ミラー２５の分散面の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。集光レンズ２６を透過した光路には、第１の検出手段としてスペクトル領域選択手段としてスリット２７とサイドオン型のフォトマルチプライヤー２８が配置されている。スリット２７は、集光レンズ２６の結像位置に配置されている。このスリット２７は駆動装置２７ａによりスリット幅をスペクトルの分散方向に変更できるようになっている。また、フォトマルチプライヤー２８は、スリット２７の後方に配置されている。この場合、フォトマルチプライヤー２８は、蛍光の分散されたスペクトル列方向と受光面の長手方向が一致するように配置されている。

回折格子ミラー２５より反射される第２の光路Ｇ上には、集光レンズ２９が配置されている。集光レンズ２９は、回折格子ミラー２５の分散面の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。集光レンズ２９の結像位置には、第２の検出手段として、分散スペクトルの波長範囲ごとの強度を検出する複数の検出チャンネルを有する、例えばラインセンサ３０が配置されている。このラインセンサ３０は、複数の受光ピクセル（検出部）３１をアレイ状に配列したもので、これら受光ピクセル３１を蛍光の分散されたスペクトル列方向と一致する方向に配置している。また、ラインセンサ３０は、受光ピクセル３１のうち光の受光を有効にするものと無効にするものを選択して各受光ピクセル３１の検出値を読み出すようになっている。

次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。

まず、ラインセンサ３０を用いて１回のスキャンにより標本１５からの蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得する。この場合、図２に示すように回折格子ミラー２５を回転してスペクトル分散された蛍光が光路Ｇに向かうように設定する。また、ビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａを光路上に切り換え、レーザ光源ユニット１の４８８ｎｍの波長の光を発振するアルゴンレーザ２と５４３ｎｍの波長の光を発振するヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光により標本１５から発生する蛍光の波長特性を取得するものとする。

レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６により４８８ｎｍの波長と５４３ｎｍの波長のレーザ光が選択されると、これら波長のレーザ光は、シングルモードファイバ７を介してスキャナユニット８に導かれる。

スキャナユニット８に導かれたレーザ光は、コリメートレンズ９で平行光になって、ビームスプリッタ１０ａで反射され、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査され、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５に結像される。

標本１５から発生された蛍光は、レーザ光と逆の経路をたどって対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介してビームスプリッタ１０ａまで戻る。ビームスプリッタ１０ａまで戻った蛍光は、このビームスプリッタ１０ａを透過し、反射ミラー１６で反射され、共焦点レンズ１７を介して共焦点絞り２２上に結像される。共焦点絞り２２を通過した蛍光は拡散光となってコリメートレンズ２３に入射し、平行光に変換される。平行光となった蛍光は、回折格子ミラー２５に入射して回折格子の分散作用により、スペクトル成分へ分散される。

スペクトル分散された蛍光は、光路Ｇに向かい、集光レンズ２９によりラインセンサ３０上に結像する。ここで、ラインセンサ３０上の全ての受光ピクセル３１を有効にすることで、１回のスキャンによりスペクトル分散された蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得することができる。

次に、このようにして取得した波長特性（分布）に基づいて注目する波長範囲を設定し、詳細データを取得する。

この場合、図３に示すように回折格子ミラー２５を回転してスペクトル分散された蛍光が光路Ｆに向かうように設定する。すると、スペクトル分散された蛍光は、光路Ｆに向かい、集光レンズ２６によりスリット２７上に結像する。このとき、スリット２７のスリット幅を駆動装置２７ａにより変えることで、フォトマルチプライヤー２８で受光するスペクトル幅を変えることができ、また、回折格子ミラー２５を回転（走査）することで、受光できるスペクトル波長範囲を変えることができる。つまり、スリット２７のスリット幅の設定と、回折格子ミラー２５の回転走査を行うことで、注目する波長範囲を設定し、この範囲の詳細データを取得する。

この場合、標本１５上で走査されるレーザ光の走査ピクセルごとに予め設定したスリット幅の設定（スペクトル成分の分解能の設定）により回折格子ミラー２５の走査を行うことで、分光データが取得されるが、このときスリット２７のスリット幅および回折格子ミラー２５の回転は一般的に２〜３ｎｍに相当する精度で十分制御できるので、高精度（高波長分解能）な分光データを取得することができる。

従って、このようにすれば、光路Ｇを使ってスペクトル分散された蛍光をラインセンサ３０に導入することで、１回のスキャンによりスペクトル分散された蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得し、次いで、この波長特性（分布）に基づいて注目する波長範囲の詳細データを取得したい場合は、光路Ｆを使ってスペクトル分散された蛍光をスリット２７に導入し、スリット２７のスリット幅の設定と回折格子ミラー２５の回転走査を行うことで、注目する波長範囲の詳細データを取得するようにしたので、波長分解能が必要な詳細な解析において無駄なスキャンをせずに、正確に取りたい分光データのみを能率的に取得することができる。

なお、このような一連の作業は、自動化することで目的とする分光データをさらに能率よく取得することができる。

一方、これら一連の動作は、要求される波長分解能に応じてそれぞれ単独で設定することもできる。例えば、波長数ｎｍレベルの高波長分解能を必要とする解析を行いたいときは、単独で光路Ｆを選択してスリット２７のスリット幅の設定と回折格子ミラー２５の回転走査を行なうことで、高精度のデータを取得し、また、標本の退色などの影響を極力避けたいときは、単独で光路Ｇを選択してラインセンサ３０を使用することで、１回の標本スキャンで多くの波長範囲のデータを同時に取得するというように目的に合わせて検出方法を選ぶことができる。

ここで、ラインセンサ３０でのデータ取得は、検出したい波長範囲に対応する光の受光ピクセル３１を有効にし、反対に検出不要な受光ピクセル３１を無効にすることにより、検出したい波長範囲の分光データのみを１回で取得することが可能となる。ちなみに、通常、蛍光検出で必用とする波長を約４００〜８００ｎｍとし、ラインセンサ３０として４０分割のものを使用するとすれば、各受光ピクセルにより１０ｎｍの範囲が検出できることになる。

また、一般的にラインセンサ３０は、フォトマルチプライヤー２８と較べると感度が低いので、高感度のデータ取得が必要な場合は、優先的に第１の光路Ｆを使用してフォトマルチプライヤー２８によりデータ検出するような選択もできる。

（変形例１）
図４は、変形例１の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。この場合、回折格子ミラー３２は、反射面を凹面にしたものを用い、それ自体に結像特性をもたせるようにしている。そして、回折格子ミラー３２の反射面からの反射光の光路Ｆと光路Ｇでのそれぞれの結像位置に、スリット２７とラインセンサ３０が配置されている。

このようにしても、第１の実施の形態で述べたと同様な効果を得られ、さらに、それぞれの光路の集光レンズ２６および２９を省略できるので、構成を簡単にできる。

（変形例２）
図５（ａ）（ｂ）は、変形例２の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。この場合、集光レンズ２６を有する光路Ｆを共通に使用し、この光路Ｆに対してスリット２７とフォトマルチプライヤー２８から構成される第１の検出手段と、ラインセンサ３０から構成される第２の検出手段を選択的に挿脱可能にしている。

このようにすれば、図５（ａ）に示すように光路Ｆに第１の検出手段を構成するスリット２７とフォトマルチプライヤー２８を挿入すれば、波長数ｎｍレベルの高波長分解能を必要とする解析のデータを取得することができ、また、図５（ｂ）に示すように光路Ｆに第２の検出手段を構成するラインセンサ３０を挿入すれば、一回の標本スキャンで多くの波長範囲のデータを取得することができ、第１の実施の形態で述べたと同様に、目的に合わせて最適な検出方法を簡単に選ぶことができる。

（変形例３）
図６（ａ）（ｂ）は、変形例３の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。

この場合、光路Ｆを共通に使用し、この光路Ｆに反射部材として反射ミラー３３を挿脱可能に設けられていて、この反射ミラー３３を光路Ｆに挿入したときは、回折格子ミラー２５によりスペクトル分散された蛍光を反射し、集光レンズ２９を介して第２の検出手段を構成するラインセンサ３０に入射させ、また、反射ミラー３３を光路Ｆ外に退避させたときは、回折格子ミラー２５によりスペクトル分散された蛍光を集光レンズ２９を介して第１の検出手段を構成するスリット２７とフォトマルチプライヤー２８に入射させるようにしている。

このようにしても、図６（ａ）に示すように反射ミラー３３を光路Ｆ外に退避させ、光路Ｆに第１の検出手段を構成するスリット２７とフォトマルチプライヤー２８を挿入すれば、波長数ｎｍレベルの高波長分解能を必要とする解析のデータを取得することができ、また、図６（ｂ）に示すように反射ミラー３３を光路Ｆに挿入して光路Ｆに第２の検出手段を構成するラインセンサ３０を挿入すれば、一回の標本スキャンで多くの波長範囲のデータを取得することができ、第１の実施の形態で述べたと同様に、目的に合わせて最適な検出方法を簡単に選ぶことができる。

その他、上述では、回折格子ミラー２５の回転動作をステッピンングモータにより行なうようにしたが、サーボモータやガルバノモータを使用しても同様に構成できる。また、上記の実施の形態では、第２の検出手段にラインセンサ３０を用いているが、これに限るものではなくＣＣＤ、マルチチャンネルホトマルチプライヤなどを用いてもいい。また構成簡略化のため集光レンズ２６、集光レンズ２９は省略することが可能である。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図７は、本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。

この場合、上述したビームスプリッタユニット１０は、第１のビームスプリッタユニット１０とする。

コリメートレンズ２３により平行光の光路上には、光路分割手段として第２のビームスプリッタユニット４０が配置されている。第２のビームスプリッタユニット４０も、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ４０ａ、４０ｂ、４０ｃが同心円状に配置されている。また、第２のビームスプリッタユニット４０は、モータ４０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ４０ａ、４０ｂ、４０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ４０ａと４０ｂと４０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ４０ａは、全ての波長域の光線を全反射する特性を有し、ビームスプリッタ４０ｂは、５６０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ４０ｃは、全ての波長域の光線を透過するような特性を有している。

第２のビームスプリッタユニット４０の反射光路を１チャンネル目と称する。この１チャンネル目の光路上には、第１のチャンネル検出手段が設けられている。この第１のチャンネル検出手段は、ミラー面が回折格子である回折格子ミラー１２５が光路上に配置されている。この回折格子ミラー１２５は、不図示のステッピンングモータを使用して回折格子面を図示の回転方向１２５ａに回転可能になっていて、回折格子により分散した各波長の蛍光の反射方向を変えることができるようになっている。

回折格子ミラー１２５により分散された光路上には、集光レンズ１２６が配置されている。集光レンズ１２６は、回折格子ミラー１２５の分散面の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。集光レンズ１２６を透過した光路には、第１の光検出手段としてスリット１２７とサイドオン型のフォトマルチプライヤー１２８が配置されている。スリット１２７は、集光レンズ１２６の結像位置に配置されている。このスリット１２７は駆動装置１２７ａによりスリット幅をスペクトルの分散方向に変更できるようになっている。また、フォトマルチプライヤー１２８は、スリット１２７の後方に配置されている。この場合、フォトマルチプライヤー１２８は、蛍光の分散されたスペクトル列方向と受光面の長手方向が一致するように配置されている。

第２のビームスプリッタユニット４０の透過光路上には、さらに光路分割手段として第３のビームスプリッタユニット５０が配置されている。第３のビームスプリッタユニット５０は、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ５０ａ、５０ｂ、５０ｃが同心円状に配置されている。また、第３のビームスプリッタユニット５０は、モータ５０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ５０ａ、５０ｂ、５０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ５０ａと５０ｂと５０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ５０ａは、全ての波長域の光線を全反射ずる特性を有し、ビームスプリッタ５０ｂは、６３０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ５０ｃは、全ての波長域の光線を透過するような特性を有している。

第３のビームスプリッタユニット５０の反射光路を２チャンネル目と称する。この２チャンネル目の光路上には、第２のチャンネル検出手段が設けられている。この第２のチャンネル検出手段は、ミラー面が回折格子である回折格子ミラー１３２が光路上に配置されている。この回折格子ミラー１３２により分散した各波長の蛍光の反射方向には、集光レンズ１２９が配置されている。集光レンズ１２９は、回折格子ミラー２５の分散面に前側焦点位置がくるように配置されている。集光レンズ１２９の結像位置には、第２の光検出手段としてラインセンサ１３０が配置されている。このラインセンサ１３０は、複数の受光ピクセル（検出部）１３１をアレイ状に配列したもので、これら受光ピクセル１３１を蛍光の分散されたスペクトル列方向と一致する方向に配置している。また、ラインセンサ３０は、受光ピクセル３１のうち光の受光を有効にするものと無効にするものを選択して各受光ピクセル３１の検出値を読み出すようになっている。

なお、第３のビームスプリッタユニット５０の透過光路は、３チャンネル目の光路となっていて、不図示のオプションの検出装置などが取り付けられ、透過してきた光を検出できるようにしている。

その他は、図１と同様である。

次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。

この場合も、最初、ラインセンサ３０を用いて１回のスキャンにより標本１５からの蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得する。この場合、第２のビームスプリッタユニット４０は、全ての波長域の光線を透過するビームスプリッタ４０ｃが光路に挿入され、また、第３のビームスプリッタユニット５０は、全ての波長域の光線を全反射する特性を有するビームスプリッタ５０ａが光路に挿入されている。

この状態で、標本１５から発せられた蛍光は、共焦点レンズ１７を介して共焦点絞り２２上に結像される。共焦点絞り２２を通過した蛍光は拡散光となってコリメートレンズ２３に入射し、平行光に変換される。平行光となった蛍光は、ビームスプリッタ４０ｃを透過し、ビームスプリッタ５０ａで全反射されて２チャンネル目の光路に導入される。２チャンネル目の光路に導入された蛍光は、回折格子ミラー１３２に入射し回折格子の分散作用により、スペクトル成分へ分散される。

スペクトル分散された蛍光は、集光レンズ１２９によりラインセンサ１３０上に結像する。ここで、ラインセンサ１３０上の全ての受光ピクセル１３１を有効にすることで、１回のスキャンによりスペクトル分散された蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得することができる。

次に、このようにして取得した波長特性（分布）に基づいて注目する波長範囲を設定し、詳細データを取得する。

この場合、第２のビームスプリッタユニット４０は、全ての波長域の光線を全反射する特性を有するビームスプリッタ４０ａが光路に挿入される。

この状態で、標本１５から発せられた蛍光は、共焦点レンズ１７を介して共焦点絞り２２上に結像される。共焦点絞り２２を通過した蛍光は拡散光となってコリメートレンズ２３に入射し、平行光に変換される。平行光となった蛍光は、ビームスプリッタ４０ｃで全反射され１チャンネル目の光路に導入される。１チャンネル目の光路に導入された蛍光は、回折格子ミラー１２５に入射して回折格子の分散作用により、スペクトル成分へ分散される。

スペクトル分散された蛍光は、集光レンズ１２６によりスリット１２７上に結像する。このとき、スリット１２７のスリット幅を駆動装置１２７ａにより変えることで、フォトマルチプライヤー１２８で受光するスペクトル幅を変えることができ、また、回折格子ミラー１２５を回転（走査）することで、受光できるスペクトル波長範囲を変えることができる。つまり、スリット１２７のスリット幅の設定と、回折格子ミラー１２５の回転走査を行うことで、注目する波長範囲を設定し、この範囲の詳細データを取得する。

この場合も、標本１５上で走査されるレーザ光の走査ピクセルごとに予め設定したスリット幅の設定（スペクトル成分の分解能の設定）により回折格子ミラー１２５の走査を行うことで、分光データが取得されるが、このときスリット１２７のスリット幅および回折格子ミラー１２５の回転は一般的に２〜３ｎｍに相当する精度で十分制御できるので、高精度（高波長分解能）な分光データを取得することができる。

従って、このようにしてもコリメートレンズ２３で平行光に変換された蛍光を２チャンネル目の光路に導き、スペクトル分散された蛍光をラインセンサ１３０に導入することで、１回のスキャンによりスペクトル分散された蛍光の大まかな波長特性（分布）を取得し、次いで、この波長特性（分布）に基づいて注目する波長範囲の詳細データを取得したい場合は、コリメートレンズ２３で平行光に変換された蛍光を１チャンネル目の光路に導き、スペクトル分散された蛍光をスリット１２７に導入し、スリット１２７のスリット幅の設定と回折格子ミラー１２５の回転走査を行うことで、注目する波長範囲の詳細データを取得するようにしたので、波長分解能が必要な詳細な解析において無駄なスキャンをせずに、正確に取りたい分光データのみを能率的に取得することができる。

このような一連の作業についても、自動化することで目的とする分光データをさらに能率よく取得することができる。

一方、これら一連の動作は、要求される波長分解能に応じて第２のビームスプリッタユニット４０と第３のビームスプリッタユニット５０の各ビームスブリッタの切り換えにより、それぞれ単独で設定することもできる。例えば、波長数ｎｍレベルの高波長分解能を必要とする解析を行いたいときは、第２のビームスプリッタユニット４０により１チャンネル目の光路を選択してスペクトル分散された蛍光に対してスリット１２７のスリット幅の設定と回折格子ミラー１２５の回転走査を行なうことで高精度のデータを取得し、また、標本の退色などの影響を極力避けたいときは、第２のビームスプリッタユニット４０と第３のビームスプリッタユニット５０により２チャンネル目の光路を選択してスペクトル分散された蛍光に対してラインセンサ１３０を使用することで、１回の標本スキャンで多くの波長範囲のデータを同時に取得するというように目的に合わせて検出方法を選ぶことができる。

さらに、第２のビームスプリッタユニット４０において、５６０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するビームスプリッタ４０ｂを設定し、第３のビームスプリッタユニット５０において全ての波長域の光線を全反射するビームスプリッタ５０ａを設定しておけば、５６０ｎｍ以下の蛍光を１チャンネル目に導入し、高波長分解能で検出しながら、それ以上の波長の光を２チャンネル目で同時に検出するようなこともできる。

なお、上述した第２の実施の形態についても、図４で述べたと同じ考えで、回折格子ミラー１２５および１３２として反射面をを凹面にしたものを用い、それぞれの結像位置にスリット１２７、ラインセンサ１３０を配置するように構成できる。こうすれば、集光レンズ１２６および１２９を省略でき、構成を簡単にできる。

また、上述では、２チャンネル目に配置された回折格子ミラー１３２は固定としているが、１チャンネル目の回折格子ミラー１２５と同様に回転可能な構成としてもよい。この場合、回折格子ミラー１３２を微量回転させることによって、より高い分解能の検出が可能となる。さらに、上述した１チャンネル目と２チャンネル目の構成は、逆であっても差し支えない。さらに、上述では、２チャンネル分の検出について説明しているが、これについても限定されるものではなく、それ以上のチャンネルに分ければ、それだけ同時にデータ検出できるチャンネルが増えることになり、検出の幅が広がる。さらに、構成簡略化のため集光レンズ１２６、集光レンズ１２９は省略することが可能である。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、回折格子として反射型のものについて述べたが、透過型のものあるいはプリズムを使用したものも、適宜これらに合わせた光路を組むことで適用することができる。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の要部の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の要部の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例１の要部の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例２の要部の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例３の要部の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…ヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…ＡＯＴＦ、７…シングルモードファイバ
８…スキャナユニット、９…コリメートレンズ
１０…ビームスプリッタユニット、１０ａ．１０ｂ、１０ｃ…ビームスプリッタ
１０ｄ…モータ、１１…ＸＹスキャナミラー
１１ａ．１１ｂ…ミラー、１２…瞳投影レンズ
１３…結像レンズ、１４…対物レンズ
１５…標本、１６…反射ミラー、１７…共焦点レンズ
２２…共焦点絞り、２２ａ…駆動装置、２３…コリメートレンズ
２４…分光ユニット、２５…回折格子ミラー
２５ａ…回転方向、２６…集光レンズ、２７…スリット
２７ａ…駆動装置、２８…フォトマルチプライヤー
２９…集光レンズ、３０…ラインセンサ
３１…受光ピクセル、３２…回折格子ミラー
３３…反射ミラー、４０…第２のビームスプリッタユニット
４０ａ．４０ｂ、４０ｃ…ビームスプリッタ
４０ｄ…モータ、５０…第３のビームスプリッタユニット
５０ａ．５０ｂ、５０ｃ…ビームスプリッタ
５０ｄ…モータ、１２５…回折格子ミラー、１２５ａ…回転方向
１２６…集光レンズ、１２７…スリット
１２７ａ…駆動装置、１２８…フォトマルチプライヤー
１２９…集光レンズ、１３０…ラインセンサ
１３１…受光ピクセル、１３２…回折格子ミラー

Claims (9)

1. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、
   前記レーザ光が照射される前記標本からの検出光を結像する共焦点レンズ及び該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、
   前記共焦点絞りを通った前記検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、
   前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、前記走査手段により前記レーザ光を２次元走査しながら、前記標本の同じ領域について該スペクトル領域選択手段により選択するスペクトル領域を変更して該スペクトル領域選択手段で選択された該スペクトルを検出する動作を複数回繰り返す第１の検出手段と、
   複数の検出チャンネルを有し、該複数の検出チャンネルによって前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルのスペクトル領域ごとの強度を前記走査手段による１回の２次元走査で同時に検出する第２の検出手段と、
   前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを選択的に前記第１の検出手段または第２の検出手段に導入するスペクトル導入手段と、
   を具備し、
   前記スペクトル領域選択手段は、前記第２の検出手段が有する１つの前記検出チャンネルが検出するスペクトル領域より狭いスペクトル領域を選択可能である
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段を回転可能にし、該スペクトル分散手段の回転により前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを前記第１の検出手段または第２の検出手段に選択的に導入するようにしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記スペクトル導入手段は、前記第１の検出手段または第２の検出手段を選択的に前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルの光路上に移動させることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルの光路に挿脱される反射部材を有し、該反射部材の光路への挿脱に応じて前記スペクトルを前記第１の検出手段または第２の検出手段に導入するようにしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記第１の検出手段または第２の検出手段の近傍に前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルを結像させるスペクトル結像手段を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記スペクトル分散手段は、反射面を凹面にした回折格子ミラーからなることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記スペクトル導入手段は、前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルを優先的に前記第２の検出手段に導入し、該第２の検出手段の検出結果を待って前記スペクトル分散手段で分解されたスペクトルを前記第１の検出手段に導入するようにしたことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、
   前記レーザ光が照射される前記標本からの検出光を結像する共焦点レンズ及び該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、
   前記検出光を波長ごとに分光し複数チャンネルの光路に分割する光路分割手段と、
   前記複数チャンネルのうち一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させる第１のスペクトル分散手段と、該第１のスペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段とを有し、前記走査手段により前記レーザ光を２次元走査しながら、前記標本の同じ領域について該スペクトル領域選択手段により選択する該スペクトル領域を変更して該スペクトル領域選択手段で選択された該スペクトルを検出する動作を複数回繰り返す第１のチャンネル検出手段と、
   前記複数チャンネルのうち他の一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させる第２のスペクトル分散手段と、複数の検出チャンネルとを有し、該複数の検出チャンネルによって該第２のスペクトル分散手段で分散されたスペクトルのスペクトル領域ごとの強度を前記走査手段による１回の２次元走査で同時に検出する第２のチャンネル検出手段と、
   を具備し、
   前記スペクトル領域選択手段は、前記第２のチャネル検出手段が有する１つの前記検出チャンネルが検出するスペクトル領域より狭いスペクトル領域を選択可能である
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
9. 標本をレーザ光により２次元走査し、標本から発生する検出光を共焦点検出するとともにその波長特性をレーザ走査位置ごとに取得する、レーザ走査型顕微鏡を用いたデータ取得方法であって、
   レーザ光を２次元的に走査しながら標本に照射し、
   この２次元走査により発生する標本からの検出光をスペクトル分散させ、
   この分散された検出光を複数の検出チャンネルを有する検出手段によって検出して、検出光の波長範囲ごとの強度である波長特性を取得し、
   取得された波長特性に基づいて詳細測定を行うべき注目波長範囲を設定し、
   レーザ光を再度２次元的に走査しながら標本に照射して標本から発生する検出光をスペクトル分散させ、
   スペクトル分散された検出光から、設定された注目波長範囲において所定のスペクトル領域を選択してその光量を前記検出手段とは異なる光検出器により検出し、
   前記選択するスペクトル領域を１回の２次元走査ごとにずらしながら２次元走査を複数回おこなって光量検出することで、注目波長範囲の波長特性を取得する、
   ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡を用いたデータ取得方法。

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