JP2003185927A - 走査型レーザー顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光クロストークを除去できるとともに、複
数の励起波長による各々の観察の時間的遅れを抑制でき
る走査型レーザー顕微鏡する。 【解決手段】 複数の蛍光色素で標識された試料１０を
励起するための複数の異なる波長域からなるレーザー光
２ａ、２ｂを対物レンズ９を介して集光して試料１０上
を走査し、試料１０からの蛍光を複数の波長域に分岐す
るとともに、各波長域の蛍光をそれぞれ異なる共焦点絞
り１５ａ、１５ｂを介して光検出器１７ａ、１７ｂに導
き、同時に光検出を行う走査型レーザー顕微鏡であっ
て、それぞれのレーザー光を対物レンズ９に対して異な
る角度で入射させ、対物レンズ９により試料１０上で形
成されるレーザースポットが一致しないように照射す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、複数の蛍光色素や
蛍光蛋白で標識された試料を複数の励起波長を用いて励
起し、各励起波長に対応して発生する複数の蛍光を同時
に検出する走査型レーザー顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、異なる蛍光色素により多重染色さ
れた試料を複数の励起波長で励起して、発生した複数の
蛍光を複数の光検出器で検出する走査型光学顕微鏡とし
て、特許公報第２８２４４６２号に開示されたものが知
られている。

【０００３】図１０に、そのスキャンヘッド部の概略構
成を示している。この場合、４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、
６４７ｎｍ等の波長を同時発振するクリプトンアルゴン
レーザー５０１から発した多波長レーザー光を励起フィ
ルタブロック５０２に入射して特定の励起波長を抽出す
る。励起フィルタブロック５０２では、３種類の励起フ
ィルタ５０３ａ、５０３ｂ、５０３ｃを選択的に光路上
に配置することにより励起波長を切り換える。このうち
の励起フィルタ５０３ａは、４８８ｎｍと５６８ｎｍを
透過させるもので、図１１（ａ）の上段（二帯域励起）
５５３ａ、５５３ｂにその透過特性を示している。ま
た、励起フィルタ５０３ｂは、４８８ｎｍの波長のみを
透過させるもので、図１１（ａ）の中段（４８８ＤＦ１
０）５５１にその透過特性を示している。さらに励起フ
ィルタ５０３ｃは、５６８ｎｍの波長のみを透過させる
もので、図１１（ａ）の下段（５６８ＤＦ１０）５５２
にその透過特性を示している。

【０００４】そして、励起フィルタブロック５０２の一
つの励起フィルタで抽出した励起波長をフィルタブロッ
ク５０８に入射して検体５０５側へ反射させる。このフ
イルタブロック５０８は、２色ダイクロイックミラー５
０４を有していて、この２色ダイクロイックミラー５０
４で、４８８ｎｍおよび５６８ｎｍの励起光を反射さ
せ、第１、第２の試薬で多重染色した検体５０５に照射
する。２色ダイクロイックミラー５０４は図１１（ｂ）
の符号５５５に示す透過特性を有しており、４８８ｎｍ
のラインにより励起される第１の試薬から発せられた蛍
光の５００〜５４０ｎｍの波長範囲と、５６８ｎｍのラ
インにより励起される第２の試薬から発せられた蛍光の
５８５〜６５０ｎｍの波長範囲とを透過させる。

【０００５】フィルタブロック５０８を透過した蛍光を
フィルタブロック５０９に入射させる。フィルタブロッ
ク５０９では、ダイクロイックミラー５２１により５０
０〜５４０ｎｍの光を反射させ検出器５０６に入射し、
また、５８５〜６５０ｎｍの光を透過させ検出器５０７
に入射する。ここでは、４８８ｎｍと５６８ｎｍの反射
光をバリアフィルタ５２２、５２３によりカットしてい
る。

【０００６】なお、フィルタブロック５０９内のダイク
ロイックミラー５２１の特性を図１１（ｃ）の上段（５
６１）に、バリアフィルタ５２２、５２３の特性を図１
１（ｃ）の中段（５６２）、下段（５６３）に示してい
る。

【０００７】このような構成によれば、励起フィルタブ
ロック５０２の励起フィルタ５０３ａが光路中にある時
は、２色ダイクロイックミラー５０４により、４８８ｎ
ｍ、５６８ｎｍのレーザー波長が図中下方に反射され、
検体５０５に照射される。すると、この波長により励起
される検体５０５に染色されている第１の試薬から発せ
られた蛍光のうち５００〜５４０ｎｍの範囲および第２
の試薬から発せられた蛍光の５８５〜６５０ｎｍの範囲
がフィルタブロック５０８の２色ダイクロイックミラー
５０４を透過する。また、フィルタブロック５０９のダ
イクロイックミラー５２１により５００〜５４０ｎｍの
光は反射して検出器５０６で検出され、５８５〜６５０
ｎｍの光は透過して検出器５０７で検出される。

【０００８】そして、図示しないガルバノミラーによ
り、検体５０５上を２次元的に走査し、各走査位置での
検出光を電気信号に変換し、図示しないモニタ上に２次
元像として表示することになる。この時、それぞれの検
出器５０６、５０７により検出された信号を色分けして
一つのモニタに表示することにより、第１の試薬と第２
の試薬のそれぞれから発せられた蛍光を識別することが
可能となる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このようにして、従来
では、第１の試薬の発する蛍光の波長５００〜５４０ｎ
ｍの範囲を検出しているが、第１の試薬が、例えばＦＩ
ＴＣの場合、このＦＩＴＣの発する蛍光波長の範囲は５
００〜６００ｎｍ以上まで分布しているので、長波長側
蛍光は、第１の試薬の発する蛍光として検出されるだけ
でなく、第２の試薬の発する蛍光（５８５〜６５０ｎ
ｍ）を検出すべき検出器５０７に混入されてしまう。こ
の現象を一般に蛍光クロストークといい、２重染色標本
を観察する場合に短波長側の蛍光が長波長側の蛍光にか
ぶることになり、精度の高い標本観察が難しくなるとい
う問題が生じる。

【００１０】そこで、このような蛍光クロストークを完
全に除去するため、励起フィルタ５０３ｂを光路に入
れ、４８８ｎｍのレーザ波長のみを用いて第１の試薬の
発する蛍光のみを検出器５０６で検出して観察を行い、
次いで、励起フィルタ５０３ｃを光路に入れ、５６８ｎ
ｍのレーザ波長のみを用いて第２の試薬の発する蛍光の
みを検出器５０７で検出して観察を行うことが考えられ
る。

【００１１】しかしながら、この場合、４８８ｎｍで観
察する時は、検出器５０７側にも第１の試薬の蛍光が混
入してくる（５８５ｎｍ以上の長波長側）ので、検出器
５０７側の検出機能を停止するか、フィルタブロック５
０９のダイクロイックミラー５２１を全反射ミラーに変
更して、すべての蛍光を検出器５０６側に反射させる必
要が生じ、さらに、５６８ｎｍの観察時は、フィルタブ
ロック５０９のダイクロイックミラー５２１を取り去
り、空穴にしておかなけれぱならないなど、顕微鏡の構
成が複雑になるばかりか、標本観察のための操作が極め
て面倒なものになってしまう。

【００１２】また、４８８ｎｍと５６８ｎｍによる観察
を２回に分けて行うと、２つの観察の間に時間的遅れを
生じるため、標本に動きなどがある場合、この時間的な
遅れにより正確な標本観察ができなくなる。

【００１３】さらに、走査型光学顕微鏡では、その特徴
である共焦点効果（光軸方向に分解能を持つ）を利用し
て、一平面走査観察後、ステージを移動させるなどして
焦点面を標本の厚さ方向に所定量ずらし、さらに一平面
走査観察を行い、再び焦点面を所定量動かして一平面走
査観察を行うという工程を繰り返し、厚さのある標本の
断層像の観察も可能にしており、通常、このような観察
をＸＹＺ観察といい、焦点面の移動と、走査の繰り返し
作業を、１つのコンピュータにより制御するようになっ
ている。しかしながら、このようなＸＹＺ観察を行うも
ので、上述した４８８ｎｍと５６８ｎｍによる観察を２
回に分けて行うと、４８８ｎｍで一連の観察を行った
後、５６８ｎｍで一連の観察を行うことになり、焦点移
動回数が増えるのに応じて、さらに時間的な遅れが大き
くなってしまう。また、焦点面移動機能の位置再現性が
悪いと、４８８ｎｍと５６８ｎｍの場合で、別の平面を
観察してしまうことにもなる。

【００１４】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、蛍光クロストークを除去できるとともに、複数の励
起波長による各々の観察の時間的な遅れを抑制すること
のできる走査型レーザー顕微鏡を提供することを目的と
する。

【００１５】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
複数の蛍光色素や蛍光蛋白で標識された試料を励起する
ための複数の異なる波長域からなるレーザー光を発生す
るレーザー光源と、前記レーザー光源より発生されるレ
ーザー光を集光して前記試料上にレーザスポットを形成
する対物レンズと、前記レーザー光を複数の波長域ごと
に前記対物レンズに対して異なる角度で入射させ、前記
対物レンズにより前記試料上に形成されるレーザースポ
ットをずらして照射させる照射手段と、前記対物レンズ
により試料上に形成されるレーザースポットを走査する
走査手段と、前記試料からの蛍光を複数の波長域ごとに
分光する蛍光分光手段と、前記蛍光分光手段で分光され
た各波長域の蛍光をそれぞれ異なる共焦点絞りを介して
同時に検出する光検出手段とを具備したことを特徴とし
ている。

【００１６】請求項２記載の発明は、請求項１記載の発
明において、前記光検出手段で検出された前記試料から
の各波長域の蛍光をそれぞれ画像化し、位置補正すると
ともに、各画像を合成可能とした位置補正手段を有する
ことを特徴としている。

【００１７】請求項３記載の発明は、請求項１または２
記載の発明において、前記照射手段は、前記レーザー光
源より発生されるレーザー光をスペクトル分解するスペ
クトル分解手段を有することを特徴としている。

【００１８】請求項４記載の発明は、請求項１乃至３の
いずれかに記載の発明において、前記照射手段は、前記
レーザー光源より発生される複数の波長域ごとのレーザ
ー光を対物レンズのほぼ瞳中心に投影するための瞳投影
手段を有することを特徴としている。

【００１９】この結果、本発明によれば、対物レンズに
より試料上に形成されるレーザースポットをずらして照
射できるので、試料を観察する際に、一方の蛍光が他方
の蛍光にかぶる現象、所謂、蛍光クロストークを回避す
ることができる。

【００２０】また、本発明によれば、異なる波長域の蛍
光画像を重ね合わせることができ、多重標識蛍光画像を
クロストークを生じさせることなく得ることができる。

【００２１】さらに、本発明によれば、スペクトル分解
手段でのレーザー光をスペクトル分解を利用してレーザ
ービームの角度差を与えるようにしたので、レーザー光
源として多波長発振レーザーを使用した場合でも、さら
に簡単な構成により本発明を実現できる。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に従い説明する。

【００２３】(第１の実施の形態)図１は、本発明の第１
の実施の形態が適用されるの走査型レーザー顕微鏡の概
略構成を示している。

【００２４】図において、１ａ、１ｂはレーザー光源
で、レーザー光源１ａは、４８８ｎｍの発振線を有する
アルゴンレーザー、レーザー光源１ｂは、５４３ｎｍの
発振線を有するヘリウムネオンレーザーからなってい
る。

【００２５】これらレーザー光源１ａ、１ｂからのレー
ザービーム２ａ、２ｂは、照射手段の一部を構成するミ
ラー３ａ、３ｂで偏向され、励起用ダイクロイックミラ
ー４に入射される。この場合、ミラー３ａ、３ｂで偏向
されるレーザービーム２ａ、２ｂは、波長域に応じて励
起用ダイクロイックミラー４に入射される入射角度差が
θに設定されている。

【００２６】励起用ダイクロイックミラー４は、４８８
ｎｍ、５４３ｎｍの光を反射し、それ以外の波長を透過
するような特性を有するもので、これにより、レーザー
ビーム２ａ、２ｂは、それぞれ反射され、走査手段とし
てのＸ−Ｙ走査装置５に入射する。

【００２７】Ｘ−Ｙ走査装置５は、Ｘ走査ミラー５ａ、
Ｙ走査ミラー５ｂ、Ｘ走査ミラー５ａをＹ走査ミラー５
ｂに投影するためのリレーレンズ５ｃを有しており、こ
れらＸ走査ミラー５ａ、Ｙ走査ミラー５ｂは、図示しな
い制御手段によりラスター走査が行われる。

【００２８】この場合、レーザービーム２ａ、２ｂは、
所定の入射角度差θに設定されているので、Ｘ走査ミラ
ー５ａの同じ場所６ａで反射され、リレーレンズ５ｃに
よりＹ走査ミラー５ｂに投影され、同じ場所６ｂでさら
に反射される。そして、Ｘ-Ｙ走査装置５で光偏向され
たレーザービームは、瞳投影レンズ７、結像レンズ８を
透過して対物レンズ９に入射する。

【００２９】この場合、Ｘ走査ミラー５ａおよびＹ走査
ミラー５ｂは、照射手段の一部を構成する瞳投影手段と
して、瞳投影レンズ７、結像レンズ８により対物レンズ
９の瞳９ａのほぼ中心に投影させるように設定されてお
り、これにより、対物レンズ９の瞳９ａには、レーザー
ビーム２ａ、２ｂが同軸に入射する。そして、対物レン
ズ９を出射したレーザービーム２ａ、２ｂは、試料1０
上に所定距離Ｌだけずれたレーザースポット１１ａ、１
１ｂとして照射される。

【００３０】ここで、試料１０は、ＦＩＴＣとＴＲＩＴ
Ｃの蛍光色素で染色されているものとすると、それぞ
れ、レーザービーム２ａ、２ｂで励起され、ＦＩＴＣ、
ＴＲＩＴＣが有する波長特性の蛍光を発する。

【００３１】これらＦＩＴＣとＴＲＩＴＣの蛍光は、光
路を逆にもどり、励起用ダイクロイックミラー４を透過
し、それぞれ蛍光光束１２ａ、１２ｂとなって、蛍光分
光手段としての蛍光分光用ダイクロイックミラー１３に
入射する。

【００３２】蛍光分光用ダイクロイックミラー１３は、
５５０ｎｍよりも短い波長の光を反射し、これよりも長
い波長の光を透過するような特性を有するものである。
これにより、図２に示すように５００ｎｍ〜６００ｎｍ
の波長範囲の蛍光を発するＦＩＴＣについては、５００
ｎｍ〜５５０ｎｍの蛍光光束１２ａ１は蛍光分光用ダイ
クロイックミラー１３で反射し、これよりも長い波長の
蛍光光束１２ａ２（図２のハッチング部分）は蛍光分光
用ダイクロイックミラー１３を透過する。そして、蛍光
分光用ダイクロイックミラー１３を反射したＦＩＴＣの
蛍光光束１２ａ１は、共焦点レンズ１４ａ、共焦点絞り
１５ａを通過し、５０５ｎｍから５３０ｎｍの光のみを
透過するバンドパスフィルタ１６ａで制限されて光検出
手段としての第１の光検出器１７ａで検出され、ＦＩＴ
Ｃの蛍光光束１２ａ１による蛍光画像が取得される。

【００３３】なお、バンドパスフィルタ１６ａは、試料
１０からの自家蛍光や、試料１０からのレーザー光の反
射光を完全に除去する目的で光路に挿入されている。

【００３４】一方、図３に示すように５５０ｎｍ〜６５
０ｎｍの波長範囲の蛍光を発するＴＲＩＴＣについて
は、蛍光光束１２ｂが蛍光分光用ダイクロイックミラー
１３を透過する。この場合、前述したように蛍光光束１
２ａの一部の長波長部分の蛍光光束１２ａ２も蛍光分光
用ダイクロイックミラー１３を透過しているので、これ
らの蛍光光束１２ｂ、１２ａ２は、ミラー１８で反射さ
れ、共焦点レンズ１４ｂを透過して共焦点絞り１５ｂに
入射する。

【００３５】この場合、共焦点絞り１５ｂは、ＴＲＩＴ
Ｃの蛍光光束１２ｂのみが通過するように位置調整され
ており、これにより、ＦＩＴＣの蛍光光束１２ａ２は、
共焦点絞り１５ｂで遮断され、ＴＲＩＴＣの蛍光光束１
２ｂのみが共焦点絞り１５ｂを通過し、５６０ｎｍ〜６
００ｎｍの光のみを透過するバンドパスフィルタ１６ｂ
で制限されて他の光検出手段としての第２の光検出器１
７ｂで検出され、ＴＲＩＴＣの蛍光光束１２ｂによる蛍
光画像が取得される。

【００３６】このようにすれば、ＦＩＴＣの蛍光光束１
２ａ２は、共焦点絞り１５ｂにより遮断されるので、第
２の光検出器1７ｂで検出されることがなくなり、ＦＩ
ＴＣ／ＴＲＩＴＣの２重染色試料を観察する際に、ＦＩ
ＴＣ蛍光がＴＲＩＴＣ蛍光にかぶる現象、所謂、蛍光ク
ロストークを確実に回避することができる。

【００３７】なお、この場合もバンドパスフィルタ１６
ｂは、試料１０からの自家蛍光や、試料１０からのレー
ザー光の反射光を完全に除去する目的で光路に挿入され
ている。

【００３８】次に、レーザー光源１ａ、１ｂからのレー
ザービーム２ａ、２ｂをミラー３ａ、３ｂで偏向し、励
起用ダイクロイックミラー４に入射する際のレーザービ
ーム２ａ、２ｂの入射角度差θの設定方法について説明
する。

【００３９】この場合、対物レンズ９の開口数をＮＡと
すると、レーザースポット１１ａ、１１ｂのスポット径
ΦＡ、ΦＢは、それぞれ次のように表わされる。

【００４０】ΦＡ＝１．２２×０．４８８／ＮＡミクロ
ン ΦＢ＝１．２２×０．５４３／ＮＡミクロン また、対物レンズ９の焦点距離をＦ、瞳投影倍率（結像
レンズ８の焦点距離／瞳投影レンズ７の焦点距離）をＫ
とすると、レーザースポット１１ａと１１ｂの間のず
れ、つまり、レーザースポット１１ａと１１ｂのそれぞ
れの中心の間の距離Ｌは、 Ｌ＝Ｆ×ＳＩＮ（θ／Ｋ） で表わされ、 Ｌ＝（ΦＡ＋ΦＢ）／２ となる。これにより入射角度差θは、 θ＝Ｋ×ＳＩＮ^−１（（ΦＡ＋ΦＢ）／２Ｆ） で計算される値に設定すればよいことになる。

【００４１】この場合、θの値は、上式により求められ
る値に正確に設定する必要はなく、これよりも大きな値
であった方が望ましい。なぜなら試料中でレーザービー
ムが散乱するので、計算上のスポット径よりも実際は大
きくなるからである。また対物レンズ９は、実際には収
差を有しており、計算上のスポット径よりも大きくなる
からである。さらに、θの値は、上式により求められる
値よりも小さな値であっても効果がまったく無い訳では
なく、少なくとも従来と比較して蛍光クロストークを軽
減することはできる。

【００４２】次に、レーザービーム２ａ、２ｂの入射角
度差θの設定方向について述べる。

【００４３】この場合、Ｘ-Ｙ走査装置５はＸ走査ミラ
ー５ａが１ライン走査を行った後、Ｙ走査ミラー５ｂが
１ステヅプだけ移動して、これを順次繰返すラスター走
査が行われる。すなわち、Ｘ方向の走査の方が高速に行
われる。

【００４４】このことから、レーザービーム２ａ、２ｂ
の入射角度差θは、Ｘ方向に設定されている。こうすれ
ば、試料１０上のある一点をレーザービーム２ａ、２ｂ
が横切る時問差を最小にすることが可能となるので、生
きた細胞や組織の機能探索、例えば細胞内のカルシウム
イオン濃度の変化など、速い事象変化を観察するような
場合に、ＦＩＴＣ蛍光とＴＲＩＴＣ蛍光に対して取得さ
れる２枚の画像の時間差を極めて小さくでき、この結
果、精度の高い観察を行うことができる。

【００４５】勿論、事象変化のない試料観察を行うよう
な場合は、レーザービーム２ａ、２ｂの入射角度差θを
Ｙ方向に設定することもできる。

【００４６】次に、このようにして取得された画像の位
置補正を行う位置補正手段について説明する。

【００４７】ところで、従来の走査型レーザー顕微鏡で
は、第１の試薬（ＦＩＴＣ）と第２の試薬（ＴＲＩＴ
Ｃ）を励起するための各レーザービーム（４８８ｎｍの
発振線と５４３ｎｍの発振線）は、試料上の同じ位置に
レーザースポットを結んでいるので、図４（ａ）に示す
ＦＩＴＣの蛍光画像と、同図（ｂ）に示すＴＲＩＴＣの
蛍光画像を単純に重ねあわせ、合成することによって、
同図（ｃ）に示すようなＦＩＴＣとＴＲＩＴＣの２重標
識蛍光画像を得ることができる。

【００４８】これに対して、本発明の走査型レーザー顕
微鏡では、試料１０上でのそれぞれのレーザースポット
１１ａ、１１ｂの位置がＸ走査方向に離れているので、
例えば、これらレーザースポット１１ａ、１１ｂを試料
１０上で左から右方向にＸ走査すると、レーザースポッ
ト１１ａの方がレーザースポット１１ｂよりも先に試料
１０の同じ場所を横切るようになる。これにより、図５
（ａ）に示すＦＩＴＣの蛍光画像と同図(ｂ)に示すＴＲ
ＩＴＣの蛍光画像は、Ｘ方向に相対的に位置ずれを有す
るものとしてそれぞれ得られる。

【００４９】そこで、Ｘ方向の１ライン幅に相当するＸ
走査ミラー５ａの振り角をα、Ｘ方向の画像ピクセル数
をＮとした場合、 Ｍ＝Ｎ×θ／α だけ両画像を相対的にシフトすれば、同図（ｃ）に示す
ようにＦＩＴＣの蛍光画像とＴＲＩＴＣの蛍光画像を重
ね合わせることができ、ＦＩＴＣとＴＲＩＴＣの２重標
識蛍光画像をクロストークを生じさせることなく得るこ
とができる。

【００５０】なお、同図（ｄ）に示すように、ＦＩＴＣ
の蛍光画像とＴＲＩＴＣの蛍光画像の重なり合わない部
分を省いて表示させれば、さらに良好な２重標識蛍光画
像が得られる。

【００５１】従って、このような構成によれば、複数の
蛍光色素で標識された試料１０を励起するための複数の
異なる波長域からなるレーザー光を対物レンズ９に対し
て異なる角度で入射させ、対物レンズ９により試料１０
上に形成されるレーザースポット１１ａ、１１ｂをずら
して照射するようにしたので、試料を観察する際に、一
方の蛍光が他方の蛍光にかぶる現象、所謂、蛍光クロス
トークを確実に回避することができる。

【００５２】また、２個のミラー３ａ、３ｂおよびこれ
らミラー３ａ、３ｂで偏向されるレーザービーム２ａ、
２ｂを調整する機構を付け加えるだけで、それ以外は従
来のものと基本構成を変える必要がないので、極めて構
成が簡単で、しかも安価にして蛍光クロストークを回避
することができる。

【００５３】さらに、試料１０上に照射されるレーザー
スポット１１ａ、１１ｂのずれ方向は、高速走査方向
（Ｘ方向）に設定されているので、ビーム走査の時間差
が小さくでき、複数の励起波長による各々の観察の時間
的な遅れを抑制できるとともに、例えば生きた試料の時
間経過観察のように速い事象変化を観察する場合にも有
利にできる。

【００５４】（第２の実施の形態）次に、第２の実施の
形態を説明する。

【００５５】図６は、第２の実施の形態が適用される走
査型レーザー顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同
一部分には同符号を付している。

【００５６】この場合、レーザー光源２０は、４５８ｎ
ｍ、５１５ｎｍ、５６８ｎｍの他、多波長の発振線を有
するクリプトンアルゴンレーザーからなっている。

【００５７】レーザー光源１からの多波長の発振線を含
むレーザービームは、ＡＯＴＦ２１に入射される。ＡＯ
ＴＦ２１は、各発振線に対して選択フィルターとして働
くもので、各発振線に対応するＲＦ電圧を選択的に印加
することによって、発振線を任意の組合せで選択可能に
している。

【００５８】ここでは、ＡＯＴＦ２１は、４５８ｎｍ、
５１５ｎｍ、５６８ｎｍの発振線に対応するＲＦ電圧が
印加されており、このＡＯＴＦ２１により選択された発
振線がレーザービーム２２としてスペクトル分解手段で
あるスペクトル分解ユニット２３に入射する。このスペ
クトル分解手段は、第１の実施の形態の照射手段の一部
に該当するものである。

【００５９】図６では、スペクトル分解ユニット２３が
光路に挿入されている状態を示しているが、光路に対し
選択的に挿脱可能になっている。

【００６０】スペクトル分解ユニット２３は、ミラー２
３ａ、２３ｂとプリズム２３ｃを有しており、レーザー
ビーム２２は、プリズム２３ｃにより４５８ｎｍ、５１
５ｎｍ、５６８ｎｍの各ビームが、それぞれレーザービ
ーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃに分散される。

【００６１】これらレーザービーム２４ａ、２４ｂ、２
４ｃは、励起用ダイクロイックミラー４に入射される。
励起用ダイクロイックミラー４は、４５８ｎｍ、５１５
ｎｍ、５６８ｎｍの光を反射し、それ以外の波長を透過
するような特性を有するもので、これによりレーザービ
ーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃは反射され、Ｘ-Ｙ走査装
置５に入射する。

【００６２】Ｘ-Ｙ走査装置５は、Ｘ走査ミラー５ａ、
Ｙ走査ミラー５ｂ、Ｘ走査ミラー５ａをＹ走査ミラー５
ｂに投影するためのリレーレンズ５ｃを有しており、こ
れらＸ走査ミラー５ａ、Ｙ走査ミラー５ｂは、図示しな
い制御手段によりラスター走査が行われる。

【００６３】この場合、レーザービーム２４ａ、２４
ｂ、２４ｃは、プリズム２３ｃの働きにより、レーザー
ビーム２ａと２ｂの入射角度差をθ１、レーザービーム
２ｂと２ｃの入射角度差をθ２の設定に設定されてお
り、これによりＸ走査ミラー５ａのほぼ同じ場所６ａで
反射され、リレーレンズ５ｃによりＹ走査ミラー５ｂに
投影され、ほぼ同じ場所６ｂで反射される。そして、Ｘ
-Ｙ走査装置５で光偏向されたレーザービームは、瞳投
影レンズ７、結像レンズ８を透過して対物レンズ９に入
射する。

【００６４】この場合も、Ｘ走査ミラー５ａおよびＹ走
査ミラー５ｂは、瞳投影レンズ７、結像レンズ８により
対物レンズ９の瞳９ａに略投影されるように設定されて
おり、これにより、対物レンズ９の瞳９ａには、レーザ
ービーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃがほぼ同軸に入射す
る。そして、対物レンズ９を出射したレーザービーム２
４ａ、２４ｂ、２４ｃは、試料１０上に、それぞれ所定
距離ずつ離れたレーザースポット１１ａ、１１ｂ、１１
ｃとして照射される。

【００６５】ここで、試料１０は、蛍光蛋白ＥＣＦＰ、
ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄが遺伝子発現した細胞であるとす
ると、それぞれレーザービーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃ
で励起され、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄがそれぞ
れ有する波長特性の蛍光を発する。

【００６６】これらＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄの
各蛍光は、光路を逆にもどり、励起用ダイクロイックミ
ラー４を透過し、それぞれ蛍光光束１２ａ、１２ｂ、１
２ｃとして第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３
ａに入射する。

【００６７】第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１
３ａは、５１５ｎｍよりも短い波長の光を反射し、これ
よりも長い波長の光を透過するような特性を有するもの
である。これにより、図７中ａに示すように４６０ｎｍ
〜６２５ｎｍの波長範囲の蛍光を発するＥＣＦＰについ
ては、４６０ｎｍ〜５１５ｎｍのＥＣＦＰ蛍光光束１２
ａ１は、第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３ａ
で反射し、これよりも長い波長の蛍光光束１２ａ２は、
第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３ａを透過す
る。そして、第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１
３ａを反射したＥＣＦＰの蛍光光束１２ａ１は、共焦点
レンズ１４ａを透過し、制御装置２５により位置調整さ
れる光軸に垂直な焦点面内で移動可能な共焦点絞り１５
ａを通過し、さらに４７０ｎｍから５００ｎｍの光のみ
を透過するバンドパスフィルタ１６ａで制限されて第１
の光検出器１７ａで検出され、ＥＣＦＰ蛍光光束１２ａ
１による蛍光画像が取得される。

【００６８】なお、バンドパスフィルタ１６ａは、試料
１０からの自家蛍光や、試料１０からのレーザー光の反
射光を完全に除去する目的で光路に挿入されている。

【００６９】一方、ＥＹＦＰは、図７中ｂに示す５1５
ｎｍ〜６２５ｎｍの波長範囲の蛍光を発しており、ま
た、ＤｓＲｅｄは、図７中ｃに示す５７０ｎｍ〜６８０
ｎｍの波長範囲の蛍光を発しているので、ＥＹＦＰの蛍
光光束１２ｂとＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃは、第１の
蛍光分光用ダイクロイックミラー1３ａを透過する。こ
の場合、前述したようにＥＣＦＰの蛍光光束１２ａの一
部の長波長部分の蛍光光束１２ａ２も第１の蛍光分光用
ダイクロイックミラー１３ａを透過しているので、これ
らの蛍光光束１２ｂ、１２ｃおよび１２ａ２は、それぞ
れ第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３ｂに入射
する。

【００７０】第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー１
３ｂは、５７０ｎｍよりも短い波長の光を反射し、これ
よりも長い波長の光を透過するような特性を有するもの
である。これにより、ＥＣＦＰの長波長部分の蛍光光束
１２ａ２のうち５１５ｎｍ〜５７０ｎｍの範囲のＥＣＦ
Ｐの蛍光光束１２ａ３は、第２の蛍光分光用ダイクロイ
ックミラー１３ｂで反射し、これよりも長い波長のＥＣ
ＦＰの蛍光光束１２ａ４は、第２の蛍光分光用ダイクロ
イックミラー１３ｂを透過する。

【００７１】また、ＥＹＦＰの蛍光光束１２ｂのうち、
５１５ｎｍ〜５７０ｎｍの波長部分は、蛍光光束１２ｂ
１として第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３ｂ
で反射し、これよりも長波長部分のＥＹＦＰの蛍光光束
１２ｂ２は、第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー１
３ｂを透過し、さらにＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃも、
第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３ｂを透過す
る。

【００７２】つまり、ここではＥＣＦＰの蛍光光束１２
ａ３（ＥＣＦＰの５１５ｎｍ〜５７０ｎｍの範囲の蛍光
光束）とＥＹＦＰの蛍光光束１２ｂ１（ＥＹＦＰの５１
５ｎｍ〜５７０ｎｍの範囲の蛍光光束）は、第２の蛍光
分光用ダイクロイックミラー１３ｂで反射され、共焦点
レンズ1４ｂを透過する。

【００７３】すると、このうちのＥＹＦＰの蛍光光束１
２ｂ１は、制御装置２５により位置調整される光軸に垂
直な焦点面内で移動可能な共焦点絞り１５ｂを通過し、
さらに５２５ｎｍ〜５６０ｎｍの光のみを透過するバン
ドパスフィルタ１６ｂで制限されて第２の光検出器１７
ｂで検出され、ＥＹＦＰ蛍光光束１２ｂ１による蛍光画
像が取得される。

【００７４】一方、ＥＣＦＰの蛍光光束１２ａ３は、共
焦点絞り１５ｂにより遮断され、これによりＥＣＦＰの
蛍光光束１２ａ３は、第２の光検出器１７ｂで検出され
ることはない。

【００７５】なお、バンドパスフィルタ１６ｂは、試料
１０からの自家蛍光や、試料１０からのレーザー光の反
射光を完全に除去する目的で光路に挿入されている。

【００７６】さらに、第２の蛍光分光用ダイクロイック
ミラー１３ｂを透過したＥＣＦＰの蛍光光束１２ａ４
（ＥＣＦＰの５７０ｎｍより長波長の蛍光光束）、ＥＹ
ＦＰの蛍光光束１２ｂ２（ＥＹＦＰの５７０ｎｍより長
波長の蛍光光束）およびＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃ
は、それぞれミラー１８で反射され、共焦点レンズ１４
ｃに入射する。

【００７７】すると、このうちのＤｓＲｅｄの蛍光光束
１２ｃは、制御装置２５により位置調整される光軸に垂
直な焦点面内で移動可能な共焦点絞り１５ｃを通過し、
さらに５８０ｎｍ〜６５０nｍの光のみを透過するバン
ドパスフィルタ１６ｃで制限されて第３の光検出器１７
ｃで検出され、ＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃによる蛍光
画像が取得される。

【００７８】一方、ＥＣＦＰの蛍光光束１２ａ４および
ＥＹＦＰの蛍光光束１２ｂ２は、共焦点絞り１５ｃによ
り遮断され、これにより、これら蛍光光束１２ａ４、１
２ｂ２は、第３の光検出器１７ｃで検出されることはな
い。

【００７９】なおバンドパスフィルタ１６ｃは、試料１
０からの自家蛍光や、試料１０からのレーザー光の反射
光を完全に除去する目的で光路に挿入されている。

【００８０】このようにすれば、ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ／
ＤｓＲｅｄの各蛍光蛋白を遺伝子発現させた試料１０を
観察するようなときにも、ＥＣＦＰ蛍光が、ＥＹＦＰ蛍
光やＤｓＲｅｄ蛍光にかぶる、あるいはＥＹＦＰ蛍光が
ＤｓＲｅｄ蛍光にかぶる現象、所謂、蛍光クロストーク
を確実に回避することができる。

【００８１】なお、共焦点絞り１５ａ、１５ｂ、１５ｃ
は、スペクトル分解ユニット２３が光路に挿入された場
合に、制御装置２５により上述したような位置調整が行
われ、スペクトル分解ユニット２３が光路から外された
場合は、制御装置２５によりレーザースポット１１ｂと
共役な位置に位置調整が行われる。

【００８２】次に、スペクトル分解ユニット２３による
レーザービーム２４ａと２４ｂの入射角度差θ１および
レーザービーム２４ｂと２４ｃの入射角度差θ２のそれ
ぞれの設定方法について説明する。

【００８３】この場合、プリズム２３ｃを形成するガラ
ス部材の分散は、可視波長域では一般的に短波長の方が
大きく、また、試料でのレーザースポットは長波長の方
が大きいので、入射角度差はθ２を満足させるように設
定してやればよい。つまり、図６に示すレーザースポッ
ト１１ｂと１１ｃの間の距離Ｌ、つまり、レーザースポ
ット１１ａと１１ｂのそれぞれの中心の間の距離Ｌを基
準に設定すればよい。

【００８４】この場合、対物レンズ９の開口数をＮＡと
すると、レーザースポット１１ｂ、１１ｃのスポット径
ΦＢ、ΦＣは、それぞれ次のように表わされる。

【００８５】ΦＢ＝１．２２×０．５１４／ＮＡミクロ
ン ΦＣ＝１．２２×０．５６８／ＮＡミクロン また、対物レンズの焦点距離をＦ、瞳投影倍率（結像レ
ンズ８の焦点距離／瞳投影レンズ７の焦点距離）をＫと
すると、レーザースポット１１ｂと１１ｃのそれぞれの
中心の間の距離Ｌは Ｌ＝Ｆ×ＳＩＮ（θ２／Ｋ） で表わされ、 Ｌ＝（ΦＢ+ΦＣ）／２ となる。これにより入射角度差θ２は、 θ２＝Ｋ×ＳＩＮ^−１（（ΦＢ＋ΦＣ）／２Ｆ） で計算される値に設定すればよいことになる。

【００８６】この場合、θ２の値は、上式により求めら
れる値に正確に設定する必要はなく、これよりも大きな
値であった方が望ましい。なぜなら試料中でレーザービ
ームが散乱するので、計算上のスポット径よりも実際は
大きくなるからである。また、対物レンズ９は、実際に
は収差を有しており、計算上のスポット径よりも大きく
なるからである。さらにθ２の値は、上式により求めら
れる値よりも小さな値であっても効果がまったく無い訳
ではなく、少なくとも蛍光クロストークが軽減すること
はできる。

【００８７】要するに、プリズム２３ｃを上述のθ２を
満足するように、かつ、レーザービーム２４ａ、２４
ｂ、２４ｃがＸ走査ミラー５ａのほぼ同じ場所に照射さ
れるように、つまり、対物レンズ９の瞳９ａにほぼ同軸
に入射するように設定してやればよい。

【００８８】なお、レーザービーム２４ａ、２４ｂ、２
４ｃの入射角度差θ１、θ２の設定方向については、第
１の実施の形態で述べたように、Ｘ方向（光束走査方
向）に設定するのが望ましいことに変わりはない。ま
た、取得した画像の位置補正についても第１の実施の形
態で述べたような方法で位置補正してやればよいことは
言うまでもない。この場合、位置補正の対象となる画像
枚数が２枚から３枚になるだけである。

【００８９】従って、このようにすれば、第１の実施の
形態で述べたと同様な効果に加えて、スペクトル分解ユ
ニット２３でのプリズム２３ｃの分散を利用してレーザ
ービーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃの角度差θを与えるよ
うにしたので、レーザー光源１として多波長発振レーザ
ーを使用した場合でもさらに簡単な構成により、本発明
を実現できる。またスペクトル分解ユニット２３の光路
への挿脱に連動して共焦点絞り１５ａ〜１５ｃが位置制
御されるので、従来型の走査型レーザー顕微鏡と本発明
の走査型レーザー顕微鏡をその使用目的に応じて選択的
に利用することが可能である。

【００９０】（変形例）なお、上述した励起用ダイクロ
イックミラー４、第１および第２の蛍光分光用ダイクロ
イックミラー１３ａ、１３ｂおよびバンドパスフィルタ
１６ａ、１６ｂ、１６ｃなどの光学素子について、それ
ぞれ特性の異なる複数の光学素子を用意し、これらをタ
ーレットなどに設けてユニット化しておき、ＡＯＴＦ２
１のレーザー波長の選択に連動して、対応する特性を有
する光学素子を自動的に光路に挿入するとともに、選択
されたレーザ波長の組み合わせにより共焦点絞り１５ａ
〜１５ｃを位置制御するような構成も考えられる。

【００９１】また、ＡＯＴＦ２１についても、４１３ｎ
ｍ、４５８ｎｍ、４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、５６８ｎｍ
のうち最大３本までを同時に選択可能にしたものを用い
れば、図７に示すＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹ
ＦＰおよびＤｓＲｅｄの各蛍光のうち任意の３つの蛍光
蛋白で標識された試料をクロストークなく観察すること
ができる。例えば、ＥＧＦＰとＤｓＲｅｄが遺伝子発現
している試料を観察する場合には、ＡＯＴＦ２１に、４
８８ｎｍ、５６８ｎｍの発振線に対応するＲＦ電圧が印
加され、これらレーザー波長の組み合わせに対応するフ
ィルタが光路に挿入されるとともに、共焦点絞りが位置
制御されればよい。

【００９２】従って、このようにすれば、多波長の発振
線を有するレーザーをＡＯＴＦ２１により選択すると、
これに連動して最適な特性を有する光学素子の組み合わ
せが自動的に設定されるので、図７に示すＥＢＦＰ、Ｅ
ＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰおよびＤｓＲｅｄの各蛍光
蛋白で標識された試料に対しても、簡単に対応すること
ができるとともに、最適な状態で蛍光クロストークを除
去することがきる。

【００９３】さらに、スペクトル分解手段としては、例
えば、図６と同一部分には、同符号を付した図８に示す
ように１組の透過型回折光子３０ａ、３０ｂを有するス
ペクトル分解ユニット３０を用いてもよい。この場合、
反射型の回折光子を用いても同様に構成できることは言
うまでもない。こうすれば、回折光子３０ａ、３０ｂは
分散を大きくとれるのでスペクトル分解ユニット３０を
小型にできる。

【００９４】（第３の実施の形態）次に、第３の実施の
形態を説明する。

【００９５】図９は、第３の実施の形態が適用される走
査型レーザー顕微鏡の概略構成を示すもので、図６と同
一部分には同符号を付している。

【００９６】この場合、レーザー光源２０は、４５８ｎ
ｍ、５１５ｎｍ、５６８ｎｍの他、多波長の発振線を有
するクリプトンアルゴンレーザーである。

【００９７】これらの発振線を含むレーザービームは各
発振線に対して選択フィルターとして働くＡＯＴＦ２１
に入射する。

【００９８】そして、このＡＯＴＦ２１にて、各発振線
に対応するＲＦ電圧を選択的に印加することによって、
発振線を任意の組合せで選択し、レーザービーム２２と
して光路に選択的に挿脱可能に構成されたスペクトル分
解ユニット４０に入射する。

【００９９】スペクトル分解ユニット４０は、ミラー４
０ａ１、４０ｂ１とプリズム４０ｃ１を有するスペクト
ル分解サブユニット４０１と、ミラー４０ａ２、４０ｂ
２とプリズム４０ｃ２を有するスペクトル分解サブユニ
ット４０２からなるもので、これらスペクトル分解サブ
ユニット４０１、４０２の各プリズム４０ｃ１、４０ｃ
２には、分散の異なるプリズムが用いられている。

【０１００】また、これらスペクトル分解サブユニット
４０１、４０２は、制御装置２５により制御されて選択
的に光路に挿入される。図示例では、スペクトル分解サ
ブユニット４０１が光路に挿入されている状態を示して
いる。

【０１０１】一方、４１はレボルバで、このレボルバ４
１には、倍率の異なる複数の対物レンズ４２ａ、４２ｂ
が装着されている。レボルバ４１は、制御装置２５によ
り駆動制御され、対物レンズ４２ａ、４２ｂを選択的に
光路に挿入するようにしている。この場合、対物レンズ
４２ａは、スペクトル分解サブユニット４０１と、対物
レンズ４２ｂは、スペクトル分解サブユニット４０２
と、それぞれ対応しており、図示例では、スペクトル分
解サブユニット４０１に対応する対物レンズ４２ａが光
路に挿入されている状態を示している。

【０１０２】このような構成においても、スペクトル分
解サブユニット４０１により分散されたレーザービーム
２４ａ、２４ｂ、２４ｃは、励起用ダイクロイックミラ
ー４で反射され、Ｘ-Ｙ走査装置５に入射する。

【０１０３】この場合、レーザービーム２４ａ、２４
ｂ、２４ｃは、スペクトル分解サブユニット４０１のプ
リズム４０ｃ１の働きにより、適当な入射角度差が設定
されており、Ｘ走査ミラー５ａのほぼ同じ場所６ａで反
射され、リレーレンズ５ｃによりＹ走査ミラー５ｂに投
影され、ほぼ同じ場所６ｂで反射され、Ｘ-Ｙ走査装置
５で光偏向されたレーザービームは、瞳投影レンズ７、
結像レンズ８を通過して対物レンズ９に入射する。

【０１０４】この場合も、Ｘ走査ミラー５ａ、Ｙ走査ミ
ラー５ｂは瞳投影レンズ７、結像レンズ８により対物レ
ンズ４２ａの瞳４２ａ１に略投影されるように設定され
ており、これにより、対物レンズ４２ａの瞳４２ａ１に
レーザービーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃがほぼ同軸に入
射し、対物レンズ４２ａを出射したレーザービーム２４
ａ、２４ｂ、２４ｃは、試料１０上にそれぞれレーザー
スポット1１ａ、１1ｂ、１１ｃとして照射される。

【０１０５】ここで、試料１０は、蛍光蛋白ＥＣＦＰ、
ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄが遺伝子発現した細胞であるとす
ると、それぞれレーザービーム２４ａ、２４ｂ、２４ｃ
で励起され、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄがそれぞ
れ有する波長特性の蛍光を発する。

【０１０６】これらＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄの
各蛍光は、光路を逆にもどり、励起用ダイクロイックミ
ラー４を透過し、それぞれ蛍光光束１２ａ、１２ｂ、１
２ｃとして第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー１３
ａに入射する。

【０１０７】以下、上述した第１の実施の形態と同様に
して、４６０ｎｍ〜６２５ｎｍの波長範囲の蛍光を発す
るＥＣＦＰは、４６０ｎｍ〜５１５ｎｍのＥＣＦＰ蛍光
光束１２ａ１が、第１の蛍光分光用ダイクロイックミラ
ー１３ａで反射し、共焦点レンズ１４ａ、共焦点絞り１
５ａを通過し、さらに４７０ｎｍから５００ｎｍの光の
みを透過するバンドパスフィルタ1６ａで制限されて第
１の光検出器１７ａで検出され、ＥＣＦＰ蛍光光束１２
ａ１による蛍光画像が取得される。

【０１０８】また、５1５ｎｍ〜６２５ｎｍの波長範囲
の蛍光を発するＥＹＦＰは、５１５ｎｍ〜５７０ｎｍの
蛍光光束１２ｂ１が第２の蛍光分光用ダイクロイックミ
ラー１３ｂで反射し、共焦点レンズ1４ｂ、焦点絞り１
５ｂを通過し、さらに５２５ｎｍ〜５６０ｎｍの光のみ
を透過するバンドパスフィルタ１６ｂで制限されて第２
の光検出器１７ｂで検出され、ＥＹＦＰ蛍光光束１２ｂ
１による蛍光画像が取得される。

【０１０９】さらに、５７０ｎｍ〜６８０ｎｍの波長範
囲の蛍光を発するＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃは、ミラ
ー１８で反射し、共焦点レンズ１４ｃ、焦点絞り1５ｃ
を通過し、さらに５８０ｎｍ〜６５０nｍの光のみを透
過するバンドパスフィルタ１６ｃで制限されて第３の光
検出器１７ｃで検出され、ＤｓＲｅｄの蛍光光束１２ｃ
による蛍光画像が取得される。

【０１１０】この場合も、各共焦点絞り１５ａ、１５
ｂ、１５ｃは、光路に選択的に挿入される対物レンズ４
２ａ、４２ｂ、スペクトル分解サブユニット４０１，４
０２、に応じて制御装置２５により第１の実施の形態で
述べたと同様な位置調整が行われる。

【０１１１】これにより、ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ／ＤｓＲ
ｅｄの各蛍光蛋白を遺伝子発現させた試料１０を観察す
るようなときにも、ＥＣＦＰ蛍光がＥＹＦＰ蛍光やＤｓ
Ｒｅｄ蛍光にかぶる、あるいはＥＹＦＰ蛍光がＤｓＲｅ
ｄ蛍光にかぶる現象、所謂、蛍光クロストークを確実に
回避することができる。

【０１１２】一方、レボルバ４１を操作して対物レンズ
４２ｂを光路に挿入した場合は、制御装置２５によりス
ペクトル分解サブユニット４０２が光路に挿入されるよ
うになるが、この場合も、上述したと同様にしてＥＣＦ
Ｐ蛍光がＥＹＦＰ蛍光やＤｓＲｅｄ蛍光にかぶる、ある
いはＥＹＦＰ蛍光がＤｓＲｅｄ蛍光にかぶる現象、所
謂、蛍光クロストークを確実に回避することができる。

【０１１３】なお、スペクトル分解ユニット４０のスペ
クトル分解サブユニット４０１、４０２によるレーザー
ビーム２４ａと２４ｂの入射角度差θ１およびレーザー
ビーム２４ｂと２４ｃの入射角度差θ２のそれぞれの設
定方法については、第１の実施の形態で述べたと同様で
あり、ここでもプリズム４０ｃ１、４０ｃ２を形成する
ガラス部材の分散は、可視波長域では一般的に短波長の
方が大きく、また、試料でのレーザースポットは長波長
の方が大きいので、入射角度差はθ２を満足させるよう
に設定してやればよい。

【０１１４】ところで、このようにして求められるθ２
は、対物レンズ４２ａ、４２ｂの焦点距離Ｆと開口数Ｎ
Ａと、この時使用されるレーザー波長に依存している。
このことから、対物レンズ４２ａ、４２ｂにより、必要
とするθ２の値は異なることが分かる。

【０１１５】このため、対物レンズ４２ａ、４２ｂに対
応するスペクトル分解ユニット４０は、分散の異なるプ
リズム４０ｃ１、４０ｃ２を各別に有するスペクトル分
解サブユニット４０１、４０２が用意されており、ここ
では、対物レンズ４２ａに対してスペクトル分解サブユ
ニット４０１が、対物レンズ４２ａに対しては、スペク
トル分解サブユニット４０２が制御装置２５の制御によ
り光路に挿入される。

【０１１６】これにより、例えば、対物レンズ４２ａと
して、倍率が１０倍（Ｆ＝１８）、ＮＡ＝０．３のもの
が用いられ、対物レンズ４２ｂとして、倍率が１００倍
（Ｆ＝１．８）、ＮＡ＝１．０のものが用いられた場
合、結像レンズ８の焦点距離＝１８０、瞳投影レンズ７
の焦点距離＝６０とすると、レーザースポット径Φは、
レーザー波長をλとすると、 Φ＝１．２２×λ×ＮＡミクロン で表わされるので、対物レンズ４２ａによるレーザース
ポット１１ｂ、１１ｃのスポット径ΦＢ、ΦＣは、それ
ぞれ次のように表わされる。

【０１１７】ΦＢ＝１．２２×０．５１４／０．３＝
２．０９ミクロン ΦＣ＝１．２２×０．５６８／０．３＝２．３１ミクロ
ン これにより、対物レンズ４２ａの場合の入射角度差θ２
は、 θ２＝Ｋ×ＳＩＮ^−１（（ΦＢ＋ΦＣ）／２Ｆ）（Ｋ＝
１８０／６０、Ｆ＝１８）＝１．２６分 に設定すればよいことになる。

【０１１８】また、対物レンズ４２ｂによるレーザース
ポット１１ｂ、１１ｃのスポット径ΦＢ、ΦＣは、それ
ぞれ次のように表わされる。

【０１１９】ΦＢ＝１．２２×０．５１４／１．０＝
０．６３ミクロン ΦＣ＝１．２２×０．５６８／１．０＝０．６９ミクロ
ン 対物レンズ４２ｂの場合の入射角度差θ２は、 θ２＝Ｋ×ＳＩＮ^−１（（ΦＢ＋ΦＣ）／２Ｆ）（Ｋ＝
１８０／６０、Ｆ＝１．８）＝３．７８分 に設定すればよいことになる。

【０１２０】従って、このようにしても第１の実施の形
態で述べたと同様な効果に加えて、倍率の異なる複数の
対物レンズ４２ａ、４２ｂを使用する場合も、対物レン
ズに応じてθ２を最適に設定することができるので、試
料１０上を走査されるレーザービーム２４ａ、２４ｂ、
２４ｃの時間差を小さくすることができ、生きた試料の
時間経過観察等、同時性が求められる場合に、さらに有
利にできる。

【０１２１】その他、本発明は、上記実施の形態に限定
されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しな
い範囲で種々変形することが可能である。

【０１２２】さらに、上記実施の形態には、種々の段階
の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件
における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出でき
る。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から
幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようと
する課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄
で述べられている効果が得られる場合には、この構成要
件が削除された構成が発明として抽出できる。

【０１２３】以上述べた実施の形態には、以下の発明も
含まれる。

【０１２４】（１）スペクトル分解手段は、プリズムで
構成されていることを特徴としている。

【０１２５】（２）スペクトル分解手段は、回折格子で
構成されていることを特徴としている。

【０１２６】（３）スペクトル分解手段は光路に挿脱可
能に構成されていることを特徴としている。

【０１２７】（４）共焦点絞りは、それぞれ焦点面内で
可動に配置されるとともに、前記スペクトル分解手段の
光路への挿脱状態に連動して位置調整されることを特徴
としている。

【０１２８】（５）照射手段は異なる分散を有する複数
のスペクトル分解手段を有しており、これらスペクトル
分解手段を選択的に光路に挿入可能にするとともに、前
記スペクトル分解手段の光路への挿脱状態に連動して共
焦点絞りの位置調整が行われることを特徴としている。

【０１２９】（６）対物レンズの焦点距離、開口数およ
びレーザー光の波長域の少なくとも一つに基づいて、対
物レンズヘのレーザー光の入射角度差を設定することを
特徴としている。

【０１３０】（７）対物レンズの切り換え、または、レ
ーザー光の波長域の切り換えの少なくとも一つに連動し
て共焦点絞りの位置調整が行われることを特徴としてい
る。

【０１３１】（８）照射手段は、対物レンズにより試料
上に形成されるレーザースポットのずらし方向を、走査
手段による高速走査方向に設定したことを特徴としてい
る。

【０１３２】（９）対物レンズの切り換え、または、レ
ーザー光の波長域の切り換えの少なくとも一方に基づい
て、光検出手段で検出された試料からの蛍光画像を位置
補正するとともに、各画像を合成することを特徴として
いる。

【０１３３】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、蛍光
クロストークを除去できるとともに、複数の励起波長に
よる各々の観察の時間的な遅れを抑制することのできる
走査型レーザー顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図２】第１の実施の形態に用いられるＦＩＴＣ蛍光の
特性を示す図。

【図３】第１の実施の形態に用いられるＴＲＩＴＣ蛍光
の特性を示す図。

【図４】第１の実施の形態に用いられる画像の位置補正
を説明するための図。

【図５】第１の実施の形態に用いられる画像の位置補正
を説明するための図。

【図６】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図７】第２の実施の形態に用いられる各種蛍光の特性
を示す図。

【図８】第２の実施の形態の変形例の概略構成を示す
図。

【図９】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す
図。

【図１０】従来の走査型光学顕微鏡の一例の概略構成を
示す図。

【図１１】従来の走査型光学顕微鏡に用いられる各フィ
ルタブロックの特性図。

【符号の説明】

１、１ａ、１ｂ…レーザー光源 ２ａ、２ｂ…レーザービーム ３ａ、３ｂ…ミラー ４…励起用ダイクロイックミラー ５…Ｙ走査装置 ５ａ…Ｘ走査ミラー ５ｂ…Ｙ走査ミラー ５ｃ…リレーレンズ ６ａ、６ｂ…場所 ７…瞳投影レンズ ８…結像レンズ ９…対物レンズ ９ａ…瞳 1０…試料 １１ａ、１１ｂ、１１ｃ…レーザースポット １２ａ、１２ｂ、１２ｃ…蛍光光束 １２ａ１、１２ａ２、１２ａ３、１２ａ４…蛍光光束 １２ｂ１、１２ｂ２…蛍光光束 １３…蛍光分光用ダイクロイックミラー １３ａ…第１の蛍光分光用ダイクロイックミラー １３ｂ…第２の蛍光分光用ダイクロイックミラー １４ａ、１４ｂ、１４ｃ…共焦点レンズ １５ａ、１５ｂ、１５ｃ…共焦点絞り １６ａ、１６ｂ、１６ｃ…バンドパスフィルタ １７ａ…第１の光検出器 １７ｂ…第２の光検出器 １７ｃ…第３の光検出器 １８…ミラー ２０…レーザー光源 ２１…ＡＯＴＦ ２２…レーザービーム ２３…スペクトル分解ユニット ２３ａ、２３ｂ…ミラー ２３ｃ…プリズム ２４ａ、２４ｂ、２４ｃ…レーザービーム ２５…制御装置 ３０ａ、３０ｂ…透過型回折光子 ３０…スペクトル分解ユニット ４０…スペクトル分解ユニット ４０ａ１、４０ｂ１、４０ａ２、４０ｂ２…ミラー ４０ｃ１、４０ｃ２…プリズム ４１…レボルバ ４２ａ、４２ｂ…対物レンズ ４２ａ１…瞳

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の蛍光色素や蛍光蛋白で標識された
   試料を励起するための複数の異なる波長域からなるレー
   ザー光を発生するレーザー光源と、 前記レーザー光源より発生されるレーザー光を集光して
   前記試料上にレーザスポットを形成する対物レンズと、 前記レーザー光を複数の波長域ごとに前記対物レンズに
   対して異なる角度で入射させ、前記対物レンズにより前
   記試料上に形成されるレーザースポットをずらして照射
   させる照射手段と、 前記対物レンズにより試料上に形成されるレーザースポ
   ットを走査する走査手段と、 前記試料からの蛍光を複数の波長域ごとに分光する蛍光
   分光手段と、 前記蛍光分光手段で分光された各波長域の蛍光をそれぞ
   れ異なる共焦点絞りを介して同時に検出する光検出手段
   とを具備したことを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記光検出手段で検出された前記試料か
   らの各波長域の蛍光をそれぞれ画像化し、位置補正する
   とともに、各画像を合成可能とした位置補正手段を有す
   ることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微
   鏡。
3. 【請求項３】 前記照射手段は、前記レーザー光源より
   発生されるレーザー光をスペクトル分解するスペクトル
   分解手段を有することを特徴とする請求項１または２に
   記載の走査型レーザー顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記照射手段は、前記レーザー光源より
   発生される複数の波長域ごとのレーザー光を対物レンズ
   のほぼ瞳中心に投影するための瞳投影手段を有すること
   を特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の走査型
   レーザー顕微鏡。