JP4804726B2

JP4804726B2 - 走査型光学観察装置

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Publication number: JP4804726B2
Application number: JP2004178253A
Authority: JP
Inventors: 博士鶴田; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2024-06-16
Also published as: JP2006003521A

Description

本発明は、標本を励起してその反応光を観察するための観察用レーザ光を発生する励起用光源と標本に刺激を与えるための刺激用レーザ光源を備えた走査型光学観察装置に関するものである。

従来、走査型光学観察装置として、特許文献１に開示されるように、蛍光観察を行なうための観察用励起レーザ光を試料上の光軸に垂直な面内で走査させるための観察用励起レーザ光走査手段と、試料に刺激を与えるための刺激用レーザ光を試料平面の任意の位置に照射するための刺激用レーザ光走査手段の２組の光走査手段を有する走査型レーザ顕微鏡が知られている。

ところで、このような走査型レーザ顕微鏡では、蛍光観察に用いられるＣａｇｅｄ手法などに有効とされる刺激用レーザとして、１光子励起波長の刺激用レーザが用いられることがあるが、かかる１光子励起波長の刺激用レーザは、標本上で刺激を与えたい位置以外にも光が通過して刺激を与えてしまうことがある。このため、最近になって、散乱が多い厚い標本を使った光刺激を行う蛍光観察においては、標本の集光面のみでしか２光子励起が発生しないことで標本の正確な点のみに刺激を与えることが可能な２光子励起波長の赤外パルスレーザを発生する刺激用レーザ光源が用いられている。

また、蛍光観察を行なうための観察用励起レーザについても、標本への光による障害を抑えて標本深部の観察ができるなどの利点から、２光子励起波長を発生させる赤外パルスレーザを使用し、近赤外波長で紫外光励起用の蛍光試薬を励起させて蛍光を発生させるようにした励起用レーザ光源も用いられている。また、一方で、蛍光観察においては、効率の良くない２光子励起より、Ｓ／Ｎの良い画像が取得可能な、１光子励起による蛍光観察も必要とされている。
特開平１０−２０６７４２号公報

しかし、特許文献１に開示された走査型レーザ顕微鏡は、１種類の観察用励起レーザ光源や刺激用レーザ光源を組み合わせ使用して蛍光観察を行なうもので、上述したように２光子励起による光刺激の他に、１光子励起による蛍光観察や２光子励起による蛍光観察などの多様化された観察方法を採用しようとすると、観察用励起レーザ波長に対応した複数の光学素子として、例えば波長分離用ダイクロイックミラーを用意し、観察方法に応じて、これらダイクロイックミラーを最適なものに切換え、または交換するなどの必要が生じる。

ところが、これら光学素子は、光路への切換え、または、交換の際に、反射角度や折返し位置の固体差により、光軸がずれることがある。このことは、光学素子を最適なものに取り換えたことによる刺激用レーザ光と観察用励起レーザ光の光路のずれにより、刺激用レーザ走査手段と観察用励起レーザ走査手段によるレーザ走査位置にもずれを生じることになる。この結果、試料内で狙った位置（ポイントまたは領域）に正確に刺激レーザ光を照射できなくなってしまうという問題を生じる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、レーザ光源を切換えても標本内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射できる走査型光学観察装置を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第１のレーザ光源と、多光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、これら第１および第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の光路を合成する第１の光学素子と、前記第１の光学素子で合成された光路の観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、多光子励起波長の刺激用レーザ光を発生する第３のレーザ光源と、前記刺激用レーザ光を標本上で２次元走査する第２の走査手段と、前記第１および第２の走査手段からの光路の交差位置に配置され、これら第１および第２の走査手段からのレーザ光の光路を合成する第２の光学素子とを具備し、前記第１の光学素子は、前記第１のレーザ光源からの観察用レーザ光の波長と前記第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、前記第２の光学素子は、前記第１及び第２のレーザ光源からのそれぞれの観察用励起レーザ光の波長と前記第３のレーザ光源からの刺激用レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、さらに共焦点ピンホールを有する第１の蛍光検出手段を前記第１の走査手段と前記第１の光学素子との間で分岐された光路上に備え、前記第２の光学素子は、さらに前記第１のレーザ光源の１光子励起波長または前記第２のレーザ光源の多光子励起波長のそれぞれの観察用励起レーザ光により励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第１の走査手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有し、さらに共焦点ピンホールを有しない第２の蛍光検出手段と、前記第２の光学素子から前記標本までの光路に挿脱可能に配置され、第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光により多光子励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有する第３の光学素子とを具備し、前記第３の光学素子は、前記第２及び第３のレーザ光源からのそれぞれのレーザ光の波長を前記標本へ向けて反射又は透過し、前記多光子励起された蛍光の波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて透過又は反射する波長特性であることを特徴としている。

本発明によれば、各種のレーザ光源を切換えても標本内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射できる走査型光学観察装置を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図において、１は第１のレーザ光源として、１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する観察用可視レーザユニットで、この観察用可視レーザユニット１は、可視レーザコンバイナを構成するもので、レーザ光源として４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と、６３３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ３を有している。ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。また、ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、レーザラインフィルタ６が配置されている。このレーザラインフィルタ６は、アルゴンレーザ２から発せられる４８８ｎｍのレーザ波長とヘリウムネオンレーザ３から発せられる６３３ｎｍののレーザ光を選択可能にしている。

一方、７は第２のレーザ光源として、２光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する観察用赤外レーザユニットで、この観察用赤外レーザユニット７は、赤外パルスレーザを有し、８２０ｎｍ〜１０００ｎｍまでのレーザ光を選択的に出力可能になっている。

観察用赤外レーザユニット７からのレーザ光の光路上には、反射ミラー８が配置されている。また、観察用可視レーザユニット１からのからのレーザ光の光路上には、反射ミラー８で反射されるレーザ光との交点上に第１の光学素子としてダイクロイックミラー９が配置されている。ダイクロイックミラー９は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、反射ミラー８で反射される観察用赤外レーザユニット７からの２光子励起波長のレーザ光を透過し、観察用可視レーザユニット１からのからの１光子励起波長のレーザ光を反射するような特性を有し、これらレーザ光を合成して同軸に導くようにしている。

ダイクロイックミラー９により出射されたレーザ光の光路上には、ダイクロイックミラー１０が配置されている。ダイクロイックミラー１０は、ダイクロイックミラー９からのレーザ光を反射し、後述する標本２３から発せられる蛍光（検出光）を透過するようになっている。

ダイクロイックミラー１０の反射光路には、第１の走査手段として、観察用励起レーザ光走査手段１１が配置されている。この観察用励起レーザ光走査手段１１は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１１ａ、１１ｂを有し、これらのミラー１１ａ、１１ｂにより標本２３上の観察用励起レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

また、ダイクロイックミラー１０の検出光（蛍光）の透過光路には、第１の光検出手段を構成する共焦点レンズ１２、共焦点ピンホール１３および内部蛍光検出器１４が配置されている。この場合、第１の光検出手段では、１光子励起による蛍光観察を行う場合は、共焦点ピンホール１３を絞って内部蛍光検出器１４により蛍光検出を行ない、２光子励起による蛍光観察を行う場合は、散乱光をより多く拾うため、共焦点ピンホール１３を開放して、内部蛍光検出器１４により蛍光検出を行なうようになっている。

一方、１５は、第３のレーザ光源としての刺激用レーザユニットで、この刺激用レーザユニット１５は、赤外パルスレーザを有し、標本２３の特定部位に２光子励起による化学反応（ケージド試薬の解除）を与えるための７２０ｎｍの２光子励起波長の刺激用レーザ光が出力可能になっている。刺激用レーザユニット１５からの刺激用レーザ光の光路には、反射ミラー１６を介して第２の走査手段としての刺激用レーザ光走査手段１７が配置されている。この刺激用レーザ光走査手段１７は、刺激用レーザ光を標本２３上の任意領域に２次元走査することや、標本２３上の任意のポイントで固定照射することを可能としたもので、２枚のミラー１７ａ、１７ｂで構成されている。これらのミラー１７ａ、１７ｂは、刺激用レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

刺激用レーザ光走査手段１７から出射される刺激用レーザ光の光路上には、観察用励起レーザ光走査手段１１から出射されるレーザ光の光路との交点上に第２の光学素子としてダイクロイックミラー１８が配置されている。このダイクロイックミラー１８は、観察用励起レーザ光走査手段１１からのレーザ光を透過し、刺激用レーザ光走査手段１７からの刺激用レーザ光を反射するような特性を有するものである。具体的には、図２に示すように観察用可視レーザユニット１から出射される４８８ｎｍおよび６３３ｎｍの波長、これら４８８ｎｍ、６３３ｎｍの励起波長により標本２３より発せられる１光子励起蛍光の波長を含む可視波長（４５０〜６７０ｎｍ）および観察用赤外レーザユニット７から出射される８２０ｎｍ〜１０００ｎｍまでの２光子励起波長を透過し、刺激用レーザユニット１５から出射される７２０ｎｍの２光子励起波長を反射するようにしている。

ダイクロイックミラー１８により出射されたレーザ光の光路上には、光学素子切換え手段としてターレット１９が配置されている。このターレット１９は、第３の光学素子としてのダイクロイックミラー２０と反射ミラー２１を有し、不図示の電動機構によりダイクロイックミラー２０または反射ミラー２１を選択的に光路上に挿入するようにしている。この場合、ダイクロイックミラー２０は、図３に示すように観察用赤外レーザユニット７から出射される８２０ｎｍ〜１０００ｎｍまでの２光子励起波長と刺激用レーザユニット１５から出射される７２０ｎｍの２光子励起波長を反射し、これら観察用赤外レーザユニット７および刺激用レーザユニット１５の２光子励起波長により標本２３より発せられる２光子励起蛍光（５３０ｎｍ）を透過するような特性を有している。図示例では、ダイクロイックミラー２０が光路上に挿入されている。

ダイクロイックミラー２０（または反射ミラー２１）の反射光路には、観察用励起レーザ光または刺激用レーザ光の走査光学系を構成する対物レンズ２２が配置されている。この場合、観察用励起レーザ光走査手段１１から出射される観察用励起レーザ光は、ダイクロイックミラー２０（または反射ミラー２１）で反射し、対物レンズ２２を介して不図示のステージに載置された標本２３の焦点位置に結像される。また、標本２３から発生された蛍光（検出光）は、ダイクロイックミラー２０（または反射ミラー２１）まで戻るようになっている。また、刺激用レーザ光走査手段１７から出射される刺激用レーザ光は、ダイクロイックミラー２０（または反射ミラー２１）で反射し、標本２３上の任意領域で２次元走査されたり、任意のポイントで固定照射されるようになっている。

この場合、標本２３には、蛍光指示薬として、例えばカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使用されている。

ダイクロイックミラー２０の透過光路には、第２の光検出手段としての外部蛍光検出器２４が配置されている。この第２の光検出手段は、例えば、２光子励起波長の観察用励起レーザ光により、散乱光が多い厚い標本２３をより明るく観察したいような場合、標本２３より発せられる蛍光（検出光）を複数のミラーやレンズなどの光学素子を経由せると損失が大きく極めて微弱なものになってしまうため、ダイクロイックミラー２０のみを経由して外部蛍光検出器２４により蛍光検出を行なうようにしている。

なお、第２の光検出手段としての外部蛍光検出器２４と標本２３の間の光路には走査手段がないので、第２の光検出手段にピンホールを設けることはできないが、２光子（多光子）励起による蛍光を検出する場合には、２光子（多光子）励起現象が生じる領域がレーザ光の集光位置の極近傍だけであることからピンホールがなくても光学的スライス像を取得することができる。

次に、このように構成した第１の実施の形態の作用を説明する。

まず、１光子励起光を使用して内部蛍光検出器１４で蛍光検出を行なう場合を説明する。

この場合、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動し、反射ミラー２１を光路上に位置させる。

この状態で、観察用可視レーザユニット１のアルゴンレーザ２から４８８ｎｍの波長のレーザ光とヘリウムネオンレーザ３から６３３ｎｍの波長のレーザ光が発せられると、このうち４８８ｎｍのレーザ波長がレーザラインフィルタ６により選択される。この４８８ｎｍのレーザ波長は、観察用励起レーザ光として、ダイクロイックミラー９で反射し、さらにダイクロイックミラー１０で反射し、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２１で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３に観察用励起レーザ光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここでは、蛍光指示薬としてカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使われているので、レーザー波長４８８ｎｍにより蛍光波長５３０ｎｍの蛍光を発する。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２１で反射され、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。この場合、共焦点ピンホール１３は、共焦点効果を得るため、回折径程度に絞られている。共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

次に、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長の刺激用レーザ光を発生すると、刺激用レーザ光は、刺激用レーザ光走査手段１７を介してダイクロイックミラー１８で反射し、さらに反射ミラー２１で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。この状態で、刺激用レーザ光走査手段１７により、刺激用レーザ光を標本２３上の任意領域で２次元走査したり、任意のポイントを固定照射して、標本２３の特定部位に２光子励起による化学反応（ケージド試薬の解除）を発生させる。そして、このときの影響により反応する標本２３の経時変化などを上述した内部蛍光検出器１４で検出し、不図示の表示装置に画像表示する。

次に、２光子励起光を使用して内部蛍光検出器１４で蛍光検出を行なう場合を説明する。

この場合、観察用赤外レーザユニット７より８５０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８５０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２１で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３に２光子励起波長の観察用励起レーザ光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここで蛍光指示薬としてカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使われているので、レーザ波長８５０ｎｍにより蛍光波長５３０ｎｍの蛍光を発する。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２１で反射され、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。この場合、共焦点ピンホール１３は、より多くの散乱光を拾うことができるように開放されている。共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

一方、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長の刺激用レーザ光を発生して標本２３上の特定部位に２光子励起による化学反応（ケージド試薬の解除）を発生させる場合は、上述したと同様である。

次に、例えば散乱光が多い厚い標本２３の蛍光観察において、２光子励起光を使用して外部蛍光検出器２４で蛍光検出を行う場合を説明する。

この場合、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動し、ダイクロイックミラー２０を光路上に位置させる。

この状態から、観察用赤外レーザユニット７より８５０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８５０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、ダイクロイックミラー２０で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、ダイクロイックミラー２０を透過して外部蛍光検出器２４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

従って、このようにすれば、観察用可視レーザユニット１から発せられる１光子励起波長の観察用励起レーザ光と観察用赤外レーザユニット７から発せられる２光子励起波長の観察用励起レーザ光のそれぞれの光路をダイクロイックミラー９により合成し、さらに刺激用レーザユニット１５から発せられる２光子励起波長の刺激用レーザ光の光路をダイクロイックミラー１８により合成し、これら合成された光路を介して、それぞれのレーザ光を標本２３内に照射し、可視レーザによる１光子励起観察、赤外パルスレーザによる２光子励起観察、さらには、刺激用レーザによる２光子励起による化学反応を得られるようにしたので、観察用可視レーザユニット１、観察用赤外レーザユニット７、さらに刺激用レーザユニット１５の切換えの際に、ダイクロイックミラーなどの光学素子の切換え、交換などを一切必要とすることがなくなり、これら光学素子の光路への切換え、交換の際に、反射角度や折返し位置の固体差に原因する光軸ずれを確実に防止することができる。つまり、観察用可視レーザユニット１、観察用赤外レーザユニット７、刺激用レーザユニット１５などのレーザ光源を切換えても、標本２３内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射することができる。これにより、標本２３の特定の部位に２光子励起により化学反応を与えて、その影響を含めて１光子または２光子励起波長による蛍光観察を行うような場合も、複数のダイクロイックミラーを必要とせず、容易に１光子蛍光画像や２光子蛍光画像を取得できる走査型レーザー顕微鏡を実現できる。

また、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４による蛍光検出を切換える目的で、光路中でダイクロイックミラー２０、反射ミラー２１を切換える場合も、これらダイクロイックミラー２０、反射ミラー２１の切換えは、観察用可視レーザユニット１、観察用赤外レーザユニット７、刺激用レーザユニット１５からのレーザ光の光路を合成した後の光路上で行われるので、これらダイクロイックミラー２０、反射ミラー２１を切換えても、それぞれのレーザ光の光路の相対位置関係に変化を生じることがなく、これにより、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４を切換えても標本内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射できる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図４は、本発明の第２の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、観察用励起レーザ光走査手段１１とダイクロイックミラー１８との間の光路の平行光束中に第３の光学素子としてのダイクロイックミラー２５が配置されている。このダイクロイックミラー２５は、不図示の電動機構により光路上に挿脱可能になっている。また、ダイクロイックミラー２５は、図５に示すように観察用赤外レーザユニット７から出射される８２０ｎｍ〜１０００ｎｍまでの２光子励起波長を透過し、観察用赤外レーザユニット７からの励起波長により標本２３より発せられる５３０ｎｍの２光子励起蛍光を反射するような特性を有している。

ダイクロイックミラー２５の反射光路には、反射ミラー２６を介して第２の光検出手段としての外部蛍光検出器２４が配置されている。図示例では、ダイクロイックミラー２５は、光路上に配置されている。

また、ダイクロイックミラー１８と対物レンズ２２との間には、反射ミラー２７が配置されている。

その他は、図１と同様である。

次に、このように構成した第２の実施の形態の作用を説明する。

この場合、不図示の電動機構によりダイクロイックミラー２５を移動し、光路上から退避させる。

この状態で、観察用可視レーザユニット１のアルゴンレーザ２から４８８ｎｍの波長のレーザ光とヘリウムネオンレーザ３から６３３ｎｍの波長のレーザ光が発せられると、このうち４８８ｎｍのレーザ波長がレーザラインフィルタ６により選択される。この４８８ｎｍのレーザ波長は、観察用励起レーザ光として、ダイクロイックミラー９で反射し、さらにダイクロイックミラー１０で反射し、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２７で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３に観察用励起レーザ光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここで、蛍光指示薬としてカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使われているので、レーザー波長４８８ｎｍにより蛍光波長５３０ｎｍの蛍光を発する。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２７で反射され、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。この場合、共焦点ピンホール１３は、共焦点効果を得るため、回折径程度に絞られている。共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

次に、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長の刺激用レーザ光を発生すると、刺激用レーザ光は、刺激用レーザ光走査手段１７を介してダイクロイックミラー１８で反射し、さらに反射ミラー２７で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。この状態で、刺激用レーザ光走査手段１７により、刺激用レーザ光を標本２３上の任意領域で２次元走査したり、任意のポイントを固定照射して、標本２３の特定部位に２光子励起による化学反応（ケージド試薬の解除）を発生させる。そして、このときの影響により反応する標本２３の経時変化などを上述した内部蛍光検出器１４で検出し、不図示の表示装置に画像表示する。

この場合、観察用赤外レーザユニット７より８５０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８５０ｎｍのレーザ光は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２７で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３に２光子励起光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここでも蛍光指示薬としてカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使われているので、レーザ波長８５０ｎｍにより蛍光波長５３０ｎｍの蛍光を発する。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２７で反射され、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。この場合、共焦点ピンホール１３は、より多くの散乱光を拾うことができるように開放されている。共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

この場合、不図示の電動機構によりダイクロイックミラー２５を光路上に挿入する。

この状態から、観察用赤外レーザユニット７より８５０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、このこの８５０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー２５、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２７で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

標本２３に２光子励起波長の観察用励起レーザ光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここでも蛍光指示薬としてカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３が使われているので、レーザ波長８５０ｎｍにより蛍光波長５３０ｎｍの蛍光を発する。

標本２３からの波長５３０ｎｍの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２７で反射し、ダイクロイックミラー１８を透過し、ダイクロイックミラー２５で反射し、反射ミラー２６を介して外部蛍光検出器２４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

従って、このようにしても、観察用可視レーザユニット１から発せられる１光子励起波長の観察用励起レーザ光と観察用赤外レーザユニット７から発せられる２光子励起波長の観察用励起レーザ光のそれぞれの光路をダイクロイックミラー９により合成し、さらに刺激用レーザユニット１５から発せられる２光子励起波長のレーザ光の光路をダイクロイックミラー１８により合成し、これら合成された光路を介して、それぞれのレーザ光を標本２３内に照射するようにしたので、第１の実施の形態と同様な効果を得ることができる。

また、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４による蛍光検出を切換える目的で、光路中にダイクロイックミラー２５が挿脱されるが、このダイクロイックミラー２５の光路への挿脱は、観察用励起レーザ光走査手段１１とダイクロイックミラー１８との間の平行光束中で行われるので、ダイクロイックミラー２５を挿脱しても、それぞれのレーザ光の光路の相対位置関係に変化を生じることがなく、これにより、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４を切換えても標本内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射できる。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。

図６は、本発明の第３の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、標本には、蛍光指示薬として、上述したカルシウムイオン指示薬のｆｌｕｏ−３を使用した標本２３と、例えばＤＡＰＩとＡｌｅｘａ４８８を使用した多重染色標本２８が適用される。

また、刺激用レーザユニット１５から出射される２光子励起波長の刺激用レーザ光を２光子励起波長の観察用励起レーザ光として使用する。

さらに、ダイクロイックミラー１８より出射されるレーザ光の光路上に配置されるターレット１９には、ダイクロイックミラー２０と反射ミラー２１の他に、第４の光学素子としてのダイクロイックミラー２９が設けられ、不図示の電動機構により、これらのうち一つを選択的に光路上に挿入可能にしている。

この場合、ダイクロイックミラー２９は、図７に示すように観察用赤外レーザユニット７から出射される８２０ｎｍ〜１０００ｎｍまでの２光子励起波長の観察用励起レーザ光と刺激用レーザユニット１５から出射される７２０ｎｍの２光子励起波長の観察用励起レーザ光を反射し、これら観察用赤外レーザユニット７および刺激用レーザユニット１５からの２光子励起波長の観察用励起レーザ光により多重染色標本２８より発せられる蛍光波長の４５６ｎｍを透過し、５２０ｎｍを反射するような特性を有している。

その他は、図１と同様である。

次に、このように構成した第３の実施の形態の作用を説明する。

この場合、標本２３の蛍光観察については、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動して反射ミラー２１またはダイクロイックミラー２０を光路上に挿入する。これ以降の動作は、上述した実施の形態と同様であり、ここでの説明は省略する。

次に、多重染色標本２８の蛍光観察について説明する。

まず、観察用赤外レーザユニット７と刺激用レーザユニット１５にそれぞれ備えられた赤外パルスレーザによる２光子励起波長の観察用励起レーザ光を使用して、内部蛍光検出器１４により蛍光検出を行なう場合を説明する。この場合、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動して反射ミラー２１を光路中に挿入する。

この状態で、観察用赤外レーザユニット７より８２０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８２０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、反射ミラー２１で反射して対物レンズ２２に入射し、多重染色標本２８に集光される。

また、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長のレーザ光を発生すると、この７２０ｎｍのレーザ波長光は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として刺激用レーザ光走査手段１７を介してダイクロイックミラー１８で反射し、さらに反射ミラー２１で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

多重染色標本２８にそれぞれの２光子励起波長の観察用励起レーザ光が照射されると、蛍光指示薬が励起され蛍光が発せられる。ここでは、蛍光指示薬としてＤＡＰＩとＡｌｅｘａ４８８をが使われているので、２光子励起レーザ波長８２０ｎｍによりＡｌｅｘａ４８８が波長５２０ｎｍの蛍光を発し、２光子励起レーザ波長７２０ｎｍによりＤＡＰＩが波長４５６ｎｍの蛍光を発する。

多重染色標本２８からの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、反射ミラー２１で反射され、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。この場合、共焦点ピンホール１３は、より多くの散乱光を拾うことができるように開放されている。共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出される。内部蛍光検出器１４は、蛍光波長の検出チャンネルを２チャンネルに分離するための不図示の分光ダイクロイックミラーが設けられていて、検出した蛍光波長から５２０ｎｍと４５６ｎｍの蛍光波長を分離する。そして、これら分離された蛍光は、電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、それぞれ画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

次に、外部蛍光検出器２４により蛍光検出を行なう場合を説明する。この場合、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動してダイクロイックミラー２０を光路中に挿入する。

この状態で、観察用赤外レーザユニット７より８２０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８２０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、ダイクロイックミラー２０で反射して対物レンズ２２に入射し、多重染色標本２８に集光される。

また、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長のレーザ光を発生すると、この７２０ｎｍのレーザ波長光も、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として刺激用レーザ光走査手段１７を介してダイクロイックミラー１８で反射し、さらにダイクロイックミラー２０で反射して対物レンズ２２に入射し、多重染色標本２８に集光される。

多重染色標本２８からの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、ダイクロイックミラー２０を透過して外部蛍光検出器２４で検出される。

外部蛍光検出器２４についても、蛍光波長の検出チャンネルを２チャンネルに分離するための不図示の分光ダイクロイックミラーが設けられていて、検出した蛍光波長から５２０ｎｍと４５６ｎｍの蛍光波長を分離する。そして、これら分離された蛍光は、電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、それぞれ画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

次に、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４により同時に蛍光検出を行なう場合を説明する。この場合、不図示の電動機構によりターレット１９を駆動してダイクロイックミラー２９を光路中に挿入する。

この状態で、観察用赤外レーザユニット７より８２０ｎｍのレーザ波長を選択して出射すると、この８２０ｎｍのレーザ波長は、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として反射ミラー８で反射し、ダイクロイックミラー９を透過し、さらにダイクロイックミラー１０で反射して、観察用励起レーザ光走査手段１１に入射し、２次元方向に偏向され、ダイクロイックミラー１８を透過し、ダイクロイックミラー２９で反射して対物レンズ２２に入射し、多重染色標本２８に集光される。

また、刺激用レーザユニット１５より７２０ｎｍの波長のレーザ光を発生すると、この７２０ｎｍのレーザ波長光も、２光子励起波長の観察用励起レーザ光として刺激用レーザ光走査手段１７を介してダイクロイックミラー１８で反射し、さらにダイクロイックミラー２９で反射して対物レンズ２２に入射し、標本２３に集光される。

多重染色標本２８からの蛍光は、先の光とは逆に、対物レンズ２２を透過し、ダイクロイックミラー２９に入射する。この場合、ダイクロイックミラー２９は、多重染色標本２８より発せられる蛍光波長の４５６ｎｍを透過し、５２０ｎｍを反射するような特性を有している。

これにより、ダイクロイックミラー２９を反射した５２０ｎｍの蛍光は、ダイクロイックミラー１８を透過し、観察用励起レーザ光走査手段１１、ダイクロイックミラー１０を透過し、共焦点レンズ１２を介して共焦点ピンホール１３面に結像される。そして、共焦点ピンホール１３を通過した蛍光は、内部蛍光検出器１４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

また、ダイクロイックミラー２９を透過した４５６ｎｍの蛍光は、外部蛍光検出器２４で検出され電気信号に変換される。電気信号は、不図示のコンピューターにより処理され、画像データとして不図示の表示装置で画像表示される。

従って、このようにしても、観察用赤外レーザユニット７から発せられる２光子励起波長の観察用励起レーザ光と刺激用レーザユニット１５から出射される２光子励起波長の観察用励起レーザ光のそれぞれの光路をダイクロイックミラー１８により合成し、これら合成された光路を介して、それぞれの観察用励起レーザ光を標本２３内に照射するようにしたので、第１の実施の形態と同様な効果を得ることができる。

また、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４による蛍光検出を切換える目的で、光路中にダイクロイックミラー２９を挿脱する場合も、ダイクロイックミラー２９の挿脱は、観察用赤外レーザユニット７および刺激用レーザユニット１５からの２光子励起波長の観察用励起レーザ光の光路を合成した後の光路上で行われるので、ダイクロイックミラー２９を光路上に出し入れしても、それぞれのレーザ光の光路の相対位置関係に変化を生じることがなく、これにより、内部蛍光検出器１４と外部蛍光検出器２４を切換えても標本内の目的とする位置に、それぞれのレーザ光を位置ずれを生じることなく正確に照射できる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

なお、上述した実施の形態には、以下の発明も含まれる。

ここで、λ１：第１レーザ光源（観察用可視、実施の形態では４８８ｎｍと６３３ｎｍ）、λ２：第２レーザ光源（２光子励起観察用、実施の形態では８２０〜１０００ｎｍ）、λ３：第３レーザ光源（２光子励起刺激用、実施の形態では７２０ｎｍ）、λf1：第１〜第３レーザ光の標本への照射により発生する蛍光の波長、とする。

（１）第１乃至第３レーザ光を発生する第１乃至第３レーザ光源と、
第１、第２レーザ光を合成する第１合成手段（ダイクロイックミラー９）と、
第１合成手段で合成された光路の光を走査する第１走査手段と、
第３レーザ光を走査する第２走査手段と、
第１走査手段からの光路と第２走査手段からの光路を合成する第２合成手段（ダイクロイックミラー１８）と、
λ１＜λ３＜λ２かつλf1＜λ３であって、
前記第２合成手段は、λ３のみを反射し、残りの波長（少なくともλ１、λf1、λ２）を透過する特性を有する。

（２）（１）記載において、第１および第２光源と第１走査手段との間で分岐された光路上に配置された共焦点ピンホールを有する第１の蛍光検出手段を備えている。

（３）（２）記載において、標本と第２合成手段との間で光路を分岐する光路分岐手段（ダイクロイックミラー２０、２５、２９）と、この分岐された光路に配置された第２の蛍光検出手段を備えている。

（４）（３）記載において、前記光路分岐手段（ダイクロイックミラー２０）は、前記標本と前記第２合成手段との間に配置され、第２レーザ光と第３レーザ光を反射し、λf1（多光子励起により発生した蛍光）を前記第２の蛍光検出手段に向けて透過する特性を有する。

（５）（３）記載において、前記光路分岐手段（ダイクロイックミラー２５）は、前記第２合成手段と前記第１走査手段の間に配置され、λf1（多光子励起により発生した蛍光）を前記第２の蛍光検出手段に向けて反射し、第２レーザ光を透過する特性を有する。

（６）（３）記載において、前記光路分岐手段（ダイクロイックミラー２９）は、前記標本と前記第２合成手段の間に配置され、第２レーザ光と第３レーザ光を反射し、第２レーザ光による多光子励起により発生した第１蛍光と第３レーザ光による多光子励起により発生した第２蛍光の一方を反射し他方を透過する特性を有する。

なお、上述した（１）〜（６）で、反射と透過を入れ替えてもよい。

本発明の第１の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの特性を示す図。第１の実施の形態に用いられる他のダイクロイックミラーの特性を示す図。本発明の第２の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。第２の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの特性を示す図。本発明の第３の実施の形態の走査型光学観察装置における走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。第３の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの特性を示す図。

符号の説明

１…観察用可視レーザユニット、２…アルゴンレーザ
３…ヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…レーザラインフィルタ
７…観察用赤外レーザユニット、８…反射ミラー
９…ダイクロイックミラー、１０…ダイクロイックミラー
１１…観察用励起レーザ光走査手段、１１ａ．１１ｂ…ミラー
１２…共焦点レンズ、１３…共焦点ピンホール
１４…内部蛍光検出器、１５…刺激用レーザユニット
１６…反射ミラー、１７…刺激用レーザ光走査手段
１７ａ．１７ｂ…ミラー、１８…ダイクロイックミラー
１９…ターレット、２０…ダイクロイックミラー
２１…反射ミラー、２２…対物レンズ
２３…標本、２４…外部蛍光検出器
２５…ダイクロイックミラー、２６…反射ミラー
２７…反射ミラー、２８…多重染色標本
２９…ダイクロイックミラー

Claims

１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
多光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
これら第１および第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の光路を合成する第１の光学素子と、
前記第１の光学素子で合成された光路の観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
多光子励起波長の刺激用レーザ光を発生する第３のレーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記第１および第２の走査手段からの光路の交差位置に配置され、これら第１および第２の走査手段からのレーザ光の光路を合成する第２の光学素子と
を具備し、
前記第１の光学素子は、前記第１のレーザ光源からの観察用レーザ光の波長と前記第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
前記第２の光学素子は、前記第１及び第２のレーザ光源からのそれぞれの観察用励起レーザ光の波長と前記第３のレーザ光源からの刺激用レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
さらに共焦点ピンホールを有する第１の蛍光検出手段を前記第１の走査手段と前記第１の光学素子との間で分岐された光路上に備え、
前記第２の光学素子は、さらに前記第１のレーザ光源の１光子励起波長または前記第２のレーザ光源の多光子励起波長のそれぞれの観察用励起レーザ光により励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第１の走査手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有し、
さらに共焦点ピンホールを有しない第２の蛍光検出手段と、
前記第２の光学素子から前記標本までの光路に挿脱可能に配置され、第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光により多光子励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有する第３の光学素子と
を具備し、
前記第３の光学素子は、前記第２及び第３のレーザ光源からのそれぞれのレーザ光の波長を前記標本へ向けて反射又は透過し、前記多光子励起された蛍光の波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて透過又は反射する波長特性であることを特徴とする走査型光学観察装置。
１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
多光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
これら第１および第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の光路を合成する第１の光学素子と、
前記第１の光学素子で合成された光路の観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
多光子励起波長の刺激用レーザ光を発生する第３のレーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記第１および第２の走査手段からの光路の交差位置に配置され、これら第１および第２の走査手段からのレーザ光の光路を合成する第２の光学素子と
を具備し、
前記第１の光学素子は、前記第１のレーザ光源からの観察用レーザ光の波長と前記第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
前記第２の光学素子は、前記第１及び第２のレーザ光源からのそれぞれの観察用励起レーザ光の波長と前記第３のレーザ光源からの刺激用レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
さらに共焦点ピンホールを有する第１の蛍光検出手段を前記第１の走査手段と前記第１の光学素子との間で分岐された光路上に備え、
前記第２の光学素子は、さらに前記第１のレーザ光源の１光子励起波長または前記第２のレーザ光源の多光子励起波長のそれぞれの観察用励起レーザ光により励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第１の走査手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有し、
さらに共焦点ピンホールを有しない第２の蛍光検出手段と、
前記第２の光学素子から前記標本までの光路に挿脱可能に配置され、第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光により多光子励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有する第３の光学素子と
を具備し、
前記標本は、前記多光子励起された蛍光として互いに波長の異なる第１蛍光と第２蛍光を発し、
前記第３の光学素子は、前記第２及び第３のレーザ光源からのそれぞれのレーザ光の波長を前記標本へ向けて反射又は透過するとともに、前記第１蛍光及び前記第２蛍光の一方の蛍光を前記第２の蛍光検出手段へ向けて透過又は反射し、他方の蛍光を前記第２の光学素子へ向けて反射又は透過する波長特性であることを特徴とする走査型光学観察装置。
前記第１、第２、第３レーザ光源からのそれぞれのレーザ光の波長をλ１、λ２、λ３とし、前記標本から発生する蛍光の波長をλｆ１とするとき、
λ１＜λ３＜λ２かつ λｆ１＜λ３であり、
前記第２の光学素子は前記λ３の波長とそれ以外の前記λ１、λ２及びλｆ１の波長の一方を反射し他方を透過する特性であることを特徴とする請求項１又は２記載の走査型光学観察装置。
１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
多光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
これら第１および第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の光路を合成する第１の光学素子と、
前記第１の光学素子で合成された光路の観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
多光子励起波長の刺激用レーザ光を発生する第３のレーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記第１および第２の走査手段からの光路の交差位置に配置され、これら第１および第２の走査手段からのレーザ光の光路を合成する第２の光学素子と
を具備し、
前記第１の光学素子は、前記第１のレーザ光源からの観察用レーザ光の波長と前記第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
前記第２の光学素子は、前記第１及び第２のレーザ光源からのそれぞれの観察用励起レーザ光の波長と前記第３のレーザ光源からの刺激用レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
さらに共焦点ピンホールを有する第１の蛍光検出手段を前記第１の走査手段と前記第１の光学素子との間で分岐された光路上に備え、
前記第２の光学素子は、さらに前記第１のレーザ光源の１光子励起波長または前記第２のレーザ光源の多光子励起波長のそれぞれの観察用励起レーザ光により励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第１の走査手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有し、
さらに共焦点ピンホールを有しない第２の蛍光検出手段と、
前記第１の走査手段から前記第２の光学素子までの光路に挿脱可能に配置され、第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光により多光子励起され前記標本より発せられる蛍光波長を前記第２の蛍光検出手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有する第３の光学素子と
を具備し、
前記第３の光学素子は、前記第２のレーザ光源からのレーザ光の波長を前記標本へ向けて反射又は透過し、前記多光子励起された蛍光の波長を前記第２の検出手段へ向けて透過又は反射する波長特性であることを特徴とする走査型光学観察装置。
前記第１、第２、第３レーザ光源からのそれぞれのレーザ光の波長をλ１、λ２、λ３とし、前記標本から発生する蛍光の波長をλｆ１とするとき、
λ１＜λ３＜λ２かつ λｆ１＜λ３であり、
前記第２の光学素子は前記λ３の波長とそれ以外の前記λ１、λ２及びλｆ１の波長の一方を反射し他方を透過する特性であることを特徴とする請求項４記載の走査型光学観察装置。
１光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第１のレーザ光源と、
多光子励起波長の観察用励起レーザ光を発生する第２のレーザ光源と、
これら第１および第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の光路を合成する第１の光学素子と、
前記第１の光学素子で合成された光路の観察用励起レーザ光を標本上で２次元走査する第１の走査手段と、
多光子励起波長の刺激用レーザ光を発生する第３のレーザ光源と、
前記刺激用レーザ光を標本上で２次元走査する第２の走査手段と、
前記第１および第２の走査手段からの光路の交差位置に配置され、これら第１および第２の走査手段からのレーザ光の光路を合成する第２の光学素子と
を具備し、
前記第１の光学素子は、前記第１のレーザ光源からの観察用レーザ光の波長と前記第２のレーザ光源からの観察用励起レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
前記第２の光学素子は、前記第１及び第２のレーザ光源からのそれぞれの観察用励起レーザ光の波長と前記第３のレーザ光源からの刺激用レーザ光の波長の一方を反射し他方を透過する波長特性であり、
前記第３のレーザ光源からの多光子励起波長の刺激用レーザ光を多光子励起波長の観察用励起レーザ光として使用可能にしたことを特徴とする走査型光学観察装置。
共焦点ピンホールを有しない蛍光検出手段と、
前記第１の走査手段から前記標本までの間の光路に配置されて前記第３の光源からのレーザ光を前記標本に照射することにより発する蛍光を前記蛍光検出手段へ向けて反射又は透過する波長特性を有する第３の光学素子と
を具備することを特徴とする請求項６記載の走査型光学観察装置。
前記第３の光学素子は、前記第１のレーザ光源からのレーザ光を標本に照射する場合には光路から退避することを特徴とする請求項１、２及び４のいずれかひとつに記載の走査型光学観察装置。
前記第１乃至第３の光学素子は、ダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１、２、４及び６のいずれかに記載の走査型光学観察装置。