WO2010095263A1 - レーザ顕微鏡 - Google Patents

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WO2010095263A1
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raman
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真一 瀧本
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オリンパス株式会社
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    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/0088—Inverse microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a laser microscope that can be suitably used in the field of cell biology, medicine, pharmacy, semiconductor inspection technology, and the like.
  • CARS microscope a coherent anti-Stokes Raman scattering microscope that can observe these molecules three-dimensionally without staining
  • CARS process coherent anti-Stokes Raman scattering light
  • CARS process coherent anti-Stokes Raman scattering process
  • the CARS microscope using the CARS process does not need to be stained even if the molecule has no fluorescence, and is more powerful with less excitation power than the natural Raman scattering microscope. A signal can be obtained.
  • CARS process corresponds to a vibration mode having a specific vibration number omega V, since it is intended to use two CARS laser beams having different wavelengths, before sample to be observed in CARS microscope It is necessary to know the natural frequency of the specimen. In order to acquire this frequency, the molecular vibration information of the sample is acquired using a Raman analyzer.
  • a specimen usually contains many molecules, and each molecule has a plurality of vibration modes. Therefore, the result of measuring the Raman scattered light is obtained as a Raman spectrum in which the Raman scattered light generated by irradiating a single wavelength laser is detected using a spectroscope or an interferometer.
  • FIG. 16 shows an example of a Raman scattering spectrum. The frequency at which the peak of the Raman scattered light intensity is obtained in this spectrum is considered to reflect the frequency information of the sample molecule.
  • the CARS spectroscopy thus obtained, from among the frequency having a peak to determine the molecular vibration frequency omega V to the object of measurement.
  • CARS microscopes that follow the above principle. For example, two CARS laser beams with different wavelengths are coaxially focused on a specimen by a microscope objective lens, and the specimen is scanned to minimize the spot size of the focal point on the specimen and improve the spatial resolution.
  • a CARS microscope designed to achieve the above for example, see Patent Document 1.
  • the light emitted from one laser light source is divided into two, and one of the divided lights is wavelength-converted by an optical parametric amplifier, and is superposed on the light that has not been wavelength-converted so as to be a single beam CARS laser.
  • an optical parametric amplifier for example, a technology for making light
  • a CARS microscope that uses a single-wavelength pulse laser beam to make a broadband by using a microstructure optical element, and selects two wavelengths from the band to make a CARS laser beam.
  • An object of the present invention made by paying attention to these points is that it is possible to selectively perform Raman scattered light detection and CARS light observation without moving the specimen to be observed, and without complicated operations.
  • An object of the present invention is to provide a laser microscope capable of efficiently selecting a vibration frequency for CARS light observation.
  • a laser irradiation optical system capable of coaxially irradiating a specimen with a CARS laser beam and a Raman scattering laser beam; CARS light detection means for detecting CARS light generated from the specimen by irradiation with the CARS laser light; Raman scattered light detection means for detecting Raman scattered light generated from the specimen by irradiation of the Raman scattering laser light; It is characterized by having.
  • the invention according to the second aspect is the laser microscope according to the first aspect,
  • the CARS light detection means and the Raman scattered light detection means are arranged on the transmission side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen.
  • the invention according to a third aspect is the laser microscope according to the second aspect, A dichroic mirror that separates the CARS light and the Raman scattered light, guides the CARS light to the CARS light detection means, and guides the Raman scattered light to the Raman scattered light detection means is disposed on the transmission side of the specimen. It is characterized by that.
  • the invention according to a fourth aspect is the laser microscope according to the first aspect,
  • the CARS light detection means is disposed on the reflection side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen,
  • the Raman scattered light detection means is arranged on the transmission side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen.
  • the invention according to a fifth aspect is the laser microscope according to the fourth aspect,
  • the CARS laser light, the Raman scattering laser light, and the CARS light are separated on the reflection side of the specimen, the CARS laser light and the Raman scattering laser light are guided to the specimen, and the CARS A dichroic mirror for guiding light to the CARS light detecting means is arranged.
  • the invention according to a sixth aspect is the laser microscope according to the first aspect,
  • the CARS light detection means is disposed on the transmission side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen,
  • the Raman scattered light detection means is arranged on the reflection side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen.
  • the invention according to a seventh aspect is the laser microscope according to the sixth aspect, Separating the CARS laser light, the Raman scattering laser light, and the Raman scattered light on the reflection side of the specimen, guiding the CARS laser light and the Raman scattering laser light to the specimen, A dichroic mirror that guides the Raman scattered light to the Raman scattered light detecting means is arranged.
  • the invention according to an eighth aspect is the laser microscope according to the first aspect,
  • the CARS light detection means and the Raman scattered light detection means are arranged on the reflection side of incident light from the laser irradiation optical system with respect to the specimen.
  • the invention according to a ninth aspect is the laser microscope according to the eighth aspect, A dichroic mirror that separates the CARS light and the Raman scattered light, guides the CARS light to the CARS light detection means, and guides the Raman scattered light to the Raman scattered light detection means is disposed on the reflection side of the specimen. It is characterized by that.
  • the invention according to a tenth aspect is the laser microscope according to any one of the first aspect to the ninth aspect,
  • the CARS light detection means has a band-pass filter that extracts only the CARS light.
  • the invention according to an eleventh aspect is the laser microscope according to any one of the first aspect to the tenth aspect,
  • the Raman scattered light detection means includes a bandpass filter that extracts only the Raman scattered light.
  • the invention according to a twelfth aspect is the laser microscope according to any one of the first aspect to the eleventh aspect,
  • the Raman scattered light detection means includes a spectroscope that detects a spectrum of the Raman scattered light.
  • the invention according to a thirteenth aspect is the laser microscope according to any one of the first aspect to the twelfth aspect, Switching means for switching between the CARS laser light and the Raman scattering laser light incident on the laser light irradiation optical system; Control means for controlling switching by the switching means.
  • the laser irradiation optical system irradiates the sample with the CARS laser beam and the Raman scattering laser beam on the same axis, detects the CARS light with the CARS light detecting means, and converts the Raman scattered light into the Raman scattered light. Since detection is performed by the detection means, it is possible to selectively perform the Raman scattered light observation and the CARS light observation without moving the specimen to be observed, and for the CARS light observation without requiring a complicated operation.
  • the vibration frequency can be selected efficiently.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a laser microscope according to the first embodiment of the present invention.
  • This laser microscope includes a CARS laser light source unit 1 and a Raman scattering laser light source unit 2.
  • the CARS laser light source unit 1 includes a first pulse laser light source 1a and a second pulse laser light source 1b having different wavelengths, and the laser light from the first pulse laser light source is half mirror 1c.
  • the laser light from the second pulse laser light source is reflected by the reflection mirror 1d, then reflected by the half mirror 1c, and synthesized coaxially with the laser light from the first pulse laser light source. Let it emit. Accordingly, the CARS laser light source unit 1 emits the CARS laser light having two wavelengths.
  • a laser having a fixed wavelength is used as the first pulse laser light source 1a, and a titanium sapphire laser whose wavelength can be adjusted according to the molecular frequency ⁇ V of the specimen to be observed as the second pulse laser light source 1b.
  • a laser or the like is used.
  • the Raman scattering laser light source unit 2 includes a Raman scattering laser light source 2a that emits a single wavelength CW (continuous oscillation) laser beam as shown in FIG. Light is emitted.
  • CW continuous oscillation
  • the CARS laser light emitted from the CARS laser light source 1 is transmitted through the half mirror 3, then reflected by the reflection mirror 4, and further has two-dimensional scanning mirrors 5a and 5b.
  • a lens 6 is used to focus light onto a light-collecting position on the sample surface 7 via a galvano scanner 5. In particular, when the swing angle of the mirrors 5 a and 5 b is 0 degree, the condensing position coincides with the focal position 8 of the lens 6.
  • the Raman scattering laser light emitted from the Raman scattering laser light source unit 2 is reflected by the reflection mirror 9, then reflected by the half mirror 3, and synthesized coaxially with the CARS laser light.
  • the center beam of the CARS laser beam and the center beam of the Raman scattering laser beam are made to coincide with the optical axis, and the lens 6 passes through the reflection mirror 4 and the galvano scanner 5 and is focused on the focusing position on the sample surface 7.
  • the laser irradiation optical system is configured including the half mirror 3, the reflection mirror 4, the galvano scanner 5, and the lens 6.
  • the CARS light and the Raman scattered light are each detected in a transmission type. Therefore, the lens 10, the dichroic mirror 11, the CARS light detection means 12, and the Raman scattered light detection means 13 for separating the CARS light and the Raman scattered light are arranged on the transmission side of the incident light with respect to the specimen.
  • the CARS light generated from the condensing position is separated by the dichroic mirror 11 through the lens 10 and guided to the CARS light detecting means 12, and the Raman scattered light generated from the condensing position on the sample surface 7 is transmitted through the lens 10 to the dichroic mirror. 11 is separated and guided to the Raman scattered light detection means 13.
  • the CARS light detection means 12 includes a band-pass filter 14 and a detector 15, and is configured to detect the CARS light separated by the dichroic mirror 11 with the detector 15 via the band-pass filter 14.
  • the Raman scattered light detection means 13 includes a bandpass filter 16 and a spectroscope 17 and is configured to detect the Raman scattered light separated by the dichroic mirror 11 by the spectroscope 17 via the bandpass filter 16.
  • the wavelength characteristics of the dichroic mirror 11, the bandpass filter 14, and the bandpass filter 16 will be described with reference to FIG.
  • the Raman scattering laser light is a monochromatic laser light having the shortest wavelength among the laser lights emitted from the laser light sources 1a, 1b, and 2a for scattering excitation.
  • the object of observation in this embodiment is Stokes light that appears on the longer wavelength side than the wavelength of the Raman scattering laser light.
  • the spectral distribution is broadened based on the sample frequency.
  • the first pulse laser light source 1a of the CARS laser light source unit 1 is a wavelength-fixed laser light source
  • the second pulse laser light source 1b corresponds to the frequency ⁇ V of the observation target.
  • This is a tunable laser whose wavelength can be adjusted.
  • the wavelength of the first pulse laser light source 1a, the wavelength of the second pulse laser light source 1b, and the wavelength of the CARS light satisfy the above-described equation (1), and the CARS light is shorter than the wavelength of the first pulse laser light source 1a. Appear in
  • the dichroic mirror 11 is configured to have a wavelength characteristic that transmits the CARS light and the CARS laser light and reflects the Raman scattered light and the Raman scattering laser light.
  • the bandpass filter 14 transmits only CARS light
  • the bandpass filter 16 has a wavelength characteristic that transmits only Raman scattered light as shown in FIG. 4C. And configure.
  • a Raman spectrum for obtaining molecular vibration information of the specimen is detected prior to CARS light observation of a specimen.
  • the Raman scattering laser light source unit 2 is operated to emit the Raman scattering laser light.
  • the light After passing through the reflection mirror 9, the half mirror 3, the reflection mirror 4, and the galvano scanner 5, the light is condensed at the condensing position on the sample surface 7 by the lens 6. In the detection of the Raman spectrum, scanning by the galvano scanner 5 is not performed.
  • the Raman scattered light scattered from the specimen by the irradiation of the Raman scattering laser light is incident on the bandpass filter 16 through the lens 10 and the dichroic mirror 11, and here, a noise component including the Raman scattering laser light transmitted through the specimen. Then, only the Raman scattered light component is made incident on the spectroscope 17, and a Raman spectrum as shown in FIG. 16 is detected.
  • the CARS laser light is condensed on the sample surface 7 by the lens 6 through the half mirror 3, the reflection mirror 4 and the galvano scanner 5, and the condensing position is two-dimensionally scanned on the sample surface 7 by the galvano scanner 5. To do.
  • the CARS light scattered from the specimen by the irradiation of the CARS laser light is incident on the bandpass filter 14 through the lens 10 and the dichroic mirror 11, where noise components including the CARS laser light transmitted through the specimen are removed. Thus, only the CARS light component is incident on the detector 15 and detected.
  • the CARS microscope includes a computer (not shown) that forms an image by performing arithmetic processing on the signal of the CARS light obtained by the detector 15.
  • the specimen surface 7 is scanned by the galvano scanner 5, and the condensing position corresponding to each pulse oscillation is calculated and processed on this computer as a pixel.
  • a three-dimensional microscopic image can be constructed by displacing the condensing position of the CARS laser light with respect to the specimen in the optical axis direction to obtain surface images having different depths.
  • the CARS microscope observation and the Raman scattered light observation are the same. This can be done selectively without moving the sample on the apparatus. Therefore, it is possible to efficiently select the frequency ⁇ V from the molecular vibrations observed by Raman scattering obtained from the sample position where CARS microscope observation is performed, and perform CARS light observation. Furthermore, in the present embodiment, since CARS light is detected in a transmission type, especially when the molecule (molecular group) in the specimen is larger than the wavelength order of the CARS laser light, the CARS light itself. Because of the interference effect, CARS light is radiated strongly only forward in the laser light irradiation direction, so that CARS light can be effectively observed.
  • FIG. 5 is a diagram showing a schematic configuration of a laser microscope according to the second embodiment of the present invention.
  • CARS light detection means 12 is arranged on the reflection side in the first embodiment to detect CARS light in an epi-illumination type.
  • the dichroic mirror 11 of the first embodiment is removed, and the dichroic mirror 18 is disposed in place of the reflection mirror 4, and the light scattered in the reflection direction from the condensing position of the sample surface 7 is reflected.
  • the lens 6, the galvano scanner 5 and the dichroic mirror 18 are made incident on the CARS light detection means 12. Further, the light scattered in the transmission direction from the condensing position on the sample surface 7 is configured to enter the Raman scattered light detection means 13 through the lens 10.
  • the bandpass filters 14 and 16 have the same wavelength characteristics as the bandpass filters in the first embodiment.
  • the dichroic mirror 18 is configured to have a wavelength characteristic that transmits at least CARS light and reflects CARS laser light and Raman scattering laser light. Since other configurations are the same as those of the first embodiment, the same components are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
  • the sample is irradiated with Raman scattering laser light in the same manner as in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is changed to the dichroic mirror 18.
  • the Raman scattered light can be detected by the same operation as in the first embodiment except that the dichroic mirror 11 is not present on the optical path of the scattered light.
  • the CARS laser light is condensed on the sample surface 7 by the lens 6 through the same optical path as that in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is replaced with the dichroic mirror 18 and the first implementation.
  • the light collection position is two-dimensionally scanned on the specimen surface 7 by the galvano scanner 5.
  • the CARS light scattered in the reflection direction from the specimen when irradiated with the CARS laser light is incident on the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5, where the CARS laser light reflected on the specimen surface 7 is separated. To do. Further, the light transmitted through the dichroic mirror 18 is incident on the bandpass filter 14 of the CARS light detection means 12, where noise components are removed and only the CARS light component is incident on the detector 15 for detection.
  • two-dimensional and three-dimensional CARS microscope images of the specimen can be obtained by a computer (not shown) by the same method as in the first embodiment.
  • the incident optical path of the CARS laser light to the specimen and the incident optical path of the Raman scattering laser light are coaxial, so that the CARS microscope observation is performed.
  • Raman scattered light observation can be selectively performed on the same apparatus without moving the sample. Therefore, as in the first embodiment, the frequency ⁇ V can be efficiently selected from the molecular vibrations observed by Raman scattering obtained from the sample position where CARS microscope observation is to be performed, and CARS light observation can be performed. It becomes possible.
  • the incident light type CARS light is detected, and therefore, in particular, when the molecule (molecular group) in the sample is smaller than the wavelength order of the CARS laser light, it is in front of the sample.
  • CARS light can be observed more effectively than transmissive CARS light detection means that generates a larger noise component (non-resonant background) together with CARS light.
  • the size of the molecule (molecular group) in the specimen is larger than the order of CARS light excitation wavelength, and CARS observation is performed on a sample (such as a living tissue) having a poor wavelength transmittance. Also effective.
  • FIG. 7 is a diagram showing a schematic configuration of a laser microscope according to the third embodiment of the present invention.
  • the Raman scattered light detection means 13 is arranged on the reflection side in the first embodiment so that the Raman scattered light is detected by the epi-illumination type.
  • the dichroic mirror 11 of the first embodiment is removed, and a dichroic mirror 18 is disposed in place of the reflection mirror 4, and light scattered in the transmission direction from the light collection position of the sample surface 7 is transmitted.
  • the lens 10 is configured to be incident on the CARS light detection means 12. Further, the light scattered in the reflection direction from the light collection position on the sample surface 7 is made incident on the Raman scattered light detection means 13 through the lens 6, the galvano scanner 5, and the dichroic mirror 18.
  • the bandpass filters 14 and 16 have the same wavelength characteristics as the bandpass filters in the first embodiment.
  • the dichroic mirror 18 has a wavelength characteristic that transmits at least Raman scattered light and reflects the CARS laser light and the Raman scattering laser light. Since other configurations are the same as those of the first embodiment, the same components are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
  • the sample is irradiated with Raman scattering laser light in the same manner as in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is changed to the dichroic mirror 18.
  • the Raman scattered light scattered from the specimen by the irradiation of the Raman scattering laser light is incident on the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5, and the Raman scattering laser reflected on the specimen surface 7 here. Separate the light. Further, the light transmitted through the dichroic mirror 18 is incident on the bandpass filter 16 of the Raman scattered light detection means 13, where the noise component is removed and only the Raman scattered light component is incident on the spectroscope 17 for detection.
  • the CARS laser light is condensed on the sample surface 7 by the lens 6 through the same optical path as that in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is replaced with the dichroic mirror 18, and the first implementation.
  • the light collection position is two-dimensionally scanned on the specimen surface 7 by the galvano scanner 5.
  • CARS light can be detected by the same operation as in the first embodiment, except that the dichroic mirror 11 is not on the scattered light path.
  • two-dimensional and three-dimensional CARS microscope images of the specimen can be obtained by a computer (not shown) by the same method as in the first embodiment.
  • the optical axis of the Raman scattered light incident on the spectroscope 17 for Raman scattering observation is not blurred. It is also possible to perform CARS microscope observation at the same time.
  • the CARS laser light source unit 1 and the Raman scattering laser light source unit 2 are simultaneously operated to emit the CARS laser light and the Raman scattering laser light at the same time.
  • Each of these laser beams passes through the same optical path as the above-described single irradiation optical path, and is simultaneously condensed and irradiated to the condensing position on the sample surface 7 coaxially.
  • the scattered light scattered on the reflection side of the sample surface 7 enters the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5.
  • the CARS laser light and the Raman scattering laser light reflected by the sample surface 7 are separated, and only the CARS light and the Raman scattered light are transmitted.
  • the light transmitted through the dichroic mirror 18 is incident on the bandpass filter 16, noise components including CARS light are removed, and only the Raman scattered light component is incident on the spectroscope 17, thereby detecting the Raman spectrum. Is obtained.
  • the spectroscope 17 is arranged on the back side of the galvano scanner 5 when viewed from the sample surface 7, the laser light for Raman scattering is sampled by the galvo scanner 5. Even when scanning is performed on the surface 7, it is possible to place the optical axis of Raman scattered light incident on the spectroscope 17 at a position (descan position) that keeps the optical axis constant. Therefore, the spectral characteristics of the spectroscope 17 are not deteriorated due to the deviation of the optical axis.
  • the incident optical path of the CARS laser light to the sample and the incident optical path of the Raman scattering laser light are coaxial.
  • CARS microscope observation and Raman scattered light observation can be selectively performed on the same apparatus without moving the sample. Therefore, as in the first and second embodiments, the frequency ⁇ V is efficiently selected from the molecular vibrations observed by Raman scattering obtained from the sample position where CARS microscope observation is performed, and CARS light observation is performed. It becomes possible to do.
  • the first implementation is performed particularly when the molecule (molecular group) in the specimen is larger than the wavelength order of the CARS laser light.
  • CARS light can be effectively observed.
  • the spectrum of the Raman scattered light can be detected while scanning the sample with the CARS laser light, it is possible to quickly cope with a change in the molecular vibration frequency of the specimen during CARS light observation.
  • FIG. 8 is a diagram showing a schematic configuration of a laser microscope according to the fourth embodiment of the present invention.
  • the CARS light detection means 12 and the Raman scattered light detection means 13 are arranged on the reflection side in the first embodiment to detect the CARS light and the Raman scattered light in an epi-illumination type. .
  • the dichroic mirror 11 and the lens 10 of the first embodiment are removed, and the dichroic mirror 18 is disposed in place of the reflection mirror 4 to scatter in the reflection direction from the light collection position on the sample surface 7.
  • Is incident on the dichroic mirror 19 via the lens 6, the galvano scanner 5 and the dichroic mirror 18, and the dichroic mirror 19 separates the CARS light component and the Raman scattered light component, and the CARS light component is detected by CARS light.
  • the light is incident on the means 12 and the Raman scattered light component is incident on the Raman scattered light detection means 13.
  • the CARS light detection means 12 causes the incident CARS light component to enter the detector 15 via the bandpass filter 14, and the Raman scattered light detection means 13 causes the Raman scattered light component to pass through the bandpass filter 16. It is configured so as to be incident on the spectroscope 17 via.
  • the bandpass filters 14 and 16 have the same wavelength characteristics as the bandpass filter in the first embodiment, and the dichroic mirror 18 transmits CARS light and Raman scattered light as shown in FIG. And having wavelength characteristics for reflecting the CARS laser beam and the Raman scattering laser beam. Further, the dichroic mirror 19 has a wavelength characteristic that reflects the CARS light and the CARS laser light and transmits the Raman scattered light and the Raman scattering laser light as shown in FIG. Since other configurations are the same as those of the first embodiment, the same components are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
  • the sample is irradiated with Raman scattering laser light in the same manner as in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is changed to the dichroic mirror 18.
  • the Raman scattered light scattered from the specimen by the irradiation of the Raman scattering laser light is incident on the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5, and the Raman scattering laser reflected on the specimen surface 7 here. Separate the light.
  • the light transmitted through the dichroic mirror 18 passes through the dichroic mirror 19 and enters the bandpass filter 16 of the Raman scattered light detection means 13, where noise components are removed and only the Raman scattered light component is input to the spectrometer 17. Detect by entering.
  • the CARS laser light is condensed on the sample surface 7 by the lens 6 through the same optical path as that in the first embodiment except that the reflection mirror 4 is replaced with the dichroic mirror 18 and the first implementation.
  • the condensing position is two-dimensionally scanned on the specimen surface 7 by the galvano scanner 5.
  • the CARS light scattered in the reflection direction from the specimen when irradiated with the CARS laser light is incident on the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5, where the CARS laser light reflected on the specimen surface 7 is separated. To do. Further, the light transmitted through the dichroic mirror 18 passes through the dichroic mirror 19 and enters the bandpass filter 14 of the CARS light detection means 12, where noise components are removed and only the CARS light component is incident on the detector 15. To detect.
  • two-dimensional and three-dimensional CARS microscope images of the specimen can be obtained by a computer (not shown) by the same method as in the first embodiment.
  • the present embodiment it is possible to perform Raman scattered light observation and CARS light observation at the same time as in the third embodiment. Also in this case, similarly to the third embodiment, the CARS laser light source unit 1 and the Raman scattering laser light source unit 2 are simultaneously operated, and are simultaneously concentrically focused at the condensing position on the sample surface 7. Irradiate.
  • Scattered light scattered on the reflection side of the sample surface 7 enters the dichroic mirror 18 through the lens 6 and the galvano scanner 5.
  • the CARS laser light and the Raman scattering laser light reflected by the sample surface 7 are separated, and only the CARS light and the Raman scattered light are transmitted.
  • the light transmitted through the dichroic mirror 18 enters the dichroic mirror 19 and is separated into a CARS light component and a Raman scattered light component.
  • the CARS light component is incident on the bandpass filter 14, and the noise component is removed and incident on the detector 15 to be detected.
  • the Raman scattered light component is incident on the bandpass filter 16 and the noise component including the CARS light is removed, and only the Raman scattered light component is incident on the spectroscope 17 to detect the Raman spectrum.
  • the spectrometer 17 is arranged on the back side of the galvano scanner 5 when viewed from the sample surface 7, so that the spectrometer 17 due to the deviation of the optical axis is used.
  • CARS microscope observation by detection of CARS light and Raman spectrum observation can be performed simultaneously without causing deterioration of spectral characteristics.
  • the incident optical path of the CARS laser light to the sample and the incident optical path of the Raman scattering laser light are coaxially arranged. Therefore, CARS microscope observation and Raman scattered light observation can be selectively performed on the same apparatus without moving the sample. Therefore, similarly to the first and second embodiments, the frequency ⁇ V is efficiently selected from the molecular vibrations observed by Raman scattering obtained from the sample position where CARS microscope observation is performed, and CARS light observation is performed. It becomes possible to do. Further, in the present embodiment, the incident light type CARS light is detected, so that the second embodiment is implemented particularly when the molecule (molecular group) in the sample is smaller than the wavelength order of the CARS laser light.
  • CARS light can be observed more effectively than the transmission type CARS light detecting means.
  • the size of molecules (molecular groups) in a specimen is larger than the order of CARS light excitation wavelength, and CARS observation is performed on a sample (such as a biological tissue) having a poor wavelength transmittance. Also effective.
  • the spectrum of the Raman scattered light can be detected while scanning the sample with the CARS laser light, it is possible to quickly cope with the change of the molecular vibration frequency of the specimen during the CARS light observation.
  • FIG. 12 is a diagram showing a schematic configuration of a laser microscope according to the fifth embodiment of the present invention.
  • the present embodiment is configured so that the CARS laser light and the Raman scattering laser light are switched and made incident on the sample in the third embodiment, and the CARS laser light and the Raman scattering laser light are switched.
  • the detection of the CARS light by the detector 15 and the detection of the Raman scattered light by the spectroscope 17 are controlled in synchronization with the switching.
  • the control unit 22 alternately switches the laser switching units 20 and 21 so that the CARS laser beam and the Raman scattering laser beam are alternately emitted without overlapping in time.
  • Each of these laser beams passes through the optical path described in the third embodiment, and is condensed on the sample surface 7 by the lens 6, and the condensing position is two-dimensionally scanned on the sample surface 7 by the galvano scanner 5.
  • the CARS laser light When the CARS laser light is emitted, the CARS light scattered on the transmission side of the sample surface 7 is incident on the detector 15 and detected in the same manner as in the third embodiment.
  • the scattered light scattered on the reflection side enters the spectroscope 17 through the lens 6, the galvano scanner 5, the dichroic mirror 18, and the bandpass filter 16. In this state, the spectroscope 17 is stopped by the control means 22. Since it is in a state, CARS light is not detected.
  • the Raman scattered light scattered on the transmission side of the sample surface 7 is incident on the detector 15 through the lens 10 and the bandpass filter 14. Since the detection means is stopped by the control means 22, no Raman scattered light is detected. On the other hand, the Raman scattered light scattered on the reflection side enters the spectroscope 17 through the lens 6, the galvano scanner 5, the dichroic mirror 18, and the band pass filter 16 and is detected.
  • CARS light detection and Raman scattered light detection are temporally separated by such an operation method even when there is an overlap in the wavelengths of Raman scattered light and CARS light to be observed. This is advantageous in that CARS microscope observation and Raman scattering observation can be performed without affecting each other.
  • the present invention is not limited to the above embodiment, and many variations or modifications are possible.
  • the CARS laser light source unit is not limited to the case of using two lasers, and two laser beams having different wavelengths are obtained by converting the wavelength of one of the beams separated by a beam splitter or the like using one laser as a light source. It is also possible to obtain a laser beam.

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Abstract

　レーザ照射光学系３，４，５，６により、ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを同軸で標本に照射して、ＣＡＲＳ光をＣＡＲＳ光検出手段１２で検出し、ラマン散乱光をラマン散乱光検出手段１３で検出するようにする。これにより、観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光検出およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択できる。

Description

レーザ顕微鏡
　本発明は、細胞生物学の分野をはじめとし、医学、薬学、半導体の検査技術等に好適に利用可能なレーザ顕微鏡に関するものである。
　近年、タンパク質やＤＮＡ等の生体分子の機能解明をするための研究等に利用可能な顕微鏡として、これらの分子を非染色で３次元的に観察することが可能な、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（以下、ＣＡＲＳ顕微鏡と呼ぶ）が知られている。
　この顕微鏡は、３次の非線形光学過程の１つであるコヒーレントアンチストークスラマン散乱過程（以下、ＣＡＲＳ過程と呼ぶ）により発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（以下、適宜、ＣＡＲＳ光とも呼ぶ）を計測するものである。以下に、図１４に示したＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムを用いて、ＣＡＲＳ光の発生原理を説明する。
　観察対象である標本内の分子が振動数ωＶの振動モードを有するものとする。ここに、振動数ω１の第１パルスレーザ光と、振動数ω２の第２パルスレーザ光とが入射すると、これら２つの入射光が有する振動数の差ω１－ω２が、標本の振動数ωＶと一致したときに、基底状態にある分子の多数が振動数ωＶで共鳴振動を起こして励起状態となる。そして、振動数ω１の第１パルスレーザ光の一部が、この分子の固有振動数ωＶのドップラー変調を受けて、ωＡＳのＣＡＲＳ光が発生する。ここで、上記の各振動数の間には、次の関係が成立する。
ωＡＳ＝ω１＋ωＶ＝２ω１－ω２　・・・（１）
　このＣＡＲＳ過程を利用するＣＡＲＳ顕微鏡は、蛍光性を有さない分子であっても標本に悪影響を与える染色をする必要が無く、また、自然ラマン散乱顕微鏡と比較するとより少ない励起パワーでより強力な信号を得ることができる。
　上記のように、ＣＡＲＳ過程は、特定の振動数ωＶを有する振動モードに対応する、波長の異なる２つのＣＡＲＳ用レーザ光を用いるものであるから、ＣＡＲＳ顕微鏡で標本の観察を行う前には、標本に固有の振動数を知ることが必要となる。この振動数を取得するには、ラマン分析装置を用いて、標本の分子振動情報を取得することが行われている。
　図１５に示したラマン散乱過程のエネルギーダイアグラムを用いて、この分子振動数を取得する方法を説明する。標本にω０のラマン散乱用レーザ光を照射すると、標本を構成する分子とラマン散乱用レーザ光との間にエネルギーの授受が生じる。このため、ω０－ωＶの成分を有するラマン散乱光が発生する。よって、入射光と散乱光との周波数の差から分子振動数を得ることができる。
　通常は標本には多くの分子が含まれ、それぞれの分子が複数の振動モードを有する。したがって、ラマン散乱光を計測した結果は、単一波長のレーザを照射して発生するラマン散乱光を分光器もしくは干渉計を用いて検出する、ラマンスペクトルとして得られる。図１６にラマン散乱スペクトルの例を示す。このスペクトルでラマン散乱光強度のピークが得られる振動数は、標本分子の振動数情報を反映していると考えられる。ＣＡＲＳ光分析では、このようにして得られた、ピークを有する振動数の中から、計測の対象とする分子振動数ωＶを決定する。
　以上のような原理に従ったＣＡＲＳ顕微鏡としては、既にいくつかの開発事例がある。たとえば、波長の異なる２つのＣＡＲＳ用レーザ光を同軸にして顕微鏡対物レンズにより標本上に集光させて、標本を走査することで、標本上における焦点のスポット寸法を最小化して、空間解像度の向上を図るようにしたＣＡＲＳ顕微鏡が知られている（たとえば、特許文献１参照）。
　また、１つのレーザ光源から発せられる光を２分割し、その分割された光の一方を光パラメトリック増幅器により波長変換をするとともに、波長変換されていない光と重ね合わせて単一ビームのＣＡＲＳ用レーザ光とする技術や（たとえば、特許文献２参照）、１波長のパルスレーザ光を、マイクロストラクチャー光学素子により広帯域化し、その帯域内から２波長を選択してＣＡＲＳ用レーザ光とするＣＡＲＳ顕微鏡が知られている（たとえば特許文献３参照）。
　このように、ＣＡＲＳ顕微鏡においては、２波長のレーザ光を同軸上に重ね合わせて、顕微鏡対物レンズにより標本上に集光させている。
特表２００２－５２０６１２号公報 特開２００２－１０７３０１号公報 米国特許第７０９２０８６号明細書
　しかしながら、前述のように、ＣＡＲＳ顕微鏡で標本の観察をするためには、標本の分子振動情報をあらかじめ知る必要がある。このため、公知のＣＡＲＳ顕微鏡法では、標本の分子振動情報を得るために、別途用意されたラマン分析装置を用いてラマン散乱光の観察を行っている。この方法では、分子情報を得るためのラマン散乱光の観測とＣＡＲＳ光の観察との間で異なる装置を用い、標本を載せ換えることが必要となる。その結果、１つの標本上の同一観察場所について分子振動情報の取得およびＣＡＲＳ光の観察の両方を行うことは極めて困難であり、標本上の観察場所に応じて高いＣＡＲＳ光が得られる振動数を効率的に選択することが難しかった。適切な振動数の選択ができないと、強いＣＡＲＳ光を計測することができず、十分なコントラストを有する顕微鏡画像が得られない。このため、再度ラマン散乱光の観測を行って振動情報を得る必要が生じ、作業が煩雑で非効率であった。
　したがって、これらの点に着目してなされた本発明の目的は、観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光検出およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択できるレーザ顕微鏡を提供することにある。
　上記目的を達成する第１の観点に係るレーザ顕微鏡の発明は、
　ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを同軸で標本に照射可能なレーザ照射光学系と、
　前記ＣＡＲＳ用レーザ光の照射により前記標本から発生するＣＡＲＳ光を検出するＣＡＲＳ光検出手段と、
　前記ラマン散乱用レーザ光の照射により前記標本から発生するラマン散乱光を検出するラマン散乱光検出手段と、
　を有することを特徴とするものである。
　第２の観点に係る発明は、第１の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ＣＡＲＳ光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とするものである。
　第３の観点に係る発明は、第２の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記標本の透過側に、前記ＣＡＲＳ光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
　第４の観点に係る発明は、第１の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ＣＡＲＳ光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置し、
　前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とするものである。
　第５の観点に係る発明は、第４の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光と、前記ＣＡＲＳ光とを分離して、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光を前記標本に導き、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
　第６の観点に係る発明は、第１の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ＣＡＲＳ光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置し、
　前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とするものである。
　第７の観点に係る発明は、第６の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光と、前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光を前記標本に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
　第８の観点に係る発明は、第１の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ＣＡＲＳ光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とするものである。
　第９の観点に係る発明は、第８の観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とするものである。
　第１０の観点に係る発明は、第１の観点～第９の観点のいずれか一つの観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ＣＡＲＳ光検出手段は、前記ＣＡＲＳ光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とするものである。
　第１１の観点に係る発明は、第１の観点～第１０の観点のいずれか一つの観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とするものである。
　第１２の観点に係る発明は、第１の観点～第１１の観点のいずれか一つの観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のスペクトルを検出する分光器を有することを特徴とするものである。
　第１３の観点に係る発明は、第１の観点～第１２の観点のいずれか一つの観点に係るレーザ顕微鏡において、
　前記レーザ光照射光学系に入射する前記ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを切り替える切替手段と、
該切替手段による切り替えを制御する制御手段とを備えることを特徴とするものである。
　本発明によれば、レーザ照射光学系により、ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを同軸で標本に照射して、ＣＡＲＳ光をＣＡＲＳ光検出手段で検出し、ラマン散乱光をラマン散乱光検出手段で検出するようにしたので、観察対象の標本を動かすことなく、ラマン散乱光観察およびＣＡＲＳ光観察を選択的に行うことができ、煩雑な作業を要することなく、ＣＡＲＳ光観察のための振動周波数を効率的に選択することができる。
本発明の第１実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 図１に示すＣＡＲＳ用レーザ光光源部の概略構成図である。 図１に示すラマン散乱用レーザ光光源部の概略構成図である。 図１に示すダイクロイックミラーおよびバンドパスフィルタの波長特性を説明する模式図である。 本発明の第２実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 図５に示すダイクロイックミラーの波長特性を説明する模式図である。 本発明の第３実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第４実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 図８に示すダイクロイックミラーの波長特性を説明する模式図である。 本発明の第５実施の形態におけるラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長の重なりを説明する模式図である。 本発明の第５実施の形態に用いられるバンドパスフィルタの波長特性を説明する模式図である。 本発明の第５実施の形態に係るレーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 図５に示すレーザ切替手段、検出器および分光器の切り替え動作を示すタイムチャートである。 ＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムである。 ラマン散乱過程のエネルギーダイアグラムである。 ラマン散乱スペクトルの例を示すグラフである。
符号の説明
　１　ＣＡＲＳ用レーザ光光源部
　１ａ　第１パルスレーザ光源
　１ｂ　第２パルスレーザ光源
　１ｃ　ハーフミラー
　１ｄ　ミラー
　２　ラマン散乱用レーザ光光源部
　２ａ　ラマン散乱用レーザ光源
　３　ハーフミラー
　４　ミラー
　５　ガルバノスキャナ
　５ａ　ミラー
　５ｂ　ミラー
　６　レンズ
　７　標本面
　８　焦点位置
　９　ミラー
　１０　レンズ
　１１　ダイクロイックミラー
　１２　ＣＡＲＳ光検出手段
　１３　ラマン散乱光検出手段
　１４　バンドパスフィルタ
　１５　検出器（ディテクタ）
　１６　バンドパスフィルタ
　１７　分光器
　１８　ダイクロイックミラー
　１９　ダイクロイックミラー
　２０　レーザ切替手段
　２１　レーザ切替手段
　２２　制御手段
　以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
　[第１実施の形態]
　図１は、本発明の第１実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。このレーザ顕微鏡は、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１とラマン散乱用レーザ光光源部２とを備えている。ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１は、図２に示すように、波長の異なる第１パルスレーザ光源１ａと第２パルスレーザ光源１ｂとを有し、第１パルスレーザ光源からのレーザ光をハーフミラー１ｃを透過させて出射させ、第２パルスレーザ光源からのレーザ光は、反射ミラー１ｄで反射させた後、ハーフミラー１ｃで反射させて、第１パルスレーザ光源からのレーザ光と同軸に合成して出射させる。これにより、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１から、２波長からなるＣＡＲＳ用レーザ光を出射させる。本実施の形態では、第１パルスレーザ光源１ａとして波長固定のレーザを使用し、第２パルスレーザ光源１ｂとして観察対象の標本の分子振動数ωＶに応じて波長を調整可能なチタンサファイアレーザ等のレーザ等を使用するものとする。
　また、ラマン散乱用レーザ光光源部２は、図３に示すように単一波長のＣＷ（連続発振）レーザ光を射出するラマン散乱用レーザ光源２ａを有して構成して、ラマン散乱用レーザ光を出射させるようにする。
　図１において、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１から出射されるＣＡＲＳ用レーザ光は、ハーフミラー３を透過させた後、反射ミラー４で反射させ、さらに、２次元走査用のミラー５ａ，５ｂを有するガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させるように構成する。とくに、ミラー５ａ，５ｂの振り角が０度のときは、この集光位置はレンズ６の焦点位置８と一致する。
　また、ラマン散乱用レーザ光光源部２から出射されるラマン散乱用レーザ光は、反射ミラー９で反射させた後、ハーフミラー３で反射させて、ＣＡＲＳ用レーザ光と同軸に合成して、すなわち、ＣＡＲＳ用レーザ光の中心光線とラマン散乱用レーザ光の中心光線とを光軸に一致させて、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させるように構成する。したがって、本実施の形態では、ハーフミラー３、反射ミラー４、ガルバノスキャナ５およびレンズ６を含んで、レーザ照射光学系を構成している。
　本実施の形態では、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光をそれぞれ透過型で検出する。このため、標本に対し入射光の透過側に、レンズ１０、ＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを分離するダイクロイックミラー１１、ＣＡＲＳ光検出手段１２およびラマン散乱光検出手段１３を配置し、標本面７の集光位置から発生するＣＡＲＳ光を、レンズ１０を経てダイクロイックミラー１１で分離してＣＡＲＳ光検出手段１２に導き、標本面７の集光位置から発生するラマン散乱光を、レンズ１０を経てダイクロイックミラー１１で分離してラマン散乱光検出手段１３に導くようにする。
　ここで、ＣＡＲＳ光検出手段１２は、バンドパスフィルタ１４および検出器１５を有し、ダイクロイックミラー１１で分離されたＣＡＲＳ光をバンドパスフィルタ１４を経て検出器１５で検出するように構成する。また、ラマン散乱光検出手段１３は、バンドパスフィルタ１６および分光器１７を有し、ダイクロイックミラー１１で分離されたラマン散乱光をバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７で検出するように構成する。
　以下、ダイクロイックミラー１１、バンドパスフィルタ１４およびバンドパスフィルタ１６の波長特性について図４を参照して説明する。
　ラマン散乱用レーザ光は、散乱励起用レーザ光源１ａ，１ｂ，２ａから射出するレーザ光の中では最も短波長の単色レーザ光である。このラマン散乱用レーザ光を標本に照射して得られるラマン散乱光のうち本実施の形態で観察対象とするのは、ラマン散乱用レーザ光の波長よりも長波長側に現れるストークス光であって、標本の振動数に基づくスペクトル分布の広がりを有している。
　一方、本実施の形態では前述のようにＣＡＲＳ用レーザ光光源部１の第１パルスレーザ光源１ａは波長固定のレーザ光源であり、第２パルスレーザ光源１ｂは観察対象の振動数ωＶに応じて波長を調整することが可能な波長可変のレーザである。また、第１パルスレーザ光源１ａの波長、第２パルスレーザ光源１ｂの波長およびＣＡＲＳ光の波長は前述の（１）式を満たし、ＣＡＲＳ光は第１パルスレーザ光源１ａの波長よりも短波長側に現れる。
　したがって、ダイクロイックミラー１１は、図４（ａ）に示すように、ＣＡＲＳ光およびＣＡＲＳ用レーザ光を透過し、ラマン散乱光およびラマン散乱用レーザ光を反射する波長特性を有して構成する。また、バンドパスフィルタ１４は、図４（ｂ）に示すように、ＣＡＲＳ光のみを透過し、バンドパスフィルタ１６は図４（ｃ）に示すようにラマン散乱光のみを透過する波長特性を有して構成する。
　次に、本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法について説明する。まず、標本のＣＡＲＳ光観察に先立って、標本の分子振動情報を得るためのラマンスペクトルの検出を行う。このラマンスペクトルの検出においては、標本をレーザ顕微鏡の標本ステージにセットした後、ラマン散乱用レーザ光光源部２を動作させてラマン散乱用レーザ光を出射させて、このラマン散乱用レーザ光を、反射ミラー９、ハーフミラー３、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上の集光位置に集光させる。なお、このラマンスペクトルの検出においては、ガルバノスキャナ５による走査は行わない。
　ラマン散乱用レーザ光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ１０およびダイクロイックミラー１１を経て、バンドパスフィルタ１６に入射させ、ここで、標本を透過したラマン散乱用レーザ光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて、図１６に示したようなラマンスペクトルを検出する。
　このようにして、ラマンスペクトルを検出したら、このラマンスペクトルから標本の分子振動モードに相当する分子振動数ωＶを選択して、標本のＣＡＲＳ光観察を行う。ＣＡＲＳ光観察においては、標本をラマンスペクトル検出状態から移動させることなく、ラマン散乱用レーザ光光源部２の動作を停止させ、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１を動作させて、ＣＡＲＳ用レーザ光を出射させる。
　このＣＡＲＳ用レーザ光は、ハーフミラー３、反射ミラー４およびガルバノスキャナ５を経てレンズ６により標本面７上に集光するとともに、この集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
　ＣＡＲＳ用レーザ光の照射により標本から散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ１０およびダイクロイックミラー１１を経て、バンドパスフィルタ１４に入射させ、ここで、標本を透過したＣＡＲＳ用レーザ光を含むノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
　ここで、本実施の形態に係るＣＡＲＳ顕微鏡は、検出器１５で得られるＣＡＲＳ光の信号を演算処理して画像を形成する図示しないコンピュータを備える。ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１のパルス発振とともに、ガルバノスキャナ５により標本面７上を走査して、このコンピュータ上で各パルス発振に対応する集光位置を画素として演算処理して、標本の２次元画像を形成する。さらに、標本に対するＣＡＲＳ用レーザ光の集光位置を光軸方向に変位させ、異なる深さの面画像を得ることにより、３次元の顕微鏡画像を構成することができる。
　以上のように、本実施の形態では、標本へのＣＡＲＳ用レーザ光の入射光路と、ラマン散乱用レーザ光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、透過型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）が、ＣＡＲＳ用レーザ光の波長オーダよりも大きい場合には、ＣＡＲＳ光自身の干渉効果によりレーザ光の照射方向に対して前方のみにＣＡＲＳ光が強く放射されるので、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。
　[第２実施の形態]
　図５は、本発明の第２実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ＣＡＲＳ光検出手段１２を反射側に配置してＣＡＲＳ光を落射型で検出するようにしたものである。
　このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５およびダイクロイックミラー１８を経てＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させるように構成する。また、標本面７の集光位置から透過方向に散乱する光を、レンズ１０を経てラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
　ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有する。また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように少なくともＣＡＲＳ光を透過し、ＣＡＲＳ用レーザ光およびラマン散乱用レーザ光を反射する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
　本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱用レーザ光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱光の検出は、散乱光の光路上にダイクロイックミラー１１が無いことを除けば、第１実施の形態と同様の動作によってラマンスペクトルを得ることができる。
　また、ＣＡＲＳ用レーザ光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったことを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
　ＣＡＲＳ用レーザ光の照射により標本から反射方向に散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経て、ダイクロイックミラー１８に入射し、ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ用レーザ光を分離する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ＣＡＲＳ光検出手段１２のバンドパスフィルタ１４に入射し、ここでノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
　本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
　以上のように、本実施の形態では、第１実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ用レーザ光の入射光路と、ラマン散乱用レーザ光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、落射型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）がＣＡＲＳ用レーザ光の波長オーダよりも小さい場合には、標本の前方にＣＡＲＳ光とともにより大きなノイズ成分（非共鳴バックグランド）が発生する透過型のＣＡＲＳ光検出手段よりも、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、本実施の形態は、標本中の分子（分子団）の大きさがＣＡＲＳ光励起波長オーダよりも大きい試料であって、波長透過率の悪い試料（生体の組織など）のＣＡＲＳ観察をする際にも有効である。
　[第３実施の形態]
　図７は、本発明の第３実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ラマン散乱光検出手段１３を反射側に配置してラマン散乱光を落射型で検出するようにしたものである。
　このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から透過方向に散乱する光を、レンズ１０を経てＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させるように構成する。また、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８を経てラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
　ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有する。また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように少なくともラマン散乱光を透過し、ＣＡＲＳ用レーザ光およびラマン散乱用レーザ光を反射する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
　本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱用レーザ光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱用レーザ光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ６およびガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射し、ここで標本面７で反射されたラマン散乱用レーザ光を分離する。さらにこのダイクロイックミラー１８を透過した光は、ラマン散乱光検出手段１３のバンドパスフィルタ１６に入射し、ここでノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出する。
　また、ＣＡＲＳ用レーザ光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったのを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。また、ＣＡＲＳ光の検出は、散乱光の光路上にダイクロイックミラー１１が無いことを除けば、第１実施の形態と同様の動作によってＣＡＲＳ光を検出することができる。
　本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
　さらに、本実施の形態においては、後述するように、ガルバノスキャナ５を走査した場合でも、ラマン散乱観察用の分光器１７に入射するラマン散乱光の光軸がぶれないため、ラマン散乱光観察とＣＡＲＳ顕微鏡観察とを同時に行うことも可能である。この場合は、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１とラマン散乱用レーザ光光源部２とを同時に動作させて、ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを同時に射出する。これらのレーザ光は、それぞれ上述した単独照射の光路と同じ光路を経て、同時に同軸で標本面７上の集光位置に集光照射する。
　この場合は、標本面７の反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射する。ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ用レーザ光およびラマン散乱用レーザ光を分離し、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光のみが透過する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、バンドパスフィルタ１６に入射し、ＣＡＲＳ光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出し、これによってラマンスペクトルが得られる。
　このとき、分光器１７を標本面７から見てガルバノスキャナ５の背面側に配置した、本実施の形態における落射型のラマン散乱検出の装置構成では、ガルバノスキャナ５によりラマン散乱用レーザ光を標本面７上で走査した場合でも、分光器１７に入射するラマン散乱光の光軸を一定に保つ位置（デスキャン位置）に置くことが可能である。したがって、光軸のずれによる分光器１７の分光特性の劣化が生じることはない。
　一方、標本面７の透過側に散乱する散乱光は、レンズ１０を経てバンドパスフィルタ１４に入射する。ここで、ＣＡＲＳ用レーザ光、ラマン散乱用レーザ光およびラマン散乱光を含むノイズ成分を除去して、ＣＡＲＳ光のみを検出器１５に入射させて検出する。これにより得られたＣＡＲＳ光を処理することにより、上述のラマンスペクトルと同時に観察したＣＡＲＳ顕微鏡画像が得られる。
　以上のように、本実施の形態では、第１および第２実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ用レーザ光の入射光路と、ラマン散乱用レーザ光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１および第２実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、透過型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）が、ＣＡＲＳ用レーザ光の波長オーダよりも大きい場合には、第１実施の形態でも述べたようにＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、試料をＣＡＲＳ用レーザ光で走査しながらラマン散乱光のスペクトルを検出することができるので、ＣＡＲＳ光観察中に標本の分子振動周波数の変更に迅速に対応できる。
　[第４実施の形態]
　図８は、本発明の第４実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、第１実施の形態において、ＣＡＲＳ光検出手段１２およびラマン散乱光検出手段１３を反射側に配置してＣＡＲＳ光およびラマン散乱光を落射型で検出するようにしたものである。
　このため、本実施の形態では、第１実施の形態のダイクロイックミラー１１およびレンズ１０を取り除くとともに、反射ミラー４に代えてダイクロイックミラー１８を配置し、標本面７の集光位置から反射方向に散乱する光を、レンズ６、ガルバノスキャナ５およびダイクロイックミラー１８を経由してダイクロイックミラー１９に入射させ、このダイクロイックミラー１９でＣＡＲＳ光成分とラマン散乱光成分とを分離し、ＣＡＲＳ光成分をＣＡＲＳ光検出手段１２に入射させ、また、ラマン散乱光成分をラマン散乱光検出手段１３に入射させるように構成する。
　さらに、ＣＡＲＳ光検出手段１２は、入射したＣＡＲＳ光成分を、バンドパスフィルタ１４を経由して検出器１５に入射させ、ラマン散乱光検出手段１３は、ラマン散乱光成分を、バンドパスフィルタ１６を経由して分光器１７に入射させるように構成する。
　ここで、バンドパスフィルタ１４，１６は、第１実施の形態におけるバンドパスフィルタと同じ波長特性を有し、また、ダイクロイックミラー１８は、図６に示すように、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光を透過し、ＣＡＲＳ用レーザ光およびラマン散乱用レーザ光を反射する波長特性を有して構成する。また、ダイクロイックミラー１９は、図９に示すようにＣＡＲＳ光およびＣＡＲＳ用レーザ光を反射し、ラマン散乱光およびラマン散乱用レーザ光を透過する波長特性を有して構成する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
　本実施の形態に係る、レーザ顕微鏡を用いるＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ラマン散乱用レーザ光の標本への照射は、反射ミラー４をダイクロイックミラー１８に変更したことを除き、第１実施の形態と同様に行い、また、ラマン散乱用レーザ光の照射により標本から散乱するラマン散乱光は、レンズ６およびガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射し、ここで標本面７で反射されたラマン散乱用レーザ光を分離する。さらにこのダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９を経て、ラマン散乱光検出手段１３のバンドパスフィルタ１６に入射し、ここでノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出する。
　また、ＣＡＲＳ用レーザ光は、反射ミラー４がダイクロイックミラー１８と入れ替わったことを除き、第１実施の形態と同様の光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、第１実施の形態と同様にこの集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
　ＣＡＲＳ用レーザ光の照射により標本から反射方向に散乱するＣＡＲＳ光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経て、ダイクロイックミラー１８に入射し、ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ用レーザ光を分離する。さらに、このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９を経て、ＣＡＲＳ光検出手段１２のバンドパスフィルタ１４に入射し、ここでノイズ成分を除去してＣＡＲＳ光成分のみを検出器１５に入射させて検出する。
　本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の方法により、図示しないコンピュータにより標本の２次元および３次元のＣＡＲＳ顕微鏡画像を得ることができる。
　さらに、本実施の形態では、第３実施の形態と同様に、ラマン散乱光観察とＣＡＲＳ光観察とを同時に行うことが可能である。この場合も、第３実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１とラマン散乱用レーザ光光源部２とを同時に動作させて、同時に同軸で標本面７上の集光位置に集光照射する。
　標本面７の反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５を経てダイクロイックミラー１８に入射する。ここで、標本面７で反射されたＣＡＲＳ用レーザ光およびラマン散乱用レーザ光を分離し、ＣＡＲＳ光およびラマン散乱光のみが透過する。このダイクロイックミラー１８を透過した光は、ダイクロイックミラー１９に入射し、ＣＡＲＳ光成分とラマン散乱光成分とに分離する。さらに、このＣＡＲＳ光成分はバンドパスフィルタ１４に入射し、ノイズ成分を除去して検出器１５に入射させて検出する。また、ラマン散乱光成分は、バンドパスフィルタ１６に入射し、ＣＡＲＳ光を含むノイズ成分を除去してラマン散乱光成分のみを分光器１７に入射させて検出し、ラマンスペクトルが得られる。
　これによって、第３実施の形態と同様に、本実施の形態においても、分光器１７を標本面７から見てガルバノスキャナ５の背面側に配置した構成により、光軸のずれによる分光器１７の分光特性の劣化を生じることなく、ＣＡＲＳ光の検出によるＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマンスペクトルの観察とを同時に行うことができる。
　以上のように、本実施の形態では、第１、第２および第３実施の形態と同様に、標本へのＣＡＲＳ用レーザ光の入射光路と、ラマン散乱用レーザ光の入射光路とを同軸にしたので、ＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱光観察とを同一の装置上で、試料を移動することなく選択的に行うことができる。したがって、第１および第２実施の形態と同様に、ＣＡＲＳ顕微鏡観察を行おうとする標本位置から得られたラマン散乱により観測した分子振動から効率良く振動数ωＶを選択して、ＣＡＲＳ光観察をすることが可能となる。さらに、本実施の形態では、落射型でＣＡＲＳ光を検出するようにしたので、特に、標本中の分子（分子団）がＣＡＲＳ用レーザ光の波長オーダよりも小さい場合には、第２実施の形態と同様に、透過型のＣＡＲＳ光検出手段よりも、ＣＡＲＳ光を有効に観察することができる。また、本実施の形態は、標本中の分子（分子団）の大きさがＣＡＲＳ光励起波長オーダよりも大きい試料であって、波長透過率の悪い試料（生体の組織など）のＣＡＲＳ観察をする際にも有効である。さらに、試料をＣＡＲＳ用レーザ光で走査しながらラマン散乱光のスペクトルを検出することができるので、ＣＡＲＳ光観察中に標本の分子振動周波数の変更に迅速に対応できる。
[第５実施の形態]
　次に本発明の第５実施の形態について説明する。本実施の形態では、図１０に示すように観察するラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長に重なりがある場合を想定する。すなわち、本レーザ顕微鏡では、標本の分子振動に応じて図２に示した第２パルスレーザー光源１ｂから出射するレーザ光の波長を変化させるようにしているので、観察対象とする分子振動数によっては、ラマン散乱によるラマンスペクトルと重なりを生じる場合がある。このような場合、たとえば、バンドパスフィルタ１４，１６の波長特性を図１１（ａ），（ｂ）に示すように設定すると、ＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを完全に分離することができないことになる。本実施の形態では、このような場合でもＣＡＲＳ光とラマン散乱光とを完全に分離できるレーザ顕微鏡を提供する。
　図１２は、本発明の第５実施の形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。本実施の形態は、上述の第３実施の形態において、ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを切り替えて標本に入射させるように構成するとともに、これらＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光との切り替えに同期して、検出器１５によるＣＡＲＳ光の検出および分光器１７によるラマン散乱光の検出を制御する。
　具体的には、図７の第３実施の形態に示す構成に加えて、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部１とハーフミラー３との間と、ラマン散乱用レーザ光光源部２と反射ミラー９との間とに、それぞれレーザ切替手段２０、２１を設け、制御手段２２によりレーザ光の透過、遮光を切り替えられるように構成する。また、検出器１５および分光器１７は制御手段２２により検出機能の開始、停止を制御する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、同一構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。
　次に、本実施の形態の動作を、図１３に示すタイムチャートを参照して説明する。本実施の形態では、制御手段２２でレーザ切替手段２０、２１を交互に切り替え、ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを時間的に重複することなく交互に射出する。これらのレーザ光はそれぞれ第３実施の形態で説明した光路を経て、レンズ６により標本面７上に集光するとともに、集光位置をガルバノスキャナ５により標本面７上で２次元走査する。
　ＣＡＲＳ用レーザ光が射出しているときは、標本面７の透過側に散乱するＣＡＲＳ光は、第３実施の形態と同様にして検出器１５に入射させて検出する。一方、反射側に散乱する散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７に入射するが、この状態では、分光器１７は制御手段２２により検出停止状態となっているため、ＣＡＲＳ光は検出されない。
　他方、ラマン散乱用レーザ光が射出しているときは、標本面７の透過側に散乱するラマン散乱光は、レンズ１０およびバンドパスフィルタ１４を経て検出器１５に入射するが、検出器１５は制御手段２２によって検出停止状態となっているため、ラマン散乱光は検出されない。これに対し、反射側に散乱するラマン散乱光は、レンズ６、ガルバノスキャナ５、ダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１６を経て分光器１７に入射して検出される。
　本実施の形態では、このような動作方法によって、観察するラマン散乱光とＣＡＲＳ光との波長に重なりがある場合であっても、ＣＡＲＳ光検出とラマン散乱光検出とを時間的に分離したので、相互に影響を与えることなくＣＡＲＳ顕微鏡観察とラマン散乱観察とができるという点で優位である。
　なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。たとえば、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部では第２パルスレーザのみでなく第１パルスレーザーも波長可変のレーザとしても良い。また、ＣＡＲＳ用レーザ光光源部は２台のレーザを用いる場合に限らず、１台のレーザを光源として、ビームスプリッタ等で分離したビームの一つに波長変換を行うことで波長の異なる２本のレーザ光を得ることも可能である。さらには、各散乱励起用の光源は、レーザ顕微鏡本体内に設ける必要は無く、本体とは別体に設けてレーザ光を導入するようにしても良い。

Claims (13)

  1. 　ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを同軸で標本に照射可能なレーザ照射光学系と、
    　前記ＣＡＲＳ用レーザ光の照射により前記標本から発生するＣＡＲＳ光を検出するＣＡＲＳ光検出手段と、
    　前記ラマン散乱用レーザ光の照射により前記標本から発生するラマン散乱光を検出するラマン散乱光検出手段と、
    　を有することを特徴とするレーザ顕微鏡。
  2. 　前記ＣＡＲＳ光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
  3. 　前記標本の透過側に、前記ＣＡＲＳ光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
  4. 　前記ＣＡＲＳ光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置し、
    　前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
  5. 　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光と、前記ＣＡＲＳ光とを分離して、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光を前記標本に導き、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
  6. 　前記ＣＡＲＳ光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の透過側に配置し、
    　前記ラマン散乱光検出手段を、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
  7. 　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光と、前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ用レーザ光および前記ラマン散乱用レーザ光を前記標本に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導く、ダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項６に記載のレーザ顕微鏡。
  8. 　前記ＣＡＲＳ光検出手段と前記ラマン散乱光検出手段とを、前記標本に対し前記レーザ照射光学系からの入射光の反射側に配置したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
  9. 　前記標本の反射側に、前記ＣＡＲＳ光と前記ラマン散乱光とを分離して、前記ＣＡＲＳ光を前記ＣＡＲＳ光検出手段に導き、前記ラマン散乱光を前記ラマン散乱光検出手段に導くダイクロイックミラーを配置したことを特徴とする請求項８に記載のレーザ顕微鏡。
  10. 　前記ＣＡＲＳ光検出手段は、前記ＣＡＲＳ光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
  11. 　前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のみを抽出するバンドパスフィルタを有することを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
  12. 　前記ラマン散乱光検出手段は、前記ラマン散乱光のスペクトルを検出する分光器を有することを特徴とする請求項１～１１のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
  13. 　前記レーザ光照射光学系に入射する前記ＣＡＲＳ用レーザ光とラマン散乱用レーザ光とを切り替える切替手段と、
    　該切替手段による切り替えを制御する制御手段とを備えることを特徴とする請求項１～１２のいずれか一項に記載のレーザ顕微鏡。
    　
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