WO2015133176A1 - 顕微分光装置 - Google Patents

Abstract

　高開口数の対物レンズを備えた顕微分光装置では、熱ドリフト等によるデフォーカスが発生するため、オートフォーカスが必要である。従来のスルーフォーカス画像取得に基づくオートフォーカスは時間がかかるため、高速サンプリングを行う長時間連続測定には適用できない。デフォーカスもしくは非点収差を有するデフォーカス検知用ビームを対物レンズに入射させる。このようなデフォーカス検知用ビームのスポットの像のぼけ方は、デフォーカスの向きによって異なるため、デフォーカスの量と向きをリアルタイムで検知することが可能となり、高速なリアルタイムオートフォーカスが可能となる。

Description

顕微分光装置

　本発明は、光学顕微鏡と分光器の組合せである顕微分光装置に関する。本発明は、顕微ラマン分光に有用であるほか、レーザ励起蛍光分光にも有用である。本発明は、長時間連続測定を必要とする用途、例えば顕微ラマン分光に基づくＤＮＡ塩基配列決定など、において特に有用である。

　特許文献１に、ナノポアを通過する生体高分子に光を照射してラマン散乱光を発生させ、それを計測することによりその生体高分子を分析する装置が記載されている。

　ラマン散乱光の分析には、特許文献２に記載されたような、ラマン顕微鏡と呼ばれる顕微分光装置（顕微鏡と分光光学系の組合せ）が用いられる。ラマン顕微鏡においては、微弱なラマン散乱光を高感度かつ高分解能で観測するため、1近くもしくは1以上の高開口数の対物レンズがしばしば用いられる。このような高開口数の顕微鏡では、被写界深度がサブミクロンとなる。試料と対物レンズの間の距離を長時間このレベルで安定に保つのは、熱膨張等のため、機械的固定だけでは困難である。通常の顕微鏡測定のような単発測定ならば、測定ごとにピントをあわせることが可能である。しかし、ＤＮＡのような巨大生体高分子をナノポアに通過させながら長時間連続で測定する場合、通常のピントあわせを行うのは測定の中断となり好ましくない。このような測定では、リアルタイムのデフォーカス補正（オートフォーカス）が好ましい。

　従来のラマン顕微鏡では一本の励起光ビームを対物レンズで試料基板上の１スポットにフォーカスし、そのスポットの発光像を観測する。スポットの像を観測することにより、デフォーカスの発生は検知できるが、向きを検知することが困難である。

　そのため、通常のピントあわせでは、画像を計測しながら、試料と対物レンズの間の距離を現状位置前後で走査する必要がある（スルーフォーカス画像の取得）。これは時間がかかるため、連続測定におけるリアルタイムオートフォーカスには適さない。

US2013/0176563 US5442438

　高開口数の対物レンズを備えた顕微分光装置において、熱膨張等によるデフォーカスが避けられないような長い時間にわたり、連続測定を可能にする高速リアルタイムオートフォーカスを実現させる。

　デフォーカスもしくは非点収差を有するデフォーカス検知用ビームを対物レンズに入射させる。このようなデフォーカス検知用ビームのスポットの像のぼけ方は、デフォーカスの向きによって異なるため、デフォーカスの量と向きをリアルタイムで検知することが可能となり、高速なリアルタイムオートフォーカスが可能となる。

　ナノポアを通過するＤＮＡのような巨大高分子の長時間連続分析、たとえば塩基配列決定が可能になる。また、一つの試料基板に対して多点計測を行う場合、基板の傾きを検知できる。

本発明の第一の実施形態を示す構成図。 第一の実施形態における対物レンズ周辺拡大図。 第一の実施形態におけるスポット像とデフォーカスの関係。 本発明の第二の実施形態を示す構成図。 第二の実施形態におけるスポット像とデフォーカスの関係。 本発明の第三の実施形態を示す構成図。 本発明の第四の実施形態を示す構成図。 本発明の第五の実施形態を示す構成図 本発明の第六の実施形態を示す構成図 第六の実施形態における像の模式図

　以下、図面に基づいて本発明の実施形態を説明する。

　図１は、本発明の第一の実施形態を示す構成図である。励起レーザ光源１から射出されたビームはビームエクスパンダ２によって、幅の大きい平行ビームとなる。本実施例における励起レーザ光源１は波長785nmの近赤外レーザである。ビームエクスパンダ２の出力ビームはビームスプリッタ３、５によって試料励起ビーム７及びデフォーカス検知ビーム８、９の計３本のビームに分割される。

　これら３本のビームはミラー４、６およびダイクロイックミラー２０、１２によって対物レンズ１３に入力され、試料１４の表面近傍に集光される。図１に示すように、デフォーカス検知ビーム８は、ビームスプリッタ３によって試料励起ビーム７から分割され、ミラー４、ダイクロイックミラー２０、ダイクロイックミラー１２を順に通過して対物レンズ１３に入力され、試料１４の表面近傍に集光される。また、デフォーカス検知ビーム９は、ビームスプリッタ５によって試料励起ビーム７から分割され、ミラー６、ダイクロイックミラー２０、を順に通過後、ダイクロイックミラー１２で反射されて対物レンズ１３に入力され、試料１４の表面近傍に集光される。

　試料１４はＸＹＺステージ１５上に固定されており、ＸＹステージによって観測位置を変更でき、また、Ｚステージによってピントをあわせることができる。デフォーカス検知ビーム８には凹レンズ１０が挿入され、発散ビームとして対物レンズ１３に入射する。凹レンズ１０のかわりに焦点距離が短く、対物レンズの手前に焦点を有する凸レンズでも同様にビーム８を発散ビームとして対物レンズ１３に入射させることが可能である。デフォーカス検知ビーム９には凸レンズ１１が挿入され、収束ビームとして対物レンズ１３に入射する。

　試料表面で散乱された光は、対物レンズ１３によって集められ、ほぼ平行ビームにされ、ダイクロイックミラー１２で反射され、ダイクロイックミラー２０を透過する。そのレーリー散乱光成分はフィルタ２１で遮断され、ラマン散乱光成分のみが第一結像レンズ２２によってピンホール２３上にフォーカスされる。ピンホール２３によって試料励起ビームの集光スポット以外からのラマン散乱光は遮断される。

　ピンホール２３の透過光はリレーレンズ２４によってコリメートされ、フィルタ２６によって残留したレーリー散乱光成分を遮断したのちに回折格子２７によって分散され、そのスペクトルが第二結像レンズ２８によってラマン散乱光検出用の撮像素子上に結像される。フィルタ２１と２６は波長792nm～935nmを透過させ、それ以外を遮断するバンドパスフィルタである。

　白色光源１７から放射された可視白色光はビームスプリッタ１８、プリズム１６で反射され、ダイクロイックミラー１２を透過して対物レンズ１３に導入され、試料１４表面を照明する。可視白色光の試料による散乱光は対物レンズ１３で回収され、照明光路を逆進し、ビームスプリッタ１８を透過してレンズ３１によって監視用撮像素子１９に結像される。ダイクロイックミラー１２は、基本的には近赤外光を反射し、可視域を透過させるが、近赤外レーザ光も0.1％程度透過する。試料上に形成された近赤外レーザ光のスポットの輝度は、白色光照明よりもはるかに高いので、監視用撮像素子上１９において明るいスポットとして観測される。

　図２は本実施例における対物レンズ周辺の拡大図である。試料励起ビームは平行ビームであるので、対物レンズ１３の焦点面にフォーカスされる。このスポットをスポット０と呼ぶ。デフォーカス検知ビーム８は発散ビームなので、対物レンズから見て、焦点面より遠くにフォーカスされる。このスポットをスポット＋とする。デフォーカス検知ビーム９は収束ビームなので、対物レンズから見て、焦点面より近くにフォーカスされる。このスポットをスポット－とする。試料表面が、対物レンズから見て焦点面より遠い時にプラスのデフォーカス、焦点面に近い時にマイナスのデフォーカスとする。図２はプラスにデフォーカスした状態を一例として示している。

　図３は、監視用撮像素子１９で得られる、スポット０、スポット＋、スポット－の像を模式的に示す。デフォーカスが＋の場合は、スポット－のサイズがスポット＋より大きくなり、逆にデフォーカスが－の場合は、スポット＋のサイズがスポット－より大きくなる。したがって、スポット＋とスポット－の大小関係からデフォーカスの向きを検知できる。より定量的には、（（スポット－のサイズ）－（スポット＋のサイズ））×比例定数、によってデフォーカス量が得られる。比例係数は実際の測定前に一度スルーフォーカス画像を得ることにより定めることができる。このようにして、監視カメラの画像から符号を含めてデフォーカス量を求め、それを打ち消す方向にＺステージを動かすことにより、測定を中断することなく、長時間に渡り良好な合焦状態を維持することが可能である。すなわち、リアルタイムの高速オートフォーカスが実現される。

　図４は、本発明の第二の実施形態を示す構成図である。本実施例の基本構成は第一の実施形態と類似である。本実施例ではレーザ出力ビームをビームスプリッタ５で分岐し、試料励起ビーム７と一本のデフォーカス検知ビーム９を得る。デフォーカス検知ビーム９の途中には、非点収差を発生させる手段としてシリンドリカルレンズ４０が挿入される。もちろん、非点収差を発生させる手段はシリンドリカルレンズ４０に限定されない。本例におけるデフォーカス検知ビーム９のスポット（スポット１）の監視用撮像素子における像を、図５に模式的に示す。非点収差のために、＋にデフォーカスするとスポットは縦長となり、－にデフォーカスすると横長となる。したがってスポット形状からデフォーカスの符号を検知できる。より定量的には、（（スポット1の縦サイズ）－（スポット１の横サイズ））×比例定数、をデフォーカス量としてＺステージにフィードバック動作をさせることにより、第一の実施形態と同様に高速なリアルタイムオートフォーカスを実現できる。本実施例に固有の効果として、デフォーカス検知ビームが一本しか必要とされない、という利点がある。

　図６は、本発明の第三の実施形態を示す構成図である。本実施例においても、基本構成は第一の実施形態と類似である。本実施例では、波長785nmの試料照明用レーザ光源１のほかに、デフォーカス検知専用の波長920nmのレーザ光源６１を備え、1の出力ビームと６１の出力ビームをダイクロイックミラーで合成し、光軸を一致させて試料１４を照明する。920nmレーザ６１は半導体レーザであり、出力ビーム自体が非点収差を有している。本実施例の目的は、785nmで励起された試料１４ラマン散乱光の波数範囲100 cm^-1から1800 cm^-1 を観測することである。920 nm（1890cm^-1）はこの範囲外にあるので、ラマン散乱光観測用撮像素子２９において、920nmスポット散乱光の像がラマンスペクトルの外側に観測される。920nmレーザ６１は半導体レーザであり、出力ビーム自体が非点収差を有している。したがって、撮像素子２９において、デフォーカスに応じて図5と同様の920nmスポットの像を得ることができ、第二の実施形態と同様に高速なリアルタイムオートフォーカスを実現できる。本実施例においては、監視用撮像素子およびそのための光学系を省略することが可能である。

　図７は、本発明の第四の実施形態を示す構成図である。本実施例においても、基本構成は第一の実施形態と類似である。本実施例ではマルチビーム発生器７１によってレーザ光源１の出力ビームを四本に分岐し、そのうち二本（７３、７４）を試料照明用ビーム、他の二本（７２、７５）をデフォーカス検知ビームとしている。デフォーカス検知ビーム７２、７５には、それぞれシリンドリカルレンズ４１、４２が挿入され、非点収差が与えられる。本実施例では、試料１４上に二つのラマンスペクトル観測用スポットと、二つのデフォーカス検知用スポット、計４個のスポットが一直線上に形成される。二つのスポットに対し第二の実施例と同様にデフォーカスが求められ、その結果、試料表面の傾きを求めることができる。本実施例ではＸＹＺステージ１５に加えて傾き補正ステージ７６が設けてあり、デフォーカス検知ビームのスポット像から求められた傾きに応じて傾きを補正する。その後、Ｚ方向のデフォーカスをＺステージの動きで補正する。この結果、二つのラマンスペクトル観測用スポットの両方にピントが合い、試料１４の二点のラマンスペクトルを同時に高感度かつ高分解能で観測することが可能となる。

　なお、本実施例においては、図示の都合上、二つのデフォーカス検知スポットによって一方向の傾きのみ検知したが、同一直線状にのらない三つ以上のデフォーカス検知スポットを配置することにより、試料表面の二方向の傾きを検知することが可能である。２軸の傾き補正ステージを設けることにより、両方の傾きを補正し、３個以上の二次元的に配置されたラマン観測用スポットのすべてに対し同時にピントをあわせることも可能である。

　図８は、本発明の第五の実施形態を示す構成図である。本実施例においても、基本構成は第一の実施形態と類似である。同部品については同番号を付与し、詳細な説明は省略する。本実施例では、デフォーカス検知ビーム１３０を発生させる専用の光源ユニット１００を設ける。光源ユニット１００は、レーザ光源１０１、シリンドリカルレンズ１０２、１０３で構成される。レーザ光源１０１の波長は励起用レーザ光源１より短波長であればよく、例えば６３３ｎｍなどの可視光としている。シリンドリカルレンズ１０２、１０３は、曲率を含む面が互いに垂直で、かつシリンドリカルレンズ１０２の焦点１０６と、シリンドリカルレンズ１０３の焦点１０７が、チューブレンズ１０４の焦点１０５を中心としてそれぞれ対称の間隔となるよう配置されている。この構成とすることで、デフォーカス検知ビーム１０３は、焦点１０５を中点とし、焦点１０６及び焦点１０７間の距離に等しい非点隔差をもつ非点収差が与えられる。デフォーカス検知ビーム１０３は、ビームスプリッタ１０８にて白色光３０と合成された後、白色光３０と同じ光路を通って対物レンズ１３に入射する。結像レンズ１０４は、焦点１０５と対物レンズ１３の焦点（図示せず）が共役となるよう配置している。そのため、対物レンズ１３の合焦点でも焦点１０５と同様に、デフォーカス検知ビーム１０３がもつ非点隔差の中点となる。デフォーカス検知ビーム１０３が監視用撮像素子１９に形成する像は、図５と同様に、対物レンズ１３の合焦点から＋にデフォーカスすると縦長となり、－にデフォーカスすると横長となる。制御装置８０は、監視用撮像素子１９に形成する像の形状からデフォーカスの方向及び量を計算し、ＸＹＺステージ１５にフィードバック制御信号を送る機能をもつ。ＸＹＺステージ１５は、与えられたフィードバック制御信号をもとにＺステージを追従する。

　このように、本実施例においても、スポットの形状からデフォーカスの符号を検知し、高速なリアルタイムオートフォーカスを実現できる。

　ここで、フォーカス検知範囲の決定方法について説明する。焦点１０５を中心とする非点隔差量Ｄと、対物レンズ１３の合焦点を中心とする非点隔差量ｄは、チューブレンズ１０４と対物レンズ１３の倍率Ｍを用いて、縦倍率の関係になっている。非点隔差量ｄはデフォーカス検知範囲に相当する。必要なデフォーカス検知範囲（非点隔差量ｄ）に合わせて、ｄ＝Ｄ/Ｍ²となるようにシリンドリカルレンズ１０２、１０３の焦点距離と配置、及び倍率Ｍを選定すればよい。

　本実施例においても、目的は785nmで励起された試料１４ラマン散乱光の波数範囲100 cm^-1から1800 cm^-1 を観測することである。デフォーカス検知ビーム１０３は、上記のように、レーザ光源１よりも短波長であるため、ダイクロイックミラー１２、及びフィルタ２１、２６でほとんどのパワーが遮断される。さらに、デフォーカス検知ビーム１０３は励起光源よりも短波長であるため、0cm^-1より小さく、ラマン散乱観測用撮像素子２９においてラマンスペクトルの外側に像を形成する。このように、本実施例でも、ラマンスペクトルの観察にデフォーカス検知ビーム１０３が影響しない利点がある。

　図９は、本発明の第六の実施形態を示す構成図である。本実施例は、第五の実施形態の光源ユニット１００を光源ユニット１００a、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄに置き換えたものである。光源ユニット１００ａ～ｄ、及びチューブレンズ１０４のみを抽出して図示し、その他の部品については省略している。光源ユニット１００ａ～ｄは、光源ユニット１００と同じ部品で構成され、１個のレーザ光源と２個のシリンドリカルレンズがある（図示せず)。面１１０は、チューブレンズ１０４の焦点位置を貫通し、かつチューブレンズ１０４の光軸に対して垂直な面である。光源ユニット１００ａ～ｄは、それぞれデフォーカス検知ビーム１３０ａ～ｄを射出する。デフォーカス検知ビーム１３０ａ～ｄは、デフォーカス検知ビーム１３０と同様に、光源ユニット１００ａ～ｄ内の２個のシリンドリカルレンズによって、面１１０の位置を中心とした非点収差が付与される。その後、ビームスプリッタで白色光と合成した後、対物レンズに入射し試料上にスポットを形成する（図示せず）。

　図１０は、撮像素子１９で得られる像を模式的に示したものである。スポット１１０は励起ビーム、スポット１１１ａ～ｄは、デフォーカス検知ビーム１３０ａ～ｄが試料上にそれぞれ形成するスポットである。図のように、デフォーカス検知ビーム１３０ａ～ｄは、励起ビームと離れた位置に照射している特徴がある。本実施例では、スポット１１１ａ～ｄを同時に観察することで、デフォーカスを検知するだけでなく、試料表面の二方向の傾きも同時に検知することができる利点がある。

　デフォーカス検知ビーム１３０ａ～ｄは励起ビームより短波長であるため、ほとんどのパワーがダイクロイックミラー２０及びフィルタ２１、２６で遮断される。さらに、デフォーカス検知ビームが励起ビームのスポット位置から離れているため、ピンホール２３で遮断される。これより、デフォーカス検知ビームがラマン光に対する影響をほとんどなくすことが可能となる。

　本実施例は、４個のデフォーカス検知ビームで構成されているが、試料上に形成する少なくとも一つのスポットが非直線上にならぶ３個のデフォーカス検知ビームで構成することで、二方向の傾きの検出をしても問題ない。

　本実施例は、２個のシリンドリカルレンズによりデフォーカス検知ビームに非点収差を付与した。しかし、２個のシリンドリカルレンズの機能を併せ持つ１個以上のシリンドリカルレンズ、及び２個のシリンドリカルレンズの機能を併せ持つ１個以上の回折素子であってもなんら構わない。

　本実施例は、１本の励起ビームとしたが、第四の実施形態と同様に、励起ビームがマルチビームであってもなんら問題ない。

　本実施例ではマルチビーム発生器として回折ビームスプリッタを用いたが、カスケード接続された通常のビームスプリッタでももちろんかまわない。

　以上、ラマン分光への適用を中心として本発明の実施形態を説明してきたが、蛍光分光に対しても全く同様に適用可能である。

１　励起レーザ光源
２　ビームエクスパンダ
３　ビームスプリッタ
４　ミラー
５　ビームスプリッタ
６　ミラー
７　励起ビーム
８　デフォーカス検知ビーム
９　デフォーカス検知ビーム
１０　凹レンズ
１１　凸レンズ
１２　ダイクロイックミラー
１３　対物レンズ
１４　試料
１５　ＸＹＺステージ
１６　プリズム
１７　白色光源
１８　ビームスプリッタ
１９　撮像素子
２０　ダイクロイックミラー
２１　フィルタ
２２　第一結像レンズ
２３　ピンホール
２４　リレーレンズ
２５　ラマン散乱光
２６　フィルタ
２７　回折格子
２８　第二結像レンズ
２９　撮像素子
３０　白色光
３１　レンズ
４０　シリンドリカルレンズ
７１　マルチビーム発生器
７２　デフォーカス検知ビーム
７３　励起ビーム
７４　励起ビーム
７５　デフォーカス検知ビーム
４１　シリンドリカルレンズ
４２　シリンドリカルレンズ
７６　傾き補正ステージ
８０　制御装置

Claims (15)

1. 　顕微分光装置において、
   　試料からの発光を励起するための励起ビームを出力する光源と、
   　該励起ビームを試料に照明するための対物レンズと、
   　該励起ビームによって励起された試料からの発光を検出する撮像素子と、
   　該対物レンズに入射する該励起ビームと波長または光軸の異なるデフォーカス検知ビームと、
   　該試料を該対物レンズの光軸方向に移動するためのステージと、
   　該デフォーカス検知ビームが該対物レンズを通って該試料上に形成する像の形状を観察する監視用撮像素子と、
   　該デフォーカス検知ビームの像の形状からデフォーカス方向およびデフォーカス量を検知し、前記ステージを前記対物レンズのフォーカス位置に移動させるようフィードバック制御信号を送る制御装置とを備えることを特徴とする顕微分光装置。
2. 　請求項１に記載の顕微分光装置において、
   　前記デフォーカス検知ビームは少なくとも二個以上を備えていることを特徴とする顕微分光装置。
3. 　請求項２記載の顕微分光装置において、
   　前記少なくとも二個以上のデフォーカス検知ビームは、
   　その少なくとも一つは前記対物レンズによって、前記励起光ビームが前記対物レンズでフォーカスされる位置より対物レンズに近い位置にフォーカスされ、その少なくとも一つは前記対物レンズによって、該励起光ビームが前記対物レンズでフォーカスされる位置より対物レンズから遠い位置にフォーカスされ、
   　さらに、デフォーカスを観察する監視用撮像素子を備えることを特徴とする顕微分光装置。
4. 　請求項３に記載の顕微分光装置において、
   　前記デフォーカス検知用ビームは、
   　前記励起光ビームの光路上に、少なくとも２個のビームスプリッタを設け、さらにスプリット後に一方の光路上に、凹レンズ、他方の光路上に、凸レンズを設けることにより生成することを特徴とする顕微分光装置。
5. 　請求項１に記載の顕微分光装置において、
   　少なくとも一つのデフォーカス検知用ビームが非点収差を有することを特徴とする顕微分光装置。
6. 　請求項５に記載の顕微分光装置において、
   　非点収差を有するデフォーカス検知用ビームは、
   　前記励起光ビームの光路上に、ビームスプリッタを設け、スプリット後の光路上に、シリンドリカルレンズを設けることにより生成することを特徴とする顕微分光装置。
7. 　請求項５に記載の顕微分光装置において、
   　非点収差を有するデフォーカス検知ビームは、
   　デフォーカス検知ビームの光路上に、少なくとも２個のシリンドリカルレンズと、少なくとも１個のチューブレンズを有し、
   　該２個のシリンドリカルレンズは互いに曲率を含む面が垂直な方向に配置し、
   　該２個のシリンドリカルレンズの焦点は、該チューブレンズの焦点に対して対称に配置していることを特徴とする顕微分光装置。
8. 　請求項１に記載の顕微分光装置において、
   　前記励起ビームと波長のことなるデフォーカス検知用ビームを出力する光源を備えることを特徴とする顕微分光装置。
9. 　請求項８に記載の顕微分光装置において、前記デフォーカス検知用ビームの波長は、前記励起ビームの波長より短いことを特徴とする顕微分光装置。
10. 　請求項９に記載の顕微分光装置において、
    　デフォーカス検知ビームのそれぞれの光路上に、シリンドリカルレンズを有することを特徴とする顕微分光装置。
11. 　請求項２記載の顕微分光装置において、
    　前記制御装置は、前記試料表面の少なくとも一方向以上の傾きを検知することを特徴とする顕微分光装置。
12. 　請求項２記載の顕微分光装置において、
    　前記複数のデフォーカス検知ビームは、前記試料上に、少なくとも三個以上のデフォーカス検知スポットを形成し、
    　前記デフォーカス検知スポットは、少なくとも一つ以上が非同一直線上にあり、
    　前記制御装置は、前記三個以上のデフォーカス検知スポットの形状から前記試料表面の少なくとも二方向の傾きを検知することを特徴とする顕微分光装置。
13. 　請求項２記載の顕微分光装置において、
    　前記複数のデフォーカス検知ビームを全て同時に観察可能な監視用撮像素子を有することを特徴とする顕微分光装置。
14. 　請求項２に記載の顕微分光装置において、
    　前記監視用撮像素子は、前記デフォーカス検知用ビームの観察と、前記試料の観察とが同時にできること特徴とする顕微分光装置。
15. 　請求項１に記載の顕微分光装置において、
    　複数の励起ビームと複数のデフォーカス検知ビームを生成するマルチビーム発生器を有することを特徴とする顕微分光装置。

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