JPWO2008081729A1 - レーザ走査共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

照射された試料７の検査面の照射点からは蛍光が発生し、対物レンズ６により集光されるが、対物レンズ６の倍率色収差のために、対物レンズ６を出た蛍光は、照射光とはずれた光路をたどり、ガルバノスキャナ５によりほぼ非走査光に変えられる。蛍光は、ダイクロイックミラー４を透過し、フィルタ８により余分な波長の光を除去されて、２次元的偏向手段である偏向手段９に入射する。偏向手段９は、コンピュータ１０によりガルバノスキャナ５に同期して駆動されており、対物レンズ６の倍率色収差に起因して発生した光軸のずれと傾きを補正する。光軸のずれと傾きを補正された蛍光は、集光レンズ１１により、ピンホール板１２のピンホール上に試料７の検査面の照射点の像を結像する。倍率色収差を有する対物レンズが使用される場合であっても、倍率色収差による周辺減光を光学系により補正可能なレーザ走査共焦点顕微鏡とすることができる。

Description

本発明はレーザ走査共焦点顕微鏡に関するものである。

例えば、特許第３３６５８８４号公報（特許文献１）に記載される共焦点顕微鏡は、生体標本などの試料上に照明光を集光すると共にその試料上の集光部から射出する光束（蛍光）を共焦点絞り面に集光し、その共焦点絞りを通過した光束の光量を光検出器で検出するものである。また、その試料の二次元の画像を得るため、照明光をガルバノミラー型スキャナ等により走査光に変え、試料上を集光部（スポット）で走査しながらその検出を行う。
共焦点絞り面には、ピンホール部材が配置される。ピンホール部材はピンホール（開口）内に集光する光線のみを透過し、それ以外の光線をカットするので、試料上の特定の深さから射出した光線のみが光検出器に入射し、それ以外の深さから射出した光線は光検出器に入射しない。このため、共焦点顕微鏡によれば、観察対象を試料上の特定の深さに位置する薄い層の像のみに限定（セクショニング）することができる。そのセクショニング分解能（観察対象となる層の薄さ）を変更するためには、ピンホール部材の開口径を変更すればよい。開口径を大きくするとセクショニング分解能が低くなり、開口径を小さくするとセクショニング分解能が高くなる。

このようにピンホールの開口径によりセクショニング分解能が変わるので、ピンホールは開口径を変化させられると便利である。このため、ピンホールの開口径がカメラの虹彩絞りのように大きさを変化させることが可能であったり、開口径の異なる複数のピンホールを用意しておきターレット式やスライド式でピンホールを取り替えたり、複数のピンホールを用意しておき光路を切り替えたりする方法が使用されている。
特許第３３６５８８４号公報 特開２００５−２７５１９９号公報

しかしながらセクショニング分解能を高めるためにピンホールの開口径を小さくする場合、対物レンズの種類により程度の差はあるが、画面中心では光量が多く、周辺部では少なくなる周辺減光現象が発生する。このため物体の明るさ（発生する蛍光の強さ）が均一であっても、その撮像結果は明るさが不均一な画像として得られることとなる。

周辺減光は、主にビグネッティングと、倍率色収差による光源とピンホールの共役点ずれにより起こる。後者の共役点ずれとは、蛍光観察では励起波長と蛍光波長が異なるため、光学系（特に対物レンズ）に倍率色収差が存在する場合には、画面周辺部を走査すると倍率色収差のために蛍光の集光位置がピンホールの位置と一致しなくなるため、蛍光がピンホールを通過する光量が少なくなり、その結果、周辺部の画像が暗くなることである。

このような周辺減光による問題を解決するために、特開２００５−２７５１９９号公報（特許文献２）では、周辺部の光量を上げる画像処理を行っている。しかしながら、画像処理ではなく、光学的に補正することが望まれている。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、倍率色収差を有する対物レンズが使用される場合であっても、倍率色収差による周辺減光の影響を光学系により補正可能なレーザ走査共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、
照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
前記光分離手段と前記ピンホール板との間に、前記光走査手段と同期して駆動される２次元的光偏向手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記光分離手段と前記２次元的光偏向手段との間に、望遠鏡光学系を設けたことを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、
照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
前記光源と前記光分離手段との間に、前記光走査手段と同期して駆動される２次元的光偏向手段を有することを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第１の手段から第３の手段のいずれかであって、前記光走査手段と、前記２次元的光偏向手段が、ガルバノミラー型スキャナであることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第５の手段は、前記第１の手段から第４の手段のいずれかであって、前記２次元的光偏向手段は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第６の手段は、
照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
前記光走査手段と同期して駆動される、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段を備えたことを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第７の手段は、前記第６の手段であって、前記２次元シフト手段は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第８の手段は、照明光系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
記光源と前記光分離手段との間に設けられた照明レンズと、前記光源の間に、前記光走査手段と同期して回転駆動される、平行平面板を設けたことを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第９の手段は、前記第８の手段であって、前記平行平面板は、２枚設けられ、互いに垂直の方向の回転軸を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１０の手段は、前記第８の手段又は第９の手段であって、前記平行平面板は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１１の手段は、前記第１の手段から第１０の手段のいずれかであって、前記光走査手段の偏向量と、前記２次元的光偏向手段、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段、前記集光レンズを２次元的にシフトさせる手段、前記平行平面板のいずれか１つの駆動量との関係を、使用する対物レンズ毎に記憶する記憶手段を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１２の手段は、前記第１の手段から第１０の手段のいずれかであって、使用する対物レンズ毎に、該対物レンズの倍率色収差に関するデータを記する記憶手段と、
前記データを用いて、前記光走査手段の偏向量と、前記２次元的光偏向手段、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段、前記集光レンズを２次元的にシフトさせる手段、前記平行平面板のいずれか１つの駆動量との関係を算出する演算手段と
を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１３の手段は、前記第１２の手段であって、前記光走査手段の走査情報と前記観察光の強度情報とから、前記駆動量を補正する補正手段を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１４の手段は、
照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
前記光走査手段と同期して駆動される、前記観察光の集光位置と前記ピンホールとの位置関係を補正する補正手段とを有することを特徴とする共焦点顕微鏡である。

本発明によれば、倍率色収差を有する対物レンズが使用される場合であっても、倍率色収差による周辺減光の影響を光学系により補正可能なレーザ走査共焦点顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施の形態の第１の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 本発明の実施の形態の第２の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 本発明の実施の形態の第３の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 本発明の実施の形態の第４の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 本発明の実施の形態の第５の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 第１の方法を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である。 第１の方法の変形例を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である 第２の方法を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である。

符号の説明

１…光源、２…照明レンズ、３…フィルタ、４…ダイクロイックミラー、５…ガルバノスキャナ、６…対物レンズ、７…試料、８…フィルタ、９…偏向手段、１０…コンピュータ、１１…集光レンズ、１２…ピンホール板、１３…光検出器、１４…モニタ、１５…偏向手段、１６…ピエゾ素子、１７…平行平面板、１８…回動軸、１９…望遠鏡系

以下、本発明の実施の形態の例を、図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の実施の形態の第１の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。点光源である光源１から照射された照明光は、照明用レンズ２で平行光とされ、フィルタ３により特定波長のみが選択されて透過し、光分離手段であるダイクロイックミラー４により反射されて、走査手段であるガルバノスキャナ５で２次元の走査光に変えられ、対物レンズ６により、試料７の検査面に集光する。光源１と試料７の検査面は、照明レンズ２〜対物レンズ６までの照明光学系に対して共役となっている。又、試料７の検査面は、対物レンズ６の焦点面に一致している。

照射された試料７の検査面の照射点からは蛍光が発生し、対物レンズ６により集光される。その際、対物レンズ６の倍率色収差のために、対物レンズ６を出た蛍光は、照射光とはずれた光路をたどり、ガルバノスキャナ５によりほぼ非走査光に変えられるが、その光路は、非走査光であった照射光の光路とはずれた光路となる。

蛍光は、ダイクロイックミラー４を透過し、フィルタ８により余分な波長の光を除去されて、２次元的偏向手段である偏向手段９に入射する。偏向手段９は、コンピュータ１０によりガルバノスキャナ５に同期して駆動されており、対物レンズ６の倍率色収差に起因して発生した光路のずれを補正する。光路のずれを補正された蛍光は、集光レンズ１１により、ピンホール板１２のピンホール上に試料７の検査面の照射点の像を結像する。

試料７の検査面の照射点とピンホール板１２のピンホールとは、対物レンズ６から集光レンズ１１までの結像光学系に対して共役となっている。すなわち、ピンホール板１２は、集光レンズ１１に対して、所定の照明光の波長を基準にして対物レンズ６の焦点面と共役な位置に設けられている。ピンホールを通過した光は、光検出器１３により検出され、コンピュータ１０に送られる。コンピュータ１０は、光検出器１３の出力から２次元画像を形成し、モニタ１４に表示する。以上で画像が取得される。

以上の光学系は、偏向手段９が設けられていることを除いて、従来のレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系と同一である。偏向手段９が設けられていないと、対物レンズ６の倍率色収差に起因して蛍光の光路のずれが発生するので、集光レンズ１１による結像位置がピンホール板１２のピンホール位置と異なる位置となり、周辺減光が発生する。倍率色収差は、対物レンズの画角によって変化するので、この実施の形態においては、コンピュータ１０の作用により、ガルバノスキャナ５の偏向量に合わせて偏向手段９の偏向量を決定し、照射点がどの位置にあっても、集光レンズ１１による蛍光の結像位置がピンホール板１２のピンホール位置となるようにしている。

なお、倍率色収差に起因して生じる蛍光の光路のずれは、ガルバノスキャナ５の偏向量以外に、使用される対物レンズの種類、照明光の波長（励起波長）と蛍光波長（蛍光色素から放出される蛍光のピーク波長）にも依存して発生するので、前述のガルバノスキャナ５の偏向量にあわせて偏向手段９の偏向量を決定する際に、コンピュータ１０がこれらを用いて演算していることはいうまでもない。

偏向手段９の偏向量の決定に使用するパラメータは、対物レンズ６の種類、照明光の波長（励起波長）、蛍光波長（蛍光色素から放出される蛍光のピーク波長）、ガルバノスキャナ５から出射される照明光の光軸（対物レンズの光軸）とのなす角（以下、偏向角という）である。これらから照明光に対する蛍光の各偏向角ごとの倍率色収差を算出し、これを偏向手段９の偏向量（偏向手段の回転角）に換算することで行う。算出する偏向角のピッチは、任意に選択すればよい。

偏向手段９の偏向量の決定は、対物レンズと照明光波長と蛍光波長が決定された後、実際に画像を取得する前に、偏向角の全領域に対して予め行われ、コンピュータ１０のメモリ上に格納される。

偏向手段の偏向量を決定する第１の方法を説明する。

図６は、第１の方法を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である。図６に記載されたテーブルは、対物レンズが１０ｘのときの照明光の波長４０５ｎｍにおける各蛍光波長の偏向角ごとの倍率色収差の値を示している。

図６に示すK11からK44は、対物レンズの設計値から予め計算された、４０５ｎｍにおける各波長の倍率色収差の値である。このテーブルは、搭載する対物レンズと、照明光の波長（励起波長）との組み合わせの数だけコンピュータ１０に記憶しておく。対物レンズの区別は倍率だけでなく、対物レンズの型名毎に分類することがより望ましい。

図６に示すテーブルを用いて、蛍光の波長が412nm、偏向角が2.5度のときの偏向手段９の偏向量を算出する場合、まず偏向角が2.5度のときの蛍光の波長412の倍率色収差の値を算出する。それは蛍光波長410nmの列と415nmの列から線形補間して412nmに相当する各偏向角における倍率色収差の値を算出し、その算出した値から、偏向角2度と3度の倍率色収差の値から線形補間して偏向角2.5度のときの倍率色収差の値を算出する。算出した倍率色収差の値をK、対物レンズの焦点距離をFとすると、
偏向手段９の偏向量αは、
α＝ｔａｎ^−１（Ｋ／Ｆ）・・・（１）
で算出される。偏向手段９の偏向方向は、ガルバノスキャナ５での偏向方向と同じ面内であり、倍率色収差を打ち消す方向である。

さらに他の方法として、偏向手段の偏向量を決定する第１の方法の変形例を説明する。図７は、第１の方法の変形例を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である。図７に記載されたテーブルは、対物レンズ１０ｘのときの基準波長における各波長（照明光、蛍光）の偏向角ごとの倍率色収差の値を示している。図７に示すS11からS44は、対物レンズの設計値から予め計算された、基準波長に対する各波長の倍率色収差の値である。基準波長は、任意に選択すればよく、例えばｄ線（587nm）などがあげられる。このテーブルは搭載する対物レンズの数だけコンピュータ１０に記憶しておく。対物レンズの区別は倍率だけでなく、対物レンズの型名毎に分類することがより望ましい。

図７に示すテーブルを用いて、照明光の波長が405nm、蛍光の波長が412nm、偏向角が2.5度のとき偏向手段９の偏向量を算出する場合、まず基準波長に対する照明光の波長における各偏向角ごとの倍率色収差の値、すなわち400nmの列と410nmの列から線形補間して基準波長に対する405nmにおける各偏向角ごとの倍率色収差の値を算出する。

その後、算出した値から、偏向角2度と３度の倍率収差の値から線形補間して偏向角2.5度のときの基準波長に対する405nmにおける倍率色収差の値を算出する。

次に、基準波長に対する蛍光の波長における各偏向角ごとの倍率色収差の値、すなわち410nmの列と420nmの列から線形補間して基準波長に対する412nmにおける各偏向角ごとの倍率色収差の値を算出する。

その後、算出した値から、偏向角2度と３度の倍率収差の値から線形補間して偏向角2.5度のときの基準波長に対する412nmにおける倍率色収差の値を算出する。

最後に、偏向角2.5度のときの基準波長に対する405nmにおける倍率色収差の値と、偏向角2.5度のときの基準波長に対する412nmにおける倍率色収差の値との差をとって、405nmに対する412nmにおける偏向角2.5度の倍率色収差の値を算出する。

算出した倍率色収差の値をＫ、対物レンズ６の焦点距離をＦとすると、偏向手段９の偏向量α、前述した式（１）から算出される。偏向手段９の偏向方向は、ガルバノスキャナ５での偏向方向と同じ面内であり、倍率色収差を打ち消す方向である。

さらに、偏向手段の偏向量を決定する第２の方法を説明する。

倍率色収差は３次関数
Ｋ＝A×ｔａｎ^３（θ）・・・（２）
でよく近似して算出される。ここでＫは倍率色収差、Ａは対物レンズの種類と波長で決まる係数である。

図８は、第２の方法を用いて偏向量を決定する際に使用するテーブルを示す図である。図８に記載されたテーブルは、対物レンズ１０ｘのときの基準波長における各波長（照明光、蛍光）の偏向角ごとの倍率色収差の係数Aの値を示している。図８のA1からA5は、対物レンズの設計値から予め計算された、基準波長に対する各波長の倍率色収差の係数Aの値である。

基準波長は任意に選択すればよく、例えばｄ線（587nm）などである。このテーブルは搭載する対物レンズの数だけコンピュータ１０に記憶しておく。対物レンズの区別は倍率だけでなく、対物レンズの型名毎に分類することがより望ましい。

図８に示すテーブルを用いて、照明光の波長が405nm、蛍光の波長が412nm、偏向角が2.5度のときに偏向手段９の偏向量を算出する場合、まず前述した式（２）用いて、基準波長に対する400nm及び410nmにおける各偏向角ごとの倍率色収差の値を算出する。

その後の線形補間計算から、405nmに対する412nmにおける偏向角2.5度の倍率色収差の値を算出する方法、及び偏向手段９の偏向量αの算出方法は前述した第1の方法の変形例と同じである。この方法は、表のデータ量を小さくできるというメリットがある。

最後に、偏向手段の偏向量を決定する第３の方法を説明する。

この方法はコンピュータ１０に搭載する対物レンズのレンズデータを保存しておき、照明光の波長（励起波長）と蛍光波長と偏向角をコンピュータ１０に入力すると、基準波長に対する照明光の倍率色収差と基準波長に対する蛍光の倍率色収差をそれぞれ算出し、前述した第１の方法の変形例と同様な方法により偏向手段９の偏向量を算出する。

レンズデータは、対物レンズを構成するレンズの曲率半径、面間隔、屈折率（ガラスの分散係数）が記憶されている。

算出した倍率色収差から偏向手段９の偏向量の決定方法は第１の方法の変形例と同様である。

なお、これらの手段で使用するテーブルやレンズデータは、対物レンズの新規追加の際に、追加して補充することができる。

また、これらのようにして決定した偏向量は、その決定後、画像を取得する前に、変更可能である。例えば、偏向量をすべて零に変更すると、偏向手段９を用いない従来のレーザ走査共焦点顕微鏡と同じ動作をする。

または、偏向量を算出された値から僅かに修正することで、倍率色収差の補正量を微修正することができる。この場合、算出された偏向量にしたがって偏向手段９を駆動して、一旦、画像を取得した後に、使用者がモニタ１４に表示される画像から周辺減光の程度を確認し、偏向量を僅かに修正する。その後、再度画像を取得し、修正の効果を確認する。その結果に応じて、使用者は修正と画像を取得する操作を繰り返すことで、周辺減光が最も少なくなる偏向手段９の偏向量を決定することができる。このとき、使用者は、偏向角のうちの数点だけについて偏向量の修正を行う。それ以外の偏向角の領域については、変更した点を補間（線形補間またはスプライン補間）することで修正された偏向量の決定を行う。

さらに、この偏向手段９の偏向量の修正は、コンピュータ１０が、周辺減光の程度が小さくなるように、逐次的に偏向量の修正と画像取得を繰り返して自動的に行うこともできる。

ガルバノスキャナ５がガルバノミラー型スキャナであるので、偏向手段９としては、ガルバノミラー型スキャナを用いるのが適当であり、両者のマッチングがとりやすいが、レゾナントミラー型スキャナ、ピエゾ素子にミラーを付けたもの、音響光学素子等を適宜使用することができる。

図２は、本発明の実施の形態の第２の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。以下の図において、前出の図に示された構成要素には同じ符号を付してその説明を省略することがある。図２に示す実施の形態は、図１に示す第１の実施の形態とは、２次元的偏向手段である偏向手段９の代わりに、２次元的偏向手段である偏向手段１５が、照明光学系の照明レンズ２とフィルタ３の間に設けられている点（フィルタ３とダイクロイックミラー４の間に設けてもよい）点が異なるのみであり、残りの構成は同じである。偏向手段１５がコンピュータ１０によりガルバノスキャナ５と同期して駆動されている点も図１に示す実施の形態と同じである。

図２に示す実施の形態においては、照射光の光路を偏向させることにより、対物レンズ６の倍率色収差に起因して、試料７の照射位置から発生する蛍光がピンホール板１２のピンホールを通らなくなることを補正しており、光学的には図１に示す実施の形態と等価である。偏向手段１５での偏向量の決定は、実施の形態の第１の例と同様に行う。

この場合も、 ガルバノスキャナ５がガルバノミラー型スキャナであるので、偏向手段１５としては、ガルバノミラー型スキャナを用いるのが適当であり、両者のマッチングがとりやすいが、レゾナントミラー型スキャナ、ピエゾ素子にミラーを付けたもの、音響光学素子等を適宜使用することができる。

図３は、本発明の実施の形態の第３の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。図３に示す実施の形態は、図１に示す実施の形態と比較して、２次元的偏向手段である偏向手段９が無く、その代わりに、ピンホール板１２を２次元的（光軸と垂直方向）に移動させるピエゾ素子１６が設けられており、ピエゾ素子１６がコンピュータ１０によりガルバノスキャナ５と同期して駆動されている点が異なるのみで、残りの光学系の構成は、図１に示す実施の形態と同じである。

すなわち、図３における実施の形態においては、ピエゾ素子１６によりピンホールの位置を移動させることにより、対物レンズ６の倍率色収差に起因して、試料７の照射位置から発生する蛍光がピンホール板１２のピンホールを通らなくなることを補正している。

ピエゾ素子１６の駆動量の決定は、前述した偏向手段の偏向量を決定する方法のいずれかを使用して、照明光の波長に対する蛍光波長における偏向角ごとの倍率色収差の値を算出する点までは同じである。

算出した倍率色収差をＫ、対物レンズ６の焦点距離をＦ、集光レンズ１１の焦点距離をＦ２とすると、
ピンホール板１２の基準位置（前述した所定の照明光の波長を基準にして設定した対物レンズの焦点面と共役な位置）からの移動量Ｄは
Ｄ＝Ｋ×（Ｆ２／Ｆ）・・・（３）で算出される。

なお、この実施の形態においては、ピンホール板１２を２次元的に移動させているが、集光レンズ１１を光軸と垂直方向に２次元的に移動させても同じ効果が得られる。

図４は、本発明の実施の形態の第４の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。図４に示す実施の形態は、２次元的偏向手段である偏向手段９が無く、その代わりに、光源１と照明レンズ２の間に、２つの平行平面板１７を有し、この２つの平行平面板１７が、光軸に垂直で、互いに直角な回動軸１８の回りに回動可能とされている点が異なっているのみで、残りの光学系の構成は、図１に示す実施の形態と同じである。回動の制御は、ガルバノスキャナ５の動きに同期してコンピュータ１０により行われている。

平行平面板１７を回動させることにより、照明レンズ２に入射する光路がずれ、相対的に光源１の位置が移動したことになるので、光学的には、図２に示す実施の形態と等価な効果を生ずることができる。光源直後に平行平面板を入れる構成としているので、結像光学系側に平行平面板を入れるのに比して、蛍光の光量のロスを少なくすることができるという効果を生ずる。

２つの平行平面板１７の回転角度の決定は、前述した偏向手段の偏向量を決定する方法のいずれかを使用して、照明光の波長に対する蛍光波長における偏向角ごとの倍率色収差の値を算出する点までは同じである。

算出した倍率色収差をＫ、対物レンズ６の焦点距離をＦ、照明レンズ２の焦点距離をＦ３とすると、照明レンズ２に入射する光路の中心軸と光軸とのズレ量Ｌは
Ｌ＝Ｋ×（Ｆ３／Ｆ）・・・（４）
で算出される。このズレ量になるように、２つの平行平面板１７を回転させる。

なお、蛍光の光量ロスが問題にならない場合は、２つの平行平面板を結像光学系の集光レンズ１１とピンホール板１２の間の位置に配置して、図４の実施形態と同様に回動の制御をガルバノスキャナ５に同期してコンピュータ１０により行うことにより本発明の目的を達成できる。

この場合も、ガルバノスキャナ５がガルバノミラー型スキャナであるので、回動手段としては、ガルバノ型スキャナを用いるのが適当であり、両者のマッチングがとりやすいが、レゾナント型スキャナ、ピエゾ素子を適宜使用することができる。

図５は、本発明の実施の形態の第５の例であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。図５に示す実施の形態はダイクロイックミラー４と偏向手段９の間に、望遠鏡系１９が設けられている点が、図１に示す実施の形態と異なるだけで、残りの光学系は同じである。

偏向手段９で偏向する量は極小さく、非常に高精度の偏向が必要となるため、望遠鏡で倍率色収差のずれを拡大し、その大きなずれを補正する方が補正しやすい。そのため、この実施の形態においては、望遠鏡系１９(ケプラー型、ガリレオ型どちらでも可)を設けている。

以上の実施の形態において、対物レンズが交換された場合には、走査手段の駆動量と、２次元的光偏向手段、ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段、集光レンズを２次元的にシフトさせる手段、平行平面板のいずれか１つの駆動量との関係（蛍光をピンホール内に集光させるための関係）が変わってくる。よって、コンピュータ１０に、使用する対物レンズ毎に、これらの関係を記憶させておき、実際に使用される対物レンズに応じた関係で、これらを駆動するようにすることが望ましい。

又、以上の実施の形態では、光源からの光をダイクロイックミラー４で反射させて折り曲げ、試料を落射照明し、発生した蛍光がダイクロイックミラー４を透過するようにしていたが、光源からの光がダイクロイックミラー４を透過するようにして、蛍光をダイクロイックミラー４で反射させて折り曲げるようにしてもよい。又、ダイクロイックミラー４の代わりに、ダイクロイックプリズムを使用するようにしてもよい。

又、光源１が単色の場合には、フィルタ３は使用しなくてもよい。又、フィルタ８は、ダイクロイックミラー４から光検出器１３の間のどの位置にあってもよい。なお、本発明の実施の形態は、光源の波長がＵＶ領域や、405nm等、より短くなるほど、対物レンズの倍率色収差が大きくなりやすいので有効である。

また、より望ましくは、対物レンズ６とガルバノスキャナ５の間に、瞳リレーレンズと結像レンズが配置される。この場合、ガルバノスキャナ５で２次元に走査された照明光は、瞳リレーレンズで一旦結像され、結像レンズに入射して平行光に戻され、その後さらに対物レンズ６に入射して、試料７の検査面に集光する。対物レンズ６は交換可能である。

Claims (14)

1. 照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
   前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
   前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
   前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
   前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
   前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
   前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
   前記光分離手段と前記ピンホール板との間に、前記光走査手段と同期して駆動される２次元的光偏向手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記光分離手段と前記２次元的光偏向手段との間に、望遠鏡光学系を設けたことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査共焦点顕微鏡。
3. 照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
   前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
   前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
   前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
   前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
   前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
   前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
   前記光源と前記光分離手段との間に、前記光走査手段と同期して駆動される２次元的光偏向手段を有することを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡。
4. 前記光走査手段と、前記２次元的光偏向手段が、ガルバノミラー型スキャナであることを特徴とする、請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記２次元的光偏向手段は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とする請求項１から請求項４のうちいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
6. 照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
   前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
   前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
   前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
   前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
   前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
   前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
   前記光走査手段と同期して駆動される、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段を備えたことを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡。
7. 前記２次元シフト手段は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とする請求項６に記載の共焦点顕微鏡。
8. 照明光系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
   前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
   前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
   前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
   前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
   前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
   前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
   前記光源と前記光分離手段との間に設けられた照明レンズと、前記光源の間に、前記光走査手段と同期して回転駆動される、平行平面板を設けたことを特徴とするレーザ走査共焦点顕微鏡。
9. 前記平行平面板は、２枚設けられ、互いに垂直の方向の回転軸を有することを特徴とする請求項８に記載のレーザ走査共焦点顕微鏡。
10. 前記平行平面板は、前記光走査手段の偏向量に対応して生じる前記照明光
    と前記観察光との光路のズレを補正することを特徴とする請求項８又は請求項９に記載の共焦点顕微鏡。
11. 前記光走査手段の偏向量と、前記２次元的光偏向手段、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段、前記集光レンズを２次元的にシフトさせる手段、前記平行平面板のいずれか１つの駆動量との関係を、使用する対物レンズ毎に記憶する記憶手段を有することを特徴とする請求項１から請求項１０のうちいずれか１項に記載のレーザ走査共焦点顕微鏡。
12. 使用する対物レンズ毎に、該対物レンズの倍率色収差に関するデータを記する記憶手段と、
    前記データを用いて、前記光走査手段の偏向量と、前記２次元的光偏向手段、前記ピンホール板を２次元的にシフトさせる手段、前記集光レンズを２次元的にシフトさせる手段、前記平行平面板のいずれか１つの駆動量との関係を算出する演算手段と
    を有することを特徴とする請求項１から請求項１０のうちいずれか１項に記載のレーザ走査共焦点顕微鏡。
13. 前記光走査手段の走査情報と前記観察光の強度情報とから、前記駆動量を補正する補正手段を有することを特徴とする請求項１２項記載のレーザ走査共焦点顕微鏡。
14. 照明光学系に対して被検物と共役な位置に置かれ、照明光を射出する光源と、
    前記照明光と前記検検物からの観察光とを分離する光分離手段と、
    前記照明光を前記被検物上で走査する光走査手段と、
    前記光走査手段と前記試料との間に配置され、前記被検物に集光点を結ぶ対物レンズと、
    前記対物レンズの集光点と共役な位置に前記観察光を集光させる集光レンズと、
    前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
    前記ピンホール板のピンホールを通過した観察光を受光する受光手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
    前記光走査手段と同期して駆動される、前記観察光の集光位置と前記ピンホールとの位置関係を補正する補正手段とを有することを特徴とする共焦点顕微鏡。

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