JP6555811B2 - 顕微鏡システム、特定方法、及び、プログラム - Google Patents

顕微鏡システム、特定方法、及び、プログラム Download PDF

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Description

本発明は、顕微鏡システム、顕微鏡システムが備える球面収差を補正する補正装置の設定値を特定する特定方法、及び、プログラムに関する。
例えば、特許文献１に記載されるような、カバーガラスの厚さに起因する球面収差を補正する補正環付きの対物レンズが知られている。補正環付きの対物レンズは、対物レンズとサンプルとの間を満たす媒質の屈折率とサンプルの屈折率に差がある場合には、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を補正する手段としても使用可能である。
ところで、球面収差が補正された状態では、球面収差が補正されていない状態に比べて、コントラストの高い画像が得られる。このため、画像のコントラストに基づいて、球面収差が補正される補正環の設定を特定することができる。このような技術は、例えば、特許文献２に記載されている。
特開平０５−１１９２６３号公報 特開２００２−１６９１０１号公報
しかしながら、球面収差が補正される補正環の設定を特定するためには、補正環の設定値が異なる複数の状態で画像データを取得する必要があり、また、高い精度で特定しようとするほどより多くの画像データが必要となる。さらに、球面収差が補正される補正環の設定は観察対象面の深さ毎に異なるため、観察対象面の深さを変更する度に、複数の画像データを取得し直して設定を特定し直す必要がある。
従って、画像データの取得にはある程度の時間がかかることを考慮すると、球面収差が良好に補正される補正環の設定を短時間で特定することは難しい。なお、以上では、カバーガラスの厚さや観察対象面の深さによって変化する球面収差を補正する手段として補正環を例示したが、球面収差を補正する任意の手段において、同様の課題が生じうる。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、球面収差が良好に補正される設定を短時間で特定する技術を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有し、画像データを取得する顕微鏡装置と、前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定する推定手段と、前記顕微鏡装置で取得された画像データから算出されたコントラスト値と前記推定手段で推定された球面収差量とを用いて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出する算出手段を備え、前記推定手段は、推定した前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、前記顕微鏡装置は、前記推定手段により決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、前記算出手段は、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を算出する顕微鏡システムを提供する。
本発明の別の態様は、対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有する顕微鏡装置で画像データを取得し、前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定し、推定された前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を特定する特定方法を提供する。
本発明の更に別の態様は、対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有する顕微鏡装置が取得した画像データからコントラスト値を算出し、前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定し、推定された前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を特定する処理をコンピュータに実行させるプログラムを提供する。
本発明によれば、球面収差が良好に補正される設定を短時間で特定することができる。
実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 図１に例示される演算装置の構成を例示した図である。 図１に例示される顕微鏡の構成を例示した図である。 Ｚスタック撮影処理のフローチャートである。 目標値算出処理のフローチャートである。 目標値算出処理において最初に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。 目標値算出処理において２回目に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。 従来のコントラスト評価式の空間周波数特性と光学系の変調伝達関数（Modulation Transfer Function）との関係を例示した図である。 顕微鏡システムで使用するコントラスト評価式の空間周波数特性と従来のコントラスト評価式の空間周波数特性とを比較した図である。 画像データの領域毎に領域目標値を算出した例を示した図である。 別の目標値算出処理のフローチャートである。 図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。 更に別の目標値算出処理のフローチャートである。 目標値の信頼性と評価値の関係について説明するための図である。 目標値を複数回算出したときの目標値の変化の様子を例示した図である。 第２の目標値を複数回算出したときの第２の目標値の変化の様子を例示した図である。 別のＺスタック撮影処理のフローチャートである。 撮影モードにおける走査ユニット１０２の設定を例示した図である。 図１６Ａに例示される設定からズーム倍率を拡大した設定を例示した図である。 図１６Ａに例示される設定から視野を維持しつつサンプリング回数を増やした設定を例示した図である。 コントラスト算出モードにおける走査ユニット１０２の設定の一例を示した図である。 コントラスト算出モードにおける走査ユニット１０２の設定の別の一例を示した図である。 更に別のＺスタック撮影処理のフローチャートである。 推定関数の一例を示した図である。 補正関数の一例を示した図である。 補正関数の別の例を示した図である。 屈折率表示処理のフローチャートである。 サンプルＳの構造を例示した図である。 図１に例示される表示装置に表示されるグラフの一例を示した図である。 屈折率算出処理のフローチャートである。 変化率と屈折率の関係を示した図である。 注目位置における屈折率情報をグラフ上に表示した図である。 図９Ａとは異なる注目位置における屈折率情報をグラフ上に表示した図である。 サンプルの屈折率分布を示す屈折率情報をグラフ上に表示した図である。 屈折率の算出方法について説明するための図である。 別の屈折率表示処理のフローチャートである。 図１に例示される表示装置に表示される三次元画像の一例を示した図である。 注目位置における屈折率情報を三次元画像上に表示した図である。 屈折率情報とグラフとを三次元画像上に表示した図である。 別の屈折率表示処理のフローチャートである。 実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 実施例３に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
図１は、本実施例に係る顕微鏡システム１の構成を例示した図である。図２は、図１に例示される演算装置２０の構成を例示した図である。図３は、図１に例示される顕微鏡１００の構成を例示した図である。
図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡１００と、顕微鏡制御装置１０と、演算装置２０と、表示装置３０と、演算装置２０への指示を入力するための複数の入力装置（キーボード４０、補正環操作装置５０、Ｚ駆動部操作装置６０）を備えている。
顕微鏡制御装置１０は、演算装置２０からの指示に従って顕微鏡１００の動作を制御する装置であり、顕微鏡１００の各種電動部の動作を制御する制御信号を生成する。顕微鏡制御装置１０は、光源の出力を制御する光源制御装置１１と、ズーム倍率を制御するズーム制御装置１２と、観察対象面の光軸方向の位置（以降、単に、観察対象面の位置と記す）を制御するＺ制御装置１３と、補正環１１１の設定値を制御する補正環制御装置１４と、を備えている。ここで、補正環１１１の設定値とは、例えば、基準位置に対する補正環１１１の回転角度のことである。
演算装置２０は、各種の演算処理を行うコンピュータであり、例えば、図２に示すように、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、メモリ２２、入力Ｉ／Ｆ装置２３、出力Ｉ／Ｆ装置２４、記憶装置２５、及び、可搬記録媒体２７が挿入される可搬記録媒体駆動装置２６を備え、これらがバス２８によって相互に接続されている。なお、図２は、演算装置２０の構成の一例であり、演算装置２０はこの構成に限定されるものではない。
ＣＰＵ２１は、所定のプログラムを実行して演算処理等を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、記憶装置２５または可搬記録媒体２７に記憶されているプログラムまたはデータを一時的に格納する。
入力Ｉ／Ｆ装置２３は、キーボード４０、補正環操作装置５０、Ｚ駆動部操作装置６０、及び表示装置３０からの信号を受信する。また、入力Ｉ／Ｆ装置２３は、図３において後述する顕微鏡１００のＡ／Ｄ変換器１０８からの信号も受信する。出力Ｉ／Ｆ装置２４は、表示装置３０及び顕微鏡制御装置１０へ信号を出力する。
記憶装置２５は、例えば、ハードディスク記憶装置であり、主に各種データやプログラムの保存に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２６は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２７を収容するもので、可搬記録媒体２７は、記憶装置２５を補助する役割を有する。
演算装置２０は、記憶装置２５または可搬記録媒体２７に記憶されているプログラムをＣＰＵ２１がメモリ２２にロードして実行することで、様々な機能を実現する。演算装置２０は、例えば、顕微鏡１００からの出力に基づいて画像データを生成する手段（画像データ生成手段）、画像データのコントラスト値を算出する手段（コントラスト値算出手段）、球面収差が補正される補正環１１１の設定値である設定目標値を算出する手段（目標値算出手段）、球面収差量を推定する手段（推定手段）、サンプルＳの屈折率を算出する手段（屈折率算出手段）、及び、表示装置３０を制御する手段（表示制御手段）として動作する。
表示装置３０は、例えば、液晶ディスプレイ装置、有機ＥＬディスプレイ装置、ＣＲＴディスプレイ装置などである。なお、表示装置３０は、タッチパネルセンサを備えてもよく、その場合、入力装置としても機能する。
キーボード４０は、演算装置２０に情報を入力する入力装置である。キーボード４０は、利用者による操作に従って、演算装置２０が球面収差量を推定するための、対物レンズ１１０と観察対象面との間の媒質の情報（屈折率、対物レンズ１１０の光軸方向の厚さ）を演算装置２０へ入力する。例えば、キーボード４０は、対物レンズ１１０とサンプルＳの間の浸液の屈折率を入力し、さらに、サンプルＳの屈折率と厚さを入力する。また、サンプルＳが屈折率の異なる多層構造を有することが想定される場合には、屈折率が異なる層毎に、屈折率と厚さを入力する。さらに、カバーガラスが利用されている場合には、カバーガラスの屈折率と厚さを入力する。
補正環操作装置５０は、補正環１１１の設定値を指示するための入力手段である。利用者が補正環操作装置５０で補正環１１１の設定値を指示すると、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値を指示された値に変更する。なお、補正環操作装置５０の代わりに、キーボード４０を用いて補正環１１１の設定値を指示するようにしてもよい。
Ｚ駆動部操作装置６０は、観察対象面の位置の変更を指示するための入力手段である。利用者がＺ駆動部操作装置６０で観察対象面の位置の変更を指示すると、Ｚ制御装置１３は、Ｚ駆動部１０９を光軸方向に移動させて観察対象面の位置を変更する。
顕微鏡１００は、走査型顕微鏡の一種である２光子励起顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料であるが、生体試料に限られない。顕微鏡１００は、図３に示すように、照明光路上に、レーザー１０１と、走査ユニット１０２と、瞳投影光学系１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、対物レンズ１１０とを備えている。
レーザー１０１は、例えば、超短パルスレーザーであり、近赤外域のレーザー光を発振する。レーザー１０１の出力は、光源制御装置１１によって制御される。即ち、光源制御装置１１は、サンプルに照射するレーザー光のパワーを制御するレーザー制御装置である。
走査ユニット１０２は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナなどを含んでいる。走査ユニット１０２の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット１０２の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。
瞳投影光学系１０３は、走査ユニット１０２を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。ダイクロイックミラー１０５は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。
対物レンズ１１０は、補正環１１１を備えた乾燥系又は液浸系の対物レンズであり、Ｚ駆動部１０９に装着されている。Ｚ駆動部１０９は、対物レンズ１１０を対物レンズ１１０の光軸方向に移動させる手段であり、Ｚ駆動部１０９の移動（即ち、対物レンズ１１０の移動）は、Ｚ制御装置１３によって制御される。
補正環１１１は、その設定値を変更することにより対物レンズ１１０内のレンズを移動させて、球面収差を補正する補正装置である。補正環１１１の設定値は、補正環制御装置１４（補正装置制御装置）によって変更される。なお、補正環１１１の設定値は、補正環１１１を直接操作することで、手動で変更することもできる。
顕微鏡１００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー１０５の反射光路）上に、瞳投影光学系１０６と、光検出器１０７とを備えている。光検出器１０７から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０８に出力される。
瞳投影光学系１０６は、対物レンズ１１０の瞳を光検出器１０７に投影する光学系である。光検出器１０７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器１０８は、光検出器１０７からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。
以上のように構成された顕微鏡システム１では、顕微鏡１００は、走査ユニット１０２を用いてレーザー光で対物レンズ１１０の光軸と直交する方向にサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器１０７で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器１０７からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット１０２からの信号とに基づいて、画像データを生成する。即ち、顕微鏡システム１では、顕微鏡１００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
以下、補正環１１１を利用して観察対象面の深さに応じた球面収差を補正しながら、各観察対象面においてＺスタック画像を撮影するＺスタック撮影処理と、サンプルＳの任意の部位の屈折率を算出して、その屈折率に関する情報（以降、屈折率情報と記す。）を表示する屈折率表示処理について説明する。
図４は、顕微鏡システム１で行われるＺスタック撮影処理のフローチャートである。図５は、顕微鏡システム１で行われる目標値算出処理のフローチャートである。図６Ａ及び図６Ｂは、図５に示す目標値算出処理について説明するための図である。図６Ａには、最初に決定した複数の設定値で得られる複数の評価値が、図６Ｂには、２回目に決定した複数の設定値で得られる複数の評価値が、示されている。図７は、従来のコントラスト評価式の空間周波数特性と光学系の変調伝達関数（以降、ＭＴＦと記す）との関係を例示した図である。図８は、顕微鏡システム１で用いるコントラスト評価式の空間周波数特性と従来のコントラスト評価式の空間周波数特性とを比較した図である。以下、図４から図８を参照しながら、図４に示すＺスタック撮影処理について説明する。
顕微鏡システム１は、まず、撮影条件及び媒質情報を取得する（ステップＳ１）。ここでは、利用者は、例えば、キーボード４０を用いて、Ｚスタック画像を取得すべき深さ範囲と間隔とを入力する。演算装置２０は、入力された深さ範囲と間隔を、撮影条件として取得して、これらの情報からＺスタック画像を取得すべき観察対象面の複数の位置（以降、撮影位置と記す）を決定する。深さ範囲とは、観察対象面が移動する光軸方向の範囲のことである。また、利用者は、キーボード４０を用いてサンプルＳの屈折率を入力する。サンプルＳが屈折率の異なる複数の層からなる場合には、層毎に屈折率と厚さを入力する。また、対物レンズ１１０が液浸系の対物レンズであれば、浸液の屈折率も入力する。さらに、カバーガラスを使用している場合には、カバーガラスの屈折率と厚さも入力する。演算装置２０は、これらの情報を媒質情報として取得する。
次に、顕微鏡システム１は、観察対象面の位置を初期撮影位置に変更する（ステップＳ２）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を光軸方向に移動させて、観察対象面の位置をステップＳ１で決定した複数の撮影位置のうちの一つである初期撮影位置に変更する。
観察対象面の位置が変更されると、顕微鏡システム１は、ステップＳ２で決定した観察対象面における球面収差が補正される補正環１１１の設定値（以降、設定目標値、又は、単に目標値、と記す）を算出する（ステップＳ３）。目標値は、顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する。ここでは、顕微鏡装置が取得した画像データに基づいて、演算装置２０が図５に示す目標値算出処理を実行する。なお、目標値算出処理で用いられる画像データを取得したときの観察対象面の深さを実測深さと記す。観察対象面の深さとは、サンプルＳの表面から観察対象面までの光軸方向の距離のことである。
目標値算出処理では、顕微鏡システム１は、推定される球面収差量に基づいて、補正環１１１の複数の設定値を決定する（ステップＳ１１）。ここでは、顕微鏡装置でサンプルＳの画像データを取得する際の補正環１１１の設定値を演算装置２０が複数個決定する。
ステップＳ１１では、具体的には、以下の手順により、複数の設定値が決定される。まず、演算装置２０は、現在の観察対象面の位置とステップＳ１で取得した媒質情報から、対物レンズ１１０と観察対象面との間の媒質の屈折率とその媒質の対物レンズ１１０の光軸方向の厚さを特定し、それらの情報に基づいて顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定する。即ち、演算装置２０は、顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定する推定手段である。演算装置２０では、浸液（対物レンズ１１０が乾燥系の対物レンズであれば、空気）とサンプルＳの屈折率の差が大きいほど、観察対象面の深さが深いほど、カバーガラスの厚さが基準値からずれているほど、大きな球面収差量が推定される。そして、球面収差量が推定されると、演算装置２０は、予め記憶装置２５に記憶されている、補正環１１１の設定値と補正環１１１が補正する球面収差量である補正量との関係を示す情報（以降、補正環情報と記す）に基づいて、推定された球面収差量に対応する補正環１１１の設定値（以降、推定設定値と記す）を算出する。推定設定値が算出されると、推定設定値を含む探索範囲を決定し、探索範囲を均等に分割する予め決められた数（ここでは１１）の設定値（補正環位置）を、複数の設定値として決定する。即ち、演算装置２０は、推定された球面収差量に基づいて複数の設定値を決定する。なお、図６Ａでは、θ０からθ１０までの１０個の設定値（補正環位置）が決定される例が示されている。
次に、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定値をステップＳ１１で決定した設定値に変更する（ステップＳ１２）。ここでは、補正環制御装置１４が演算装置２０からの指示に従ってステップＳ１１で決定した複数の設定値のいずれかに設定する。例えば、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値をθ０に変更する。
補正環１１１の設定値が変更されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの画像データを取得する（ステップＳ１３）。ここでは、顕微鏡装置が演算装置２０からの指示に従って画像データを取得する。例えば、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値がθ０の状態で画像データを取得する。
その後、顕微鏡システム１は、ステップＳ１１で決定したすべての設定値で画像データを取得したか否かを判定し（ステップＳ１４）、すべての設定値で画像データを取得していない場合には、ステップＳ１２からステップＳ１４の処理を繰り返す。これにより、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値が異なる複数の状態の各々で、サンプルＳの観察対象面の画像データを取得し、その結果、複数の画像データを取得する。
すべての設定値で画像データが取得されると、顕微鏡システム１は、ステップＳ１３で取得した複数の画像データから複数の評価値を算出する（ステップＳ１５）。ここでは、演算装置２０が、画素間の画素値（輝度値）の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、複数の画像データから、複数のコントラスト値を算出する。なお、一般に、球面収差が補正された画像ほど高いコントラストを有していることから、コントラスト値は、球面収差が補正されているかどうかを評価する評価値として好適である。
画像のコントラストを評価する評価式としては、例えば、ｘ方向にｎ画素分ずれた位置にある２つの画素の画素値の差分の２乗を、画像データ全体で積算してコントラスト値を算出する、下式が知られている。下式は、J.F.Brennerらによって提案された評価式であり、Brenner gradientと呼ばれている。
ここで、ＦＢｒｅｎｎｅｒはコントラスト値であり、ｘは画像データを構成する画素の列を特定する変数であり、ｙは画像データを構成する画素の行を特定する変数である。Ｗは画像データを構成する画素のｘ方向の画素数（即ち、列数）であり、Ｈは画像データを構成する画素のｙ方向の画素数（即ち、行数）である。ｆは画素の画素値であり、ｎはシフト量であり、画素値の差分が算出される画素間の間隔を示す整数（例えば、２など）である。
顕微鏡の分野では、Brenner gradientのシフト量を２に設定するのが通常である。従って、ステップＳ１５では、シフト量２のBrenner gradientにより、ステップＳ１３で取得した複数の画像データの各々のコントラスト値を算出してもよい。
しかしながら、Brenner gradientのシフト量を特定の値に固定して画像のコントラストを評価すると、光学系が情報を伝達することができる空間周波数領域内に、画像のコントラストに対する感度が極端に低い領域が生じてしまう可能性がある。このため、画像のコントラストを適切に評価することができない場合が起こり得る。
例えば、画素サイズが０．５ｍｍであり、ｘ方向の画素数が１０２４画素である撮像素子を用いる場合、シフト量２におけるBrenner gradient（評価式）は、図７の線ＬＢｒｅｎｎｅｒで示す空間周波数特性を有する。また、図７の線ＬＭＴＦは光学系のＭＴＦを示している。従って、この場合、光学系によってコントラスト情報が伝達されているにもかかわらず、撮像素子上で1000[line/mm]程度の空間周波数を有する成分については、そのコントラストが低く評価されてしまう。なお、図７では、シフト量２におけるBrenner gradientの特性を例示したが、他のシフト量におけるBrenner gradientでも、コントラストに対する感度が低い空間周波数領域が存在する。
そこで、ステップＳ１５では、例えば、異なる複数のシフト量を使用する以下の評価式により、ステップＳ１３で取得した複数の画像データの各々のコントラスト値を算出してもよい。なお、図６Ａには、ステップＳ１３で取得した複数の画像データのコントラスト値が示されている。
例えば、５つのシフト量（ｎ＝１、２、３、５、１０）を用いる場合、評価式（２）は、図８の線Ｌｗｉｄｅに示す空間周波数特性を有する。なお、図８では、評価式（１）の空間周波数特性と評価式（２）の空間周波数特性との比較を容易にするため、評価式（２）のコントラスト値を評価式（２）で使用するシフト量の数（５つ）で割った値で線Ｌｗｉｄｅを描いている。
図８に示すように、評価式（２）によれば、従来の評価式（１）に比べて、広い空間周波数領域でコントラストを安定して評価することができる。このため、画像に含まれる周波数成分によらず、即ち、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。
複数の評価値が算出されると、顕微鏡システム１は、所定の条件を満たしているか否かを判定する（ステップＳ１６）。所定の条件としては、例えば、ステップＳ１２からステップＳ１６までの処理の繰り返し回数が所定回数に達しているか否かであってもよく、複数の設定値の平均間隔が所定値以下であるか否かであってもよい。
ステップＳ１６で所定の条件を満たしていない場合には、顕微鏡システム１は、改めて複数の設定値を決定し（ステップＳ１７）、その後、ステップＳ１２からステップＳ１６の処理を繰り返す。
ステップＳ１７では、演算装置２０は、以下の２つの条件を満たすように複数の設定値を決定する。第１の条件は、ステップＳ１７で決定する複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔が、先の複数の設定値の分布範囲及び平均間隔と比較して、狭いことである。第２の条件は、ステップＳ１７で決定する複数の設定値の分布範囲内に、ステップＳ１５で算出された最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれることである。なお、本明細書において、評価値に対応する設定値とは、ある画像データから算出された評価値に対するその画像データが取得されたときの補正装置の設定値のことをいうものとする。また、設定値に対応する評価値とは、ある画像データが取得されたときの補正装置の設定値に対するその画像データから算出された評価値のことをいうものとする。
これにより、顕微鏡装置は、設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する処理を、複数の状態で設定される補正環１１１の複数の設定値の分布範囲と平均間隔とが繰り返し毎に狭まり、且つ、その分布範囲内に演算装置２０が算出した最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれるように、繰り返す。そして、演算装置は、繰り返し毎に、複数の画像データから複数の評価値を算出する。
図６Ｂは、ステップＳ１７で決定した複数の設定値に基づいて取得した複数の画像データのコントラスト値が示されている。図６Ａと図６Ｂを比較すると、図６Ｂに示す複数の設定値（補正環位置）は、上記２つの条件を満たしていることが確認できる。なお、図６Ａと図６Ｂでは、いずれも１１個の設定値（補正環位置）が決定されている例が示されているが、設定値の数は、繰り返し毎に設定値の平均間隔が狭くなる限り、同一に限られず、増加しても減少してもよい。
ステップＳ１６で所定の条件を満たしている場合には、顕微鏡システム１は、ステップＳ１５で算出した複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて目標値を算出し（ステップＳ１８）、目標値算出処理を終了する。ここでは、例えば、最後の繰り返しにおいてステップＳ１５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。また、最後の繰り返しに限らずステップＳ１５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。なお、演算装置２０は、算出した目標値と観察対象面の位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。
顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、補正環１１１の設定値を目標値に変更する（ステップＳ４）。ここでは、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値をステップＳ３で算出された目標値に変更する。なお、補正環制御装置１４は、自動的に、即ち、演算装置２０からの指示に従って、ステップＳ３で算出した目標値に補正環１１１の設定値を変更してもよい。また、手動により、即ち、ステップＳ３で算出された目標値が表示装置３０に表示され、表示された目標値に基づいて利用者が補正環操作装置５０を操作することにより、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。また、利用者が補正環１１１を直接操作して補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。
さらに、顕微鏡システム１は、レーザー１０１の出力を設定する（ステップＳ５）。ここでは、光源制御装置１１が、補正環１１１の設定値が目標値であるときに顕微鏡装置で取得された画像データに基づいて、サンプルＳに照射するレーザー光のパワーを制御する。例えば、ステップＳ４で補正環１１１の設定値を変更した後に改めて画像データを取得して、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよい。また、ステップＳ３で補正環１１１の設定値が目標値であるときの画像データが既に取得されている場合には、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよいし、光検出器１０７の感度（ゲイン）を調整してもよい。
レーザー１０１の出力の設定が完了すると、顕微鏡システム１は、Ｚスタック画像を撮影する（ステップＳ６）。ここでは、顕微鏡装置が、球面収差が補正された状態で、サンプルＳのＺスタック画像を撮影し、画像データを取得する。その後、顕微鏡システム１は、すべてのＺスタック画像を撮影済みか否かを判定する（ステップＳ７）。ここでは、演算装置２０が、ステップＳ１で決定した複数の撮影位置でＺスタック画像を撮影済みか否かを判定する。
すべてのＺスタック画像を撮影済みである場合には、顕微鏡システム１は、Ｚスタック撮影処理を終了する。すべてのＺスタック画像を撮影済みではない場合には、顕微鏡システム１は、観察対象面の位置を次の撮影位置に変更する（ステップＳ８）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を光軸方向に移動させて、観察対象面の位置をステップＳ１で決定した複数の撮影位置のうちの未だＺスタック画像が取得されていない撮影位置に変更する。その後、顕微鏡システム１は、再び、ステップＳ３からステップＳ７の処理を実行する。これを繰り返すことで、顕微鏡システム１により、全てのＺスタック画像が撮影される。
以上のように、顕微鏡システム１は、画像データから算出されたコントラスト値と、対物レンズと観察対象面の間の媒質の情報に基づいて推定された球面収差量とを用いて、設定目標値を特定する。これにより、球面収差が良好に補正される設定を短時間で特定することができる。より具体的には、顕微鏡システム１では、顕微鏡装置が、補正環１１１の設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得して、演算装置２０が、複数の画像データから算出された複数のコントラスト値から補正環１１１の設定目標値を算出する。この際、演算装置２０が、顕微鏡装置で発生する球面収差量を予め推定し、推定された球面収差量に基づいて補正環１１１の設定値が異なる複数の状態を決定する。これにより、補正環１１１の設定値の探索範囲を、図６Ａに示すように、当初からある程度絞り込むことができる。このため、画像データの取得回数を減らすことができるため、短時間で設定目標値を特定することが可能となる。
また、顕微鏡システム１は、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を短時間で良好に補正しながらＺスタック画像を撮影することができる。これにより、顕微鏡１００が有する光学性能を十分に発揮して、高品質な画像を得ることができる。また、球面収差が補正された状態では、一般に、球面収差が補正されていない状態に比べて明るい画像が得られる。このため、球面収差が補正された状態で取得された画像データに基づいてレーザー１０１の出力を設定することで、レーザー１０１の出力を抑えて、生体試料へのダメージを抑制することができる。なお、この効果は、より大きな出力が必要とされるサンプルＳの深部を観察する場合に、特に顕著である。
また、顕微鏡システム１は、複数のシフト量を用いてコントラスト値を算出する場合には、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することができる。
なお、図５のステップＳ１５では、シフト量を５つ使用する例を示したが、安定したコントラストの評価を行うためには、複数のシフト量が使用されればよく、５つに限られない。また、画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、画像データの全体領域を複数の領域に分割して、分割によって得られる領域毎に評価値（以降、画像データ毎に算出される評価値と区別するため、領域評価値と記す。）を算出してもよい。この場合、ステップＳ１８では、領域毎に目標値（全体領域に対して算出される目標値と区別するため、以降、領域目標値と記す。）を算出し、複数の領域目標値に基づいて、全体領域に対する目標値を算出する。
図９は、画像データの全体領域ＷＲを領域Ｒ１から領域Ｒ９の９つの領域に分割し、領域毎に領域目標値を算出した例を示している。全体領域に対する目標値は、例えば、領域目標値を昇順又は降順に並べた（θ３：θ３：θ４：θ４：θ５：θ５：θ５：θ６：θ６）中間値（θ５）に決定されてもよく、最頻値（θ５）に決定されてもよい。なお、分割数も９つに限られず、９つより少なくても多くてもよい。
領域毎に領域目標値を算出し、複数の領域目標値に対する統計的な処理により確からしい目標値を算出することで、画像データに他の画素データと比較して極端に高輝度又は低輝度を有する画素データが含まれる場合であっても、その影響を抑えて画像のコントラストを評価することができる。このため、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。
また、図５のステップＳ１５（評価値算出処理）では、ステップＳ１３で取得した画像データ毎に、複数のシフト量を用いて単一のコントラスト値を算出する例を示したが、画像データ毎に、それぞれ異なるシフト量を用いて算出した複数のコントラスト値を算出してもよい。その場合、ステップＳ１８で、同じシフト量を用いて算出された複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて、そのシフト量における暫定的な目標値（以降、暫定目標値と記す）を算出し、各々が異なるシフト量における暫定目標値である、複数の暫定目標値から最終的な単一の目標値を算出してもよい。複数の暫定目標値から最終的な目標値を算出する処理は、例えば、複数の暫定目標値から最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）であってもよく、複数の暫定目標値から確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）であってもよい。即ち、安定したコントラストの評価を行うためには、ステップＳ１５で複数の画像データから複数のシフト量を用いて複数のコントラスト値が算出されればよく、画像データの数と算出されるコントラストの数は一致しなくてもよい。
図１０は、顕微鏡システム１で行われる別の目標値算出処理のフローチャートである。図１１は、図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。図１０及び図１１を参照しながら、図１０に示す目標値算出処理について説明する。なお、図１０に示す目標値算出処理のステップＳ２１からステップＳ２５までの処理は、図５に示す目標値算出処理のステップＳ１１からステップＳ１５までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。
顕微鏡システム１は、ステップＳ２５で複数の評価値が算出されると、複数の画像データの座標情報に基づいて目標値を算出し（ステップＳ２６）、目標値算出処理を終了する。なお、画像データの座標情報とは、その画像データから算出された評価値とその評価値に対応する補正環１１１の設定値との組み合わせをいうものとする。
ステップＳ２６では、演算装置２０は、まず、ステップＳ２３で取得した複数の画像データから３つ以上の画像データを選択する。この３つ以上の画像データは、ステップＳ２５で算出した複数の評価値のうちの最大値が算出された画像データが含まれるように、選択される。
その後、演算装置２０は、選択した３つ以上の画像データの座標情報に基づいて目標値を算出する。具体的には、３つ以上の画像データの座標情報に基づいて、補間又は関数近似により関数を算出する。なお、この関数は、評価値と設定値に関する関数である。そして、算出した関数のピーク座標（評価値が最大となる座標）から得られる設定値が目標値として算出される。演算装置２０は、算出した目標値と観察対象面の位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。
図１１には、最大の評価値が算出される画像データとその前後（つまり、設定値が近い）の画像データからなる３つの画像データを選択し、それらの画像データから得られる３つの座標情報からラグランジュ補間により二次関数を算出し、そのピーク座標から目標値を算出した例が示されている。なお、補間には、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。また、関数近似にも、最小二乗法などの任意の近似法が採用され得る。
顕微鏡システム１は、図５に示す目標値算出処理の代わりに、図１０に示す目標値算出処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。また、図１０に示す目標値算出処理を実行した場合には、図５に示す目標値算出処理よりもさらに少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することができる。従って、顕微鏡システム１は、より短時間で球面収差を良好に補正することができる。
なお、図５に示す目標値算出処理と図１０に示す目標値算出処理を組み合わせて目標値を算出してもよい。例えば、図１０に示す目標値算出処理に図５のステップＳ１６及びステップＳ１７の処理を追加して、ステップＳ２６で算出した目標値が分布範囲に含まれるように、複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔を徐々に狭めながら、目標値の算出を繰り返してもよい。これにより、目標値をより高い精度で算出することが可能となる。
図１２は、顕微鏡システム１で行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。図１３は、目標値の信頼性と評価値の関係について説明するための図である。図１４Ａは、目標値を複数回算出したときの目標値の変化の様子を例示した図である。図１４Ｂは、第２の目標値を複数回算出したときの第２の目標値の変化の様子を例示した図である。図１２から図１４Ｂを参照しながら、図１２に示す目標値算出処理について説明する。なお、図１２に示す目標値算出処理のステップＳ３１からステップＳ３６までの処理は、図１０に示す目標値算出処理のステップＳ２１からステップＳ２６までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。
顕微鏡システム１は、ステップＳ３６で目標値が算出されると、目標値の信頼性の高低を判定済みか否かについて判定し（ステップＳ３７）、信頼性の高低を判定していない場合には、目標値の信頼性の高低を判定する（ステップＳ３８）。
図１３には、観察対象面の深さが１００μｍのときに取得した複数の画像データから算出した複数のコントラスト値（実測値）と、観察対象面の深さが６００μｍのときに取得した複数の画像データから算出した複数のコントラスト値（実測値）が、プロットされている。図１３に示すように、一般に観察対象面の位置が深くなるほど、球面収差が補正された状態での画像のコントラストは低下し、且つ、補正環の設定値の変更によるコントラストの変化も小さくなる。このため、球面収差が補正されている状態を正しく特定することが難しくなり、目標値の信頼性が低下する。
そこで、ステップＳ３８では、演算装置２０は、ステップＳ３５で算出した複数のコントラスト値に基づいて、ステップＳ３６で算出した目標値の信頼性の高低を判定する（ステップＳ３９）。より具体的には、演算装置２０は、例えば、複数のコントラスト値のうちの最大値のコントラスト値が所定の閾値以上であれば信頼性が高いと判定し、閾値未満であれば信頼性が低いと判定してもよい。また、演算装置２０は、観察対象面の深さに基づいて、目標値の信頼性の高低を判定してもよい。
顕微鏡システム１は、ステップＳ３９で信頼性が高いと判定された場合には、目標値算出処理を終了する。一方、ステップＳ３９で信頼性が低いと判定された場合には、複数の画像データを再度取得して、それらの画像データに基づいて目標値を再度算出する（ステップＳ３１からステップＳ３６）。これにより、顕微鏡システム１では、顕微鏡装置によって複数の画像データが複数回取得され、演算装置２０によって目標値が複数回算出される。
顕微鏡システム１は、ステップＳ３７で信頼性の高低を判定済みと判断すると、さらに、目標値を所定回数以上算出済みか否かを判定する（ステップＳ４０）。ここでは、演算装置２０は、例えば、予め決められた回数（例えば、３回）以上目標値を算出しているか否かを判定する。目標値の算出回数が予め決められた回数に達していないと判定されると、顕微鏡システム１は、複数の画像データを再度取得して、それらの画像データに基づいて目標値を再度算出する（ステップＳ３１からステップＳ３６）。
顕微鏡システム１は、ステップＳ４０で所定回数以上目標値を算出済みであると判断すると、複数の目標値に基づいて第２の目標値を算出し（ステップＳ４１）、目標値算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ３６で算出した複数の目標値に基づいて、第２の目標値を算出する。第２の目標値を算出する処理は、例えば、複数の目標値から最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）であってもよく、複数の目標値から確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）であってもよい。
図１４Ａには、観察対象面の深さが１００μｍのときに算出された複数の目標値と、観察対象面の深さが６００μｍのときに算出された複数の目標値が、プロットされている。図１４Ｂには、観察対象面の深さが１００μｍのときに算出された複数の目標値を３つ毎に平均した第２の目標値と、観察対象面の深さが６００μｍのときに算出された複数の目標値を３つ毎に平均した第２の目標値と、がプロットされている。図１４Ａに示すように、画像のコントラストが低くなるサンプル深部（ここでは、深さ６００μｍの部位）では、目標値は、算出される度に比較的大きく変動する。しかしながら、図１４Ｂに示すように、平均化処理によって算出される第２の目標値では、算出される度に生じる変動幅が小さくなり、観察対象面の深さによらず、ほぼ一定の値を示している。つまり、第２の目標値を算出することで、データの信頼性が向上する。
顕微鏡システム１は、図５に示す目標値算出処理の代わりに、図１２に示す目標値算出処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。また、図１２に示す目標値算出処理を実行することで、画像のコントラストが低く目標値の信頼性が低い場合には、複数回目標値を算出し、より信頼性の高い第２の目標値を算出することができる。従って、顕微鏡システム１は、観察対象面の深さによらず、球面収差を良好に補正することができる。
なお、図１２では、目標値の信頼性の高低を判定して、第２の目標値を算出するか否かを決定する例を示したが、第２の目標値は、目標値の信頼性の高低を判定することなく算出されてもよい。また、図５に示す目標値算出処理と図１２に示す目標値算出処理を組み合わせて第２の目標値を算出してもよい。例えば、図５に示す目標値算出処理に図１２のステップＳ３７からステップＳ４１の処理を追加してもよい。
また、図１２では、複数の目標値から第２の目標値を算出することで、目標値（第２の目標値）の信頼性の向上を図る例を示したが、信頼性を向上させる方法はこの方法に限られない。複数の評価値を設定値毎に取得し、複数の評価値から第２の評価値を設定値毎に算出し、異なる設定値で算出された複数の第２の評価値から信頼性の高い目標値を算出してもよい。この場合、ステップＳ３６の処理を省略し、ステップＳ４１において、同じ設定値で取得した複数の評価値から、最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）、又は、確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）により、設定値毎に第２の評価値を算出してもよい。その上で、さらに、異なる設定値に対応する複数の第２の評価値から目標値を算出してもよい。なお、複数の第２の評価値から目標値を算出する処理は、例えば、ステップＳ３６と同様の処理に、座標情報に基づく処理であってもよい。このような方法でも、複数の画像データの情報から目標値が算出されるため、目標値の信頼性が向上することができる。
図１５は、顕微鏡システム１で行われる別のＺスタック撮影処理のフローチャートである。図１６Ａから図１６Ｅは、走査ユニット１０２の設定を説明するための図である。図１６Ａは、撮影モードにおける走査ユニット１０２の設定を例示した図である。図１６Ｂは、図１６Ａに例示される設定からズーム倍率を拡大した設定を例示した図である。図１６Ｃは、図１６Ａに例示される設定から視野を維持しつつサンプリング回数を増やした設定を例示した図である。図１６Ｄ及び図１６Ｅは、コントラスト算出モードにおける走査ユニット１０２の設定の一例を示した図である。図１５から図１６Ｅを参照しながら、図１５に示すＺスタック撮影処理について説明する。なお、図１５に示すＺスタック撮影処理は、動作モードを変更する処理（ステップＳ５３及びステップＳ５７）が含まれている点が図４に示すＺスタック撮影処理とは異なっている。その他の処理（ステップＳ５１、ステップＳ５２、ステップＳ５４からステップＳ５６、ステップＳ５８からステップＳ６０）は、図４に示すＺスタック撮影処理のステップＳ１からステップＳ８までの処理と同様である。
顕微鏡システム１は、ステップＳ５２で観察対象面の位置が初期撮影位置に変更されると、動作モードを目標値算出モードに設定する（ステップＳ５３）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、ズーム制御装置１２が、走査ユニット１０２の設定を後述する撮影モードでの設定（第１の設定）とは異なる設定（第２の設定）に変更する。なお、目標値算出モードにおける走査ユニット１０２の設定は、コントラスト値の算出のために一定以下の画素分解能（即ち、一定以上の画素解像力）を確保しつつ、できる限り高速な画像データの取得を可能にするための設定である。以下、目標値算出モードにおける走査ユニット１０２の設定についてより具体的に説明する。
画素分解能が大きすぎると、画素分解能が光学分解能よりも大きくなり、画素分解能から算出される画素サイズが光学的に識別し得る２点間の距離よりも大きくなってしまう。この場合、発生した球面収差が画像データに十分に反映されないため、画像のコントラストを正しく評価することができない。従って、コントラスト値を算出するための画像データを取得する際には、画素分解能が小さいことが望ましく、コントラストを適切に評価可能な一定以下であることが望ましい。
画素分解能を小さくする方法には、ズーム倍率を高くする方法がある。例えば、図１６Ａに示すような撮影モードにおける走査ユニット１０２の設定（例えば、画像サイズ５１２×５１２、ズーム倍率１倍）での画素分解能が大きすぎる場合には、図１６Ｂに示すように、ズーム倍率を高くすることで、画素分解能を小さくすることができる。しかしながら、ズーム倍率だけを高くすると視野が狭まってしまうため、サンプルＳ内の構造物（構造物ＳＴ１、構造物ＳＴ２）が視野内に存在しない確率が高くなる。視野内に構造物（蛍光観察であれば蛍光を発する構造物）が存在しない場合には、十分なコントラストが生じず、コントラスト値の算出に適さない。また、図１６Ｃに示すような、視野を維持したままズーム倍率を高くする方法では、画像サイズ（１０２４×１０２４）が大きくなるため、画像データの取得に時間がかかってしまう。
ところで、コントラスト値は、上述した式（１）及び式（２）に示すように、一定方向に並んだ画素間の画素値の差分に基づいて算出される。演算する画素間の時間差を小さくするため、通常は、走査線ＳＣに沿った方向（ｘ方向）に並んだ画素間の画素値の差分に基づいて算出される。従って、コントラスト値を適切に評価するために小さくすべき画素分解能は、ｘ方向に関する画素分解能であり、ｙ方向に関する画素分解能は、必ずしもｘ方向に関する画素分解能ほど小さい必要はない。
そこで、顕微鏡システム１では、図１６Ｄ及び図１６Ｅに示すように、視野を維持しながらズーム倍率を高くし、走査の一部を間引いて走査線ＳＣの数を減らした設定を、目標値算出モードにおける走査ユニット１０２の設定とする。図１６Ｄ、図１６Ｅは、それぞれ、図１６Ｃに示す設定における走査線数の１／２、１／４にした設定を示している。なお、走査線の間隔が広すぎると、構造物が視野内に存在するにも関わらず走査線上に位置しないことが起こり得る。このため、走査線数は、画像データのサンプルＳ、対物レンズ１１０の倍率、及び、走査手段のズーム倍率に基づいて決定することが望ましい。これにより、画像データの取得時間を短縮しながら、コントラストを適切に評価することができる。
なお、以上では、撮影モードでの画素分解能が大きい場合を例示したが、撮影モードでの画素分解能が十分に小さい場合には、コントラスト算出モードの設定は、走査線数の設定のみが撮影モードの設定と異なってもよい。また、撮影モードとコントラスト算出モードで、視野を一定に維持する例を示したが、コントラスト算出モードの視野は撮影モードの視野よりも広くてもよい。
顕微鏡システム１は、目標値算出モードで目標値を算出する（ステップＳ５４）。より詳細には、コントラスト算出用の画像データを取得して目標値を算出する。その後、補正環１１１とレーザー１０１の設定を変更する（ステップＳ５５、ステップＳ５６）と、動作モードを撮影モードに変更する（ステップＳ５７）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、ズーム制御装置１２が、走査ユニット１０２の設定を目標値算出モードでの設定（第２の設定）とは異なる設定（第１の設定）に変更する。なお、撮影モードにおける走査ユニット１０２の設定は、観察用の画像データの取得に適した設定である。
その後、顕微鏡システム１は、撮影モードでＺスタック画像を撮影し（ステップＳ５８）、全てのＺスタック画像が撮影済みとなるまで、ステップＳ５３からステップＳ６０までの処理を繰り返す。
顕微鏡システム１は、図４に示すＺスタック撮影処理の代わりに、図１５に示すＺスタック撮影処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。また、図１５に示すＺスタック撮影処理を実行することで、画像のコントラストを短時間で適切に評価することが可能となるため、球面収差が良好に補正される設定をより短時間で特定することができる。従って、球面収差をより短時間で良好に補正することが可能となる。
図１７は、顕微鏡システム１で行われる更に別のＺスタック撮影処理のフローチャートである。図１８は、推定関数の一例を示した図である。図１９は、補正関数の一例を示した図である。図１７から図１９を参照しながら、図１７に示すＺスタック撮影処理について説明する。
顕微鏡システム１は、まず、撮影条件及び媒質情報を取得し（ステップＳ６１）、観察対象面の位置を初期撮影位置に変更し（ステップＳ６２）、目標値を算出する（ステップＳ６３）。なお、ステップＳ６１からステップＳ６３までの処理は、図４に示すステップＳ１からステップＳ３までの処理と同様である。
初期撮影位置における目標値が算出されると、顕微鏡システム１は、補正関数を算出する（ステップＳ６４）。ここでは、まず、演算装置２０は、ステップＳ６１で取得した媒質情報から、顕微鏡装置で発生する球面収差量を観察対象面の深さ毎に推定する。その後、演算装置２０は、推定された球面収差量に対応する観察対象面の深さ毎の推定設定値と、ステップＳ６３で算出された目標値とに基づいて、観察対象面の深さ毎の目標値を表わす補正関数を算出する。より具体的には、記憶装置２５に記憶されている補正環情報に基づいて、図１８に示すような、観察対象面の深さ毎の推定設定値を表わす推定関数Ｆ１を算出し、その後、推定関数Ｆ１をステップＳ６３で算出された目標値Ｐ１に基づいて変形して、図１９に示すような補正関数Ｆ２を算出する。なお、図１８には、サンプルが屈折率の異なる２層構造を有する場合の、推定関数が例示されている。また、図１９では、目標値Ｐ１を通るように推定関数Ｆ１が平行移動した補正関数Ｆ２が例示されている。
補正関数が算出されると、顕微鏡システム１は、補正環１１１とレーザー１０１の設定を変更し（ステップＳ６５、ステップＳ６６）、Ｚスタック画像を撮影する（ステップＳ６７）。撮影終了後、全てＺスタック画像を撮影済みか否かを判定し（ステップＳ６８）、撮影済みでない場合には、観察対象面の位置を次の撮影位置に変更する（ステップＳ６９）。なお、ステップＳ６５からステップＳ６９までの処理は、図４に示すステップＳ４からステップＳ８までの処理と同様である。
観察対象面の位置を変更すると、顕微鏡システム１は、補正関数に基づいて目標値を算出する（ステップＳ７０）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ６４で算出した補正関数と現在の観察対象面の深さに基づいて、現在の観察対象面の深さにおける目標値を算出する。その後、顕微鏡システム１は、全てのＺスタック画像の撮影が終了するまで、ステップＳ６５からステップＳ７０の処理を繰り返し、Ｚスタック撮影処理を終了する。
顕微鏡システム１は、図４に示すＺスタック撮影処理の代わりに、図１７に示すＺスタック撮影処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。また、図１７に示すＺスタック撮影処理では、補正関数を用いることで目標値を算出する処理における画像取得回数を大幅に減らすことができる。このため、球面収差が良好に補正される設定を更に短時間で特定することが可能となる。さらに、観察対象面がコントラストを生じさせる構造物が存在しない位置にある場合には、画像のコントラストを適切に評価することができないことがあるため、画像データから目標値を算出することが難しい。しかしながら、補正関数を用いて目標値を算出することで、より確実に球面収差を補正することができる。
なお、図１７では、初期撮影位置における目標値のみが画像データから算出される例を示したが、任意の複数の深さ位置における目標値においても画像データから算出されてもよい。実測深さを増やすことでより精度の高い補正関数を得ることができる。例えば、図２０に示すように、深さ６００μｍと１６００μｍで画像データから目標値Ｐ１及び目標値Ｐ２を算出し、推定関数Ｆ１を目標値Ｐ１及び目標値Ｐ２に基づいて変形して補正関数Ｆ３を算出してもよい。図２０には、目標値Ｐ１と目標値Ｐ２を通るように、推定関数Ｆ１を横方向（回転角度の軸方向）に拡大した補正関数Ｆ３が例示されている。また、目標値Ｐ１及び目標値Ｐ２を用いて最小二乗法などの任意の近似法により補正関数を算出してもよい。
また、図１７では、実測深さ以外の深さにおける目標値を補正関数に基づいて算出する例を示したが、補正関数を算出しなくてもよい。実測深さ以外の深さにおける目標値を、補正関数に基づいて算出する代わりに、実測深さにおける既知の目標値と推定される球面収差量とに基づいて、都度算出してもよい。
図２１は、顕微鏡システム１で行われる屈折率表示処理のフローチャートである。図２２は、サンプルＳの構造を例示した図である。図２３は、表示装置３０に表示されるグラフの一例を示した図である。図２４は、顕微鏡システム１で行われる屈折率算出処理のフローチャートである。図２５は、変化率と屈折率の関係を示した図である。図２６Ａ及び図２６Ｂは、異なる注目位置における屈折率情報をグラフ上に表示した図である。図２７は、サンプルＳの屈折率分布を示す屈折率情報をグラフ上に表示した図である。以下、図２１から図２７を参照しながら、図２１に示す屈折率表示処理について説明する。
以降では、サンプルＳが、図２２に示すような、屈折率の異なる複数の層（層Ｌ１から層Ｌ５）からなる積層構造物である場合を例に説明する。図２２には、５層からなる構造物が記載されていて、層Ｌ１、層Ｌ３、層Ｌ５は、１．５２の屈折率を有するガラス板であり、層Ｌ２は、屈折率が１．４のシリコーンであり、層Ｌ４は、屈折率１．３３の水である。また、層Ｌ１及び層Ｌ３の上下両面、並びに、層Ｌ５の上面には、レーザー光の照射により蛍光を発するビーズＢ１からビーズＢ５が置かれている。さらに、対物レンズ１１０とサンプルＳの間は、浸液ＩＭで満たされている。浸液ＩＭは、屈折率が１．３３の水である。
顕微鏡システム１は、まず、媒質情報を取得する（ステップＳ７１）。ここでは、図４のステップＳ１と同様に、利用者がサンプルＳの屈折率、カバーガラスの屈折率及び厚さ、浸液の屈折率などの媒質情報を入力し、演算装置２０がそれらの情報を取得する。なお、ここで入力される屈折率は、画像データ取得回数を減らす目的で使用されるものであるので、およその値でよい。正確な屈折率は、後述するステップＳ７８において算出される。
顕微鏡システム１は、次に、観察対象面の位置の候補である、複数の候補位置を決定する（ステップＳ７２）。ここでは、演算装置２０が、利用者がキーボード４０等を用いて入力した観察対象面の深さ情報に基づいて、画像データを取得すべき複数の候補位置を決定する。決定した複数の候補位置の情報（複数の深さ情報）は記憶装置２５に記憶される。例えば、利用者が画像データを取得すべき深さ範囲と間隔を入力することで、演算装置２０が深さ範囲と間隔から複数の候補位置を決定してもよい。本実施例では、それぞれビーズが存在する５つの候補位置を、演算装置２０が決定する。
その後、顕微鏡システム１は、観察対象面の位置を初期位置に変更する（ステップＳ７３）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を光軸方向に移動させて、観察対象面の位置をステップＳ７１で決定した複数の候補位置のうちの一つである初期位置に変更する。本実施例では、観察対象面の位置をビーズＢ１の位置に変更する。
観察対象面の位置が変更されると、顕微鏡システム１は、その観察対象面における設定目標値を算出する（ステップＳ７４）。ここでは、上述した図５、図１０又は図１２に示す目標値算出処理が行われる。算出した目標値は、候補位置の情報（例えば、深さ情報など）と関連付けて、記憶装置２５に記憶される。なお、目標値算出処理は、上述した目標値算出モードで行われることが望ましい。
顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、ステップＳ７２で決定した複数の候補位置のすべてで目標値が算出済みか否かを判断する（ステップＳ７５）。すべての候補位置で目標値が算出されていない場合には、顕微鏡システム１は、観察対象面の位置をステップＳ７２で決定した複数の候補位置のうちの未だ目標値が算出されていない候補位置に変更し（ステップＳ７６）、変更後の候補位置で目標値を算出する（ステップＳ７４）。これを繰り返すことにより、各々が、観察対象面が対物レンズ１１０の光軸方向に異なるサンプルＳ内の位置にあるときに顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する、複数の目標値が算出される。本実施例では、観察対象面がビーズＢ１からビーズＢ５のそれぞれの位置にあるときに顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する、５つの目標値が算出される。
すべての候補位置で目標値が算出されている場合には、顕微鏡システム１は、観察対象面の位置と目標値との関係を表わすグラフを表示する（ステップＳ７７）。ここでは、演算装置２０が、まず、ステップＳ７４で算出した複数の目標値に基づいて上記のグラフを生成し、その後、生成したグラフを表示装置３０に表示させる。グラフは、例えば、縦軸が観察対象面の位置を示し横軸が目標値を示す空間上に記憶装置２５に記憶されている複数の目標値を示す点をプロットし、さらに、隣接する２点間を補間することで、作成されてもよい。補間には、線形補間、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。また、グラフは、補間の代わりに関数近似によって生成されてもよい。本実施例では、図２３に示すように、算出した５つの目標値を示す５つの点をプロットし、隣り合う点間を線形補間したグラフＧ１が表示される。なお、図２３の縦軸は、サンプル表面（層Ｌ１の上面）からの光軸方向への距離である深さＤを示し、横軸は補正環１１１の回転角度θを示している。
利用者がポインタＰを使用して表示装置３０に表示されたグラフＧ１上の点を指定し、その結果、サンプルＳ内の注目位置が指定されると、顕微鏡システム１は、注目位置におけるサンプルＳの屈折率を算出する（ステップＳ７８）。ここでは、演算装置２０は、複数の目標値に基づいて、注目位置におけるサンプルＳの屈折率を算出する。より詳細には、演算装置２０は、図２４に示す処理を実行する。
まず、演算装置２０は、指定された注目位置の情報を取得する（ステップＳ８１）。演算装置２０は、例えば、注目位置の深さ情報を取得する。次に、演算装置２０は、複数の目標値を取得する（ステップＳ８２）。演算装置２０は、例えば、グラフにプロットされている複数の点のうち指定された点に近い２点を特定し、その２点の目標値を取得する。この際、目標値とともに深さ情報を取得する。なお、ステップＳ８２で取得する複数の目標値は、ステップＳ７４で算出された目標値に限られない。注目位置の深さ近傍の複数の位置に観察対象面を移動させて、それぞれの位置で目標値を算出することで、複数の目標値と複数の深さ情報を取得してもよい。
その後、演算装置２０は、複数の目標値に基づいて、注目位置における、光軸方向へ観察対象面の移動量（観察対象面の位置の変化量）と目標値の変化量との関係を算出する（ステップＳ８３）。演算装置２０は、例えば、ステップＳ８２で取得した２つの目標値の差分（目標値の変化量Δθ）に対する、ステップＳ８２で取得した２つの深さ情報の差分（観察対象面の移動量ΔＤ）の比を算出する。即ち、注目位置におけるグラフの傾きである変化率ΔＤ／Δθを算出する。
そして、最後に、演算装置２０は、ステップＳ８３で算出した関係に基づいて、注目位置におけるサンプルＳの屈折率を算出する（ステップＳ８４）。演算装置２０は、例えば、記憶装置２５に記憶されている図２５に示す変化率と屈折率との関数Ｆに基づいて、ステップＳ８３で算出した関係（変化率）から屈折率を算出する。なお、変化率と屈折率の関数Ｆは、対物レンズ毎に異なるため、記憶装置２５には、対物レンズ毎の変化率と屈折率の関数Ｆが記憶されていることが望ましい。また、記憶装置２５には、関数Ｆの代わりに、変化率と屈折率の関係を示すデータが記憶されていてもよい。
屈折率が算出されて図２４に示す処理が終了すると、顕微鏡システム１は、グラフ上に屈折率情報を表示する（ステップＳ７９）。ここでは、演算装置２０は、注目位置におけるサンプルＳの屈折率に関する情報を、グラフと関連付けて表示装置３０に表示させる。本実施例では、例えば、ポインタＰを用いて深さ１５０μｍ当たりを注目位置に指定した場合であれば、図２６Ａに示すように、グラフＧ１上の注目位置に対応する点の近くに、屈折率情報Ｉ１（１．５３）を表示する。また、ポインタＰを用いて深さ４００μｍ当たりを注目位置に指定した場合であれば、図２６Ｂに示すように、グラフＧ１上の注目位置に対応する点の近くに、屈折率情報Ｉ２（１．３９）を表示する。なお、深さ１５０μｍ、４００μｍの位置は、図２２に示す層Ｌ１（ガラス板、屈折率１．５２）、層Ｌ２（シリコーン、屈折率１．４）内である。
以上のように、本実施例に係る顕微鏡システム１によれば、サンプル内の任意の部位の屈折率を算出することができる。例えば、サンプルが、図２２に示すような屈折率の異なる複数の層からなる積層構造物など、複雑な屈折率分布を有するものであっても、そのサンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。この点については、後に詳述する。さらに、サンプルをスライスすることなくサンプルの深部の屈折率を算出することができるため、in vivoでの生体サンプルの屈折率の測定が可能となる。
また、顕微鏡システム１では、補正環１１１で球面収差を補正することで得られた情報を用いて、サンプルの屈折率が算出される。従って、球面収差を補正してサンプルの深部を観察しながら、それと同時に屈折率を測定することができる。このため、顕微鏡システム１は、サンプルへのダメージの軽減が重要な、in vivoでの生体サンプルの観察への利用が特に好適である。
また、顕微鏡システム１では、観察対象面の位置と目標値との関係を表わすグラフが表示される。グラフの傾きは屈折率に依存しているため、グラフを表示することで、利用者はグラフから生体サンプルなど屈折率が深さによって異なるサンプルの屈折率分布を把握することができる。さらに、グラフ上に屈折率情報を表示することで、より正確に屈折率を把握することができる。なお、図２６Ａ及び図２６Ｂでは、指定された注目位置の屈折率情報（屈折率情報Ｉ１、屈折率情報Ｉ２）のみをグラフＧ１に表示する例を示したが、図２７に示すように、注目位置の指定の有無によらず、サンプルの屈折率分布を示す屈折率情報Ｉ３をグラフＧ１に表示してもよい。これにより、サンプルの各深さにおける屈折率が表示されるため、より正確にサンプルの屈折率分布を把握することができる。
図２８は、屈折率の算出方法について説明するための図である。図２８を参照しながら、サンプルの構造によらず、サンプル内の任意の部位の屈折率を正確に算出することができることについて、より詳細に説明する。
以降、図２８に示すように、観察対象面が、対物レンズ１１０から３層目の屈折率ｎ３を有する媒質からなる第３層内に位置する場合を例に説明する。なお、対物レンズ１１０に隣接する屈折率ｎ１を有する媒質からなる第１層は、例えば、空気や浸液であり、屈折率ｎ２を有する媒質からなる第２層と屈折率ｎ３を有する媒質からなる第３層は、例えば、生体サンプルである。
対物レンズ１１０からの光線Ｒの、第１層と第２層との界面ＩＦ１への入射角をθ１、界面ＩＦ１からの出射角をθ２、第２層と第３層との界面ＩＦ２からの出射角をθ３とすると、スネルの法則から、以下の式（３）が導かれる。
さらに、図２８から幾何学的に次の関係も導かれる。なお、Ｄは第２層の厚さである。
これらの関係から、δは、下式（４）で表わされる。
さらに、図２８から幾何学的に次の関係も導かれる。
この関係から、ｄ２は、下式（５）で表わされる。
さらに、式（５）を用いて、式（４）を変形すると、式（６）が導かれる。
ここで、式（３）から次の関係が導かれる。
この関係を用いて、式（６）を変形すると、式（７）が導かれる。
Ｄ＝０のときには、δは第２層のパラメータに依存しない。また、式（７）は、θ１＝０のときには、δは、屈折率差（屈折率比）のみに依存する。θ１＝０のときのδである近軸移動量δ０は、式（８）で表わされる。
光線Ｒに生じる球面収差量Δは、δとδ０の差分である。このため、式（７）と式（８）から式（９）が導かれる。なお、顕微鏡装置で生じる球面収差量は、式（９）をθ１について０から対物レンズ１１０のＮＡで定まる最大入射角度θＭＡＸまで積分することで、算出される。
さらに、式（９）をｄ１で微分することで、式（１０）が導かれる。式（１０）は、観察対象面の深さ変化量あたりの球面収差量の変化量で定義される、球面収差量の変化率を表わしている。
式（１０）には、第２層のパラメータが含まれない。このことから、球面収差量の変化率は、第１層と観察対象面を含む第３層に依存し、中間層である第２層には影響しないことがわかる。さらに、θ１は積分変数であり、ｎ１は対物レンズ１１０とサンプルＳの間の媒質の屈折率であって、一般に対物レンズ１１０によって定まる。これらを考慮すると、球面収差量の変化率を特定することで、式（１０）を用いて観察対象面を含む第３層の屈折率ｎ３を算出し得ることがわかる。従って、球面収差量の変化率を特定することで、サンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。
顕微鏡システム１では、球面収差量の変化率を直接算出する代わりに、補正環１１１の目標値の変化率（観察対象面の移動量と目標値の変化量の関係）を算出している。対物レンズが定まると目標値と球面収差量の関係は既知な一定の関係にあるため、球面収差の変化率を目標値の変化率に変換することができる。このため、目標値の変化率から屈折率を算出する顕微鏡システム１でも、サンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。
図２９は、顕微鏡システム１で行われる別の屈折率表示処理のフローチャートである。図３０は、表示装置３０に表示される三次元画像Ｇ２の一例を示した図である。図３１は、注目位置における屈折率情報を三次元画像Ｇ２上に表示した図である。図３２は、屈折率情報とグラフを三次元画像上に表示した図である。以下、図２９から図３２を参照しながら、三次元画像上に屈折率情報を表示する屈折率表示処理について説明する。なお、ここでは、サンプルＳはマウスの脳である。
顕微鏡システム１は、サンプルＳの三次元画像データを生成する（ステップＳ９１）。ここでは、顕微鏡システム１が、上述した図４、図１５又は図１７に示すＺスタック撮影処理を実行し、演算装置２０が、その結果得られた複数の画像データに基づいて、サンプルＳの三次元画像データを生成する。
次に、顕微鏡システム１は、サンプルＳの三次元画像を表示する（ステップＳ９２）。ここでは、演算装置２０は、サンプルＳの三次元画像データに基づいて、サンプルＳの三次元画像を表示装置３０に表示させる。本実施例では、例えば、図３０に示すような深さ方向に構造が変化しているマウスの脳の三次元画像Ｇ２が表示される。
利用者がポインタＰを使用して表示装置３０に表示された三次元画像Ｇ２上の点を指定し、その結果、サンプルＳ内の注目位置が指定されると、顕微鏡システム１は、注目位置におけるサンプルＳの屈折率を算出する（ステップＳ９３）。この処理は、図２４に示す屈折率算出処理と同様である。ただし、ステップＳ８２では、注目位置の深さ近傍の複数の位置に観察対象面を移動させて、それぞれの位置で目標値を算出することで、複数の目標値と複数の深さ情報を取得する。
屈折率が算出されると、顕微鏡システム１は、三次元画像Ｇ２上に屈折率情報を表示する（ステップＳ９４）。ここでは、演算装置２０は、注目位置におけるサンプルＳの屈折率に関する情報を、三次元画像Ｇ２と関連付けて表示装置３０に表示させる。本実施例では、例えば、図３１に示すように、三次元画像Ｇ２上の注目位置に、屈折率情報Ｉ４（１．３８）を表示する。
以上のように、顕微鏡システム１は、三次元画像と関連付けて注目位置におけるサンプルＳの屈折率を表示することができる。このため、サンプルＳの構造と屈折率の関係を容易に把握することが可能となる。また、画像を見ながら注目位置を指定することができるため、屈折率を知りたい部位を確実に指定することができる。また、利用者が三次元画像を見ながら深さ方向に幅のある注目範囲を指定できるようにしてもよい。そして、注目範囲内における観察対象面の移動量と目標値の変化量との関係を算出し、注目範囲内の屈折率分布を算出してもよい。
さらに、図２１の屈折率表示処理と図２９の屈折率表示処理を組み合わせてもよい。例えば、例えば、図２９のステップＳ９１の前に、図２１のステップＳ７１からステップＳ７６の処理を行うことで、図３２に示すように、屈折率情報Ｉ５とグラフを三次元画像Ｇ２上に表示してもよい。これにより、サンプルＳの構造と屈折率の関係をさらに詳細に把握することができる。
また、屈折率情報は、図３１及び図３２に示すような文字情報に限られない。例えば、三次元画像Ｇ２の色を変更することで、利用者に屈折率情報を提供してもよい。この場合、画像中の屈折率が異なる部分は異なる色で表示される。また、画像そのものの色を変更する代わりにグラフの色を変更してもよい。色を用いて屈折率情報を提供することで、利用者はより直感的に屈折率を把握することが可能となる。
図３３は、顕微鏡システム１で行われる更に別の屈折率表示処理のフローチャートである。以下、図３３を参照しながら、二次元画像上に屈折率情報を表示する屈折率表示処理について説明する。
顕微鏡システム１は、まず、媒質情報を取得する（ステップＳ１０１）。この処理は、図２１のステップＳ７１と同様である。その後、顕微鏡システム１は、球面収差を補正する（ステップＳ１０２）。ここでは、顕微鏡システム１は、上述した図５、図１０又は図１２に示す目標値算出処理を行って目標値を算出し、算出した目標値に補正環１１１の設定値を変更する。
球面収差が補正されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの二次元画像データを取得する（ステップＳ１０３）。ここでは、顕微鏡装置は、サンプルＳの画像データを取得する。さらに、顕微鏡システム１は、屈折率を算出する（ステップＳ１０４）。ここでは、演算装置２０は、サンプルＳの現在の観察対象面における屈折率を算出する。この処理は、図２４に示す屈折率算出処理と同様である。ただし、ステップＳ８２では、注目位置の深さ近傍の複数の位置に観察対象面を移動させて、それぞれの位置で目標値を算出することで、複数の目標値と複数の深さ情報を取得する。
屈折率が算出されると、顕微鏡システム１は、二次元画像上に屈折率情報を表示する（ステップＳ１０５）。ここでは、演算装置２０は、サンプルＳの屈折率に関する情報をステップＳ１０３で取得した二次元画像と関連付けて表示装置３０に表示させる。
以上のように、顕微鏡システム１は、二次元画像上に屈折率情報を表示することができる。このため、利用者は、サンプルを観察しながら、それと同時に観察対象面の屈折率を把握することができる。
図３４は、本実施例に係る顕微鏡２００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡２００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。
顕微鏡２００は、走査型顕微鏡の一種である共焦点顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡２００は、図３４に示すように、照明光路上に、レーザー２０１と、ビームエクスパンダ２０２と、ダイクロイックミラー２０３と、走査ユニット２０４と、瞳投影光学系２０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるＺ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。
レーザー２０１は、例えば、可視域や紫外域、赤外域のレーザー光を発振する。レーザー２０１から発振されるレーザーの出力は、光源制御装置１１によって制御される。ビームエクスパンダ２０２は、レーザー２０１からのレーザー光（コリメート光）の光束を対物レンズ１１１の瞳径に応じて調整する光学系である。ダイクロイックミラー２０３は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。
走査ユニット２０４は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナなどを含んでいる。走査ユニット２０４の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット２０４の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。瞳投影光学系２０５は、走査ユニット２０４を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。
顕微鏡２００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー２０３の透過光路）上に、ミラー２０６と、共焦点レンズ２０７と、共焦点絞り２０８と、集光レンズ２０９と、光検出器２１０とを備えている。光検出器２１０から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器２１１に出力される。
共焦点レンズ２０７は、共焦点絞り２０８上に、蛍光を集光するレンズである。共焦点絞り２０８は、対物レンズ１１０の焦点面と光学的に共役な位置に配置された絞りである。共焦点絞り２０８には、対物レンズ１１０の焦点位置から生じた蛍光を透過させるピンホールが形成されている。集光レンズ２０９は、共焦点絞り２０８を通過した蛍光を光検出器２１０に導くレンズである。
光検出器２１０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器２１１は、光検出器２１０からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。
以上のように構成された本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００は、走査ユニット２０４を用いてレーザー光でサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器２１０で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器２１０からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット２０４の走査情報とに基づいて、画像データを生成する。即ち、本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様のＺスタック撮影処理及び屈折率表示処理を行うことができる。
図３５は、本実施例に係る顕微鏡３００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡３００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。
顕微鏡３００は、走査型ではない通常の蛍光顕微鏡である。なお、顕微鏡３００は、ズーム機能を備えているため、ズーム顕微鏡とも呼ばれる。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡３００は、図２０に示すように、照明光路上に、光源３０２を内蔵したランプハウス３０１と、コレクタレンズ３０３と、蛍光キューブ３０４と、ズームレンズ３０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるＺ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。
光源３０２は、例えば、ＬＥＤ光源、高出力の水銀ランプなどである。なお、光源３０２の出力は、光源制御装置１１によって制御される。コレクタレンズ３０３は、光源３０２からの励起光をコリメートする。蛍光キューブ３０４は、図示しないダイクロイックミラーと励起フィルタと吸収フィルタとを備えている。蛍光キューブ３０４は、励起光とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長により励起光と蛍光を分離する。
ズームレンズ３０５は、ズームレンズ３０５を構成するレンズ間の距離が変化するように構成されている。ズーム制御装置１２がレンズ間の距離を図示しないモータ等によって変化させることでズーム倍率が変化する。即ち、ズームレンズ３０５は、ズーム制御装置１２によって制御される。
顕微鏡３００は、さらに、検出光路（蛍光キューブ３０４の透過光路）上に、結像レンズ３０６と、撮像装置３０７を備えている。結像レンズ３０６は、対物レンズ１１０及びズームレンズ３０５を介して入射する蛍光を撮像装置３０７上に集光させて、サンプルＳの光学像を形成する。撮像装置３０７は、例えば、ＣＣＤカメラであり、サンプルＳの光学像を撮像してサンプルＳの画像データを生成する。撮像装置３０７は、生成した画像データを演算装置２０に出力する。本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡３００である顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様のＺスタック撮影処理及び屈折率表示処理を行うことができる。
上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。顕微鏡システム、算出方法及びプログラムは、特許請求の範囲により規定される範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。
Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を制御して観察対象面の位置を変化させる構成を例示したが、Ｚ制御装置１３は、顕微鏡のステージを光軸方向に移動させることにより観察対象面の位置を変化させてもよい。
また、観察対象面の深さによって変化する球面収差を補正する補正装置として補正環１１１を例示したが、補正装置は、光路上で生じる球面収差の量を変化させることができるものであればよい。補正装置は、例えば、ＬＣＯＳ（Liquid crystal on silicon、商標）、ＤＦＭ（Deformable Mirror）、液体レンズなどを用いた装置であってもよい。また、発生する球面収差量が大きく単一の補正装置では十分に球面収差を補正しきれない場合には、補正する球面収差量を複数の補正装置で分担して、観察対象面で生じる球面収差を補正してもよい。
また、評価値を算出する方法として、設定値毎に１枚の画像データを取得し、取得した画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、設定値毎に複数の画像データを取得して、カルマンフィルタ等を用いて複数の画像データから評価値を算出してもよい。このような方法によれば、画像データの各々に含まれるノイズ成分を設定値毎の複数の画像データを用いて相殺させることができるため、より精度の高い評価値を算出することができる。
また、走査手段による走査方式が最も一般的なラスタスキャンであることを前提に説明したが、走査方式は、ラスタスキャンに限られず、例えば、渦巻き状にサンプルを走査するトルネードスキャンであってもよい。
１ 顕微鏡システム
１０ 顕微鏡制御装置
１１ 光源制御装置
１２ ズーム制御装置
１３ Ｚ制御装置
１４ 補正環制御装置
２０ 演算装置
３０ 表示装置
４０ キーボード
５０ 補正環操作装置
６０ Ｚ駆動部操作装置
１００、２００、３００ 顕微鏡
１０１、２０１ レーザー
１０２、２０４ 走査ユニット
１０３、１０６、２０５ 瞳投影光学系
１０４、２０６ ミラー
１０５、２０３ ダイクロイックミラー
１０７、２１０ 光検出器
１０８、２１１ Ａ／Ｄ変換器
１０９ Ｚ駆動部
１１０ 対物レンズ
１１１ 補正環
２０２ ビームエクスパンダ
２０７ 共焦点レンズ
２０８ 共焦点絞り
２０９ 集光レンズ
３０１ ランプハウス
３０２ 光源
３０３ コレクタレンズ
３０４ 蛍光キューブ
３０５ ズームレンズ
３０６ 結像レンズ
３０７ 撮像装置
Ｓ サンプル

Claims (12)

  1. 対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有し、画像データを取得する顕微鏡装置と、
    前記対物レンズと、観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定する推定手段と、
    前記顕微鏡装置で取得された画像データから算出されたコントラスト値と前記推定手段で推定された球面収差量とを用いて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出する算出手段を備え、
    前記推定手段は、推定した前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、
    前記顕微鏡装置は、前記推定手段により決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、
    前記算出手段は、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を算出する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  2. 請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記算出手段は、前記観察対象面の深さ毎に、前記設定目標値を算出し、
    前記算出手段は、
    前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で前記顕微鏡装置が複数の画像データを取得したときの前記観察対象面の深さである実測深さにおける前記設定目標値を、前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて算出し、
    前記実測深さ以外の前記観察対象面の深さにおける前記設定目標値を、前記実測深さにおける前記設定目標値と、前記推定手段により推定された球面収差量と、に基づいて算出する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  3. 請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記算出手段は、前記推定手段により推定された球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である推定設定値と前記実測深さにおける前記設定目標値とに基づいて、前記観察対象面の深さ毎の前記設定目標値を表わす補正関数を算出する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  4. 請求項３に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記算出手段は、前記観察対象面の深さ毎の前記推定設定値を表わす推定関数を、前記実測深さにおける前記設定目標値に基づいて変形して、前記補正関数を算出する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  5. 請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記顕微鏡装置は、前記推定手段により推定された球面収差量に基づいて決定された前記複数の状態で、前記複数の画像データを取得する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記顕微鏡装置は、
    走査手段を備える走査型顕微鏡装置であり、
    観察用の画像データを取得するときの前記走査手段の第１の設定とは異なる前記走査手段の第２の設定で、コントラスト値算出用の画像データを取得する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  7. 請求項６に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記第２の設定は、前記走査手段による走査の一部を間引く設定である
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  8. 請求項６又は請求項７に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記第２の設定における走査ライン数は、コントラスト値算出用の前記画像データのサンプル、前記対物レンズの倍率、及び、前記走査手段のズーム倍率に基づいて決定された
    ライン数である
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
    前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報を入力する入力装置を備える
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記補正装置は、前記対物レンズ内のレンズを移動させる補正環を含む
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
  11. 対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有する顕微鏡装置で画像データを取得し、
    前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定し、
    推定された前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、
    決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、
    前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を特定する
    ことを特徴とする特定方法。
  12. 対物レンズと、球面収差を設定値を用いて補正する補正装置を有する顕微鏡装置が取得した画像データからコントラスト値を算出し、
    前記対物レンズと観察対象面との間の媒質の情報に基づいて、前記顕微鏡装置で発生する球面収差量を推定し、
    推定された前記球面収差量に基づいて、前記補正装置の複数の設定値を決定し、
    決定された前記複数の設定値に基づいて、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で、複数の画像データを取得し、
    前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから算出した複数のコントラスト値に基づいて、前記設定目標値を特定する
    処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
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