JP6422761B2 - 顕微鏡システム、及び、ｚ位置と補正装置の設定値との関係算出方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システム、及び、対物レンズのＺ位置と球面収差が補正される補正装置の設定値との関係を算出する方法に関する。

顕微鏡によるサンプルの観察では、カバーガラスの厚さによって異なる量の球面収差が発生することが知られており、カバーガラスの厚さに起因する球面収差を補正する手段として対物レンズの補正環が知られている。

従来、補正環は、専らカバーガラスの厚さに起因する球面収差を補正する手段として用いられてきたが、サンプル（例えば、生体試料）の深部を観察する手法が開発され普及した近年では、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を補正する目的にも使用可能である。

しかしながら、サンプルの画像を観察しながら球面収差が補正されているか否かを判断することは容易ではない。このため、補正環を用いて球面収差を補正する作業は、敬遠されがちであり、現時点においては、補正環は球面収差を補正する手段として十分に活用されているとは言い難い。

このような課題に関連して、顕微鏡利用者による補正環の利用を支援する技術が、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１には、球面収差が補正される補正環の設定値を複数のＺ位置で算出し、複数のＺ位置と補正環の設定値との組み合わせから、Ｚ位置と球面収差が補正される補正環の設定値との関係を示す関数を補間により算出する技術が記載されている。特許文献１に記載されるような補正環の利用を支援する機能を顕微鏡システムが備えることで、顕微鏡利用者の補正環の利用を促すことができる。

特開２０１４−１６０２１３号公報

ところで、特許文献１の技術では、関数の算出にあたり、サンプル中の観察対象とすべき範囲（以降、注目範囲と記す。）については考慮されていない。高精度に球面収差を補正した状態で注目範囲を観察するためには、注目範囲に対応するＺ範囲（以降、注目Ｚ範囲）内のＺ位置と補正環の設定値との組み合わせから、関数を算出することが望ましい。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、注目範囲及び注目Ｚ範囲を関数の算出前に特定することは、容易ではない。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、容易に且つ高精度に球面収差を補正するのに資する技術を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、対物レンズと球面収差を補正する補正装置とを備え、サンプルの画像データを取得する顕微鏡装置と、前記顕微鏡装置で取得した画像データに基づいて、前記サンプルの三次元画像を表示装置に表示させる表示制御装置と、前記表示装置に表示された前記三次元画像内の範囲を指定する範囲指定手段と、前記範囲指定手段で指定された範囲で特定される前記対物レンズのＺ範囲を対象とした、前記対物レンズのＺ位置と球面収差が補正される前記補正装置の設定値である目標値との関係を算出する演算装置と、を備え、前記演算装置は、前記Ｚ範囲内の複数のＺ位置を決定し、前記顕微鏡装置は、前記複数のＺ位置の各々毎に、前記補正装置の設定値の異なる複数の状態の各々でサンプルの画像データを取得し、前記演算装置は、前記顕微鏡装置で前記複数のＺ位置の各々毎に取得した複数の画像データに基づいて、当該Ｚ位置における目標値を算出し、前記複数のＺ位置と算出した複数の目標値に基づいて、前記Ｚ範囲を分割した複数のＺ範囲を決定し、前記複数のＺ範囲毎に、前記Ｚ位置と前記目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出する顕微鏡システムを提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、前記表示制御装置は、前記演算装置で算出した関係を前記三次元画像に関連付けて、前記表示装置に表示させる顕微鏡システムを提供する。

本発明の第３の態様は、第１の態様又は第２の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、前記対物レンズのＺ位置に応じて、当該Ｚ位置と前記演算装置で算出した関係とに基づいて算出される目標値に前記補正装置の設定値を変更する補正装置制御装置を備える顕微鏡システムを提供する。

本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、前記補正装置は、前記対物レンズ内のレンズを移動させる補正環である顕微鏡システムを提供する。

本発明の第５の態様は、対物レンズのＺ位置と球面収差が補正される補正装置の設定値である目標値との関係を算出する方法であって、前記対物レンズと球面収差を補正する前記補正装置とを備える顕微鏡装置が取得したサンプルの画像データに基づいて、前記サンプルの三次元画像を表示装置に表示し、前記表示装置に表示された前記三次元画像内の範囲を指定し、指定した前記範囲で特定される前記対物レンズのＺ範囲を対象とした、前記対物レンズのＺ位置と前記目標値との関係を算出し、前記関係を算出することは、前記Ｚ範囲内の複数のＺ位置を決定することと、前記複数のＺ位置の各々毎に、前記補正装置の設定値の異なる複数の状態の各々でサンプルの画像データを取得することと、前記複数のＺ位置の各々毎に取得した複数の画像データに基づいて、当該Ｚ位置における目標値を算出することと、前記複数のＺ位置と算出した複数の目標値に基づいて、前記Ｚ範囲を分割した複数のＺ範囲を決定することと、前記複数のＺ範囲毎に、前記Ｚ位置と前記目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出すること、を含むことを特徴とする方法。

本発明によれば、容易に且つ高精度に球面収差を補正するのに資する技術を提供することができる。

本発明の実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 図１に例示される演算装置の構成を例示した図である。 図１に例示される顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる関数算出処理のフローチャートである。 図１に示す表示装置に表示されたサンプルの三次元画像の一例である。 図５に例示される三次元画像が表示された画面上で注目範囲Ｒを指定する様子を示した図である。 関数を三次元画像と関連付けて表示した図である。 図４に示すステップＳ８の処理を自動化した具体例を示すフローチャートである。 図８に示すステップＳ１１の処理で算出されたＺ位置に対する目標値の傾きを示した図である。 図８に示すステップＳ１２の処理で決定した複数のＺ範囲について例示した図である。 図８に示すステップＳ１４の処理で算出された全関数の一例を示した図である。 図８に示すステップＳ１４の処理で算出された全関数の別の例を示した図である。 図８に示すステップＳ１４の処理で算出された全関数の更に別の例を示した図である。 図４に示すステップＳ８の処理を自動化した別の具体例を示すフローチャートである。 図４に示すステップＳ８の処理を半自動化した具体例を示すフローチャートである。 図１５に示すステップＳ３２で受け付けるＺ範囲の指定を入力する方法について説明するための図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる球面収差補正処理のフローチャートである。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムでＺ位置毎に行われる目標値算出処理のフローチャートである。 図１８に示す目標値算出処理について説明するための図である。 画像データの全体領域を９つの領域に分割し、領域毎に領域目標値を算出する例を示した図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる別の目標値算出処理のフローチャートである。 画像データの全体領域を９つの領域に分割し、領域毎に領域組み合わせを算出する例を示した図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。 図２３に示す目標値算出処理について説明するための図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。 図２５に示す目標値算出処理のステップＳ７９の処理のフローチャートである。 図２６に示す処理について説明するための図であり、目標値と評価値の関数を算出する方法を示す図である。 図２６に示す処理について説明するための図であり、目標値とＺ位置の関数を算出する方法を示す図である。 Ｚ位置毎且つ補正環の設定値毎に得られる標本の画像を並べた図である。 本発明の実施例２に係る顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の実施例３に係る顕微鏡の構成を例示した図である。 画像データを加工してから評価値を算出する処理のフローチャートである。

図１は、本実施例に係る顕微鏡システム１の構成を例示した図である。図２は、図１に例示される演算装置２０の構成を例示した図である。図３は、図１に例示される顕微鏡１００の構成を例示した図である。

図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡１００と、顕微鏡制御装置１０と、演算装置２０と、表示装置３０と、演算装置２０への指示を入力するための複数の入力装置（キーボード４０、補正環操作装置５０、Z駆動部操作装置６０）を備えている。

顕微鏡制御装置１０は、演算装置２０からの指示に従って顕微鏡１００の動作を制御する装置であり、顕微鏡１００の各種電動部の動作を制御する制御信号を生成する。顕微鏡制御装置１０は、光源の出力を制御する光源制御装置１１と、ズーム倍率を制御するズーム制御装置１２と、対物レンズ１１０のＺ位置を制御するＺ制御装置１３と、補正環１１１の設定値を制御する補正環制御装置１４と、を備えている。ここで、Ｚ位置とは、サンプルＳに対する対物レンズ１１０の光軸方向の相対位置のことである。また、補正環１１１の設定値とは、例えば、基準位置に対する補正環１１１の回転角度のことである。

演算装置２０は、各種の演算処理を行うコンピュータであり、例えば、図２に示すように、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、メモリ２２、入力Ｉ／Ｆ装置２３、出力Ｉ／Ｆ装置２４、記憶装置２５、及び、可搬記録媒体２７が挿入される可搬記録媒体駆動装置２６を備え、これらがバス２８によって相互に接続されている。演算装置２０は、顕微鏡１００の制御を顕微鏡制御装置１０に指示する役割、顕微鏡１００からの出力に基づいて画像データを生成する役割、三次元画像等を表示装置３０に表示させる役割、及び、対物レンズ１１０のＺ位置と球面収差が補正される補正環１１１の設定値との関係を算出する役割を担っている。なお、図２は、演算装置２０の構成の一例であり、演算装置２０はこの構成に限定されるものではない。

ＣＰＵ２１は、所定のプログラムを実行して演算処理等を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、記憶装置２５または可搬記録媒体２７に記憶されているプログラムまたはデータを一時的に格納する。

入力Ｉ／Ｆ装置２３は、キーボード４０、補正環操作装置５０、Z駆動部操作装置６０、及び表示装置３０からの信号を受信する手段であり、観察者による入力を受け付ける入力受付部として機能する。また、入力Ｉ／Ｆ装置２３は、図３において後述する顕微鏡１００のＡ／Ｄ変換器１０８からの信号も受信する。

出力Ｉ／Ｆ装置２４は、表示装置３０及び顕微鏡制御装置１０へ信号を出力する手段である。即ち、出力Ｉ／Ｆ装置２４及び出力Ｉ／Ｆ装置２４を含む演算装置２０は、表示装置３０の表示を制御する表示制御装置であり、且つ、顕微鏡制御装置１０に顕微鏡１００の制御を指示する顕微鏡制御指示装置である。

記憶装置２５は、例えば、ハードディスク記憶装置であり、主に各種データやプログラムの保存に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２６は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２７を収容するもので、可搬記録媒体２７は、記憶装置２５を補助する役割を有する。

表示装置３０は、例えば、液晶ディスプレイ装置、有機ＥＬディスプレイ装置、ＣＲＴディスプレイ装置などである。なお、表示装置３０は、タッチパネルセンサを備えてもよく、その場合、入力装置としても機能する。

キーボード４０は、後述するように、表示装置３０に表示された三次元画像内の注目範囲を指定する範囲指定手段として機能する。なお、キーボード４０の代わりに、入力装置として機能する表示装置３０やその他の入力装置が範囲指定手段として機能しても良い。

補正環操作装置５０は、補正環１１１の設定値を指示するための入力装置である。利用者が補正環操作装置５０で補正環１１１の設定値を指示すると、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値を指示された値に変更する。

Z駆動部操作装置６０は、対物レンズ１１０のＺ位置の変更を指示するための入力装置である。利用者がZ駆動部操作装置６０でＺ位置の変更を指示すると、Ｚ制御装置１３は、Z駆動部１０９を光軸方向に移動させて対物レンズ１１０のＺ位置を変更する。

顕微鏡１００は、２光子励起顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料であり、サンプルＳにはカバーガラスＣＧが載せられている。顕微鏡１００は、図３に示すように、照明光路上に、レーザー１０１と、走査ユニット１０２と、瞳投影光学系１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、対物レンズ１１０とを備えている。

レーザー１０１は、例えば、超短パルスレーザーであり、近赤外域のレーザー光を発振する。レーザー１０１の出力は、光源制御装置１１によって制御される。即ち、光源制御装置１１は、サンプルに照射するレーザー光のパワーを制御するレーザー制御装置である。

走査ユニット１０２は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナンドスキャナなどを含んでいる。走査ユニット１０２の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット１０２の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。

瞳投影光学系１０３は、走査ユニット１０２を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。ダイクロイックミラー１０５は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。

対物レンズ１１０は、補正環１１１を備えた乾燥系又は液浸系の対物レンズであり、Z駆動部１０９に装着されている。Z駆動部１０９は、対物レンズ１１０を対物レンズ１１０の光軸方向に移動させる手段であり、Z駆動部１０９の移動（即ち、対物レンズ１１０の移動）は、Ｚ制御装置１３によって制御される。

補正環１１１は、その設定値を変更することにより対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である。補正環１１１の設定値は、補正環制御装置１４によって変更される。なお、補正環１１１の設定値は、補正環１１１を直接操作することで、手動で変更することもできる。

顕微鏡１００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー１０５の反射光路）上に、瞳投影光学系１０６と、光検出器１０７とを備えている。光検出器１０７から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０８に出力される。

瞳投影光学系１０６は、対物レンズ１１０の瞳を光検出器１０７に投影する光学系である。光検出器１０７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器１０８は、光検出器１０７からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。

以上のように構成された顕微鏡システム１では、顕微鏡１００は、走査ユニット１０２を用いてレーザー光でサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器１０７で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器１０７からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット１０２の走査情報とに基づいて、画像データを生成する。即ち、顕微鏡システム１では、顕微鏡１００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。

図４は、顕微鏡システム１で行われる関数算出処理のフローチャートである。以下、図４を参照しながら、Ｚ位置と球面収差が補正される補正環の設定値（目標値）との関係を示す関数を算出する処理である関数算出処理について説明する。

顕微鏡システム１は、サンプルＳの三次元画像を表示装置３０に表示させる（ステップＳ１）。ここでは、演算装置２０が、まず、利用者がキーボード４０等を用いて入力した情報に基づいて、三次元画像を生成するために画像データを取得すべき複数のＺ位置を決定する。例えば、利用者が画像データを取得すべきＺ範囲とＺ間隔を入力し、演算装置２０がＺ範囲とＺ間隔から複数のＺ位置を決定する。なお、Ｚ範囲とは、Ｚ位置の範囲のことであり、Ｚ間隔とは、Ｚ位置間の間隔である。次に、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を光軸方向に移動させて、対物レンズ１１０を決定した複数のＺ位置に順番に移動させる。そして、顕微鏡装置は、各Ｚ位置でサンプルＳの画像データを取得する。最後に、演算装置２０は、複数のＺ位置で取得した画像データ（Ｚスタック画像データ）に基づいて、サンプルＳの三次元画像を表示装置３０に表示させる。即ち、演算装置２０は、三次元画像を表示装置３０に表示させる表示制御装置である。なお、Ｚスタック画像データに基づいて三次元画像データを生成する方法は既知であるので、詳細な説明は省略する。

図５は、表示装置３０に表示されたサンプルＳの三次元画像の一例である。図５に例示される三次元画像Ｇは、マウスの脳の画像であり、図５には、Ｚ方向（深さ方向）に脳の構造が変化している様子が示されている。

三次元画像が表示されると、顕微鏡システム１は、注目範囲の指定を受け付ける（ステップＳ２）。ここでは、ステップＳ１で表示装置３０に表示された三次元画像Ｇを参照してサンプルＳの構造を確認した利用者が、キーボード４０等の入力装置を用いて三次元画像Ｇ内の注目範囲Ｒを指定する。図６には、三次元画像Ｇが表示された画面上で、観察対象面の深さが３５０μｍから５００μｍの範囲を注目範囲Ｒとして指定する様子が例示されている。注目範囲Ｒが指定されると、演算装置２０は、指定された注目範囲Ｒに関する情報を受信する。

三次元画像上で注目範囲が指定されると、顕微鏡システム１は、複数のＺ位置を決定する（ステップＳ３）。ここでは、演算装置２０が、注目範囲Ｒに関する情報に基づいて、Ｚ位置と目標値との関係を示す関数を算出するために画像データを取得すべき複数のＺ位置を決定する。例えば、演算装置２０は、注目範囲Ｒで特定される対物レンズ１１０のＺ範囲（深さ３５０μｍから５００μｍに対応するＺ範囲）と予め決められた一定の間隔（例えば、５０μｍ間隔）から複数のＺ位置を決定してもよい。決定した複数のＺ位置は記憶装置２５に記憶される。

次に、顕微鏡システム１は、Ｚ位置を初期位置に変更する（ステップＳ４）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を光軸方向に移動させて、対物レンズ１１０のＺ位置をステップＳ３で決定した複数のＺ位置のうちの一つである初期位置に変更する。これにより、後に目標値算出のために画像データが取得されるサンプルＳの観察対象面が確定する。

Ｚ位置が変更されると、顕微鏡システム１は、観察対象面における球面収差が補正される補正環１１１の設定値（以降、目標値と記す）を算出する（ステップＳ５）。ここでは、顕微鏡装置が現在のＺ位置で取得した複数の画像データに基づいて、演算装置２０がそのＺ位置における目標値を算出する。なお、目標値を算出する処理については、図１８から図２９を参照しながら、後に詳述する。

顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、ステップＳ３で決定した複数のＺ位置のすべてで目標値が算出済みか否かを判断する（ステップＳ６）。すべてのＺ位置で目標値が算出されていない場合には、顕微鏡システム１は、対物レンズ１１０のＺ位置をステップＳ３で決定した複数のＺ位置のうちの目標値が算出されていないＺ位置に変更し（ステップＳ７）、その新たなＺ位置で目標値を算出する（ステップＳ５）。これを繰り返すことにより、Ｚ位置毎に取得した複数の画像データに基づいて、複数のＺ位置における複数の目標値が算出される。

すべてのＺ位置で目標値が算出されている場合には、顕微鏡システム１は、Ｚ位置と目標値との関係を示す関数を算出する（ステップＳ８）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ２で指定された注目範囲で特定される対物レンズ１１０のＺ範囲を対象とした関数を、ステップＳ５で算出した複数のＺ位置と複数の目標値との組み合わせに基づいて算出する。関数は、既に取得した情報を基にして演算装置２０が自動的に算出してもよく、又は、利用者がさらに情報を入力した上で演算装置２０が算出する、即ち、演算装置２０が半自動的に算出してもよい。算出した関数は、記憶装置２５に記憶される。

最後に、顕微鏡システム１は、関数を三次元画像に関連付けて表示装置３０に表示させて（ステップＳ９）、関数算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ８で算出した関数を三次元画像Ｇに関連付けて、表示装置３０に表示させる。図７には、ステップＳ８で算出した関数のグラフＦと三次元画像Ｇとを並べて表示装置３０に表示させた例が示されている。図７のグラフＦの横軸は、球面収差が補正される補正環１１１の設定値（即ち、目標値）を示している。また、縦軸は、観察対象面の深さを示していて、対物レンズ１１０のＺ位置と１対１で対応している。

顕微鏡システム１は、図４に示す処理を実行することで、Ｚ位置と目標値との関係を示す関数を容易に算出することができる。また、顕微鏡システム１では、関数の算出前に、サンプルＳの三次元画像が表示され、表示された三次元画像を参照した利用者によって注目範囲が指定される。これにより、顕微鏡システム１は、関数の対象範囲を利用者が指定した注目範囲に限定することができるため、その注目範囲で球面収差を高精度に補正する関数を算出することができる。また、顕微鏡システム１では、注目範囲を対象として算出した関数と三次元画像が関連付けて表示される。このため、利用者は、これらの表示から、注目範囲内での屈折率の変化などを推測することができる。これは、Ｚ位置に対する目標値の変化率がサンプルＳの屈折率に大きく依存するからである。

なお、ステップＳ８では、関数は、補間又は関数近似により算出されることが望ましい。補間には、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。関数近似にも、最小二乗法などの任意の近似法が採用され得る。これにより、比較的少ない数のＺ位置と目標値の組み合わせから関数を算出することができる。このため、画像データを取得する回数を少なく抑えることが可能であり、その結果、サンプルＳへのダメージを抑えながら、短時間での関数の算出が可能となる。

さらに、ステップＳ８では、関数は、少なくとも３つのＺ位置と少なくとも３つのＺ位置における目標値との組み合わせに基づいて、補間又は関数近似により算出されることがより望ましい。これにより、サンプルＳが深さによって屈折率が大きく異なる構造を有している場合であっても、その屈折率の変化に伴う目標値の変化を捉えた関数を算出することができるからである。

以下、ステップＳ８の処理について具体的に説明する。なお、以下では、観察深さ５０μｍから６００μｍの範囲が注目範囲として指定された場合を例に説明する。

図８は、図４に示すステップＳ８の処理を自動化した具体例を示すフローチャートである。図９は、図８に示すステップＳ１１の処理で算出されたＺ位置に対する目標値の傾きを示した図である。図１０は、図８に示すステップＳ１２の処理で決定した複数のＺ範囲について例示した図である。図１１から図１３は、それぞれ、図８に示すステップＳ１４の処理で算出された全関数の一例を示した図である。

顕微鏡システム１は、ステップＳ５で目標値が算出された複数のＺ位置のうちの隣り合う２つのＺ位置毎に、Ｚ位置に対する目標値の傾きを算出する（ステップＳ１１）。ここでは、演算装置２０は、複数のＺ位置のうちの隣り合う２つのＺ位置毎に、２つのＺ位置と２つのＺ位置の各々における目標値からなる２つの目標値とに基づいて、Ｚ位置に対する目標値の傾きを算出する。図９は、ステップＳ１１で算出した傾きを図示した図である。横軸は、球面収差が補正される補正環１１１の設定値（即ち、目標値）を示している。縦軸は、観察対象面の深さを示していて、対物レンズ１１０のＺ位置と１対１で対応している。なお、傾きは、２つのＺ位置間におけるサンプルの屈折率に依存し、対物レンズ１１０の設計において基準とした屈折率（以降、基準屈折率と記す。）に対してサンプルの屈折率が大きいほど、その絶対値は大きくなる。これは、基準屈折率とサンプルの屈折率の差異が大きいほどより大きな球面収差が発生するためである。

次に、顕微鏡システム１は、複数のＺ範囲を決定する（ステップＳ１２）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ１１において、２つのＺ位置毎に算出したＺ位置に対する目標値の傾きからなる、複数のＺ位置に対する目標値の傾きに基づいて、複数のＺ範囲を決定する。より詳細には、傾きの変化に着目する。例えば、傾きの変化がある閾値以上であるＺ位置を特定し、特定したＺ位置が境界に位置するようにＺ範囲を決定してもよい。傾きの変化が小さい領域（Ｚ範囲）では、サンプルの屈折率はほぼ一定であると考えられる。一方、傾きの変化が大きい領域（Ｚ範囲）では、サンプルの屈折率が大きく変化していると考えられる。傾きの変化が大きいＺ位置を境界にしてＺ範囲を決定することで、屈折率の変化が少なくおよそ均質な領域毎にＺ範囲を決定することができる。図１０では、傾きの変化が大きなＺ位置として、観察対象面の深さ１００μｍに対応するＺ位置（以降、Ｚ１００と記す。）と観察対象面の深さ５００μｍに対応するＺ位置（以降、Ｚ５００と記す。）を特定し、３つのＺ範囲（第１のＺ範囲、第２のＺ範囲、第３のＺ範囲）を決定した例が示されている。

複数のＺ範囲が決定されると、顕微鏡システム１は、Ｚ範囲毎に部分関数を算出する（ステップＳ１３）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ１２で決定した複数のＺ範囲毎に、そのＺ範囲を定義域とするＺ位置と目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出する。図１１には、Ｚ１００における目標値とＺ５００における目標値を線形補間して、第２のＺ範囲を定義域とする部分関数を算出した例が示されている。図１２には、最小二乗法により第２のＺ範囲を定義域とする部分関数を算出した例が示されている。図１３には、二次関数の関数近似により第２のＺ範囲を定義域とする部分関数を算出した例が示されている。なお、図１１から図１３のいずれも、第１のＺ範囲と第３のＺ範囲については、線形補間により部分関数を算出した例が示されている。
最後に、顕微鏡システム１は、部分関数の集合からなる全関数を算出し（ステップＳ１４）、図８の処理を終了する。

顕微鏡システム１は、図４及び図８に示す処理を実行することで、Ｚ位置と目標値との関係を示す関数を自動的に算出することができる。また、注目範囲内において屈折率の変化が少なくおよそ均質な領域毎にＺ範囲を決定して、Ｚ範囲毎に算出した部分関数から全関数を算出する。このため、サンプルＳが深さによって屈折率が大きく異なる構造を有している場合であっても、高精度に球面収差を補正する関数を算出することができる。これは、屈折率が異なる層が積層された構造を有する脳などのサンプルを対象とする場合に、特に好適である。従って、顕微鏡システム１によれば、高精度に球面収差を補正する関数を容易に算出することができる。

図１４は、図４に示すステップＳ８の処理を自動化した別の具体例を示すフローチャートである。顕微鏡システム１は、図８に示す処理の代わりに、図１４に示す処理を実行してもよい。

顕微鏡システム１は、まず、ステップＳ５で目標値が算出された複数のＺ位置のうちの隣り合う２つのＺ位置毎に、線形補間により部分関数を算出する（ステップＳ２１）。ここでは、演算装置２０は、複数のＺ位置のうちの隣り合う２つのＺ位置と、その２つのＺ位置の各々における目標値からなる２つの目標値とに基づいて、その２つのＺ位置を両端としたＺ範囲を定義域とするＺ位置と目標値との関係を示す部分関数を、線形補間により算出する。この処理は、隣り合う２つのＺ位置毎に行われる。

その後、顕微鏡システム１は、部分関数の集合からなる全関数を算出し（ステップＳ２２）、図１４の処理を終了する。図９には、図１４の処理により算出されたＺ位置と目標値との関係を示す関数が示されている。

図１４の処理は、図８の処理において、隣り合う２つのＺ位置間をそれぞれＺ範囲と決定した場合に相当する。従って、顕微鏡システム１は、図４及び図１４に示す処理を実行することによっても、図４及び図８に示す処理を実行した場合と同様の効果を得ることができる。

図１５は、図４に示すステップＳ８の処理を半自動化した具体例を示すフローチャートである。図１６は、図１５に示すステップＳ３２で受け付けるＺ範囲の指定を入力する方法について説明するための図である。顕微鏡システム１は、図８に示す処理の代わりに、図１６に示す処理を実行してもよい。

顕微鏡システム１は、まず、ステップＳ５で目標値が算出された複数のＺ位置と複数の目標値を表示装置３０に表示させる（ステップＳ３１）。ここでは、演算装置２０（出力Ｉ／Ｆ装置２４）が、複数のＺ位置と、複数のＺ位置の各々における目標値からなる複数の目標値と、を表示装置３０に表示させる。図１６には、Ｚ位置と目標値の組み合わせを示す点をプロットすることで、複数のＺ位置と複数の目標値を表示する例が示されている。なお、表示方法は、図１６の例に限られず、例えば、表形式で各数値が表示されてもよい。

次に、顕微鏡システム１は、複数のＺ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ３２）。ここでは、例えば、ステップＳ３１で表示装置３０に表示された情報を確認した利用者が、キーボード４０等を用いて複数のＺ範囲を指定する。図１６には、複数のＺ位置と複数の目標値が表示された画面上でＺ範囲を指定する様子が例示されている。複数のＺ範囲が指定されると、演算装置２０は指定されたＺ範囲に関する情報を受信する。

その後、顕微鏡システム１は、Ｚ範囲毎に、部分関数を算出する（ステップＳ３３）。ここでは、表示装置３０が複数のＺ位置と複数の目標値を表示した後にステップＳ３２で指定されたＺ範囲毎に、演算装置２０が、そのＺ範囲を定義域とするＺ位置と目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出する。
最後に、顕微鏡システム１は、ステップＳ３３で算出した部分関数の集合からなる全関数を算出し（ステップＳ３４）、図１５の処理を終了する。

顕微鏡システム１は、図４及び図１５に示す処理を実行することで、演算装置２０による機械的な判断が困難な場合であっても、利用者が表示装置３０に表示される情報を見ながら、屈折率の変化が少なくおよそ均質な領域をＺ範囲として指定することができる。このため、顕微鏡システム１によれば、高精度に球面収差を補正する関数を容易に算出することができる。

図１７は、本実施例に係る顕微鏡システム１で行われる球面収差補正処理のフローチャートである。以下、図１７を参照しながら、顕微鏡システム１において補正環１１１を利用して行われる球面収差を補正する処理について説明する。なお、図１７に示す球面収差補正処理は、例えば、観察開始直前に行われる。

顕微鏡システム１は、まず、Ｚ位置の指定を受け付ける（ステップＳ４１）。ここでは、例えば、利用者が観察対象面を決定するためにＺ駆動部操作装置６０を操作してＺ位置を指定する。これにより、演算装置２０がＺ駆動部操作装置６０から指定されたＺ位置に関する情報を受信する。なお、ここで指定されるＺ位置は、注目範囲によって特定されるＺ範囲内の位置である。さらに、Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を制御して対物レンズ１１０のＺ位置を指定されたＺ位置に変化させる。その結果、サンプルＳの観察対象面が確定する。

次に、顕微鏡システム１は、ステップＳ４１で指定されたＺ位置と図４に示す関数算出処理で算出された関数とに基づいて、目標値を算出する（ステップＳ４２）。ここでは、演算装置２０が、ステップＳ４１で指定されたＺ位置（現在のＺ位置）と図４に示す関数算出処理で算出された関数に基づいて、現在のＺ位置における目標値を算出する。

顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、補正環１１１の設定値を目標値に設定する（ステップＳ４３）。ここでは、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値をステップＳ４２で算出された目標値に変更する。なお、補正環制御装置１４は、自動的に、即ち、演算装置２０からの指示に従って、ステップＳ４２で算出した目標値に補正環１１１の設定値を変更してもよい。また、手動により、即ち、ステップＳ４２で算出された目標値が表示装置３０に表示され、表示された目標値に基づいて利用者が補正環操作装置５０を操作することにより、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。また、利用者が補正環１１１を直接操作して補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。

最後に、顕微鏡システム１は、レーザー１０１の出力を設定する（ステップＳ４４）。ここでは、光源制御装置１１が、補正環１１１の設定値が目標値であるときに顕微鏡装置で取得された画像データに基づいて、サンプルＳに照射するレーザー光のパワーを制御する。例えば、ステップＳ４３で補正環１１１の設定値を変更した後に画像データを取得して、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定する。

顕微鏡システム１は、図１７に示す球面収差補正処理を実行することで、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を容易に補正することができる。これにより、顕微鏡１００が有する光学性能を十分に発揮して、高品質な画像を得ることができる。また、顕微鏡システム１は、Ｚ位置と関数に基づいて簡単な計算で現在のＺ位置における目標値を算出することができる。このため、観察深さを頻繁に変更しながらサンプルＳを観察する場合であっても、短時間で補正環１１１の設定値を深さに応じた目標値に変更することができる。補正環１１１の調整作業を自動化することができるため、他の自動化処理、例えば、複数のＺ位置で画像データを取得して三次元画像やエクステンドフォーカス画像を自動的に生成する処理などにも、容易に組み込むことができる。さらに、球面収差が補正された状態では、一般に、球面収差が補正されていない状態に比べて明るい画像が得られる。このため、球面収差が補正された状態で取得された画像データに基づいてレーザー１０１の出力を設定することで、レーザー１０１の出力を抑えて、生体試料へのダメージを抑制することができる。

以下、図４に示す関数算出処理のステップＳ５で行われる目標値算出処理について、具体的に説明する。図１８は、顕微鏡システム１でＺ位置毎に行われる目標値算出処理のフローチャートである。図１９は、図１８に示す目標値算出処理について説明するための図である。

顕微鏡システム１は、まず、補正環１１１の複数の設定値を決定する（ステップＳ５１）。ここでは、顕微鏡装置でサンプルの画像データを取得する際の補正環１１１の設定値を演算装置２０が複数個決定する。例えば、図１９（ａ）に示すように、演算装置２０は、補正環１１１が回転可能な範囲（動作可能範囲）自体又はそれより少しだけ狭い範囲を探索範囲に決定し、探索範囲を均等に分割する予め決められた数（ここでは１０）の設定値（補正環位置）を、複数の設定値として決定する。なお、図１９（ａ）では、θ１からθ１０までの１０個の設定値（補正環位置）が決定される例が示されている。

次に、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定値をステップＳ５１で決定した設定値に変更する（ステップＳ５２）。ここでは、補正環制御装置１４が演算装置２０からの指示に従ってステップＳ５１で決定した複数の設定値のいずれかに設定する。例えば、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値をステップＳ５１で決定したθ１に変更する。

補正環１１１の設定値が変更されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの画像データを取得する（ステップＳ５３）。ここでは、顕微鏡装置が演算装置２０からの指示に従って画像データを取得する。例えば、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値がθ１の状態で画像データを取得する。

その後、顕微鏡システム１は、ステップＳ５１で決定したすべての設定値で画像データを取得したか否かを判断し（ステップＳ５４）、すべての設定値で画像データを取得していない場合には、ステップＳ５２からステップＳ５４の処理を繰り返す。これにより、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値が異なる複数の状態の各々で、サンプルＳの観察対象面の画像データを取得し、その結果、複数の画像データを取得する。

すべての設定値で画像データが取得されると、顕微鏡システム１は、ステップＳ５３で取得した複数の画像データの各々の評価値を算出する（ステップＳ５５）。ここでは、演算装置２０が、複数の画像データの各々に基づいて球面収差が補正されているほど大きな値を示すその画像データの評価値を算出して、その結果、複数の画像データの複数の評価値を算出する。一般に、球面収差が補正された画像データほど高いコントラストを有していることから、評価値としては、例えば、画像データに対してコントラスト評価法を用いて算出されるコントラスト値が用いられる。図１９（ａ）には、ステップＳ５３で取得した複数の画像データの評価値が示されている。なお、図１９（ａ）では、画像データは補正環位置（補正環１１１の設定値）によって特定され、その画像データの評価値がコントラスト値として示されている。

コントラスト評価法によるコントラスト値は、画像データを構成するピクセル間の輝度値の差分に基づいて算出される。具体的には、例えば、下式により、ｘ方向にｎピクセル分ずれた位置にある２つのピクセルの輝度値の差分の２乗を画像データ全体で積分した値が、コントラスト値として算出される。

ここで、ｘは画像データを構成するピクセルの列を特定する変数であり、ｙは画像データを構成するピクセルの行を特定する変数である。Ｗは画像データを構成するピクセルのｘ方向の数（即ち、列数）であり、Ｈは画像データを構成するピクセルのｙ方向の数（即ち、行数）である。ｆはピクセルの輝度値であり、ｎは整数（例えば、５など）である。

評価値が算出されると、顕微鏡システム１は、所定の条件を満たしているか否かを判断する（ステップＳ５６）。所定の条件としては、例えば、ステップＳ５２からステップＳ５６までの処理の繰り返し回数が所定回数に達しているか否かであってもよく、複数の設定値の平均間隔が所定値以下であるか否かであってもよい。

ステップＳ５６で所定の条件を満たしていない場合には、顕微鏡システム１は、改めて複数の設定値を決定し（ステップＳ５７）、その後、ステップＳ５２からステップＳ５６の処理を繰り返す。

ステップＳ５７では、演算装置２０は、以下の２つの条件を満たすように複数の設定値を決定する。第１の条件は、ステップＳ５７で決定する複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔が、先の複数の設定値の分布範囲及び平均間隔と比較して、狭いことである。第２の条件は、ステップＳ５７で決定する複数の設定値の分布範囲内に、ステップＳ５５において最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれることである。なお、本明細書において、評価値に対応する設定値とは、ある画像データから算出された評価値に対するその画像データが取得されたときの補正装置の設定値のことをいうものとする。また、設定値に対応する評価値とは、ある画像データが取得されたときの補正装置の設定値に対するその画像データから算出された評価値のことをいうものとする。

これにより、顕微鏡装置は、設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する処理を、複数の状態で設定される補正環１１１の複数の設定値の分布範囲と平均間隔とが繰り返し毎に狭まり、且つ、その分布範囲内に演算装置２０が算出した最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれるように、繰り返す。そして、演算装置２０は、繰り返し毎に、複数の画像データの複数の評価値を算出する。

図１９（ｂ）は、ステップＳ５７で決定した複数の設定値に基づいて取得した複数の画像データの評価値が示されている。図１９（ａ）と図１９（ｂ）を比較すると、図１９（ｂ）に示す複数の設定値（補正環位置）は、上記２つの条件を満たしていることが確認できる。なお、図１９（ａ）と図１９（ｂ）では、いずれも１０個の設定値（補正環位置）が決定されている例が示されているが、設定値の数は、繰り返し毎に設定値の平均間隔が狭くなる限り、同一に限られず、増加しても減少してもよい。

ステップＳ５６で所定の条件を満たしている場合には、顕微鏡システム１は、ステップＳ５５で算出した複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて目標値を算出し（ステップＳ５８）、目標値算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、例えば、最後の繰り返しにおいてステップＳ５５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値を目標値として算出してもよい。また、最後の繰り返しに限らずステップＳ５５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値を目標値として算出してもよい。なお、演算装置２０は、算出した目標値と現在のＺ位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。
顕微鏡システム１は、図１８に示す目標値算出処理を実行することで、比較的少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することができる。

なお、図１８のステップＳ５５では、画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、画像データの全体領域を複数の領域に分割して、分割によって得られる領域毎に評価値（以降、画像データ毎に算出される評価値と区別するため、領域評価値と記す。）を算出してもよい。この場合、ステップＳ５８では、領域毎に目標値（全体領域に対して算出される目標値と区別するため、以降、領域目標値と記す。）を算出し、複数の領域目標値に基づいて、全体領域に対する目標値を算出する。

図２０は、画像データの全体領域Ｗを領域Ｒ１から領域Ｒ９の９つの領域に分割し、領域毎に領域目標値を算出した例を示している。全体領域に対する目標値は、例えば、領域目標値を昇順又は降順に並べた（θ３：θ３：θ４：θ４：θ５：θ５：θ５：θ６：θ６）中間値（θ５）に決定されてもよく、最頻値（θ５）に決定されてもよい。なお、分割数も９つに限られず、９つより少なくても多くてもよい。

領域毎に領域目標値を算出し、複数の領域目標値に対する統計的な処理により目標値を算出することで、画像データに他のピクセルデータと比較して極端に高輝度又は低輝度を有するピクセルデータが含まれる場合であっても、その影響を抑えて画像データのコントラストを評価することができる。このため、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。

図２１は、顕微鏡システム１で行われる別の目標値算出処理のフローチャートである。対物レンズ１１０には、補正環１１１の設定値を変更することにより対物レンズ１１０の焦点距離がわずかに変化するものが存在する。図２１に示す目標値算出処理は、このような対物レンズ１１０が使用される場合に行われる。図２１に示す目標値算出処理は、ステップＳ５８に続いて、さらに、ステップＳ５９からステップＳ６１の処理が行われる点が、図１８に示す目標値算出処理と異なっている。その他の点は、図１８に示す目標値算出処理と同様であるので、説明を割愛する。

顕微鏡システム１は、ステップＳ５８で目標値が算出されると、Ｚ位置を変更する（ステップＳ５９）。ここでは、演算装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置１３がZ駆動部１０９を光軸方向に移動させて対物レンズ１１０のＺ位置を変更する。Ｚ位置の移動量は、補正環１１１の設定値を動作可能範囲内で変更したときに、その変更によって生じる観察対象面の最大移動量（つまり、対物レンズ１１０の焦点距離の最大変化量）よりも小さな距離である。

次に、顕微鏡システム１は、変更後のＺ位置が所定のＺ範囲内にあるか否かを判断する（ステップＳ６０）。ここでは、例えば、変更後のＺ位置が基準位置（例えば、図４のステップＳ４またはステップＳ７で確定したＺ位置）から補正環１１１の設定値の変更によって生じる観察対象面の最大移動量よりも離れていない場合には、演算装置２０はＺ位置が所定のＺ範囲内にあると判断する。即ち、所定のＺ範囲とは、例えば、ステップＳ４又はステップＳ７で確定した観察対象面のＺ位置を中心とした、対物レンズ１１０の焦点距離の最大変化量の２倍の幅を有するＺ範囲である。

変更後のＺ位置が所定のＺ範囲内にある場合には、顕微鏡システム１は、変更後のＺ位置でステップＳ５２からステップＳ５８の処理を行う。これにより、演算装置２０は、Ｚ位置毎に目標値を算出し、その結果、複数のＺ位置における複数の目標値を算出する。

変更後のＺ位置が所定のＺ範囲外にある場合には、顕微鏡システム１は、複数のＺ位置における複数の目標値とこれら複数の目標値に対応する評価値とに基づいて、評価値が最大となると推定される補正環１１１の設定値とＺ位置の組み合わせを算出し（ステップＳ６１）、目標値算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、例えば、複数の目標値に対応する複数の評価値のうちの最大の評価値を特定し、その最大の評価値に対応する目標値を、評価値が最大となると推定される設定値として算出する。そして、演算装置２０は、評価値が最大となると推定される設定値とＺ位置の組み合わせを記憶装置２５に記憶させる。

顕微鏡システム１は、図２１に示す目標値算出処理を実行することで、対物レンズ１１０の焦点距離が補正環１１１の設定値によって変化する場合であっても、比較的少ない画像データの取得回数で、球面収差を良好に補正する補正環１１１の設定値と対物レンズ１１０のＺ位置の組み合わせを高精度に算出することができる。そして、ステップＳ６１で算出した設定値とＺ位置の組み合わせに従って、Ｚ制御装置１３及び補正環制御装置１４がZ駆動部１０９及び補正環１１１を制御することで、観察対象面で生じる球面収差を良好に補正することができる。

なお、図２２のステップＳ５５では、画像データの全体領域を複数の領域に分割して、領域毎に領域評価値を算出してもよく、この場合、ステップＳ５８では、複数の領域目標値を算出する。また、ステップＳ６１では、複数のＺ位置における複数の領域目標値とこれら複数の領域目標値に対応する領域評価値とに基づいて、評価値が最大となると推定される補正環１１１の設定値とＺ位置の組み合わせ（全体領域に対して算出される組み合わせと区別するため、以降、領域組み合わせと記す）を、領域毎に算出する。その後、複数の領域組み合わせに基づいて、全体領域に対する組み合わせを算出する。

図２２は、画像データの全体領域Ｗを領域Ｒ１から領域Ｒ９の９つの領域に分割し、領域毎に領域組み合わせを算出した例を示している。領域組み合わせを構成する設定値は、例えば、ステップＳ５８で算出される領域目標値を昇順又は降順に並べた（θ３．６：θ３．７：θ４．４：θ４．４：θ４．５：θ４．６：θ４．７：θ５．１：θ６．１）中間値（θ４．５）に決定されてもよく、最頻値（θ４．４）に決定されてもよい。また、領域組み合わせを構成するＺ位置は、例えば、決定された設定値に基づいて決定されてもよく、中間値（θ４．５）であれば、中間値に対応するＺ位置の値（Ｚ２．５）、最頻値（θ４．４）であれば、最頻値に対応するＺ位置の値（Ｚ２．３）に決定されてもよい。なお、分割数も９つに限られず、９つより少なくても多くてもよい。

領域毎に領域組み合わせを算出し、複数の領域組み合わせに対する統計的な処理により、評価値が最大となると推定される補正環１１１の設定値とＺ位置の組み合わせ組み合わせを算出する。これにより、画像データに他のピクセルデータと比較して極端に高輝度又は低輝度を有するピクセルデータが含まれる場合であっても、その影響を抑えて画像データのコントラストを評価することができる。このため、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。

図２３は、顕微鏡システム１で行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。図２４は、図２３に示す目標値算出処理について説明するための図である。図２３及び図２４を参照しながら、図２３に示す目標値算出処理について説明する。なお、図２３に示すステップＳ７１からステップＳ７５までの処理は、図１８に示すステップＳ５１からステップＳ５５までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。

顕微鏡システム１は、ステップＳ７５で評価値が算出されると、複数の画像データの第１の座標情報に基づいて目標値を算出し（ステップＳ７６）、目標値算出処理を終了する。なお、画像データの第１の座標情報とは、その画像データから算出された評価値とその評価値に対応する補正環１１１の設定値との組み合わせをいうものとする。

ステップＳ７６では、演算装置２０は、まず、ステップＳ７３で取得した複数の画像データから３つ以上の画像データを選択する。この３つ以上の画像データは、ステップＳ７５で算出した複数の評価値のうちの最大値が算出された画像データが含まれるように、選択される。

その後、演算装置２０は、選択した３つ以上の画像データの第１の座標情報に基づいて、観察対象面における球面収差が補正される補正環１１１の設定値である目標値を算出する。具体的には、３つ以上の画像データの第１の座標情報に基づいて、補間又は関数近似により関数を算出する。なお、この関数は、評価値と設定値に関する関数である。そして、算出した関数のピーク座標（評価値が最大となる座標）から得られる設定値を目標値として算出する。演算装置２０は、算出した目標値と現在のＺ位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。

図２４には、最大の評価値が算出される画像データとその前後（つまり、設定値が近い）の画像データからなる３つの画像データが選択され、それらの画像データから得られる３つの第１の座標情報からラグランジュ補間により二次関数を算出し、そのピーク座標から目標値を算出した例が示されている。なお、補間には、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。また、関数近似にも、最小二乗法などの任意の近似法が採用され得る。
顕微鏡システム１は、図２３に示す目標値算出処理を実行することで、比較的少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することができる。

なお、図１８に示す目標値算出処理と図２３に示す目標値算出処理を組み合わせて目標値を算出してもよい。例えば、図２３に示す目標値算出処理に図１８のステップＳ５６及びステップＳ５７の処理を追加して、ステップＳ７６で算出した目標値が分布範囲に含まれるように、複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔を徐々に狭めながら、目標値の算出を繰り返してもよい。これにより、目標値をより高い精度で算出することが可能となる。

図２５は、顕微鏡システム１で行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。図２６は、図２５に示す目標値算出処理のステップＳ７９の処理のフローチャートである。図２７及び図２８は、図２６に示す処理について説明するための図であり、図２７は目標値と評価値の関数を算出する方法を、図２８は目標値とＺ位置の関数を算出する方法を示している。図２５に示す目標値算出処理は、補正環１１１の設定値を変更することにより焦点距離が変化する対物レンズ１１０が使用される場合に行われる。図２５に示す目標値算出処理は、ステップＳ７６の代わりにステップＳ７６ａの処理が行われる点と、さらに、ステップＳ７７からステップＳ７９の処理が行われる点が、図２３に示す目標値算出処理と異なっている。その他の点は、図２３に示す目標値算出処理と同様であるので、説明を割愛する。なお、ステップＳ７６ａでは、関数のピーク座標から目標値に加えてその目標値に対応する評価値を算出する点がステップＳ７６とは異なっている。

顕微鏡システム１は、ステップＳ７６ａで目標値と評価値が算出されると、Ｚ位置を変更する（ステップＳ７７）。さらに、変更後のＺ位置が所定のＺ範囲内にあるか否かを判断する（ステップＳ７８）。なお、ステップＳ７７及びステップＳ７８の処理は、図２０に示すステップＳ５９及びステップＳ６０の処理と同様である。

変更後のＺ位置が所定のＺ範囲内にある場合には、顕微鏡システム１は、変更後のＺ位置でステップＳ７２からステップＳ７６ａの処理を行う。これにより、Ｚ位置毎に目標値と目標値に対応する評価値が算出され、その結果、複数のＺ位置における複数の目標値と複数の評価値が算出される。即ち、複数の第２の座標情報が算出される。なお、第２の座標情報とは、Ｚ位置と、Ｚ位置における目標値と、Ｚ位置における目標値に対応する評価値の組み合わせをいうものとする。

変更後のＺ位置が所定のＺ範囲外にある場合には、顕微鏡システム１は、複数の第２の座標情報に基づいて、評価値が最大となると推定される設定値とＺ位置の組み合わせを算出し（ステップＳ７９）、目標値算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、図２６に示すように、まず、複数の第２の座標情報から３つ以上の第２の座標情報を選択する（ステップＳ７９ａ）。この３つ以上の第２の座標情報は、複数の第２の座標情報のうちの最大値の評価値を有する第２の座標情報が含まれるように選択される。その後、演算装置２０は、選択した３つ以上の第２の座標情報に基づいて、補間又は関数近似により目標値と評価値の関数（図２７における破線）を算出する（ステップＳ７９ｂ）。このとき、第２の座標情報に含まれるＺ位置の情報は関数の算出に利用しない。次に、ステップＳ７９ｂで算出した関数のピーク座標（評価値が最大となる座標）からピーク座標での目標値を算出する（ステップＳ７９ｃ）。さらに、選択した３つ以上の第２の座標情報に基づいて、線形補間により目標値とＺ位置の関数（図２８における破線）を算出する（ステップＳ７９ｄ）。このとき、第２の座標情報に含まれる評価値の情報は関数の算出に利用しない。そして、ステップＳ７９ｃで算出した目標値とステップＳ７９ｄで算出した関数に基づいてＺ位置を算出する（ステップＳ７９ｅ）。最後に、ステップＳ７９ｃで算出した目標値とステップＳ７９ｅで算出したＺ位置の組み合わせを評価値が最大となると推定される設定値とＺ位置の組み組み合わせとして算出し、記憶装置２５に記憶させる（ステップＳ７９ｆ）。図２１のステップＳ６１でも同様の方法で組み合わせを算出してもよい。

顕微鏡システム１は、図２５に示す目標値算出処理を実行することで、対物レンズ１１０の焦点距離が補正環１１１の設定値によって変化する場合であっても、比較的少ない画像データの取得回数で、球面収差を良好に補正する補正環１１１の設定値と対物レンズ１１０のＺ位置の組み合わせを高精度に算出することができる。そして、ステップＳ７９で算出した設定値とＺ位置の組み合わせに従って、Ｚ制御装置１３及び補正環制御装置１４がZ駆動部１０９及び補正環１１１を制御することで、観察対象面で生じる球面収差を良好に補正することができる。

図２５では、所定のＺ範囲内のＺ位置毎にステップＳ７２からステップＳ７６ａの処理を行う例を示したが、さらに、Ｚ位置毎にステップＳ７１が行われてもよい。即ち、Ｚ位置毎に、補正環１１１の複数の設定値（画像データを取得する補正環の設定値の範囲）を決定し直してもよい。

図２９は、Ｚ位置毎且つ補正環１１１の設定値（角度）毎に得られる標本Ｓの画像を並べた図である。図２９には、Ｚ位置が深くなるほど、高いコントラストの画像が得られる補正環１１１の設定値も大きくなるという傾向が示されている。従って、このようなＺ位置に対する傾向が既知である場合には、Ｚ位置毎に、この傾向に基づいて探索範囲を決定して、ステップＳ７１でその探索範囲内で複数の設定値を決定してもよい。図２９に示す例であれば、Ｚ２では、θ１からθ３の３つの設定値を決定し、Ｚ３では、θ１からθ５の５つの設定値を決定し、Ｚ４では、θ２からθ６の５つの設定値を決定する。これにより、Ｚ位置毎に複数の設定値を決定し直さない場合に比べて、探索範囲を狭くすることができるため、ステップＳ７１で決定する設定値の数も少なくすることができる。このため、より少ない画像データの取得回数で、球面収差を良好に補正する補正環１１１の設定値と対物レンズ１１０のＺ位置の組み合わせを高精度に算出することができる。

なお、探索範囲の幅（Ｌ１とＬ２との間のθ方向の距離）は、例えば、対物レンズの設計値等に基づいて、対物レンズ毎に設定されていてもよく、また、実験等により、図２９に示すようなデータを予め取得し、このデータに基づいて設定されていてもよい。また、上述した傾向（即ち、Ｚ位置と評価値と設定値の関係を示す傾向、例えば、Ｌ１及びＬ２の傾き）は、最初の数回のＺ位置の変更までの間に算出されたＺ位置と目標値の組み合わせの情報から算出してもよい。

また、図２１及び図２５は、Ｚ位置を変更することなく決定した補正環１１１の全ての設定値で画像データを取得した後に、Ｚ位置を次の位置へ変更する例を示しているが、結果として、設定値が異なる複数の状態の各々で取得された画像データが所定範囲内のＺ位置毎に得られればよい。このため、補正環１１１の設定値を変更することなく所定範囲内の各Ｚ位置で画像データを取得した後に、補正環１１１の設定値を次の設定値に変更してもよい。

図３０は、本実施例に係る顕微鏡２００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡２００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。

顕微鏡２００は、共焦点顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡２００は、図３０に示すように、照明光路上に、レーザー２０１と、ビームエクスパンダ２０２と、ダイクロイックミラー２０３と、走査ユニット２０４と、瞳投影光学系２０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるZ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。

レーザー２０１は、例えば、可視域や紫外域、赤外域のレーザー光を発振する。レーザー２０１から発振されるレーザーの出力は、光源制御装置１１によって制御される。ビームエクスパンダ２０２は、レーザー２０１からのレーザー光（コリメート光）の光束を対物レンズ２１３の瞳径に応じて調整する光学系である。ダイクロイックミラー２０３は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。

走査ユニット２０４は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナンドスキャナなどを含んでいる。走査ユニット２０４の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット２０４の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。瞳投影光学系２０５は、走査ユニット２０４を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。

顕微鏡２００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー２０３の透過光路）上に、ミラー２０６と、共焦点レンズ２０７と、共焦点絞り２０８と、集光レンズ２０９と、光検出器２１０とを備えている。光検出器２１０から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器２１１に出力される。

共焦点レンズ２０７は、共焦点絞り２０８上に、蛍光を集光するレンズである。共焦点絞り２０８は、対物レンズ１１０の焦点面と光学的に共役な位置に配置された絞りである。共焦点絞り２０８には、対物レンズ１１０の焦点位置から生じた蛍光を透過させるピンホールが形成されている。集光レンズ２０９は、共焦点絞り２０８を通過した蛍光を光検出器２１０に導くレンズである。

光検出器２１０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器２１１は、光検出器２１０からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。

以上のように構成された本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００は、走査ユニット２０４を用いてレーザー光でサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器２１０で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器２１０からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット２０４の走査情報とに基づいて、画像データを生成する。即ち、本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。

本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、図４に示す関数算出処理を行うことができる。このため、注目範囲内で球面収差を高精度に補正する関数を容易に算出することができる。

図３１は、本実施例に係る顕微鏡３００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡３００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。

顕微鏡３００は、走査型ではない通常の蛍光顕微鏡である。なお、顕微鏡３００は、ズーム機能を備えているため、ズーム顕微鏡とも呼ばれる。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡３００は、図３１に示すように、照明光路上に、光源３０２を内蔵したランプハウス３０１と、コレクタレンズ３０３と、蛍光キューブ３０４と、ズームレンズ３０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるZ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。

光源３０２は、例えば、ＬＥＤ光源、高出力の水銀ランプなどである。なお、光源３０２の出力は、光源制御装置１１によって制御される。コレクタレンズ３０３は、光源３０２からの励起光をコリメートする。蛍光キューブ３０４は、図示しないダイクロイックミラーと励起フィルタと吸収フィルタとを備えている。蛍光キューブ３０４は、励起光とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長により励起光と蛍光を分離する。

ズームレンズ３０５は、ズームレンズ３０５を構成するレンズ間の距離が変化するように構成されている。ズーム制御装置１２がレンズ間の距離を図示しないモータ等によって変化させることでズーム倍率が変化する。即ち、ズームレンズ３０５は、ズーム制御装置１２によって制御される。

顕微鏡３００は、さらに、検出光路（蛍光キューブ３０４の透過光路）上に、結像レンズ３０６と、撮像装置３０７を備えている。結像レンズ３０６は、対物レンズ１１０及びズームレンズ３０５を介して入射する蛍光を撮像装置３０７上に集光させて、サンプルＳの光学像を形成する。撮像装置３０７は、例えば、ＣＣＤカメラであり、サンプルＳの光学像を撮像してサンプルＳの画像データを生成する。撮像装置３０７は、生成した画像データを演算装置２０に出力する。本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡３００である顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。

本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、図４に示す関数算出処理を行うことができる。このため、注目範囲内で球面収差を高精度に補正する関数を容易に算出することができる。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。顕微鏡システム、Ｚ位置と目標値との関係を算出する方法は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。

Ｚ制御装置１３がZ駆動部１０９を制御して対物レンズ１１０のＺ位置を変化させる構成を例示したが、Ｚ制御装置１３は、顕微鏡のステージを光軸方向に移動させることにより対物レンズ１１０のＺ位置を変化させてもよい。

また、観察対象面の深さによって変化する球面収差を補正する補正装置として補正環１１１を例示したが、補正装置は、光路上で生じる球面収差の量を変化させることができるものであればよい。補正装置は、例えば、ＬＣＯＳ（Liquid crystal on silicon、商標）、ＤＦＭ（Deformable Mirror）、液体レンズなどを用いた装置であってもよい。また、発生する球面収差量が大きく単一の補正装置では十分に球面収差を補正しきれない場合には、補正する球面収差量を複数の補正装置で分担して、観察対象面で生じる球面収差を補正してもよい。

また、画素分解能が光学分解能よりも大きい、即ち、画素分解能から算出されるピクセルサイズが光学的に識別し得る２点間の距離よりも大きい場合には、発生した球面収差が画像データに十分に反映していない可能性がある。このような場合には、発生した球面収差を画像データ、ひいては評価値に正しく反映させるため、画素分解能が光学分解能よりも小さくなるように、ズーム倍率を高くした状態で目標値算出処理を実行してもよい。これにより、観察対象面に生じた球面収差をより高い精度で補正する設定値を算出することが可能となる。

また、評価値を算出する方法として、設定値毎に１枚の画像データを取得し、取得した画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、設定値毎に複数の画像データを取得して、カルマンフィルタ等を用いて複数の画像データから評価値を算出してもよい。このような方法によれば、画像データの各々に含まれるノイズ成分を設定値毎の複数の画像データを用いて相殺させることができるため、より精度の高い評価値を算出することができる。

また、図１８及び図２３に示す目標値算出処理に加えて、図２１及び図２５に示すに示す目標値算出処理でも、画像データの全体領域を複数の領域に分割して、領域毎に評価値及び目標値を算出してもよい。これにより、球面収差が補正される設定値をより正しく算出することができる。

また、例えば、マウスの脳などの生体試料を観察する場合、観察対象面に明るく発光する細胞体が点在している場合がある。このような細胞体の明るさは、球面収差の影響に比べて焦点ズレの影響によって大きく変化する。このため、補正環１１１の設定値によって焦点距離が変化する対物レンズが用いられている場合には、評価値（画像のコントラスト）によって球面収差が補正される設定値を適切に算出することが困難になる場合がある。そのような場合には、評価値を算出する方法として、画像データを加工してから評価値を算出する図３２に示す方法を採用してもよい。

図３２は、画像データを加工してから評価値を算出する処理のフローチャートである。以下、図３２を参照しながら、評価値算出処理について説明する。

顕微鏡システムは、まず、画像データから輝度値に関するヒストグラムを作成する（ステップＳ８１）。ここでは、演算装置２０は、画像データを構成する各ピクセルの輝度値を特定し、輝度値毎のピクセル数を算出して、輝度値に関するヒストグラムを作成する。なお、ヒストグラムは、顕微鏡利用者が輝度値の度数分布を視覚的に把握するために作成される。従って、評価値算出処理に際して、ヒストグラムの作成は省略されてもよい。

次に、顕微鏡システムは、画像データから平均輝度値を算出する（ステップＳ８２）。ここでは、演算装置２０は、画像データを構成する複数のピクセルの輝度値の合計をピクセル数で除して、平均輝度値を算出する。

さらに、顕微鏡システムは、高輝度を有するピクセルデータの影響を排除する（ステップＳ８３）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ８１で作成したヒストグラムとステップＳ８２で算出した平均輝度値を用いて、平均輝度値から例えば３σ（σは画像データを構成するピクセルの輝度値の標準偏差）を超えて高い輝度を有するピクセルデータを特定し、それらのピクセルデータの輝度値を所定の輝度値に変更して画像データを更新する。なお、所定の輝度値は、例えば、平均輝度値＋３σである。

最後に、顕微鏡システムは、ステップＳ８３で更新した画像データに基づいて、その画像データの評価値を算出する（ステップＳ８４）。なお、このステップでの評価値の算出方法は、上述した方法と同様である。

顕微鏡システムが図３２に示す処理を行うことで、例えば、観察対象面内で明るく発光している細胞の影響を排除することができる。このため、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。なお、画像データを加工する方法は、上述した方法に限られない。例えば、表示された画像上で、画像中の評価対象とする範囲を指定して、その範囲内のピクセルデータに基づいて評価値を算出してもよい。この場合も、明るく発光する細胞を含まないように範囲を指定することで、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。

１ 顕微鏡システム
１０ 顕微鏡制御装置
１１ 光源制御装置
１２ ズーム制御装置
１３ Ｚ制御装置
１４ 補正環制御装置
２０ 演算装置
３０ 表示装置
４０ キーボード
５０ 補正環操作装置
６０ Z駆動部操作装置
１００、２００、３００ 顕微鏡
１０１、２０１ レーザー
１０２、２０４ 走査ユニット
１０３、１０６、２０５ 瞳投影光学系
１０４、２０６ ミラー
１０５、２０３ ダイクロイックミラー
１０７、２１０ 光検出器
１０８、２１１ Ａ／Ｄ変換器
１０９ Z駆動部
１１０ 対物レンズ
１１１ 補正環
２０２ ビームエクスパンダ
２０７ 共焦点レンズ
２０８ 共焦点絞り
２０９ 集光レンズ
３０１ ランプハウス
３０２ 光源
３０３ コレクタレンズ
３０４ 蛍光キューブ
３０５ ズームレンズ
３０６ 結像レンズ
３０７ 撮像装置
Ｓ サンプル
ＣＧ カバーガラス
Ｇ 三次元画像
Ｒ 注目範囲
Ｆ グラフ

Claims (5)

1. 対物レンズと球面収差を補正する補正装置とを備え、サンプルの画像データを取得する顕微鏡装置と、
   前記顕微鏡装置で取得した画像データに基づいて、前記サンプルの三次元画像を表示装置に表示させる表示制御装置と、
   前記表示装置に表示された前記三次元画像内の範囲を指定する範囲指定手段と、
   前記範囲指定手段で指定された範囲で特定される前記対物レンズのＺ範囲を対象とした、前記対物レンズのＺ位置と球面収差が補正される前記補正装置の設定値である目標値との関係を算出する演算装置と、を備え、
   前記演算装置は、前記Ｚ範囲内の複数のＺ位置を決定し、
   前記顕微鏡装置は、前記複数のＺ位置の各々毎に、前記補正装置の設定値の異なる複数の状態の各々でサンプルの画像データを取得し、
   前記演算装置は、
   前記顕微鏡装置で前記複数のＺ位置の各々毎に取得した複数の画像データに基づいて、当該Ｚ位置における目標値を算出し、
   前記複数のＺ位置と算出した複数の目標値に基づいて、前記Ｚ範囲を分割した複数のＺ範囲を決定し、
   前記複数のＺ範囲毎に、前記Ｚ位置と前記目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記表示制御装置は、前記演算装置で算出した関係を前記三次元画像に関連付けて、前記表示装置に表示させる
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
3. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
   前記対物レンズのＺ位置に応じて、当該Ｚ位置と前記演算装置で算出した関係とに基づいて算出される目標値に前記補正装置の設定値を変更する補正装置制御装置を備える
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記補正装置は、前記対物レンズ内のレンズを移動させる補正環である
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
5. 対物レンズのＺ位置と球面収差が補正される補正装置の設定値である目標値との関係を算出する方法であって、
   前記対物レンズと球面収差を補正する前記補正装置とを備える顕微鏡装置が取得したサンプルの画像データに基づいて、前記サンプルの三次元画像を表示装置に表示し、
   前記表示装置に表示された前記三次元画像内の範囲を指定し、
   指定した前記範囲で特定される前記対物レンズのＺ範囲を対象とした、前記対物レンズのＺ位置と前記目標値との関係を算出し、
   前記関係を算出することは、
   前記Ｚ範囲内の複数のＺ位置を決定することと、
   前記複数のＺ位置の各々毎に、前記補正装置の設定値の異なる複数の状態の各々でサンプルの画像データを取得することと、
   前記複数のＺ位置の各々毎に取得した複数の画像データに基づいて、当該Ｚ位置における目標値を算出することと、
   前記複数のＺ位置と算出した複数の目標値に基づいて、前記Ｚ範囲を分割した複数のＺ範囲を決定することと、
   前記複数のＺ範囲毎に、前記Ｚ位置と前記目標値との関係を示す部分関数を、補間又は関数近似により算出すること、を含む
   ことを特徴とする方法。