JP5881445B2

JP5881445B2 - 顕微鏡

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Publication number: JP5881445B2
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Authority: JP
Inventors: 広渡邉
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Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-02-01
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Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2032-02-01
Also published as: JP2013160816A

Description

本発明は、観察対象の標本の像を結像し、この像を撮像する機能を有する顕微鏡に関する。

近年、顕微鏡の分野では、デジタルカメラ等の撮像装置を搭載し、撮像装置が撮像した画像を表示部で表示する構成を有するものが知られている。このような顕微鏡が測定機能を有する場合、対物レンズやズーム倍率の誤差を予め測定し、取得した画像のＸＹ平面内の測定誤差を倍率誤差補正係数として記録する。

図１１は、ズーム倍率の誤差を測定する際に使用するサンプルの構成を示す図である。同図に示すキャリブレーションサンプル１０１は、ガラスの基材の表面に金属のパターンを蒸着等によって形成したラインアンドスペース（Ｌ／Ｓ）サンプルである。キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２には、高倍対物レンズ用のＬ／ＳパターンＬＳ１、中倍対物レンズ用のＬ／ＳパターンＬＳ２、および低倍対物レンズ用のＬ／ＳパターンＬＳ３が形成されている。各Ｌ／Ｓパターンは、線幅およびピッチが互いに異なる。例えば、低倍とは２０倍以下であり、高倍とは２０倍以上である。

図１２は、キャリブレーションサンプル１０１の顕微鏡画像の表示例を示す図である。顕微鏡画像では、ガラスと金属製のＬ／Ｓパターンとの明暗が逆転する。これは、ガラスの方が光の吸収率が大きいためである。

顕微鏡では、ズームのストローク中の複数の位置に対して、各ズーム倍率でキャリブレーションサンプル１０１のピッチに相当するピクセル数をカウントし、理想の倍率におけるピクセル数と比較して誤差率を算出する。

また、顕微鏡では、ズームのストローク中の複数の位置における測定値の間を所定の関数で補間することにより、全ズーム領域に対してＸＹ平面測定用の倍率誤差の補正を行っている。図１３は、倍率誤差の補正に使用する曲線の例を示す図である。同図に示す曲線Ｃは、顕微鏡の所定の要素（例えば、ズームレンズ）を駆動するモータの位置とズーム倍率との関係を与えている。

誤差率を正確に算出するためには、キャリブレーション対象の各ズーム倍率で基準となるキャリブレーションサンプル１０１に対して確実にピントを合わせる必要がある。しかしながら、作業者がマニュアルでピント合わせを行うと手間がかかるだけでなく、作業者による個人差が出てキャリブレーションを正しく行うことができないおそれがあった。そこで、オートフォーカス（ＡＦ）機能を備えた顕微鏡を用いて、自動キャリブレーションを行う方法が一般的に知られている。

顕微鏡観察のＡＦ処理として、コントラストＡＦが知られている。コントラストＡＦでは、コントラスト演算の結果からコントラスト値が最大となる合焦位置を探す山登り法が広く実用化されている。ここでのコントラスト演算は、隣接画素の差分または隣接画素の差分の自乗を画素全体または指定した範囲で平均化することによって算出するのが一般的である。

コントラストＡＦの一例として、ステージをＡＦ開始位置から細かいピッチで移動させながら、コントラストＡＦを行う技術が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。この技術では、コントラストＡＦを高速化するために、ステージの駆動ピッチが大きい粗フォーカス動作（以下、Roughスキャンと呼ぶ）と、ステージの駆動ピッチが小さい密フォーカス動作（以下、Fineスキャンと呼ぶ）の２種類のＡＦ処理を行う。より具体的には、Roughスキャンで大まかな合焦位置を見つけた後に、Fineスキャンで正確な合焦位置を見つけている。また、キャリブレーションを行う際には、キャリブレーションの速度を上げるために、ズーム低倍でＡＦを行った後、ズーム高倍でＡＦをかけることが一般的である。

特開平１０−１９７７８４号公報

しかしながら、上述した従来技術のＡＦ処理を使用してキャリブレーションを行う場合、本来見つけたい合焦位置とは異なる位置で合焦してしまう現象（偽合焦）が発生するおそれがあった。以下、この点について詳細に説明する。

図１４Ａは、従来の顕微鏡において、使用している対物レンズの倍率が所定の倍率より低い場合（焦点深度が大きく、ＡＦサーチ範囲が大きい場合）に生じる偽合焦の概要を説明する図である。キャリブレーションサンプル１０１は、基材としてガラスを適用しているので、ズーム倍率が最小の状態では焦点深度ＤＯＦ₁が大きい（大きさＤ₁）。このため、コントラスト曲線Ｃ₁はＡＦサーチＳＲ_１の範囲内でキャリブレーションサンプル１０１の表面１０２を中心とした一つのピークのみ存在する。これに対し、ズーム倍率が最大の状態では焦点深度が小さい。このため、コントラスト曲線Ｃ₂のピークが、表面１０２と裏面１０３（キャリブレーションサンプル１０１を載置するステージ表面に相当）との２つ存在する。

ズーム倍率が最小の状態でのＡＦ実行後は、サーチ範囲ＳＲ₁の１／２の分（Ｒ₁／２）だけＺ軸負の方向（以下、Near方向という）にステージを駆動した後、Ｚ軸正の方向（以下、Far方向という）にサーチする。これにより、コントラスト曲線Ｃ₁のピークを検出してからFineサーチしてピント合わせを行う。

その後、顕微鏡の制御部は、駆動モータに対してズーム倍率が最大となるようにヘッド部を駆動させた後、ＡＦを実行する。この場合、同じくＲ₁／２分だけNear方向にステージを駆動した後、Far方向にサーチするので、キャリブレーションサンプル１０１の裏面１０３におけるコントラスト曲線Ｃ₂のピークを検出し、Fineサーチによって合焦したと判断してしまう（図１４Ａの位置Ａ）。なお、コントラスト曲線Ｃ₂において、二つのピークの焦点深度ＤＯＦ₂の大きさＤ₂と焦点深度ＤＯＦ’₂の大きさＤ’₂は一般に異なる。また、Ｄ₂、Ｄ’₂は、焦点深度ＤＯＦ₁の大きさＤ₁より大きい。

そのため、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２にピントが合わず、キャリブレーションが実行できないという問題があった。

図１４Ｂは、従来の顕微鏡において、使用している対物レンズの倍率が所定の倍率より高い場合（撮像素子への入射光量が小さい場合）に生じる偽合焦の概要を説明する図である。図１４Ｂにおいて、ズーム倍率が最小の状態の焦点深度をＤＯＦ₃（大きさＤ₃）とし、コントラスト曲線をＣ₃としている。また、ズーム倍率が最大の状態の焦点深度をＤＯＦ₄（大きさＤ₄）とし、コントラスト曲線をＣ₄としている。

このような高倍対物レンズ使用時において、ズーム倍率が最小の状態でのＡＦでは、サーチ範囲ＳＲ₂は低倍対物レンズのサーチ範囲ＳＲ₁より小さいため、サーチ範囲ＳＲ₂の中では、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２を中心とした一つのピークのみ存在する。

これに対し、高倍対物レンズ使用時において、ズーム倍率を最大にしてＡＦを実行すると、ピントから大きく外れた位置において、撮像素子における受光量が激減して顕微鏡画像が暗くなる。この傾向は、デフォーカスした場合にさらに顕著になる。図１５は、図１４Ｂのコントラスト曲線Ｃ₄を拡大してより詳細に記載した図である。

コントラスト値を算出する際には、隣接画素比較をしているため、顕微鏡画像が暗くなると、顕微鏡画像にノイズが現れ、画像コントラスト値が大きくなる。図１６はこのような場合の例として、ピント内外で撮像素子への入射光量が激的に変化するズーム高倍で自動露出のターゲット値が７０である場合において、ピント位置から大きく外れた位置（ＡＦ開始位置に相当する位置）の直線上の輝度プロファイルを示す図である。図１７は、撮像素子のシャッタスピード、ゲイン等の露出条件が図１６と同様で、自動露出のターゲット値が１００である場合の直線上の輝度プロファイルを示す図であり、図１６に示す状態よりもピント位置に近づいた状態における直線上の輝度プロファイルを示す図である。図１６と図１７の比較からも明らかなように、撮像素子への入射光量はピント位置に近づくにつれ大きくなるため、画像輝度値が大きくなり、またノイズ成分も小さくなる。このため、コントラスト値は、ピント位置に近づくにつれて小さくなる。

このように、ノイズが加わった画像でピント位置に大きく外れた場所からＡＦを実行すると、ピント位置に近づくにつれてコントラスト値が小さくなり、本体検出すべき合焦位置と異なる位置で合焦してしまう現象（偽合焦）が発生する。このような偽合焦を回避するために、顕微鏡画像におけるノイズを除去するためにローパスフィルタをかける方法もあるが、低倍対物レンズや低倍ズーム時の細かいピッチのパターンでＡＦが合わなくなる可能性があるとともに、条件出しが大変であり、正確さに問題があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、ズーム倍率キャリブレーションを迅速にかつ正確に実行できる顕微鏡を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る顕微鏡は、ステージ上に載置された標本からの光を対物レンズによって集光し、この集光した光をもとに前記標本の像を撮像することによって観察用の画像データを生成する顕微鏡であって、前記対物レンズによって集光する光学系のズーム倍率を変更可能なズーム光学系と、前記ステージおよび前記ズーム光学系の少なくとも一方を駆動して他方に対する相対距離を変化させる駆動手段と、前記画像データを用いて該画像データのコントラスト値を算出するコントラスト演算を行うコントラスト演算部と、前記コントラスト演算部が算出したコントラスト値に基づいて前記駆動手段を動作させることによって前記標本の像を合焦させるオートフォーカスを、前記ズーム倍率が低い倍率の状態および高い倍率の状態の順に実行した後、前記ズーム倍率を小さくしていきながら撮像した前記画像データを順次取得する制御部と、を備え、前記制御部は、前記ズーム倍率が高い倍率の状態で前記オートフォーカスを実行する際に前記コントラスト演算部が前記コントラスト演算を開始する位置を偽合焦しない範囲に設定することを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記ズーム倍率が低い倍率の状態は、前記ズーム倍率が最小の状態であり、前記ズーム倍率が高い倍率の状態は、前記ズーム倍率が最大の状態であることを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記ズーム光学系は、前記ステージの上方に位置し、前記ズーム倍率が最大の状態で偽合焦しない範囲は、前記対物レンズの倍率が所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系の光軸に沿って見たとき少なくとも前記標本の底面より上方に位置する領域であり、前記対物レンズの倍率が所定の倍率より高い場合、前記コントラスト演算部が算出した前記コントラスト値の前記相対距離に応じた変化を示すコントラスト曲線において、偽ピークが立ち上がって所定のコントラスト値を超える位置よりも該コントラスト曲線の真のピーク位置に近い領域であることを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記制御部は、前記ズーム倍率が最大の状態で、前記駆動手段を動作させて前記相対距離を所定のオフセット量だけ大きくした後、前記オートフォーカスを実行することを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記オフセット量は、以下の式（１）、（２）を満たすことを特徴とする：
−Ｚ₀＜−Ｄ／Ｐｒ＋ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（１）
ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（２）
ここで、ＯＳは前記オフセット量、Ｒは前記オートフォーカスのサーチ範囲、Ｄは前記ズーム光学系のズーム倍率に応じた焦点深度、Ｐｒは前記焦点深度を前記オートフォーカス時における前記駆動手段の移動ピッチで除した量である。また、Ｚ_０は、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系に沿って見たときの前記標本の厚さであり、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より高い場合、前記コントラスト曲線において、前記偽ピークが立ち上がって前記所定のコントラスト値に達する位置と該コントラスト曲線の真のピーク位置との距離である。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記制御部は、前記ズーム倍率が最大の状態で、前記駆動手段に対し、前記相対距離を所定のオフセット量だけ大きくする処理と、前記オートフォーカスの際に前記コントラスト演算部による前記コントラスト演算の開始位置まで前記ステージおよび前記ズーム光学系の少なくとも一方を駆動する処理とを一括して行わせることを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記制御部は、前記ズーム倍率が最小の状態における前記オートフォーカスのサーチ方向と前記ズーム倍率が最大の状態における前記オートフォーカスのサーチ方向とを反対に設定することを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、前記制御部は、前記ズーム倍率が最小の場合と最大の場合とで前記オートフォーカスのサーチ範囲の大きさを変更することを特徴とする。

また、本発明に係る顕微鏡は、上記発明において、以下の条件式（３）を満たすことを特徴とする：
｜コントラスト演算開始位置｜＜｜Ｚ₀−Ｄ／２｜・・・（３）
ここで、Ｚ_０は、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系に沿って見たときの前記標本の厚さであり、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より高い場合、前記コントラスト曲線において、前記偽ピークが立ち上がって前記所定のコントラスト値を超える位置と該コントラスト曲線の真のピーク位置との距離である。また、Ｄは前記ズーム光学系のズーム倍率に応じた焦点深度である。

本発明によれば、ズーム倍率が最大の状態でオートフォーカスを行う際に、コントラスト演算部がコントラスト演算を開始する位置を偽合焦しない範囲に設定するため、ズーム倍率キャリブレーションを迅速にかつ正確に実行することができる。

図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡の構成を示す図である。図２は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡が備える記憶部が記憶する対物レンズの倍率とオフセット量との関係を示す図である。図３は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡が備える表示装置のモニタ画面における表示例を示す図である。図４Ａは、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡がズーム倍率最大の状態で行うＡＦ処理の概要（焦点深度の最もNear側でピントが合った場合）を示す図である。図４Ｂは、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡がズーム倍率最大の状態で行うＡＦ処理の概要（焦点深度の中心でピントが合った場合）を示す図である。図５は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を示すフローチャートである。図６Ａは、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡に適用される対物レンズの倍率が所定の倍率よりも低い場合に該顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。図６Ｂは、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡に適用される対物レンズの倍率が所定の倍率よりも高い場合に該顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。図７は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明するフローチャートである。図８Ａは、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡に適用される対物レンズの倍率が所定の倍率よりも高い場合に該顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。図８Ｂは、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡に適用される対物レンズの倍率が所定の倍率よりも高い場合に該顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。図９は、本発明の実施の形態３に係る顕微鏡が行うオートフォーカス処理の概要を示す図である。図１０は、本発明の実施の形態４に係る顕微鏡が行うオートフォーカス処理の概要を示す図である。図１１は、ズーム倍率の誤差を測定する際に使用するキャリブレーションサンプルの構成を示す図である。図１２は、キャリブレーションサンプルの顕微鏡画像の表示例を示す図である。図１３は、倍率誤差の補正に使用する曲線の例を示す図である。図１４Ａは、従来の顕微鏡において、対物レンズの倍率が所定の倍率より低い場合に生じる偽合焦の概要を説明する図である。図１４Ｂは、従来の顕微鏡において、使用している対物レンズの倍率が所定の倍率より高い場合に生じる偽合焦の概要を説明する図である。図１５は、高倍対物レンズ使用時において、ズーム倍率を最大にした場合のコントラスト曲線を示す図である。図１６は、ピント内外で撮像素子への入射光量が激的に変化するズーム高倍で自動露出の自動露出のターゲット値が７０である場合において、ピント位置から大きく外れた位置の直線上の輝度プロファイルを示す図である。図１７は、撮像素子のシャッタスピード、ゲイン等の露出条件が図１６と同様で、図１６に示す状態よりもピント位置に近づいた状態における直線上の輝度プロファイルを示す図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態（以下、「実施の形態」という）を説明する。なお、以下の説明で参照する図面は模式的なものであって、同じ物体を異なる図面で示す場合には、寸法や縮尺等が異なる場合もある。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡の構成を示す図である。同図に示す顕微鏡１は、オートフォーカス（ＡＦ）機能を有しており、顕微鏡架台２、ステージ３、投光管４、撮像装置５、制御装置６、表示装置７を備える。

顕微鏡架台２は、ステージ３を固定して支持するステージ支持部２１と、投光管４を上下動可能に支持する投光管支持部２２と、投光管４が有する駆動モータ４８（後述）を制御することによって投光管４および撮像装置５の上下動を制御する駆動モータ制御部２３とを有する。
駆動モータ制御部２３は、制御装置６から送られてくるモータ駆動量に基づいて、投光管４が有する駆動モータ４８を駆動させることにより、投光管４および撮像装置５を上下動させる。

投光管４は、結像光学系４１と、ズーム光学系４２と、ズームモータ４３と、ズームモータ制御部４４と、光源４５と、光源制御部４６と、ハーフミラー４７と、駆動モータ４８と、を有する。投光管４は、対物レンズ８を保持する。投光管４には、倍率の異なる対物レンズが、付け替え可能である。
ズーム光学系４２は、対物レンズ８によって集光する光学系のズーム倍率を変更可能である。
ズームモータ制御部４４は、制御装置６から送られてくる駆動量に基づいてズームモータ４３を駆動させることにより、ズーム光学系４２を移動させる。
光源４５から出射した光は、ハーフミラー４７で反射して対物レンズ８を経由してステージ３に載置された標本Ｓｐへ照射される。これに対し、標本Ｓｐによって反射された光は、対物レンズ８からハーフミラー４７を経由し、ズーム光学系４２、結像光学系４１を通過して撮像素子５１で集光されて電気信号へ光電変換される。
駆動モータ４８は、ズーム光学系４２を含む投光管４および撮像装置５を駆動する駆動手段の機能を有する。以下、投光管４および撮像装置５をまとめて「ヘッド部」という。

撮像装置５は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ等の撮像素子５１と、撮像素子５１が取得した信号に対してＡ／Ｄ変換等の信号処理を施す信号処理部５２と、撮像装置５の動作を制御する撮像制御部５３とを有する。

制御装置６は、入力部６１と、コントラスト演算部６２と、記憶部６３と、制御部６４とを有する。

コントラスト演算部６２は、撮像装置５から画像データを受信し、該画像データのコントラスト値を算出するコントラスト演算を行う。

記憶部６３は、ＡＦ実行時にズーム倍率が最低の状態のピント合わせ位置からヘッド部がオフセットする量を対物レンズ８の倍率と関連付けて記憶する。図２は、記憶部６３が記憶する対物レンズの倍率とヘッド部のオフセット量との関係を示す図である。同図に示すテーブルＴｂは、対物レンズの倍率に応じてオートフォーカス時にヘッド部をオフセットさせる量を与える。図２からも明らかなように、オフセット量は、対物レンズ８の倍率が低いほど大きい。記憶部６３は、顕微鏡１の動作を制御するプログラム（アプリケーションソフトウェア）を記憶する。

制御部６４は、ＣＰＵ等を用いて構成され、顕微鏡１全体の動作を統括的に制御する。制御部６４は、コントラスト演算部６２による演算結果の最大値および該最大値をとるときのＺ座標等を記憶部６３に書き込んで記憶させる。制御部６４は、光源制御部４６に対して光源４５の明るさを調整するための指示信号を送信する。

制御部６４は、コントラスト演算部６２が算出したコントラスト値に基づいて駆動モータ４８を動作させることによって標本Ｓｐの像を合焦させるオートフォーカスを、ズーム光学系４２のズーム倍率が最小および最大の状態（低い倍率および高い倍率）でこの順に実行した後、そのズーム倍率を小さくしていきながら撮像装置５が撮像した画像データを順次取得してズームキャリブレーション処理を行う。

表示装置７は、顕微鏡画像等を表示するモニタ画面と、顕微鏡操作用ＧＵＩタッチパネルとを有する。タッチパネルは、モニタ画面上に積層され、外部からの接触位置に応じた入力信号を受け付ける。

図３は、表示装置７のモニタ画面における表示例を示す図である。同図に示す表示画像７０は、顕微鏡画像を表示する顕微鏡画像表示部７１と、ヘッド部を動作させてフォーカス操作を行わせる際の操作信号を入力可能なフォーカス操作入力部７２と、オートフォーカスの実行を指示するＡＦ信号を入力可能なＡＦ操作入力部７３と、光源４５の明るさやオン・オフを操作する信号を入力可能な光源操作入力部７４と、キャリブレーションの実行を指示するキャリブレーション信号を入力可能なキャリブレーション操作入力部７５と、ズーム倍率を変更する指示信号を入力可能なズーム操作入力部７６とを有する。各操作入力部７２〜７６にそれぞれ表示されているアイコンの部分に外部からの接触があると、タッチパネルがその接触を検知して、接触位置に応じた信号の入力を受け付ける。

以上の構成を有する顕微鏡１において、制御部６４は、ズーム倍率が最大の状態でオートフォーカスを実行する際、コントラスト演算部６２がコントラスト演算を開始する位置を偽合焦しない範囲に設定する。以下、図４Ａおよび図４Ｂを参照して、偽合焦を回避する機構を説明する。

図４Ａおよび図４Ｂは、ズーム倍率最小の状態でＡＦ処理が終了後、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２にピントを合わせる処理のうち、ズーム倍率最大の状態におけるＡＦ処理を行う状況を示す図である。図４Ａおよび図４Ｂにおいて、範囲ＳＲ₁は、ズーム倍率が最小である場合のＡＦのサーチ範囲（大きさＲ₁）を示している。また、図４Ａおよび図４Ｂにおいて、範囲ＤＯＦ₁は、焦点深度（大きさＤ）を示している。図４Ａは、焦点深度ＤＯＦ₁の最もNear側でピントが合った場合を示す一方、図４Ｂは、焦点深度ＤＯＦ₁の中心でピントが合った場合を示している。

図４Ａおよび図４Ｂにおいて、駆動モータ制御部２３は、ズーム倍率が最小である場合のピント合わせ完了位置Ｐ₁からFar側へオフセット量ＯＳだけ移動させる（処理（Ｉ））。ここでのオフセット量ＯＳの情報は、制御部６４が記憶部６３のテーブルＴｂを参照することによって得られる。

この処理（Ｉ）の後、顕微鏡１は、ズーム倍率を最大にしてＡＦを実行する。その際、制御部６４は、オフセット後の位置Ｐ₂を中心とする新たなサーチ範囲ＳＲ’₁（大きさＲ₁）の半分の距離Ｒ₁／２だけヘッド部をNear側へ移動させる（処理（ＩＩ））。その後、処理（ＩＩ）における移動後の位置Ｐ₃からコントラスト演算を開始し、ヘッド部をFar側へ移動させながらピント位置をサーチする。

顕微鏡１が偽合焦を回避するためには、（１）ズーム倍率が最小でＡＦ完了時に焦点深度ＤＯＦ₁の最下端でピントが合った場合（図４Ａ）、（２）ズーム倍率が最小でＡＦ完了時に焦点深度ＤＯＦ₁の中心でピントが合った場合（図４Ｂ）に分けて考える必要がある。

（１）ズーム倍率が最小でＡＦ完了時に焦点深度ＤＯＦ₁の最下端でピントが合った場合
所定の倍率より低い倍率の対物レンズ８（以下、低倍の対物レンズ８という）を使用する場合、ズーム倍率が最大でのサーチ範囲ＳＲ’₁に、キャリブレーションサンプル１０１の裏面１０３の位置が含まれないことが必要である（図１４Ａを参照）。一方、所定の倍率よりも高い倍率の対物レンズ８（以下、高倍の対物レンズ８という）を使用する場合、ズーム倍率が最大の状態でのサーチ範囲ＳＲ’₂が、図１４Ｂに示すコントラスト曲線Ｃ₄がピークよりもNear側で立ち上がり始める位置に対してFar側に位置していることが必要である。

以上をまとめると、偽合焦回避条件は、以下の式（１）で表される。
−Ｚ₀＜−Ｄ／２＋ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（１）
ここで、Ｚ₀は、低倍の対物レンズ８を使用している場合、キャリブレーションサンプル１０１の厚さＴであり、高倍の対物レンズ８を使用している場合、図１４Ｂに示すコントラスト曲線Ｃ₄がピークよりもNear側で立ち上がって所定のコントラスト値に達する位置と真のピーク位置との距離Ｕである。また、Ｄはズーム光学系４２のズーム倍率に応じた焦点深度、Ｒは、ＡＦサーチ範囲である（低倍の対物レンズ８ではＲ＝Ｒ₁、高倍の対物レンズではＲ＝Ｒ₂）。なお、低倍の対物レンズ８としては、例えば２０倍以下の対物レンズが想定される。また、高倍の対物レンズ８としては、例えば２０倍以上の対物レンズが想定される。

（２）ズーム倍率が最小でＡＦ完了時に焦点深度ＤＯＦ₁の中心でピントが合った場合
この場合、偽合焦を回避するためには、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２がズーム倍率が最大の状態でのサーチ範囲ＳＲ’₁（またはＳＲ’₂）に含まれていればよく、その条件式は次式（２）で与えられる。
ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（２）

ズーム倍率が最大の状態におけるＡＦ処理は、ヘッド部をサーチ範囲Ｒ₁の１／２だけNear方向にオフセット移動した位置Ｐ₃から開始することで、図４Ａ、図４Ｂに示す通り、新たなサーチ範囲ＳＲ’₁にキャリブレーションサンプル１０１の裏面１０３が含まれないようにすることができる。

図５は、顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を示すフローチャートである。図６Ａは、対物レンズ８の倍率が所定の倍率よりも低い場合（焦点深度が大きく、ＡＦサーチ範囲が大きい場合）に顕微鏡１が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。また、図６Ｂは、対物レンズ８の倍率が所定の倍率よりも高い場合（撮像素子への入射光量が小さい場合）に顕微鏡１が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。

制御部６４は、ズームモータ制御部４４に信号を送り、ズーム光学系４２が位置合わせ用のズーム倍率（最小）になるようにズームモータ４３を移動させる（ステップＳ１）。その後、顕微鏡１は、ＡＦ処理を実行する（ステップＳ２）。

ズーム倍率が最小の状態でピントが合った後、制御部６４は、ズームモータ制御部４４を介してズームモータ４３を駆動し、ズーム光学系４２のズーム倍率を、キャリブレーション開始倍率であるズーム倍率（最大）にする（ステップＳ３）。

続いて、制御部６４は、記憶部６３のテーブルＴｂから使用中の対物レンズ８に対応するオフセット量ＯＳを取得する（ステップＳ４）。

続いて、制御部６４は、駆動モータ制御部２３を介して駆動モータ４８を駆動し、オフセット量ＯＳだけFar方向にヘッド部を駆動する（ステップＳ５）。

この後、制御部６４は、駆動モータ制御部２３を介して駆動モータ４８を駆動し、ヘッド部をサーチ範囲の半分だけNear側へ移動させてからコントラスト演算を開始することによってＡＦ処理を実行する（ステップＳ６）。この際、コントラスト演算開始位置とズーム倍率が最小の状態のピント合わせ完了位置とは、上述した条件式（１）、（２）を満たしている。このため、低倍の対物レンズ８を使用している場合、ズーム倍率が最大の状態におけるコントラスト曲線Ｃ₂の二つのピーク（ピーク位置Ｐ₁₁、Ａ）のうち、キャリブレーションサンプル１０１の裏面１０３に対応するピーク位置Ａでピントが合うことがない。また、高倍の対物レンズ８を使用している場合、ズーム倍率が最大の状態におけるコントラスト曲線Ｃ₂のピークよりもNear側で立ち上がる領域（位置Ｐ₁₃よりもNear側の部分）でピントが合うこともない。

続いて、制御部６４は、ズームキャリブレーション処理を実行する（ステップＳ７）。ここでのズームキャリブレーション処理は、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２のＬ／Ｓパターンを用いた公知の手法によって行われる。

したがって、ＡＦ処理によってキャリブレーションサンプル１０１の表面１０２に確実にピントを合わせることができ、Ｌ／Ｓパターンに基づいたズームキャリブレーションを迅速にかつ正確に実行することができる。

以上説明した本発明の実施の形態１によれば、ズーム倍率が最大の状態で、駆動手段を動作させてステージに対する投光管の距離（相対距離）を所定のオフセット量だけ大きくした後、オートフォーカスを実行するため、偽合焦を生じることなく、ズーム倍率キャリブレーションを迅速にかつ正確に実行できる。

（実施の形態２）
図７は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明するフローチャートである。本実施の形態２に係る顕微鏡の構成は、実施の形態１で説明した顕微鏡１の構成と同様である。図８Ａは、対物レンズ８の倍率が所定の倍率よりも低い場合に顕微鏡１が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。また、図８Ｂは、対物レンズ８の倍率が所定の倍率よりも高い場合に顕微鏡１が行うズームキャリブレーション処理の概要を説明する図である。

以下、図７、図８Ａおよび図８Ｂを参照して、本実施の形態２に係るズームキャリブレーション処理を説明する。図７において、ステップＳ１１〜Ｓ１４の処理は、図５で説明したステップＳ１〜Ｓ４の処理に順次対応している。

ステップＳ１５において、制御部６４は、駆動モータ制御部２３を介して駆動モータ４８をNear側へ駆動する（ステップＳ１５）。このときの駆動量は、低倍の対物レンズ８を使用している場合、ＯＳ−Ｒ₁／２であり、高倍の対物レンズ８を使用している場合、ＯＳ−Ｒ₂／２である。

続いて、制御部６４は、駆動モータ制御部２３を介して駆動モータ４８を駆動し、ヘッド部をFar側へ移動させながらコントラスト演算を行うことによってＡＦ処理を実行する（ステップＳ１６）。本実施の形態２においては、ＡＦ処理において、ズーム光学系４２のNear側への移動を省略することにより、高速のＡＦ処理を実現している。

最後に、制御部６４は、ズームキャリブレーション処理を実行する（ステップＳ１７）。このズームキャリブレーション処理は、実施の形態１と同様に、キャリブレーションサンプル１０１の表面１０２のＬ／Ｓパターンを用いた公知の手法によって行われる。

以上説明した本発明の実施の形態２によれば、距離を所定のオフセット量だけ大きくする処理と、オートフォーカスの際にコントラスト演算部によるコントラスト演算の開始位置までヘッド部を駆動する処理とを駆動手段が一括して行うため、ズーム倍率キャリブレーションを迅速にかつ正確に実行することができる。

（実施の形態３）
図９は、本発明の実施の形態３に係る顕微鏡が行うオートフォーカス処理の概要を示す図である。図９に示す場合、実施の形態１と異なるのは、ズーム倍率が最大の状態におけるＡＦ処理において、ズーム倍率が最小の状態におけるピント位置Ｐ₃₁からオフセット距離ＯＳだけオフセットした後（位置Ｐ₃₂）、ヘッド部をNear側へ向けて移動させる際にコントラスト演算も合わせて行う。すなわち、本実施の形態３では、ズーム倍率が最小の状態におけるＡＦサーチ方向と、ズーム倍率が最大の状態におけるＡＦサーチ方向とが異なる。

以上説明した本発明の実施の形態３によれば、ＡＦ処理において、ヘッド部のNear側への移動を省略することにより、高速のＡＦ処理を実現することができる。

（実施の形態４）
図１０は、本発明の実施の形態４に係る顕微鏡が行うオートフォーカス処理の概要を示す図である。本実施の形態４では、ズーム倍率が最大の状態におけるサーチ範囲ＳＲ₃の大きさＲ₃を、ズーム倍率が最小の状態におけるサーチ範囲ＳＲ₁の大きさＲ₁と異なる値にしている。本実施の形態４では、ズーム倍率が最小の状態でピント合わせを行った後、Roughサーチの際に焦点深度Ｒ₃の１／２のピッチ（Ｒ₃／２）で動く。

この場合には、以下の式（３）が成り立つようにサーチ範囲が設定されていればよい。
｜コントラスト演算開始位置｜＜｜Ｚ₀−Ｄ／２｜・・・（３）
ここで、式（３）の右辺のＺ₀、Ｄは、式（１）のＺ₀、Ｄと同じである。また、｜｜は絶対値を示す。

以上説明した本発明の実施の形態４によれば、上記条件式（３）を満たすようにすることで、上述した実施の形態におけるオフセット動作を行わないで同様の効果を得ることができる。

ここまで、本発明を実施するための形態を説明してきたが、本発明は、上述した実施の形態によってのみ限定されるべきものではない。例えば、サーチを行う際のズーム結像光学系の移動ピッチは焦点深度の１／２であることを想定しているが、より一般に焦点深度の１／Ｎ（０＜Ｎ＜２．５）としてもよい。また、ズーム結像光学系を連続的に移動できるようにしてもよい。

また、本発明において、ステージを動かすことができる構成としてもよいし、ステージとヘッド部（投光管および撮像装置）を個別に動かすことができる構成としてもよい。

このように、本発明は、ここでは記載していない様々な実施の形態等を含みうるものである。

１顕微鏡
２顕微鏡架台
３ステージ
４投光管
５撮像装置
６制御装置
７表示装置
８対物レンズ
２１ステージ支持部
２２投光管支持部
２３駆動モータ制御部
４１結像光学系
４２ズーム光学系
４３ズームモータ
４４ズームモータ制御部
４５光源
４６光源制御部
４７ハーフミラー
４８駆動モータ
５１撮像素子
５２信号処理部
５３撮像制御部
６１入力部
６２コントラスト演算部
６３記憶部
６４制御部
７０表示画像
７１顕微鏡画像表示部
７２フォーカス操作入力部
７３ＡＦ操作入力部
７４光源操作入力部
７５キャリブレーション操作入力部
７６ズーム操作入力部
１０１キャリブレーションサンプル
１０２表面
１０３裏面
Ｃ₁、Ｃ₂、Ｃ₃、Ｃ_４コントラスト曲線
Ｓｐ標本
Ｔｂテーブル

Claims

ステージ上に載置された標本からの光を対物レンズによって集光し、この集光した光をもとに前記標本の像を撮像することによって観察用の画像データを生成する顕微鏡であって、
前記対物レンズによって集光する光学系のズーム倍率を変更可能なズーム光学系と、
前記ステージおよび前記ズーム光学系の少なくとも一方を駆動して他方に対する相対距離を変化させる駆動手段と、
前記画像データを用いて該画像データのコントラスト値を算出するコントラスト演算を行うコントラスト演算部と、
前記コントラスト演算部が算出したコントラスト値に基づいて前記駆動手段を動作させることによって前記標本の像を合焦させるオートフォーカスを、前記ズーム倍率が低い倍率の状態および高い倍率の状態の順に実行した後、前記ズーム倍率を小さくしていきながら撮像した前記画像データを順次取得する制御部と、
を備え、
前記制御部は、
前記ズーム倍率が高い倍率の状態で前記オートフォーカスを実行する際に前記コントラスト演算部が前記コントラスト演算を開始する位置を偽合焦しない範囲に設定することを特徴とする顕微鏡。
前記ズーム倍率が低い倍率の状態は、前記ズーム倍率が最小の状態であり、
前記ズーム倍率が高い倍率の状態は、前記ズーム倍率が最大の状態であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記ズーム光学系は、前記ステージの上方に位置し、
前記ズーム倍率が最大の状態で偽合焦しない範囲は、
前記対物レンズの倍率が所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系の光軸に沿って見たとき少なくとも前記標本の底面より上方に位置する領域であり、
前記対物レンズの倍率が所定の倍率より高い場合、前記コントラスト演算部が算出した前記コントラスト値の前記相対距離に応じた変化を示すコントラスト曲線において、偽ピークが立ち上がって所定のコントラスト値を超える位置よりも該コントラスト曲線の真のピーク位置に近い領域であることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最大の状態で、前記駆動手段を動作させて前記相対距離を所定のオフセット量だけ大きくした後、前記オートフォーカスを実行することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最大の状態で、前記駆動手段を動作させて前記相対距離を所定のオフセット量だけ大きくした後、前記オートフォーカスを実行することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
前記オフセット量は、以下の式（１）、（２）を満たすことを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡：
−Ｚ₀＜−Ｄ／Ｐｒ＋ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（１）
ＯＳ−Ｒ／２＜０・・・（２）
ここで、ＯＳは前記オフセット量、Ｒは前記オートフォーカスのサーチ範囲、Ｄは前記ズーム光学系のズーム倍率に応じた焦点深度、Ｐｒは前記焦点深度を前記オートフォーカス時における前記駆動手段の移動ピッチで除した量である。また、Ｚ_０は、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系に沿って見たときの前記標本の厚さであり、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より高い場合、前記コントラスト曲線において、前記偽ピークが立ち上がって前記所定のコントラスト値に達する位置と該コントラスト曲線の真のピーク位置との距離である。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最大の状態で、前記駆動手段に対し、前記相対距離を所定のオフセット量だけ大きくする処理と、前記オートフォーカスの際に前記コントラスト演算部による前記コントラスト演算の開始位置まで前記ステージおよび前記ズーム光学系の少なくとも一方を駆動する処理とを一括して行わせることを特徴とする請求項５または６に記載の顕微鏡。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最小の状態における前記オートフォーカスのサーチ方向と前記ズーム倍率が最大の状態における前記オートフォーカスのサーチ方向とを反対に設定することを特徴とする請求項２〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最小の場合と最大の場合とで前記オートフォーカスのサーチ範囲の大きさを変更することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
前記制御部は、
前記ズーム倍率が最小の場合と最大の場合とで前記オートフォーカスのサーチ範囲の大きさを変更することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
以下の条件式（３）を満たすことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡：
｜コントラスト演算開始位置｜＜｜Ｚ₀−Ｄ／２｜・・・（３）
ここで、Ｚ_０は、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より低い場合、前記ズーム光学系に沿って見たときの前記標本の厚さであり、前記対物レンズの倍率が前記所定の倍率より高い場合、前記コントラスト曲線において、前記偽ピークが立ち上がって前記所定のコントラスト値を超える位置と該コントラスト曲線の真のピーク位置との距離である。また、Ｄは前記ズーム光学系のズーム倍率に応じた焦点深度である。