JP2013142769A - 顕微鏡システム、オートフォーカスプログラムおよびオートフォーカス方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ステージなどの焦準部を動かしながらＡＦを行っても合焦位置を正確に定めることが可能な、オートフォーカス機能を備えた顕微鏡システム、オートフォーカスプログラムおよびオートフォーカス方法を提供すること。
【解決手段】被写体を載置するステージと顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、結像光学系を介して被写体を所定の時間間隔で撮像し、撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、撮像した複数の観察画像のうち算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像を検出し、観察画像が撮像されると、ステージと結像光学系の相対位置を検出し、検出した最大コントラスト画像に対応する検出した相対位置を、相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行い、補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスする。
【選択図】図４

Description

本発明は、オートフォーカス（ＡＦ：Auto Focus）機能を備えた顕微鏡システムに関し、特に、電気制御によってステージ等の焦準部が上下左右に移動するような電動部を備え、撮像素子によって撮像した画像のコントラスト演算を行った結果から、焦点位置を定めるオートフォーカス機能を備えた顕微鏡システム、オートフォーカスプログラムおよびオートフォーカス方法に関する。

従来、撮像レンズ等の撮像光学系によって結像される被写体像を、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）等からなる固体撮像素子を利用して撮像し、その撮像した被写体像をデジタルデータ等の画像データとして画像の明るさの数値とともに記録媒体に記録するデジタルスチルカメラや電子カメラ等の撮像装置が広く普及している。このような撮像装置は、一般的に景色や人物等を被写体として撮像する用途以外に、生体組織や細胞等の微視的状態を撮像するために、顕微鏡に接続して使用するものも多く存在する。

また、近年の顕微鏡は、デジタルカメラを利用したオートフォーカス（ＡＦ：Auto Focus）機構を搭載し、デジタルカメラで撮像した画像を表示部で観察するという観察手法が増えてきている。

ＣＣＤ等の撮像素子を有するデジタルカメラを利用したＡＦでは、隣接画素を比較してコントラスト演算を行い、そのコントラスト演算値が最大となる位置を合焦位置とする方法が実用化されており、コントラストＡＦとして知られている。

顕微鏡観察におけるコントラストＡＦでは、電気制御によって上下方向に移動するステージなどの焦準部の位置（以下、Ｚ位置という）を変えて撮像を行い、その後、ＣＰＵ（Central Processing Unit：中央処理装置）などの制御部からＺ位置情報を取得して、そのＺ位置情報を画像の位置情報として登録し、コントラスト演算の結果からコントラスト値が最大となる合焦位置を探す方法が広く実用化されている。

例えば、光学顕微鏡および写真撮影装置の結像光学系を介して形成される被写体の画像が、ＣＣＤカメラ等の撮像素子を介して取り込み可能となっており、光学顕微鏡のステージを移動させながら、一定のタイミングで映像信号を取り込み、その高周波成分の検出を行い、映像信号のコントラストを算出する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

上記特許文献１で開示されたコントラストＡＦでは、１回のスキャンで合焦位置を精度よく探索するためにステージをゆっくりと広範囲にわたって動かさなければならなかった。よって、ＡＦ時間が長くかかっていた。そこで、上記特許文献１ではＡＦ速度を高速化するために、ステージ速度が速い粗フォーカス動作（以下、Roughスキャンという）と、ステージ速度が遅い密フォーカス動作（以下、Fineスキャンという）という２回スキャンによるＡＦ処理を行い、Roughスキャンで大まかな合焦位置を見つけた後に、Fineスキャンで詳細な合焦位置を見つける工夫を行っている。

上記特許文献１の２回スキャンのＡＦシーケンスについて、以下で説明する。なお、ＡＦシーケンス中のステージ移動方向は、ステージが対物レンズに近づく方向をNear方向、対物レンズから遠ざかる方向をFar方向とする。

図１３は、従来のステージ静止を伴うＡＦシーケンスを説明するための図である。
（１）ＡＦを開始すると、ＡＦを開始したＺ位置から一定距離Ｗstart(m)だけステージをNear側へ移動させる。

（２）Ｗstart(m)だけ移動が終了したら、Roughスキャンを開始し、一定の走査範囲Ｗrough(m)だけステージをFar側へ動かす。この間、ステージは一定のサンプリングピッチで送りながら静止した状態で画像を取得する。そして、取得した画像についてコントラスト演算を行い、ステージのＺ座標を読み出し、そのＺ座標を画像の取得位置として登録する（図１３中の三角印で示した点）。

（３）Ｗrough(m)だけ移動が終了したらRoughスキャンを終了し、ステージをNear側へ一定距離Ｗback(m)だけ動かし、Fineスキャンスタート位置にステージを移動させる。
（４）Ｗback(m)だけ移動が終了したらFineスキャンを開始し、一定の走査範囲Ｗfine(m)だけステージをFar側へ動かす。この間、ステージは一定のサンプリングピッチで送りながら画像を取得してコントラスト演算を行う。そして、画像を取得した後にステージのＺ座標を読み出し、そのＺ座標を画像の取得位置として登録する（図１３中の丸印で示した点）。なお、Fineスキャンのサンプリングピッチは、Roughスキャンのサンプリングピッチよりも小さい。

（５）Ｗfine(m)だけ移動が終了したら、上記（２）と（４）の処理で見つけたコントラスト値が最大となるＺ座標（コントラストピーク座標）へステージを移動させる。
（６）コントラストピーク座標への移動が終了したらＡＦ処理を終了する。

以上のように従来のコントラストＡＦ（以下、ＡＦという）では、画像を取得するときにいったんステージを止めて撮像を行い、続いてＺ位置情報を取得している。
そこで、高速にＡＦ処理を実行するため、画像を取得する際、ステージを止めずに撮像することが考えられる。この手法を上記ＡＦシーケンスに適用すると以下のようになる。

図１４は、従来のステージ静止を伴わないＡＦシーケンスを説明するための図である。
（１）図１３と同様、ＡＦを開始すると、ＡＦを開始したＺ位置から一定距離Ｗstart(m)だけステージをNear側へ移動させる。

（２）Ｗstart(m)だけ移動が終了したら、Roughスキャンを開始し、一定の走査範囲Ｗrough(m)だけステージをFar側へ動かしながら撮像を行い、取得した画像に対してコントラスト演算を行う。このとき、画像を取得した後にステージのＺ座標を読み出し、そのＺ座標を画像の取得位置として登録する（図１４中の三角印で示した点）。

ここで、画像を取得してからステージ座標を取得するまで時間差があるので、その時間差にステージ速度をかけた分だけ画像のＺ位置情報は、画像を取得した本当の位置よりもずれることになる。なお、図１４中の破線は、画像を取得した本当の位置を表している。

（３）Ｗrough(m)だけ移動が終了したらRoughスキャンを終了し、ステージをNear側へ一定距離Ｗback(m)だけ動かし、Fineスキャンスタート位置にステージを移動させる。
このとき、図１３ではRoughスキャンで見つけたコントラストピーク位置を越えたところからFineスキャンを開始できるが、画像を取得した本当の位置とのずれが大きい場合には、Fineスキャンの開始点が本当のコントラストピークよりも手前になってしまう。

（４）Ｗback(m)だけ移動が終了したらFineスキャンを開始し、一定の走査範囲Ｗfine(m)だけステージをFar側へ動かしながら撮像を行い、取得した画像に対してコントラスト演算を行う。このとき、画像を取得した後にステージのＺ座標を読み出し、そのＺ座標を画像の取得位置として登録する（図１４中の丸印で示した点）。

（５）Ｗfine(m)だけ移動が終了したら、上記（４）の処理で見つけたコントラスト値が最大となるＺ座標（コントラストピーク座標）へステージを移動させる。
図１４の場合では、本当の合焦位置よりもコントラスト値が低い場所がコントラストピーク座標となっているため、最終的なＡＦ終了位置は偽合焦位置となってしまう。

（６）偽合焦位置への移動が終了し、ＡＦ処理が終了する。

特開平１０−１９７７８４公報

しかしながら、上述のステージを止めて撮像する方法では、ＡＦが終了するまで長時間かかってしまう、という問題点があった。
また、ＡＦ速度を高速化するためにステージを動かしながらコントラストＡＦを行う方法では、合焦位置を正確に定めることができない、という問題点があった。

本発明は、上述のような実状に鑑みたものであり、ステージなどの焦準部を動かしながらＡＦを行っても合焦位置を正確に定めることが可能な、オートフォーカス機能を備えた顕微鏡システム、オートフォーカスプログラムおよびオートフォーカス方法を提供することを目的とする。

本発明は、前記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明の顕微鏡システムは、顕微鏡における観察画像のフォーカスを行う顕微鏡システムであって、被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像する撮像手段と、前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像の検出を行う最大コントラスト画像検出手段と、前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出する相対位置検出手段と、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行う位置補正手段と、前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスするオートフォーカス手段とを備えることを特徴とする。

また、本発明の顕微鏡システムは、前記ステージと前記結像光学系の相対速度を算出する相対速度算出手段をさらに備え、前記位置補正手段が、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記観察画像を撮像した撮像時刻と前記取得した相対位置の取得時刻との差分に前記相対速度を乗算した値だけ移動させることが望ましい。

また、本発明の顕微鏡システムは、前記撮像手段が、第１の時間間隔で撮像するラフスキャン手段と、前記第１の時間間隔より短い第２の時間間隔で撮像するファインスキャン手段とを備え、前記最大コントラスト画像検出手段が、前記ラフスキャン手段により撮像した観察画像を用いて第１の最大コントラスト画像を検出し、前記検出した第１の最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を含む所定範囲内について前記ファインスキャン手段により撮像した観察画像を用いて第２の最大コントラスト画像を検出することが望ましい。

また、本発明の一態様によれば、本発明のオートフォーカスプログラムは、顕微鏡における観察画像のフォーカスを行うオートフォーカスプログラムであって、コンピュータに、被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像する撮像機能と、前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出機能と、前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像の検出を行う最大コントラスト画像検出機能と、前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出する相対位置検出機能と、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行う位置補正機能と、前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスするオートフォーカス機能とを実行させることを特徴とする。

また、本発明のオートフォーカスプログラムは、前記コンピュータに、前記ステージと前記結像光学系の相対速度を算出する相対速度算出機能をさらに実行させ、前記位置補正機能が、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記観察画像を撮像した撮像時刻と前記取得した相対位置の取得時刻との差分に前記相対速度を乗算した値だけ移動させることが望ましい。

また、本発明のオートフォーカスプログラムは、前記撮像機能が、第１の時間間隔で撮像するラフスキャン機能と、前記第１の時間間隔より短い第２の時間間隔で撮像するファインスキャン機能とを備え、前記最大コントラスト画像検出機能が、前記ラフスキャン機能により撮像した観察画像を用いて第１の最大コントラスト画像を検出し、前記検出した第１の最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を含む所定範囲内について前記ファインスキャン機能により撮像した観察画像を用いて第２の最大コントラスト画像を検出することが望ましい。

また、本発明の一態様によれば、本発明のオートフォーカス方法は、顕微鏡における観察画像のフォーカスを行うオートフォーカス方法であって、被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像し、前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像を検出し、前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出し、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行い、前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスすることを特徴とする。

本発明は、画像を取得したＺ座標を正確に定めることができ、合焦位置を正確に定めることができる、という効果を奏する。

合焦位置のずれを説明するための図である。 本発明の第１または第２の実施の形態によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。 本発明の第１の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャート（その１）である。 本発明の第１の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャート（その２）である。 本発明の第１の実施の形態によるＡＦシーケンスを説明するための図である。 本発明の第２の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャート（その１）である。 本発明の第２の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャート（その２）である。 本発明の第２の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャート（その３）である。 本発明の第２の実施の形態によるＡＦシーケンスを説明するための図である。 本発明のその他の変形例１によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。 本発明のその他の変形例２によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。 本発明のその他の変形例５によるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。 従来のステージ静止を伴うＡＦシーケンスを説明するための図である。 従来のステージ静止を伴わないＡＦシーケンスを説明するための図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
上述したように、ＡＦを高速化するには、ステージを止めずにＡＦを行えばよいが、その場合には、撮像終了信号を受信した後にＺ位置情報を取得することになる。その結果、画像に登録されたＺ位置情報は、画像を取得した時からＺ位置情報を取得するまでの間にステージが移動した分だけずれた情報となる。このずれ量は、ステージの移動速度が速いほど大きくなり、合焦位置が正確に定まらないという問題が生じる。これは、画像を取得してからステージのＺ座標を取得するまでの時間差にステージ移動速度をかけた分だけ、画像を取得した本当のＺ座標との間にずれが生じるためである。

図１は、合焦位置のずれを説明するための図である。
図１において、（１）時刻ｔ１で画像を取得し、（２）時刻ｔ２でステージ位置を取得する。そして、上記（２）の時刻ｔ２で取得したステージ位置を上記（１）の時刻ｔ１で取得した画像のＺ位置として登録する。そのため、画像を取得したときのＺ位置と、ＣＰＵがＺ位置を取得したときのステージのＺ位置とが、時刻ｔ２と時刻ｔ１の時間差分ずれることになる。これは、合焦位置においてもずれることになるので、合焦位置とのずれ量は下記の式１で表される。

合焦位置とのずれ量 ΔＺ(m)＝（ｔ２−ｔ１）(s)×ｖ(m/s) ・・・・・式１
ここで、ｖは、ステージの移動速度である。
上記式１より、合焦位置とのずれ量はステージ移動速度に比例して大きくなることが分かる。

合焦位置とのずれ量は、簡単のために上記式１で定義したが、正確には上記式１にサンプリング誤差ΔＺsmpl(m)が加わった下記の式２となる。
合焦位置とのずれ量 ΔＺ(m)＝（ｔ２−ｔ１）(s)×ｖ(m/s)＋ΔＺSmpl(m) ・・・・・式２

ここで、サンプリング誤差ΔＺsmpl(m)とは、画像をサンプリングする間隔の中に本当の合焦位置がある場合の、サンプリングした画像から見つけたコントラストピーク位置と本当の合焦位置とのずれ量のことである。

（第１の実施の形態）
図２は、本発明の第１または第２の実施の形態によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。

図２において、本発明が適用される顕微鏡システムは、顕微鏡本体、カメラ２４、撮影した観察画像および顕微鏡操作用ＧＵＩを表示するための表示部１９、表示部１９に表示された顕微鏡操作用ＧＵＩを操作するためのキーボードやマウス等のキー入力部２０およびＰＣ２１を備える。

顕微鏡本体は、顕微鏡架台１、観察に用いる被写体としての標本２３を載せるためのステージ２、モータ３、ステージ支持部４、モータ制御部５、対物レンズ６、ハーフミラー７、結像光学系部８、光源１２、光源制御部１３、ハーフミラー７から光源制御部１３までを内部に持つ投光管１４を備える。

カメラ２４は、撮像素子９、自動露出感度調整機能を備えた撮像素子制御部１０およびＡ／Ｄ変換部１１を備える。
また、ＰＣ２１は、コントラスト演算処理部１５、主制御部１６、記憶装置１７、本発明を実現するオートフォーカスプログラムを記憶するプログラム記憶媒体１８を備える。

このような構成において、主制御部１６は、モータ制御部５にモータ駆動量の指示値を送り、モータ制御部５はモータ３を駆動させる。モータ３が駆動することにより、ステージ２はステージ支持部４に沿って移動する。光源１２から出た光は、ハーフミラー７から対物レンズ６を経由し、ステージ２に載せられた標本２３へと照射される。ステージ２に載せられた標本２３から反射された光は、対物レンズ６からハーフミラー７を経由し、結像光学系部８を通って撮像素子９に至り、撮像素子９にて結像する。モータ制御部５は、プログラム記憶媒体１８より主制御部１６にロードされたプログラムソフトによって制御される。コントラスト演算処理部１５は、撮像素子９、Ａ／Ｄ変換部１１を通じてデジタル変換された画像信号を受け取り、コントラスト演算処理をした演算結果を主制御部１６に入力する。主制御部１６は、入力されたコントラスト演算結果の最大値、およびコントラスト演算が最大となるときのＺ座標等を記憶装置１７に入力する。

キー入力部２０によって表示部１９に映し出された顕微鏡操作用ＧＵＩ上から光源１２の明るさを指示でき、主制御部１６は光源制御部１３に指示値を送り、光源１２の明るさを調節することができる。

撮像素子制御部１０は、自動露出感度調整機能（以下、ＡＥという）を備えており、Ａ／Ｄ変換部１１から送られてきた画像の輝度データから撮像する画像の輝度値を最適にするように撮像素子９のフレームレートを制御し、カメラ２４の露出感度を自動的に調整する。ただし、ＡＦ中はＡＥをロックし、露出感度が一定となるようにする。

上述のような構成の顕微鏡システムが、顕微鏡で観察する観察画像のオートフォーカスを行う。
カメラ２４は、被写体としての標本２３を載置するステージ２と前記顕微鏡の結像光学系部８を相対的に移動させながら、前記結像光学系部８を介して前記標本２３を所定の時間間隔で撮像する。

コントラスト演算処理部１５は、前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出する。
主制御部１６は、前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像の検出を行う。また、主制御部１６は、前記観察画像が撮像されると、前記ステージ２と前記結像光学系部８の相対位置を検出する。さらに、主制御部１６は、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行い、前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスする。

次に、本発明を適用したＡＦ処理の流れを説明する。
図３および図４は、本発明の第１の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャートであり、図５は、本発明の第１の実施の形態によるＡＦシーケンスを説明するための図である。

まず、図３のステップＳ１０１において、表示部１９に表示された顕微鏡操作用ＧＵＩ上からＡＦ開始ボタンを押す（図５：（１））。ステップＳ１０１でＡＦ開始ボタンが押されると、ステップＳ１０２において、主制御部１６は撮像素子制御部１０にＡＦ開始信号を送信し、撮像素子制御部１０は露出感度が一定となるように撮像素子９を制御する。

ステップＳ１０２の後、ステップＳ１０３において、ＡＦスキャン開始位置に一定の値Ｗstart(m)だけステージ２を移動させる（図５：（１）−＞（２））。このとき、ステージ２が移動する向きは、ステージ２が対物レンズ６へと近づく方向（Near方向）とする。

そして、ステップＳ１０３でＷstart(m)だけステージ２の移動が終了したら、ステップＳ１０４において、主制御部１６はモータ制御部５に現在のステージ２のＺ座標を確認するコマンドを送信して、ステージ２のＺ座標を取得し、ＡＦスキャン開始位置Ｚ_start(m)として記憶装置１７に記憶させる。

次に、ステップＳ１０５において、ＡＦスキャン終了位置Ｚ_end(m)を計算し、記憶装置１７に記憶させる。ＡＦスキャン終了位置Ｚ_end(m)は、ＡＦスキャン開始位置Ｚ_start(m)にＡＦスキャン範囲Ｗscan(m)を加えた値（Ｚ_end＝Ｚ_start＋Ｗscan）である。

そして、ステップＳ１０５の後、ステップＳ１０６において、主制御部１６は撮像素子制御部１０からカメラフレームレートｆ(fps)を取得し、ステップＳ１０７において、下記式３のようにしてステージ移動速度ｖを算出する。

ステージ移動速度 ｖ(m/s)＝ｆ(fps)×（Ｗscan(m)／Ｐ） ・・・・・式３
ここで、Ｐは画像サンプリング数である。また、Ｗscan／Ｐは、ＡＦスキャン範囲Ｗscan(m)を画像サンプリング数Ｐで割ることにより、１サンプリング間の距離を表わす。なお、ステージ移動速度ｖは、予め定められた一致の速度でもよい。

ステップＳ１０７の後、ステップＳ１０８において、ステージ２をステージ移動速度ｖ(m/s)でFar方向へと移動させる（図５：（２））。
次に、ステップＳ１０９において、ＡＦ処理を実行する。このＡＦ処理の詳細は、図４を用いて説明する。

図４のステップＳ００１でＡＦ処理が開始されると、ステップＳ００２において、ステージ２がＡＦスキャン終了位置に到達したかを判断する。
未だ到達していない場合（ステップＳ００２：Ｎｏ）、ステップＳ００３において、ステージ２を移動させたまま主制御部１６にて撮像素子制御部１０を操作し、一定間隔で撮像を行って画像を取得する。取得した画像は画像番号index_[i]とし、画像を取得した時刻をｔ１_[i]として記憶装置１７に記憶させる。

次に、ステップＳ００４において、主制御部１６はモータ制御部５に現在のステージ２のＺ座標を確認するコマンドを送信して、ステージ２のＺ座標を取得してＺ_[i]とし、ステージ２のＺ座標を取得した時刻をｔ２_[i]として記憶装置１７に記録する。

また、ステップＳ００５において、画像番号index_[i]のコントラスト演算を行い、コントラスト演算値をef_[i]として記憶装置１７に記憶させる。
そして、ef_[i]が過去最大の値ならば（ステップＳ００６：Ｙｅｓ）、ステップＳ００７において、コントラストピーク値ef_peak、ピークＺ座標Ｚ_peak(m)、ピーク画像取得時刻ｔ１_peak、ピークＺ座標取得時刻ｔ２_peakを更新し、ステップＳ００８において、インデックス番号iを１インクリメントする。他方、ステップＳ００６でef_[i]が過去最大値でなければ（ステップＳ００６：Ｎｏ）、ステップＳ００８に移動する。

以降、ＡＦスキャン終了位置に到達したと判定されるまで（ステップＳ００２：Ｙｅｓ）、ステップＳ００３からステップＳ００８までの処理を繰り返す（図５：（２）−＞（３））。

そして、ＡＦスキャン終了位置に到達後（図５：（３））、図３のステップＳ１１０において、ピークＺ座標を見つけた時にステージ２が移動していた方向と反対方向（この場合はNear方向）へ、以下のようにピークＺ座標をずらす補正処理を行い、補正したピークＺ座標を下記式４のようにＺ_final(m)とする（図５：（４））。

ピークＺ座標 Ｚ_final(m)＝Ｚ_peak(m)−（ｔ２_peak−ｔ１_peak）(s)×ｖ(m/s) ・・・・・式４
上記の式４において、ピークＺ座標取得時刻ｔ２_peakからピーク画像取得時刻ｔ１_peakを引いた値（ｔ２_peak−ｔ１_peak）は、画像を取得してからステージ位置を取得するまでの時間差を表しており、その値にステージ移動速度ｖ(m/s)をかけることで、画像取得位置からステージ位置を取得した位置までの距離が算出される。そして、その距離分、ピークＺ座標Ｚ_peak(m)をNear側に移動させることで、正確な合焦位置を算出することができる。

そして、ステップＳ１１０の処理が終了した後、ステップＳ１１１において、ステージ２をＺ_final(m)へ移動させ（図５：（３）−＞（５））、ステップＳ１１２において、本処理を終了する（図５：（５））。

これにより、画像取得位置とステージ位置のずれを無くすことができ、合焦位置を正確に定めることができる。
（第２の実施の形態）

第２の実施の形態における顕微鏡システムは、図２を用いて説明した第１の実施の形態における顕微鏡システムと同様である。
図６、図７および図８は、本発明の第２の実施の形態によるＡＦ処理の流れを示すフローチャートであり、図９は、本発明の第２の実施の形態によるＡＦシーケンスを説明するための図である。

まず、図６のステップＳ２０１において、表示部１９に表示された顕微鏡操作用ＧＵＩ上からＡＦ開始ボタンを押す（図９：（１））。ステップＳ２０１でＡＦ開始ボタンが押されると、ステップＳ２０２において、主制御部１６は撮像素子制御部１０にＡＦ開始信号を送信し、撮像素子制御部１０は露出感度が一定となるように撮像素子９を制御する。

ステップＳ２０２の後、ステップＳ２０３において、Roughスキャン開始位置に一定の値Ｗstart(m)だけステージ２を移動させる（図９：（１）−＞（２））。このとき、ステージ２が移動する向きは、ステージ２が対物レンズ６へと近づく方向（Near方向)とする。

そして、ステップＳ２０３でＷstart(m)だけステージ２の移動が終了したら、ステップＳ２０４において、主制御部１６はモータ制御部５に現在のステージ２のＺ座標を確認するコマンドを送信して、ステージ２のＺ座標を取得し、Roughスキャン開始位置Ｚ_rstart(m)として記憶装置１７に記憶させる。

次に、ステップＳ２０５において、Roughスキャン終了位置Ｚ_rend(m)を計算し、記憶装置１７に記憶させる。Roughスキャン終了位置Ｚ_rend(m)は、Roughスキャン開始位置Ｚ_rstart(m)にRoughスキャン範囲Ｗrough(m)を加えた値（Ｚ_rend＝Ｚ_rstart＋Ｗrough）である。

そして、ステップＳ２０５の後、ステップＳ２０６において、主制御部１６は撮像制御部１０からカメラフレームレートｆ(fps)を取得し、ステップＳ２０７において、下記式５のようにしてステージ移動速度ｖ_rough(m/s)を算出する。

ステージ移動速度 ｖ_rough(m/s)＝ｆ(fps)×（Ｗrough(m)／Ｐrough） ・・・・・式５
ここで、ＰroughはRoughスキャンの画像サンプリング数である。また、Ｗrough／Ｐroughは、Roughスキャン範囲Ｗrough(m)をRoughスキャンの画像サンプリング数Ｐroughで割ることにより、１サンプリング間の距離を表わす。

ステップＳ２０７の後、ステップＳ２０８において、Roughスキャン処理を実行する。このRoughスキャン処理の詳細は、図７を用いて説明する。
まず、図７のステップＳ３０１でRoughスキャン処理が開始されると、ステップＳ３０２において、Roughスキャン終了位置Ｚ_rend(m)の値をＡＦスキャン終了位置Ｚ_end(m)にコピーする。

次に、ステップＳ３０３において、ステージ２をステージ移動速度v_rough(m/s)でFar方向へと移動させ（図９：（２））、ステップＳ３０４において、図７を用いて説明した第１の実施の形態におけるＡＦ処理（図７のステップＳ００１乃至ステップＳ００９）を実行する（図９：（２）−＞（３））。

そして、Roughスキャン終了位置に到達後（図９：（３））、ステップＳ３０５において、Roughスキャン処理を終了する。
次に、図６のステップＳ２０９において、ピークＺ座標を見つけた時にステージ２が移動していた方向と反対方向（この場合はNear方向）へ、以下のようにピークＺ座標をずらす補正処理をし、補正したピークＺ座標を下記式６のようにＺ_rpeak(m)とする（図９：（４））。

ピークＺ座標 Ｚ_rpeak(m)＝Ｚ_peak(m)−（ｔ２_peak−ｔ１_peak）(s)×ｖ_rough(m/s) ・・・・・式６
上記の式６において、ピークＺ座標取得時刻ｔ２_peakからピーク画像取得時刻ｔ１_peakを引いた値（ｔ２_peak−ｔ１_peak）は、画像を取得してからステージ位置を取得するまでの時間差を表しており、その値にステージ移動速度ｖ_rough(m/s)をかけることで、画像取得位置からステージ位置を取得した位置までの距離が算出される。そして、その距離分、ピークＺ座標Ｚ_rpeak(m)をNear側に移動させることで、正確な合焦位置を算出することができる。

そして、ステップＳ２０９の処理が終了した後、ステップＳ２１０において、Fineスキャン開始位置Ｚ_fstart(m)を算出する。Fineスキャン開始位置は、補正後のRoughスキャンピーク位置Ｚ_rpeak(m)からNear側に、Roughスキャン１フレーム分だけステージ２を移動した位置から開始する。下記の式７のようにして計算する。

Fineスキャン開始位置 Ｚ_fstart(m)＝Ｚ_rpeak(m)−（Ｗrough(m)／Ｐrough） ・・・・・式７
Roughスキャン１フレーム分だけNear側に移動することにより、Roughスキャンのフレーム間で取りこぼした可能性のあるコントラストピークを、Fineスキャンで詳細に調べることができる。

そして、ステップＳ２１０の後、ステップＳ２１１において、Fineスキャン終了位置Ｚ_fend(m)を計算し、記憶装置１７に記憶させる。Fineスキャン終了位置Ｚ_fend(m)は、Fineスキャン開始位置Ｚ_fstart(m)にFineスキャン範囲Ｗfine(m)を加えた値（Ｚ_fend＝Ｚ_fstart＋Ｗfine）である。

ステップＳ２１１の後、ステップＳ２１２において、ステージ２をＺ_fstart(m)の位置へ移動させる（図９：（３）−＞（５））。
そして、ステップＳ２１３において、Fineスキャン開始位置に到達後、下記の式８によりステージ移動速度ｖ_fine(m/s)を算出する。

ステージ移動速度 ｖ_fine(m/s)＝ｆ(fps)×（Ｗfine(m)／Ｐfine） ・・・・・式８
ここで、ＰfineはFineスキャン画像のサンプリング数である。また、Ｗfine／Ｐfineは、Fineスキャン範囲Ｗfine(m)をFineスキャン画像のサンプリング数Ｐfineで割ることにより、１サンプリング間の距離を表わす。

このFineスキャン時のステージ移動速度ｖ_fine(m/s)は、Roughスキャン時のステージ移動速度ｖ_rough(m/s)よりも遅く（ｖ_fine＜＜ｖ_rough）、FineスキャンではRoughスキャンよりも詳細な画像サンプリングを行うことができる。

ステップＳ２１３の後、ステップＳ２１４において、Fineスキャン処理を実行する。このFineスキャン処理の詳細は、図８を用いて説明する。
まず、図８のステップＳ４０１でFineスキャン処理が開始されると、ステップＳ４０２において、Fineスキャン終了位置Ｚ_fend(m)の値をＡＦスキャン終了位置Ｚ_end(m)にコピーする。

次に、ステップＳ４０３において、ステージ２を移ステージ移動速度ｖ_fine(m/s)でFar方向へと移動させ（図９：（５））、ステップＳ４０４において、図７を用いて説明した第１の実施の形態におけるＡＦ処理（図７のステップＳ００１乃至ステップＳ００９）を実行する（図９：（２）−＞（３））。

そして、Fineスキャン終了位置に到達後（図９：（６））、ステップＳ４０５において、Fineスキャンを終了する。
次に、図６のステップＳ２１５において、Fineスキャンで見つけたピークＺ位置Ｚ_peak(m)の値を、最終Ｚ位置Ｚ_final(m)にコピーする。

そして、ステップＳ２１５の処理が終了した後、ステップＳ２１６において、ステージ２をＺ_final(m)の位置へ移動させて（図９：（６）−＞（７））、ステップＳ２１７において、ＡＦを終了する（図９：（７））。

上述の第１の実施の形態では１回のスキャンしか行っていないため、スキャンスピードを遅くして広範囲の画像を取得しなければならなかった。そのため、ＡＦ時間が長くなってしまった。そこで、本第２の実施の形態のように、Roughスキャンで大まかにコントラストピークの位置を探した後に、Fineスキャンで詳細なコントラストピークの位置を探すことで、１回だけのスキャンよりも高速かつ高精度にコントラストピーク位置を探すことができるようになった。

さらに本第２の実施の形態では、Roughスキャンで見つけたコントラストピーク位置を補正し、その補正したコントラストピーク位置からRoughスキャンの１サンプリング区間分Near側に移動した場所をFineスキャン開始位置とすることにより、Roughスキャンで取りこぼした可能性のあるコントラストピークを探すＡＦ処理となっている。このFineスキャン位置を決める処理を加えることにより、短い区間で確実に真のコントラストピークを見つけることが可能となる。

（第２の実施の形態の変形例１）
次に、上記第２の実施の形態の変形例１について説明する。
本変形例は、上述の第２の実施の形態を説明するために用いた図６のステップＳ２１４のFineスキャン処理が終了した後、後述するステップＳ２１８およびステップＳ２１９の処理を加える例である。上記第２の実施の形態におけるFineスキャンでは、ステージ２はRoughスキャンに比べてゆっくりと動かしているため、画像を取得した時のステージ位置と、Ｚ座標を取得したときのステージ位置とのずれは少ない。しかしながら、ステップＳ２１８およびステップＳ２１９の処理を加えることにより、より高精度に合焦位置を定めることができる。

すなわち、ステップＳ２１４でFineスキャン処理が終了後、ステップＳ２１８において、ピークＺ座標を見つけた時にステージ２が移動していた方向と反対方向（この場合はNear方向）へ、以下のようにピークＺ座標をずらす補正処理をし、補正したピークＺ座標を下記の式９のようにＺ_fpeak(m)とする（図９：（４））。

ピークＺ座標 Ｚ_ｆpeak(m)＝Ｚ_peak(m)−（ｔ２_peak−ｔ１_peak）(s)×ｖ_fine(m/s) ・・・・・式９
上記の式９において、ピークＺ座標取得時刻ｔ２_peakからピーク画像取得時刻ｔ１_peakを引いた値（ｔ２_peak−ｔ１_peak）は、画像を取得してからステージ位置を取得するまでの時間差を表しており、その値にステージ移動速度ｖ_fine(m/s)をかけることで、画像取得位置からステージ位置を取得した位置までの距離が算出される。そして、その距離分、ピークＺ座標Ｚ_peak(m)をNear側に移動させることで、正確な合焦位置を算出することができる。

そして、ステップＳ２１８の処理が終了後、ステップＳ２１９において、正したピークＺ位置Ｚ_fpeak(m)の値を、最終Ｚ位置Ｚ_final(m)にコピーする。
ステップＳ２１９の後は、第２の実施の形態と同様、ステップＳ２１６において、ステージ２をＺ_final(m)の位置へ移動させて（図９：（６）−＞（７））、ステップＳ２１７において、ＡＦを終了する（図９：（７））。

（第２の実施の形態の変形例２）
次に、上記第２の実施の形態の変形例２について説明する。
上述した第２の実施の形態における、ステップＳ２１４のFineスキャン処理中で行うＡＦ処理（図８中のステップＳ４０４）においては、特許文献１で開示された技術と同様にステージ２をピッチ送りでＡＦ処理を行ってもよい。すなわち、ステージ２をステージ移動速度ｖ_fineでFar側へ送り、画像を撮影するときにいったんステージ２を止め、撮像信号受信後にステージ位置を取得するといったＡＦ動作になる。

以上第１の実施の形態及び第２の実施の形態を説明してきたが、上述した第１の実施の形態または第２の実施形態において、下記のその他の変形例１乃至その他の変形例５のように、顕微鏡システムの構成やＡＦ動作を変更することもできる。なお、下記のその他の変形例１乃至その他の変形例５は１つ以上を組合せて実施してもよく、上述した第１、第２の実施の形態、第２の実施の形態の変形例１または変形例２と組み合わせてもよい。

（その他の変形例１）
図１０は、本発明のその他の変形例１によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。

図１０に示した顕微鏡システムは、透明の生体サンプルを観察するような場合に適用される顕微鏡システムである。図２に示した第１または第２の実施の形態による顕微鏡システムとは、顕微鏡本体の構成が相違している。すなわち、光源１２がステージ２の下側に位置し、ステージ２の中央にあいた穴から光を透過させる、いわゆる倒立型顕微鏡を備えている。

（その他の変形例２）
図１１は、本発明のその他の変形例２によるＡＦ機構を有する顕微鏡システムの構成例を示す図である。

図１１に示した顕微鏡システムは、図２に示した第１または第２の実施の形態による顕微鏡システムと、顕微鏡本体の構成が相違している。すなわち、ＡＦを行う場合、モータ３を駆動することにより、ステージ２ではなく投光管１４を投光管支持部２２に沿って移動させる。なお、投光管１４を移動させる場合には、対物レンズ６がステージ２に近づく方向をNear方向、対物レンズ６がステージ２から遠ざかる方向をFar方向とする。

（その他の変形例３）
下記の定数は、対物レンズ６の倍率ごとに異なる値を持つことができる。また、顕微鏡本体の投光管１４やカメラ２４の構造に光学ズーム機構を備えている場合には、対物レンズ６の倍率と光学ズームの倍率を掛け合わせた総合倍率に応じて異なる値を持つことができる。そして、そのような異なる値を持つ場合には、記憶装置１７から対物レンズ６の倍率や総合倍率に応じた値を読み出すことができる。

定数：Ｗstart(m)：ＡＦを開始するとＡＦスキャン開始位置またはRoughスキャン開始位置まで移動する一定量のこと。対物レンズ６は倍率ごとに作動距離（ＷＤ）が異なり、対物レンズ６の倍率が高倍であるほどＷＤが小さくなる。そのため、Ｗstart(m)が対物レンズ６にかかわらず一律に大きな値であると、高倍の対物レンズ６がセットされている場合に、標本２３と対物レンズ６が衝突する可能性がある。それを回避するため、対物レンズ６ごとにＷstart(m)の値を変える。

定数：Ｗscan(m)、Ｗrough(m)、Ｗfine(m)：ＡＦを行うスキャン範囲のこと。対物レンズ６の倍率または総合倍率が低倍と高倍では、焦点深度の範囲が異なり、高倍になるほど焦点深度は狭くなる。逆に低倍になるほど焦点深度は広くなる。ＡＦスキャン範囲がどの倍率でも一定であると、例えば低倍でＡＦをかけた場合に、ＡＦスキャン範囲が短すぎて合焦位置にたどり着けない可能性がある。そのような問題を回避するため、Ｗscan(m)、Ｗrough(m)、Ｗfine(m)の値を適切に変える。

定数：Ｐ、Ｐrough、Ｐfine：画像のサンプリング数のこと。この値が多いほどＡＦスキャン中にたくさんの画像をサンプリングするので、コントラストピーク位置を見つける精度が向上する。一方、ステージ２はゆっくりと動くことになるので、ＡＦ時間は長くかかってしまう。対物レンズ６の倍率や総合倍率によって、焦点深度の値が異なり、高倍ほど焦点深度は狭く、低倍ほど焦点深度は広い。よって、高倍では画像サンプリング数は多くし、画像のサンプリング間隔を短くしないと、コントラストピーク位置を見つけることが困難となる。他方、低倍でサンプリング数を多くしてしまうと、ＡＦ時間が長くなってしまう。このようなことを回避するため、倍率に応じて画像のサンプリング数を変更する。

（その他の変形例４）
Near方向とFar方向の向きを逆にしてもよい。ステージ２を動かしてＡＦを行う場合、対物レンズ６に近づく方向がFar側、遠ざかる方向がNear側となる。他方、投光管１４を動かしてＡＦを行う場合には、ステージ２に近づく方向がFar側、遠ざかる方向がNear側となる。

（その他の変形例５）
図１２は、本発明のその他の変形例５によるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。

図４の（ａ）で囲った範囲の処理を図１２の（ｂ）に置き換えて、ＡＦ処理の終了判定を変更してもよい。図１２の処理に変更することにより、ＡＦ探索範囲の最後まで画像をサンプリングしなくてもＡＦを終了することができるので、ＡＦ時間を短縮することが可能となる。

具体的には下記のような処理を実行する。
すなわち、図４のステップＳ００８の処理の後、ステップＳ０１０において、コントラスト演算値ef_[i]が、コントラストピーク値ef_peakの半分を下回ったかどうかを判定する。判定が真であれば（ステップＳ０１０：Ｙｅｓ）、ステップＳ００９において、ＡＦ処理を終了して呼び出し元に戻る。他方、判定が偽であれば（ステップＳ０１０：Ｎｏ）、ステップＳ００２の処理に進む。ステップＳ００２以降の処理は、図４と同様である。

以上本発明を適用した各実施の形態を説明してきたが、本発明は、以上に述べた各実施の形態等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または形状を取ることができる。

なお、上述の各実施の形態で用いた変数Ｚ_start、Ｚ_rstart、Ｚ_fstart、Ｚ_end、Ｚ_rend、Ｚ_fend、ｉ、ef_peak、Ｚ_peak、Ｚ_rpeak、Ｚ_fpeak、Ｚ_final、ｔ１_peak、ｔ２_peak、index_[i] 、ｔ１_[i] 、ｔ２_[i] 、ef_[i] 、Ｚ_[i] 、ｖ、ｖ_rough、ｖ_fine、ｆ等は、ＰＣ２１に電源が投入され、プログラム記憶媒体１８が作動すると全て０（ゼロ）に初期化され、従前に記憶した値を全て消去するものとする。

１ 顕微鏡架台
２ ステージ
３ モータ
４ ステージ支持部
５ モータ制御部
６ 対物レンズ
７ ハーフミラー
８ 結像光学系部
９ 撮像素子
１０ 撮像素子制御部
１１ Ａ／Ｄ変換部
１２ 光源
１３ 光源制御部
１４ 投光管
１５ コントラスト演算処理部
１６ 主制御部
１７ 記憶装置
１８ プログラム記憶媒体
１９ 表示部
２０ キー入力部
２１ ＰＣ
２３ 標本
２４ カメラ

Claims (7)

1. 顕微鏡における観察画像のフォーカスを行う顕微鏡システムであって、
   被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像する撮像手段と、
   前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、
   前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像の検出を行う最大コントラスト画像検出手段と、
   前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出する相対位置検出手段と、
   前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行う位置補正手段と、
   前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスするオートフォーカス手段と、
   を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
2. 前記ステージと前記結像光学系の相対速度を算出する相対速度算出手段と、
   をさらに備え、
   前記位置補正手段は、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記観察画像を撮像した撮像時刻と前記取得した相対位置の取得時刻との差分に前記相対速度を乗算した値だけ移動させる、ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記撮像手段は、第１の時間間隔で撮像するラフスキャン手段と、前記第１の時間間隔より短い第２の時間間隔で撮像するファインスキャン手段とを備え、
   前記最大コントラスト画像検出手段は、前記ラフスキャン手段により撮像した観察画像を用いて第１の最大コントラスト画像を検出し、前記検出した第１の最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を含む所定範囲内について前記ファインスキャン手段により撮像した観察画像を用いて第２の最大コントラスト画像を検出する、
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡システム。
4. 顕微鏡における観察画像のフォーカスを行うオートフォーカスプログラムであって、
   コンピュータに、
   被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像する撮像機能と、
   前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出機能と、
   前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像の検出を行う最大コントラスト画像検出機能と、
   前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出する相対位置検出機能と、
   前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行う位置補正機能と、
   前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスするオートフォーカス機能と、
   を実行させることを特徴とするオートフォーカスプログラム。
5. 前記コンピュータに、
   前記ステージと前記結像光学系の相対速度を算出する相対速度算出機能と、
   をさらに実行させ、
   前記位置補正機能は、前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記観察画像を撮像した撮像時刻と前記取得した相対位置の取得時刻との差分に前記相対速度を乗算した値だけ移動させる、ことを特徴とする請求項４に記載のオートフォーカスプログラム。
6. 前記撮像機能は、第１の時間間隔で撮像するラフスキャン機能と、前記第１の時間間隔より短い第２の時間間隔で撮像するファインスキャン機能とを備え、
   前記最大コントラスト画像検出機能は、前記ラフスキャン機能により撮像した観察画像を用いて第１の最大コントラスト画像を検出し、前記検出した第１の最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を含む所定範囲内について前記ファインスキャン機能により撮像した観察画像を用いて第２の最大コントラスト画像を検出する、
   ことを特徴とする請求項４または５に記載のオートフォーカスプログラム。
7. 顕微鏡における観察画像のフォーカスを行うオートフォーカス方法であって、
   被写体を載置するステージと前記顕微鏡の結像光学系を相対的に移動させながら、前記結像光学系を介して前記被写体を所定の時間間隔で撮像し、
   前記撮像した観察画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、
   前記撮像した複数の観察画像のうち前記算出したコントラスト値が最大である最大コントラスト画像を検出し、
   前記観察画像が撮像されると、前記ステージと前記結像光学系の相対位置を検出し、
   前記検出した最大コントラスト画像に対応する前記検出した相対位置を、前記相対移動した方向と反対方向に所定値だけ移動させる補正処理を行い、
   前記補正された相対位置をフォーカスポイントとしてフォーカスする、
   ことを特徴とするオートフォーカス方法。