JP2015222311A

JP2015222311A - オートフォーカス装置および顕微鏡システム

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Publication number: JP2015222311A
Application number: JP2014106126A
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Inventors: 俊太山本; Shunta Yamamoto
Original assignee: Olympus Corp
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Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2015-12-10
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Abstract

【課題】より高速かつ正確に焦点調節を行う。【解決手段】光学系９と標本Ａとの光軸方向の距離を変化させながら、前記光学系により結像された前記標本の光学像を撮像して前記標本の観察像に係る複数の画像を取得する撮像装置に適用され、複数の前記画像について、コントラストの高低を示すコントラスト値を夫々算出するコントラスト算出手段１６と、複数の前記画像の空間周波数を夫々解析する空間周波数解析手段１７と、前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値及び前記空間周波数解析手段による解析結果の少なくとも一方に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定するフォーカス位置判定手段１４と、を備えるオートフォーカス装置を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、オートフォーカス装置および顕微鏡システムに関するものである。

光学顕微鏡など測定装置に搭載されるオートフォーカス装置において、観察画像のコントラストに基づいてオートフォーカス機能を実現するものや、観察画像の空周波数を解析し、空間周波数のスペクトル強度に基づいてオートフォーカス機能を実現するものが知られている。

このようなオートフォーカス装置の例として、特許文献１には、観察画像の全画素または一部の画素について、隣接画素との差分和をコントラストとして算出し、このコントラストに基づいてオートフォーカス機能を実現する技術が開示されている。また、特許文献２には、観察画像について高速フーリエ変換を用いて算出した空間周波数のスペクトル強度に基づいてオートフォーカス機能を実現する技術が提案されている。

特開２００２−１６２５５８号公報特開２００６−３０１２７０号公報

しかしながら、特許文献１に開示されたオートフォーカス装置では、得られた試料の観察画像のコントラストが低い場合には、コントラストに基づいて正確に焦点を合わせることが困難となる。また、観察画像を取得する際の光学系の倍率が高倍であればあるほど、焦点調節、すなわち、オートフォーカスの精度が低下する。
特許文献２に開示されたオートフォーカス装置では、試料の観察画像の空間周波数を解析するための計算量が膨大であり、高速オートフォーカスを実現することが困難となる。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、高速かつ正確に焦点調節を行うオートフォーカス装置および顕微鏡システムを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら、前記光学系により結像された前記標本の光学像を撮像して前記標本の観察像に係る複数の画像を取得する撮像装置に適用され、複数の前記画像について、コントラストの高低を示すコントラスト値を夫々算出するコントラスト算出手段と、複数の前記画像の空間周波数を夫々解析する空間周波数解析手段と、前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値及び前記空間周波数解析手段による解析結果の少なくとも一方に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定するフォーカス位置判定手段と、を備えるオートフォーカス装置を提供する。

本態様によれば、光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら取得した標本の光学像に係る複数の画像について、コントラスト算出手段によりコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、空間周波数解析手段により空間周波数を夫々解析する。そして、フォーカス位置判定手段が、コントラスト値及び空間周波数の解析結果の少なくとも一方に基づいて、光学系と標本とのフォーカス位置を判定する。このように、フォーカス位置を判定するので、精度よく高速に焦点調節を行うことができる。

上記した発明において、前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値に基づいて前記空間周波数解析手段による解析を行うか否かを判定するモード切替判定手段を備え、前記フォーカス位置判定手段が、前記モード切替判定手段の判定結果、前記空間周波数解析手段による解析を行う場合、前記空間周波数解析手段による解析結果に基づいて前記フォーカス位置を判定し、前記空間周波数解析手段による解析を行わない場合、前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値に基づいて前記フォーカス位置を判定することとしてもよい。

このように、モード切替判定手段がコントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値に基づいて空間周波数解析手段による解析を行うか否かを判定しているため、必要なとき以外、空間周波数解析手段による解析を行わずに済み、精度よく高速に焦点調節を行うことができる。

上記した発明において、光軸方向において前記光学系と前記標本との距離を変化させる範囲を決定するサーチ範囲決定手段を備え、前記コントラスト算出手段が、光軸方向の第１の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、前記サーチ範囲決定手段が、前記第１の範囲のうち、フォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて決定し、前記空間周波数解析手段が、前記第２の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々空間周波数を夫々解析し、前記フォーカス位置判定手段が、前記空間周波数解析手段による解析結果に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定することとしてもよい。

このように、コントラスト算出手段によって第１の範囲において光学系と標本との距離を変化させながら取得した複数の画像のコントラスト値を算出し、このコントラスト値に基づいて、サーチ範囲決定手段が、第１の範囲のうちフォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を決定する。すなわち、コントラスト値を算出することによって大雑把にフォーカス位置がいずれの位置であるかの見当をつけ、より詳細にフォーカス位置を探索すべき範囲として第２の範囲を決定する。そして、第２の範囲内において取得した標本に係る複数の画像について空間周波数解析手段により空間周波数を解析し、この解析結果に基づいて、フォーカス位置判定手段が光学系と標本とのフォーカス位置を判定する。

つまり、コントラスト値の算出によって高速に空間周波数を解析すべき範囲をコントラスト値を算出した範囲より狭い範囲とし、空間周波数の解析を行うべき範囲を限定的なものとすることで、空間周波数の解析に要する計算コストを抑制するので、精度よく高速に焦点調節を行うことができる。

上記した発明において、光軸方向において前記光学系と前記標本との距離を変化させる範囲を決定するサーチ範囲決定手段を備え、前記コントラスト算出手段が、光軸方向の第１の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、前記サーチ範囲決定手段が、前記第１の範囲のうち、フォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて決定し、前記第２の範囲が所定範囲以下である場合に、前記コントラスト算出手段が、前記第２の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、前記フォーカス位置判定手段が、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定することとしてもよい。

このように、コントラスト算出手段によって第１の範囲において光学系と標本との距離を変化させながら取得した複数の画像のコントラスト値を算出し、このコントラスト値に基づいて、サーチ範囲決定手段が、第１の範囲のうちフォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を決定する。すなわち、第１の範囲において取得された画像のコントラスト値に基づいてフォーカス位置が含まれる範囲を大雑把に把握し、より詳細にフォーカス位置を探索すべき範囲として第２の範囲を決定する。この第２の範囲が所定範囲以下である場合には、第２の範囲内において取得した標本に係る複数の画像についてコントラスト値を算出し、コントラスト値に基づいて、フォーカス位置判定手段が光学系と標本とのフォーカス位置を判定する。

つまり、第２の範囲が所定範囲以下である場合には、コントラストの算出のみで精度よくフォーカス位置を判定することができるので、第２の範囲において取得された標本に係る複数の画像についてもコントラスト値を算出し、これに基づいて、光学系と標本とのフォーカス位置を判定する。従って、空間周波数の解析に要する計算コストを抑制するので、高速でありながら精度よく焦点調節を行うことができる。

また、本発明の他の態様は、上記した発明に係るオートフォーカス装置と、前記標本を載せるステージと、前記標本の像を形成する光学系と、該光学系及び前記ステージの少なくとも一方を駆動することにより、前記標本と前記光学系とを相対的に移動させる駆動手段と、前記光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら、前記光学系により結像された前記標本の光学像を撮像して前記標本の観察像に係る複数の画像を取得する撮像手段と、を有する顕微鏡と、を備えた顕微鏡システムを提供する。

本態様によれば、顕微鏡による標本の観察時においても精度よく高速に焦点調節を行うことができる。

本発明によれば、高速かつ正確に焦点調節を行うことができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成を示すブロック図である。本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムにおいて生成した評価値カーブの例である。本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムによるオートフォーカスについてのフローチャートである。本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムにおいて評価値カーブからファインサーチ範囲を決定する場合の例を示す参考図である。本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムにおいて空間周波数の解析結果の例を示すグラフである。本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成を示すブロック図である。本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムによるオートフォーカスについてのフローチャートである。本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムによって生成された評価値カーブから決定されたファインサーチ範囲を示す参考図である。本発明の各実施形態の変形例に係る顕微鏡システムによるオートフォーカスについてのフローチャートである。本発明の各実施形態の変形例に係る顕微鏡システムによってファインサーチ範囲における画像の取得を終了させる場合の例を示すグラフである。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係るオートフォーカス装置および顕微鏡システムについて、図面を参照して以下に説明する。
図１に示すように、顕微鏡システムは、標本Ａの光学像を撮像して画像を取得する顕微鏡１、顕微鏡１を制御する制御部２、及び制御部２に接続され顕微鏡１により取得した画像に対して所定の処理を施す画像処理部として機能すると共に顕微鏡１により取得した画像から顕微鏡１の光学系と標本Ａとのフォーカス位置を判定するオートフォーカス装置としても機能するコンピュータ（ＰＣ）３を備えている。

顕微鏡１では、光源６から出射した照明光がコンデンサユニット７を経由してステージ８に設置された標本Ａを照明し、レボルバに装着されている対物レンズ９及び図示しない結像レンズ（光学系）を介して撮像部１０の撮像面において標本Ａの光学像を結像し、この光学像を撮像部１０が画像として取得する。

顕微鏡１のステージ８には図示しないステッピングモータが設けられており、このモータ１１を駆動機構制御部２０により駆動することにより、ステージ８に載置された標本Ａを対物レンズ９及び結像レンズからなる光学系に対して対物レンズ９の光軸方向（Ｚ方向）に相対的に移動させる。なお、ステージ８は、対物レンズ９の光軸に対して垂直な２方向（Ｘ方向、Ｙ方向）にも移動可能である。

撮像部１０はＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の撮像素子を備えたデジタルカメラであり、結像した光学像を撮像し、デジタル画像として制御部２の撮像制御部２１に出力する。撮像部１０は、撮像制御部２１により制御される。また、撮像制御部２１は、後述するコンピュータ３からの指示に従って、撮像部１０における露光時間やＩＳＯ感度等の撮像条件を設定したり、撮像した画像の現像処理を行って現像処理後の画像をコンピュータ３に出力したりする。

制御部２は、撮像部１０を制御する撮像制御部２１とステージ８を制御する駆動機構制御部２０とを備え、撮像制御部２１により撮像部１０を、駆動機構制御部２０によりステージ８を夫々制御して所定の位置、所定枚数の画像を撮像する。より具体的には、制御部２は、撮像部１０及びステージ８を制御して、光学系と標本Ａとの光軸方向（Ｚ方向）の距離を相対的に変化させながら、光学系により結像された標本の光学像を撮像して標本の観察像に係る複数の画像を取得し、取得したこれらの画像を画像処理部４に出力する。

コンピュータ３は、演算部としてのＣＰＵ（中央処理部）を備え、撮像制御部２１から入力された画像に対して所定の画像処理を行うと共に、コンピュータ３に接続された制御部２、モニタ２３、キーボード２４及びマウス２５を統括的に制御する。コンピュータ３としては、汎用又は専用のコンピュータを適用することができ、ＣＰＵが、撮像部１０によって取得された標本Ａの画像に対して所定の画像処理を行う他、光学系と標本Ａとのフォーカス位置を判定するなど、種々の制御プログラムを実行する。

コンピュータ３は、ＣＰＵが所定のプログラムを展開して実行することによって実現される処理部としての画像処理部４と、画像処理部４に接続される評価値カーブ生成部１２、ファインサーチ範囲決定部１３及びフォーカス位置判定部１４を備えている。
画像処理部４は、領域抽出部１５、コントラスト算出部１６及び空間周波数解析部１７を備えている。

領域抽出部１５は、顕微鏡１において取得された画像のうち、キーボード２４やマウス２５等により入力されたフォーカスを合わせたい領域を、以降の処理の対象領域として抽出する。
コントラスト算出部１６は、光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら取得した標本に係る複数の画像について、領域抽出部１５によって抽出された領域のコントラストを夫々算出する。
空間周波数解析部１７は、光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら取得した標本に係る複数の画像について、領域抽出部１５によって抽出された領域の空間周波数を夫々解析する。

評価値カーブ生成部１２は、コントラスト算出部１６により算出されたコントラストから、合焦の度合いを示す評価値を算出し、この評価値と、評価値と対応する光軸方向の位置とに基づいて、例えば図２に示す評価値カーブを生成する。評価値としては、例えばコントラスト値の二乗を適用することができる。

ファインサーチ範囲決定部１３は、評価値カーブ生成部１２により生成された評価値カーブに基づいて、フォーカス位置を詳細に探索すべき光軸方向の範囲を決定する。つまり、コントラストを算出した画像は、光軸方向の第１の範囲において光学系と標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像であり、これら画像のコントラストから大雑把にフォーカス位置がいずれの位置であるかの見当をつけている。そこで、第１の範囲のうち、より詳細にフォーカス位置を探索すべき範囲として第２の範囲をファインサーチ範囲決定部１３により決定する。

フォーカス位置判定部１４は、ファインサーチ範囲決定部１３により決定された第２の範囲内において光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら取得した複数の画像からフォーカス位置を判定する。すなわち、空間周波数解析部１７により取得した第２の範囲内において光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら取得した複数の画像についての空間周波数の解析結果に基づいてフォーカス位置を判定する。

以下、このように構成された顕微鏡システムによるオートフォーカスの流れについて、図３のフローチャートに従って説明する。

はじめに、光軸方向の第１の範囲で光学系と標本との距離を変化させてラフサーチを行うために、対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置を予め定めた初期位置とする。すなわち、例えば標本Ａが対物レンズ９と接触しない程度に接近する位置にステージ８を移動させる。そして、ステップＳ１０１において、撮像制御部２１がコンピュータ３の指示に従って標本Ａの光学像を撮像する旨の指示を撮像部１０に行い、この指示を受けて撮像部１０が、標本Ａの画像を撮像する。撮影した画像及び撮影した際の光軸方向の位置（以下、「Ｚ位置」という）は、ＰＣ３に備えられた図示しないデータ記録部に出力される。

次に、ステップＳ１０２にて、ラフサーチの際に、ラフサーチ範囲である第１の範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させるピッチ、つまり対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置の移動量であるラフ間隔で対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させる、つまり、両者の相対位置を移動させる。ラフ間隔は、予めＰＣ３の図示しない記憶部などに記憶しておき、これに従って、ラフサーチ範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの相対位置を移動させることで、両者の距離を変化させる。予め定めたラフ間隔として、例えば、対物レンズの焦点深度の５倍の移動量を設定することができ、ラフ間隔は適宜設定することができる。本実施形態においては、対物レンズ９の焦点深度の５倍でステージ８を移動させることにより対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させることとする。

次のステップＳ１０３において、ラフサーチ範囲における画像の撮像が終了したか否かを判定する。これは、例えば、現在のステージ８の位置がラフサーチ範囲を超えたか否かについて、下限をラフサーチの初期位置、上限を標本Ａが対物レンズ９から最も離れる位置とした範囲内であるか判定し、範囲外である場合に、ラフサーチ範囲における画像の撮像を終了したと判定し次のステップＳ１０４に進む。第１の範囲における撮像が終了していない場合には、ステップＳ１０１に戻り第１の範囲内における撮像を継続する。

ステップＳ１０４では、先のステップにおいてラフサーチによって撮影されたラフサーチ範囲の全ての画像に対して、フォーカスしたい領域の画像を領域抽出部１５により抽出し、抽出した領域についてコントラスト算出部１６により夫々コントラスト値を算出する。コントラスト算出部１６は、例えば、抽出した領域において、隣接する画素同士の差分和の絶対値をコントラスト値として演算する。算出されたコントラスト値は評価値カーブ生成部１２に出力される。

次のステップＳ１０５では、入力されたコントラスト値に基づいて、評価値カーブ生成部１２が合焦の度合いを示す評価値として、例えばコントラスト値の二乗を算出する。そして、この評価値と、ステップＳ１０１において画像撮像時に記憶した画像を撮影した際のＺ位置とに基づいて、例えば、ラグランジュ補間等の補間法を用いて評価値カーブを生成する（図２）。図２において、点５０１〜点５０９は算出された評価値をプロットした点を模式的に示しており、曲線５１０は点５０１〜点５０９について補間法を適用して求めた曲線を模式的に表したものであり、本ステップで生成する評価値カーブである。なお、補間法はラグランジュ補間以外の手法を用いても良い。

ステップＳ１０６では、先のステップで生成された評価値カーブとあらかじめ定めた閾値、例えば、評価値カーブにおけるカーブの山が最も高いピーク位置の評価値の７０％の値を用いて、より詳細にフォーカス位置を探索すべき範囲である第２の範囲としてのファインサーチ範囲を決定する。図４の曲線６０１は評価値カーブを、直線６０２は閾値を、直線６０３は評価値が閾値を越える画像のＺ位置の最小値、直線６０４は評価値が閾値を超える画像のＺ位置の最大値を、矢印６０５は直線６０３と直線６０４から決定したファインサーチの範囲を模式的に示している。なお、閾値は適宜設定することができ、ＰＣの図示しない記憶部等に記憶させるなど、予め定めることができる。ファインサーチ範囲の決定後、対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置をファインサーチ範囲の初期位置とする、すなわち、ファインサーチの範囲の下限位置にステージ８を移動させる。

ステップＳ１０７では、ステップＳ１０１と同様に、撮像制御部２１がコンピュータ３の指示に従って標本Ａの光学像を撮像する旨の指示を撮像部１０に行い、この指示を受けて撮像部１０が、標本Ａの画像を撮像する。撮影した画像及び撮影した際のＺ位置は、ＰＣ３に備えられた図示しないデータ記録部に出力される。

次に、ステップＳ１０８で、ファインサーチの際に、ファインサーチ範囲において、対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させるピッチ、つまり対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置の移動量であるファイン間隔で対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させる、つまり、両者の相対位置を移動させる。ファイン間隔は、予めＰＣ３の図示しない記憶部などに記憶しておき、これに従って、ファインサーチ範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの相対位置を移動させることで、両者の距離を変化させる。予め定めたファイン間隔として、例えば、対物レンズの焦点深度の１倍の移動量を設定することができ、ファイン間隔はラフ間隔よりも小さい距離で適宜設定することができる。本実施形態においては、対物レンズ９の焦点深度の１倍でステージ８を移動させることにより対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させることとする。

次のステップＳ１０９において、ファインサーチ範囲における画像の撮像が終了したか否かを判定する。これは、例えば、現在のステージ８の位置がファインサーチ範囲を超えたか否かについて判定し、ステージ８の位置がファインサーチ範囲外である場合に、ファインサーチ範囲における画像の撮像を終了したと判定し次のステップＳ１１０に進む。ファインサーチ範囲における撮像が終了していない場合には、ステップＳ１０７に戻りファインサーチ範囲内における撮像を継続する。

ステップＳ１１０では、先のステップにおいてファインサーチによって撮影されたファインサーチ範囲の全ての画像に対して、フォーカスしたい領域の画像を領域抽出部１５により抽出し、抽出した領域について、空間周波数解析部１７で空間周波数を解析する。空間周波数の解析は、例えば、高速フーリエ変換による解析で各空間周波数のスペクトルを解析する。なお、空間周波数の解析手法は高速フーリエ変換に限られず適宜選択することができる。解析した空間周波数の解析結果はフォーカス位置判定部１４に出力される。

ステップＳ１１１では、解析した空間周波数の解析結果の入力を受けて、フォーカス位置判定部１４が、空間周波数の解析結果の全体からＤＣ成分を除いた空間周波数のスペクトルの強度の総和をとったものを評価値として算出する。図５の７０１の棒グラフはＤＣ成分を、７０２は全体からＤＣ成分を除いたスペクトルを模式的に示したものである。なお、評価値に用いる空間周波数のスペクトルは上述のものに限られず、適宜選択することができる。

フォーカス位置判定部１４は、算出した評価値の大きさを比較し、評価値の値が最も大きくなる画像を撮影した位置をフォーカス位置であると判定する。
本実施形態においては、オートフォーカス装置は顕微鏡システムに適用されているので、フォーカス位置判定部１４により、判定したフォーカス位置を駆動機構制御部２０に出力し、駆動機構制御部２０が判定したフォーカス位置にステージ８を移動させることで対物レンズ９と標本Ａとがフォーカス位置に合うように相対移動させられる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡システムによれば、ラフサーチを行った範囲についてコントラストを算出することにより高速にファインサーチを実施する範囲を決定することで、空間周波数の解析を行うべき範囲を限定的なものとしているので、膨大な計算を行うことなく高速にフォーカス位置を判定することができる。また、ファインサーチ範囲について空間周波数の解析結果に基づいてフォーカス位置を判定しているので、精度よくフォーカス位置を判定することができる。

（第２の実施形態）
以下、本発明の第２の実施形態について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システムは、図６に示すように、ファインサーチ範囲における画像について、どのようにしてフォーカス位置の判定を行うかを判定するモード切替判定部１８を備えている点が、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡システムと異なっている。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡システムにおいて、ＰＣ３が、ＣＰＵが所定のプログラムを展開して実行することによって実現される処理部として、さらにモード切替判定部１８を備えている。本実施形態に係る顕微鏡システムは、その他の構成については上述した第１の実施形態と略同一の構成であるため、各構成についての説明を省略し、オートフォーカスの流れについて、図７のフローチャートに従って説明する。

はじめに、光軸方向の第１の範囲で光学系と標本との距離を変化させてラフサーチを行うために、対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置を予め定めた初期位置とする。すなわち、例えば標本Ａが対物レンズ９と接触しない程度に接近する位置にステージ８を移動させる。そして、ステップＳ２０１において、撮像制御部２１がコンピュータ３の指示に従って標本Ａの光学像を撮像する旨の指示を撮像部１０に行い、この指示を受けて撮像部１０が、標本Ａの画像を撮像する。撮影した画像及び撮影した際のＺ位置は、ＰＣ３に備えられた図示しないデータ記録部に出力される。

次に、ステップＳ２０２にて、ラフサーチの際に、ラフサーチ範囲である第１の範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させるピッチ、つまり対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置の移動量であるラフ間隔で対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させる、つまり、両者の相対位置を移動させる。ラフ間隔は、予めＰＣ３の図示しない記憶部などに記憶しておき、これに従って、ラフサーチ範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの相対位置を移動させることで、両者の距離を変化させる。予め定めたラフ間隔として、例えば、対物レンズの焦点深度の５倍の移動量を設定することができ、ラフ間隔は適宜設定することができる。本実施形態においては、対物レンズ９の焦点深度の５倍でステージ８を移動させることにより対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させることとする。

次のステップＳ２０３において、ラフサーチ範囲における画像の撮像が終了したか否かを判定する。これは、例えば、現在のステージ８の位置がラフサーチ範囲を超えたか否かについて、下限をラフサーチの初期位置、上限を標本Ａが対物レンズ９から最も離れる位置とした範囲内であるか判定し、範囲外である場合に、ラフサーチ範囲における画像の撮像を終了したと判定し次のステップＳ２０４に進む。第１の範囲における撮像が終了していない場合には、ステップＳ２０１に戻り第１の範囲内における撮像を継続する。

ステップＳ２０４では、先のステップにおいてラフサーチによって撮影されたラフサーチ範囲の全ての画像に対して、フォーカスしたい領域の画像を領域抽出部１５により抽出し、抽出した領域についてコントラスト算出部１６により夫々コントラスト値を算出する。コントラスト算出部１６は、例えば、抽出した領域において、隣接する画素同士の差分和の絶対値をコントラスト値として演算する。算出されたコントラスト値は評価値カーブ生成部１２に出力される。

次のステップＳ２０５では、入力されたコントラスト値に基づいて、評価値カーブ生成部１２が合焦の度合いを示す評価値として、例えばコントラスト値の二乗を算出する。そして、この評価値と、ステップＳ２０１において画像撮像時に記憶した画像を撮影した際のＺ位置とに基づいて評価値カーブを生成する（上記第１の実施形態における図２参照）。

ステップＳ２０６では、先のステップで生成された評価値カーブとあらかじめ定めた閾値、例えば、評価値カーブにおけるカーブの山が最も高いピーク位置の評価値の７０％の値を用いて、より詳細にフォーカス位置を探索すべき範囲である第２の範囲としてのファインサーチ範囲を決定する（上記第１の実施形態における図４参照）。ファインサーチ範囲の決定後、対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置をファインサーチ範囲の初期位置とする、すなわち、ファインサーチの範囲の下限位置にステージ８を移動させる。

ステップＳ２０７では、ステップＳ２０１と同様に、撮像制御部２１がコンピュータ３の指示に従って標本Ａの光学像を撮像する旨の指示を撮像部１０に行い、この指示を受けて撮像部１０が、標本Ａの画像を撮像する。撮影した画像及び撮影した際のＺ位置は、ＰＣ３に備えられた図示しないデータ記録部に出力される。

次に、ステップＳ２０８で、ファインサーチの際に、ファインサーチ範囲において、対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させるピッチ、つまり対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置の移動量であるファイン間隔で対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させる、つまり、両者の相対位置を移動させる。ファイン間隔は、予めＰＣ３の図示しない記憶部などに記憶しておき、これに従って、ファインサーチ範囲内において、対物レンズ９と標本Ａとの相対位置を移動させることで、両者の距離を変化させる。予め定めたファイン間隔として、例えば、対物レンズの焦点深度の１倍の移動量を設定することができ、ファイン間隔はラフ間隔よりも小さい距離で適宜設定することができる。本実施形態においては、対物レンズ９の焦点深度の１倍でステージ８を移動させることにより対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させることとする。

次のステップＳ２０９において、ファインサーチ範囲における画像の撮像が終了したか否かを判定する。これは、例えば、現在のステージ８の位置がファインサーチ範囲を超えたか否かについて判定し、ステージ８の位置がファインサーチ範囲外である場合に、ファインサーチ範囲における画像の撮像を終了したと判定し次のステップＳ２１０に進む。ファインサーチ範囲における撮像が終了していない場合には、ステップＳ２０７に戻りファインサーチ範囲内における撮像を継続する。

ステップＳ２１０では、ファインサーチ範囲において撮像した画像について、空間周波数による解析が必要か否か、すなわちモード切替が必要か否かを判定する。つまり、モード切替判定部１８が、コントラストを算出することによりフォーカス位置を判定するのか、又は、空間周波数を解析することによりフォーカス位置を判定するのかについて、先のステップにおけるラフサーチによって生成された評価値カーブに基づいて判定する。

評価値カーブの山がなだらかな場合、ノイズの影響を受けてピーク（最大値）の判定が困難となるため、評価値カーブに対する閾値を予め設定し、この閾値に基づいてモード切替の要否を判定する。本実施形態においては、対物レンズ９の焦点深度の６倍を閾値とし、図８に示すように、評価値カーブに対してこの閾値を適用した場合にファインサーチ範囲（図８における矢印Ｆの範囲）が、閾値未満の場合は、コントラストを算出することによりフォーカス判定を行うと判定され、ファインサーチ範囲が閾値以上の場合に空間周波数の解析が必要と判定される。よって、ファインサーチ範囲が閾値以上の場合には、ステップＳ２１１に進み、閾値未満の場合はステップＳ２１３に進む。

ステップＳ２１１では、先のステップにおいてファインサーチによって撮影されたファインサーチ範囲の全ての画像に対して、フォーカスしたい領域の画像を領域抽出部１５により抽出し、抽出した領域について、空間周波数解析部１７で空間周波数を解析する。空間周波数の解析は、例えば、高速フーリエ変換による解析で各空間周波数のスペクトルを解析する。なお、空間周波数の解析手法は高速フーリエ変換に限られず適宜選択することができる。解析した空間周波数の解析結果はフォーカス位置判定部１４に出力される。

ステップＳ２１２では、解析した空間周波数の解析結果の入力を受けて、フォーカス位置判定部１４が、空間周波数の解析結果の全体からＤＣ成分を除いた空間周波数のスペクトルの強度の総和をとったものを評価値として算出する。図５の７０１の棒グラフはＤＣ成分を、７０２は全体からＤＣ成分を除いたスペクトルを模式的に示したものである。なお、評価値に用いる空間周波数のスペクトルは上述のものに限られず、適宜選択することができる。
フォーカス位置判定部１４は、算出した評価値の大きさを比較し、評価値の値が最も大きくなる画像を撮影した位置をフォーカス位置であると判定する。

ステップＳ２１３では、ファインサーチによって撮影されたファインサーチ範囲の全ての画像に対して、フォーカスしたい領域の画像を領域抽出部１５により抽出し、抽出した領域についてコントラスト算出部１６により夫々コントラスト値を算出する。コントラスト算出部１６は、例えば、抽出した領域において、隣接する画素同士の差分和の絶対値をコントラスト値として演算する。

ステップＳ２１４において、フォーカス位置判定部１４は、入力されたコントラスト値に基づいて、合焦の度合いを示す評価値として、例えばコントラスト値の二乗を算出し、算出した評価値の大きさを比較し、評価値の値が最も大きくなる画像を撮影した位置をフォーカス位置であると判定する。
本実施形態においては、オートフォーカス装置は顕微鏡システムに適用されているので、フォーカス位置判定部１４により、判定したフォーカス位置を駆動機構制御部２０に出力し、駆動機構制御部２０が判定したフォーカス位置にステージ８を移動させることで対物レンズ９と標本Ａとがフォーカス位置に合うように相対移動させられる。

本実施の形態にかかる顕微鏡システムによれば、コントラストを算出するのみでフォーカス位置を判定可能な場合は、膨大な計算量を要する空間周波数の解析処理を行わずにフォーカス位置を判定するので、計算コストを低減し、高速にフォーカス位置を判定することができる。

（変形例）
以下、上記した第１の実施形態及び第２の実施形態の変形例について説明する。
本変形例では、ファインサーチ範囲が決定した後に、ファインサーチ範囲において画像を撮像している間、画像の撮像毎に評価値を算出し、算出した評価値が予め定めた所定の条件を満たす場合に、ファインサーチ範囲における全範囲の画像の取得が終了していない場合であっても、画像の取得を終了し、フォーカス位置を判定する。

より詳細には、図９のフローチャートに従って、ファインサーチを強制的に終了させるか否かを判定する。
図９はファインサーチ範囲の決定後からの処理を示しており、対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置をファインサーチ範囲の初期位置とする、すなわち、ファインサーチの範囲の下限位置にステージ８を移動させた状態である。

ステップＳ３０１では、撮像制御部２１がコンピュータ３の指示に従って標本Ａの光学像を撮像する旨の指示を撮像部１０に行い、この指示を受けて撮像部１０が、標本Ａの画像を撮像する。撮影した画像及び撮影した際のＺ位置は、ＰＣ３に備えられた図示しないデータ記録部に出力される。
ステップＳ３０２において、撮像した画像について、フォーカス位置判定部１４が、コントラスト算出又は空間周波数解析に基づいて評価値を算出する。

次に、ステップＳ３０３で、ファインサーチの際に、ファインサーチ範囲において、対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させるピッチ、つまり対物レンズ９と標本Ａとの光軸方向の相対位置の移動量であるファイン間隔で対物レンズ９と標本Ａとの距離を変化させる、つまり、両者の相対位置を移動させる。

ステップＳ３０４では、先のステップで算出された評価値がファインサーチの所定の終了条件を満たす場合に、ファインサーチを強制的に終了させると判定する。終了条件としては、例えば、評価値の最大値の２０％の値を閾値とし、評価値の算出が所定の回数を超えても評価値が閾値を超えない場合にファインサーチを終了させる等と定めることができる。ファインサーチを終了させると判定した場合は、次のステップＳ３０５によりフォーカス位置の判定を行い、ファインサーチを終了させないと判定した場合には、ステップＳ３０１に戻りファインサーチ内における画像の取得を繰り返す。

図１０に、ファインサーチの終了条件に従ってファインサーチの範囲の途中までファインサーチを実施し、演算した評価値をプロットした場合の一例を示す。つまり、点線８０１がファインサーチ範囲の途中までファインサーチを実施し、演算した評価値をプロットしたものであり、矢印８０２はその途中までファインサーチを実施した範囲を、矢印８０３はファインサーチ範囲全体を模式的に示している。フォーカス位置の判定は、算出した評価値の中から最大値を選択することで行われる。

このように、本変形例に係る顕微鏡システムによれば、不要なファインサーチを行う回数を減少させることでより高速にフォーカス位置を判定することができる。特に、空間周波数の解析結果に基づいてファインサーチを行う場合に有効となる。

１顕微鏡
２制御部
３コンピュータ（ＰＣ）
４画像処理部
８ステージ
９対物レンズ
１０撮像部
１２評価値カーブ生成部
１３ファインサーチ範囲決定部
１４フォーカス位置判定部
１５領域抽出部
１６コントラスト算出部
１７空間周波数解析部
１８モード切替判定部
２０駆動機構制御部
２１撮像制御部

Claims

光学系と標本との光軸方向の距離を変化させながら、前記光学系により結像された前記標本の光学像を撮像して前記標本の観察像に係る複数の画像を取得する撮像装置に適用され、
複数の前記画像について、コントラストの高低を示すコントラスト値を夫々算出するコントラスト算出手段と、
複数の前記画像の空間周波数を夫々解析する空間周波数解析手段と、
前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値及び前記空間周波数解析手段による解析結果の少なくとも一方に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定するフォーカス位置判定手段と、
を備えるオートフォーカス装置。
前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値に基づいて前記空間周波数解析手段による解析を行うか否かを判定するモード切替判定手段を備え、
前記フォーカス位置判定手段が、前記モード切替判定手段の判定結果、前記空間周波数解析手段による解析を行う場合、前記空間周波数解析手段による解析結果に基づいて前記フォーカス位置を判定し、前記空間周波数解析手段による解析を行わない場合、前記コントラスト算出手段によって算出されたコントラスト値に基づいて前記フォーカス位置を判定する請求項１記載のオートフォーカス装置。
光軸方向において前記光学系と前記標本との距離を変化させる範囲を決定するサーチ範囲決定手段を備え、
前記コントラスト算出手段が、光軸方向の第１の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、
前記サーチ範囲決定手段が、前記第１の範囲のうち、フォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて決定し、
前記空間周波数解析手段が、前記第２の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々空間周波数を夫々解析し、
前記フォーカス位置判定手段が、前記空間周波数解析手段による解析結果に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定する請求項１記載のオートフォーカス装置。
光軸方向において前記光学系と前記標本との距離を変化させる範囲を決定するサーチ範囲決定手段を備え、
前記コントラスト算出手段が、光軸方向の第１の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、
前記サーチ範囲決定手段が、前記第１の範囲のうち、フォーカス位置を詳細に探索すべき範囲として光軸方向の第２の範囲を、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて決定し、
前記第２の範囲が所定範囲以下である場合に、前記コントラスト算出手段が、前記第２の範囲において前記光学系と前記標本との距離を変化させながら取得した標本の観察像に係る複数の画像について夫々コントラスト値を算出し、
前記フォーカス位置判定手段が、前記コントラスト算出手段により算出されたコントラスト値に基づいて前記光学系と前記標本とのフォーカス位置を判定する請求項１記載のオートフォーカス装置。
請求項１乃至請求項４の何れか１項に記載のオートフォーカス装置と、
前記標本を載せるステージと、前記標本の像を形成する光学系と、該光学系及び前記ステージの少なくとも一方を駆動することにより、前記標本と前記光学系とを相対的に移動させる駆動手段と、前記光学系と前記標本との光軸方向の距離を変化させながら、前記光学系により結像された前記標本の光学像を撮像して前記標本の観察像に係る複数の画像を取得する撮像手段と、を有する顕微鏡と、
を備えた顕微鏡システム。