JP2016075817A - 画像取得装置、画像取得方法及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】凹凸やうねりを有する被写体に対して、光軸方向における被写体の断面像を高速且つ確実に取得する。
【解決手段】被写体を複数の区画に分け、各区画に対して光軸方向の撮像範囲内で光軸方向の焦点位置を変えながら撮像手段で被写体を複数回撮像することにより、前記被写体内の複数のレイヤーの画像を取得する画像取得装置であって、被写体の複数の検出位置について光軸方向の合焦位置をそれぞれ検出する検出手段と、検出された複数の検出位置における合焦位置からフォーカスマップを作成する作成手段と、作成されたフォーカスマップから、注目区画において合焦位置が位置する光軸方向の範囲を算出する算出手段と、光軸方向の撮像範囲の基準となる基準撮像範囲を設定する設定手段と、設定された基準撮像範囲と算出された合焦位置の範囲とに基づいて、光軸方向の撮像範囲を区画ごとに決定する決定手段と、を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡等の画像取得装置、画像取得方法及びプログラムに関する。

近年、病理診断や臨床研究等の分野において、人から摘出した組織片等の病理標本の顕微鏡像をデジタル画像として取得することで、データ管理の効率化や遠隔診断を測るバーチャル・スライド・システムが注目されている。このシステムの被写体である病理標本は、数μｍ〜数十μｍ程度に薄くスライスされた組織片をスライドグラスとカバーグラスで挟み、封入剤により固定して作製されるスライドである。
一方で、病理観察用顕微鏡の対物レンズは高解像が要求されており、高ＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ）側に設計するとレンズの被写界深度が浅くなってしまうことが懸念される。病理観察用顕微鏡で一般に用いられる対物レンズの被写界深度は、０．５〜１μｍ程度と組織片の厚みに比べて小さい。そのため、組織片の厚み範囲全域の画像を取得したい場合、光軸方向における対物レンズの焦点と被写体との相対位置を変更しながら撮像を繰り返して断面像を取得する。

また、被写体である組織片は表面に凹凸やうねりを有していることから、光軸方向における撮像開始位置を常に変更しながら撮像を行う必要がある。
それを実現する手段として、特許文献１に記載の顕微鏡では、標本の表面位置を推定し、その表面位置を基準として所定範囲にわたって標本からの光を検出する光検出部を備えている。これにより、標本の凹凸やうねりに対応して標本の断面像を取得することができる。
特許文献２に記載の顕微鏡では、被検物の像の合焦曲面の傾きに応じて撮像素子の撮像面が合焦面に近づくように撮像素子を移動する移動機構を備えている。これにより、被検物の凹凸やうねりに対応して被検物の合焦画像を取得することができる。

特開２０１２−２０３０４８号公報 特開２０１２−１０８４７６号公報

しかしながら、画像取得の高速化に向けて病理観察用顕微鏡の対物レンズを広画角にする方法が考えられるが、それにより、被写体である組織片の凹凸やうねりの影響がより顕著になる。そのため、被写体の厚み範囲全域において必要な画像情報が欠落したり、被写体の合焦画像が取得できないという問題が生じることが懸念される。
その解決方法として、光軸方向における被写体の断面像の取得範囲を常に変更しながら撮像する方法が考えられる。しかし、特許文献１、及び２に記載の顕微鏡は、いずれも被写体の厚み情報を考慮しておらず、被写体の厚さ範囲全域に対して必要な合焦画像を確実に取得するのが困難である。

本発明は上記したような事情に鑑みてなされたものであり、凹凸やうねりを有する被写体に対して、光軸方向における被写体の断面像を高速且つ確実に取得することのできる画像取得装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために本発明にあっては、
被写体を複数の区画に分け、各区画に対して光軸方向の撮像範囲内で光軸方向の焦点位置を変えながら撮像手段で被写体を複数回撮像することにより、前記被写体内の複数のレイヤーの画像を取得する画像取得装置であって、
被写体の複数の検出位置について光軸方向の合焦位置をそれぞれ検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された複数の検出位置における合焦位置からフォーカスマップを作成する作成手段と、
前記作成手段により作成されたフォーカスマップから、注目区画において合焦位置が位置する光軸方向の範囲を算出する算出手段と、
光軸方向の撮像範囲の基準となる基準撮像範囲を設定する設定手段と、
前記設定手段により設定された基準撮像範囲と、前記算出手段により算出された合焦位置の範囲とに基づいて、光軸方向の撮像範囲を区画ごとに決定する決定手段と、
を有することを特徴とする。

本発明によれば、凹凸やうねりを有する被写体に対して、光軸方向における被写体の断面像を高速且つ確実に取得することのできる画像取得装置を提供することが可能となる。

実施例１の画像取得装置のシステム構成を示す概略図 実施例１における画像取得プロセスを示すフローチャート図 実施例１におけるＸＹ存在範囲の算出方法を示す概略図 実施例１における合焦位置を検出するＸＹ位置の算出方法を示す概略図 実施例１における合焦位置の検出方法を示す概略図 実施例１における合焦位置の算出方法を示す概略図 実施例１におけるフォーカスマップの算出方法を示す概略図 実施例１におけるＺスタック範囲の算出方法を示す概略図 実施例１におけるＺスタック範囲の変更方法を示す概略図 実施例２の画像取得装置のシステム構成を示す概略図 実施例２における画像取得プロセスを示すフローチャート図 実施例２における組織片の厚さの算出方法を示す概略図 実施例３における画像取得プロセスを示すフローチャート図

以下に図面を参照して、この発明を実施するための形態を例示的に詳しく説明する。ただし、この実施の形態に記載されている構成部品の寸法、材質、形状それらの相対配置などは、発明が適用される装置の構成や各種条件により適宜変更されるべきものであり、この発明の範囲を以下の実施の形態に限定する趣旨のものではない。

［実施例１］
以下に、実施例１について説明する。
（装置構成について）
図１は、本実施例の画像取得装置１のシステム構成を示す概略図である。
本実施例の画像取得装置１は、被写体を複数の区画に分け、各区画に対して光軸方向の撮像範囲内で光軸方向の焦点位置を変えながら撮像手段で被写体を複数回撮像することにより、被写体内の複数のレイヤーの画像を取得する装置である。
画像取得装置１は、撮像装置１００、広域撮像装置２００、制御部３００、撮像範囲算出部４００、画像処理部５、画像保存部６、画像表示部７を有している。

撮像装置１００は、細胞や組織片等を封入したスライド（以下、試料）８の拡大像を撮
像するための装置であり、撮像装置１００としては、いわゆるデジタル顕微鏡やバーチャルスライドスキャナを例示することができる。また、試料８には、図５に示すように、撮像対象となる被写体としての組織片８０１と、スライドグラス８０２と、カバーグラス８０３と、組織片８０１を固定する封入剤８０４が含まれる。
広域撮像装置２００は、試料８の全体像を撮像するための装置であり、取得した画像は、サムネイル画像の作成や、後述する小区画９０１の位置算出のために用いられる。

制御部３００は、画像取得装置１における様々な処理に対しての制御を行う。制御部３００は、具体的には、ＣＰＵやメモリ、記憶デバイスを備えたコンピュータで構成されており、記憶されたプログラムをＣＰＵが実行、処理することにより、画像取得装置１が制御される。
撮像範囲算出部４００は、撮像装置１００、及び広域撮像装置２００により撮像された試料８の画像情報に基づき、撮像位置、及び撮像枚数を決定する処理を行う。
画像処理部５は、撮像装置１００により撮像された画像のデジタル補正や、画像合成等を行う。デジタル補正については、取得した分光透過率に基づく色調補正やガンマ補正、ノイズ処理等の方法が考えられる。

画像保存部６は、撮像装置１００により撮像された画像データの保存、蓄積を行うものであり、画像保存部６としては、ハードディスク等の記憶装置を用いることができる。画像表示部７は、画像保存部６に保存された画像を出力し、表示、閲覧を行うためのもので、本実施例では画像表示部７としてディスプレイを例示している。
撮像装置１００は、ステージ１０１、照明部１０２、対物レンズ１０３、撮像部１０４を有する。尚、本実施例では、図１に示すように、対物レンズ１０３の光軸方向に対して直交する方向をＸＹ方向とし、対物レンズ１０３の光軸方向をＺ方向として説明する。また、撮像装置１００は、Ｚ方向にステージ１０１をステップ移動させながら、撮像部１０４により、試料８の存在範囲全域における試料８の断面像を撮像する。本実施例では、この撮像方法をＺスタックという。

ステージ１０１は、試料８の保持、及び試料８の位置制御を行う機構を有しており、試料８をＸＹ方向、及びＺ方向に移動させることができる。尚、ステージ１０１として、本実施例では、ボールねじやピエゾ等を用いた駆動機構を使用する。
照明部１０２は、試料８を照明するための光源、及び試料８に光を集光するための光学系を有する。尚、照明部１０２の光源として、本実施例では、ハロゲンランプやＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）等を使用する。
対物レンズ１０３は、照明部１０２により照射されて試料８を透過した光を撮像部１０４に含まれる撮像素子の受光面上に結像させる。尚、対物レンズ１０３として、本実施例では、物体側の視野サイズ１ｍｍ以上で且つ被写界深度０．５μｍ相当のものを使用する。

撮像部１０４は、光電変換を行う撮像素子や、電気信号の入出力を行う伝送ケーブル等を有する。撮像素子では、対物レンズ１０３を介して受光した光を光電変換することにより、試料８の画像のデータを電気信号として出力する。尚、撮像素子として、本実施例では、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）やＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）等といったイメージセンサを使用する。

広域撮像装置２００は、広域撮像部２０１、及び試料載置部２０２を有する。広域撮像部２０１は、試料８の全体像の撮像を行う。試料載置部２０２は、試料８を載置するための台である。具体的に、広域撮像部２０１は、撮像素子やレンズ等から成るカメラと、載置された試料８を照明する照明部を有する。尚、試料８の照明方法として、本実施例では
、レンズの周囲に設けられるリング照明を用いた暗視野照明を行う。また、広域撮像部２０１の撮像範囲内に試料８の全体が収まるように、広域撮像部２０１、及び試料載置部２０２の位置が調整されている。

制御部３００は、制御統括部３０１、広域撮像制御部３０２、ステージ制御部３０３、照明制御部３０４、撮像制御部３０５を有する。
制御統括部３０１は、画像取得装置１の装置全体における各制御部を統合して制御する部分であり、各制御部の駆動タイミング等は制御統括部３０１により制御される。
広域撮像制御部３０２は、広域撮像部２０１に含まれる照明部や撮像素子の露出に関するＯＮ／ＯＦＦ制御を行う。また、広域撮像部２０１により撮像された試料８の画像情報を、後述するＸＹ存在範囲算出部４１０に伝送する役割を担う。

ステージ制御部３０３は、制御統括部３０１から入力されたステージ１０１の目標移動量や位置情報に基づき、ステージ１０１をＸＹ方向、及びＺ方向に移動させて、試料８の位置制御を行う。
照明制御部３０４は、照明部１０２の光源のＯＮ／ＯＦＦ制御や、絞り調整やカラーフィルタの交換等といった照明部１０２の全体を制御する。
撮像制御部３０５は、撮像部１０４に含まれる撮像素子の露出に関するＯＮ／ＯＦＦ制御や、撮像部１０４により撮像された試料８の画像情報を画像保存部６に伝送する役割を担う。尚、ステージ制御部３０３、照明制御部３０４、撮像制御部３０５は、それぞれ制御統括部３０１により、ステップ移動、及び撮像のタイミングが合うように制御される。

撮像範囲算出部４００は、ＸＹ存在範囲算出部４１０と、Ｚ撮像範囲算出部４２０を有する。また、Ｚ撮像範囲算出部４２０は、合焦位置算出部４２１と、フォーカスマップ算出部４２２と、Ｚスタック範囲算出部４２３を有する。
ＸＹ存在範囲算出部４１０は、広域撮像制御部３０２により伝送された試料８の画像情報に基づき、ＸＹ方向における試料８の存在範囲を算出する。詳細については後述するが、ＸＹ方向において試料８内で組織片８０１が存在する範囲を推定し、その範囲を存在範囲として算出する。

また、ＸＹ存在範囲算出部４１０は、算出されたＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲を複数の小区画９０１に分割する処理を行う。１つの小区画９０１は、撮像装置１００のＸＹ方向における撮像範囲９０３に対応している。撮像装置１００のＸＹ方向の撮像範囲９０３に対して、組織片８０１は広範囲に存在するために、組織片８０１の全体を撮像するには、組織片８０１の存在範囲を複数の小区画９０１に分割して撮像し、それらの画像を合成する処理が施される。
各小区画９０１におけるＸＹ位置情報については、ＸＹ存在範囲算出部４１０から制御統括部３０１に伝送される。制御統括部３０１では、各小区画９０１のＸＹ位置情報に基づき、ステージ１０１の駆動ステップ量や移動座標を算出し、ステージ制御部３０３に出力する。

合焦位置算出部４２１は、画像保存部６に蓄積された試料８の画像情報と、ステージ１０１のＸＹＺ方向に関する位置情報を対応付けて演算処理を施すことにより、組織片８０１のＺ位置、すなわち組織片８０１に対する合焦位置を算出する。詳細については後述するが、算出された合焦位置は、ステージ１０１のＸＹ位置情報と関連付けてフォーカスマップ算出部４２２へと伝送される。

フォーカスマップ算出部４２２は、合焦位置算出部４２１から伝送された試料８のＸＹ位置、及び合焦位置情報に基づき、組織片８０１に対する合焦位置情報を３次元上にプロットしたフォーカスマップ９０４を算出して作成する。また、フォーカスマップ算出部４
２２は、算出されたフォーカスマップ９０４の位置情報に基づき、各小区画９０１におけるフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量（注目区画において合焦位置が位置する光軸方向の範囲）を算出する。フォーカスマップ９０４、及びフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量の算出方法等の詳細については後述する。算出されたフォーカスマップ９０４に基づくＺ位置情報、及びフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量は、それぞれ対応する小区画９０１のＸＹ位置情報と合わせて、Ｚスタック範囲算出部４２３に伝送される。

Ｚスタック範囲算出部４２３は、入力され設定された基準となるＺスタック範囲９０５の情報と、フォーカスマップ算出部４２２から入力された情報に基づき、各小区画（注目区画）９０１におけるＺスタック範囲（光軸方向の撮像範囲）を算出する。基準となるＺスタック範囲（基準撮像範囲）９０５の情報に関して、本実施例では、試料８の組織片８０１の厚さ情報を用いている。
尚、組織片８０１の厚さ情報を入力する手段としては、以下の２つの方法を例示できる。それは、事前に測定、検出し予め既知である厚さ情報をユーザにより入力する方法（実施例１）と、画像取得装置１の装置内で組織片８０１の厚さ情報を検出する方法（実施例２）であり、詳細については後述する。

（装置プロセスについて）
図２は、本実施例の画像取得装置１による画像取得プロセスを示すフローチャート図である。
図２のステップＳ１０１では、試料８に対して広域撮像が行われる。まず、ユーザにより、試料８が試料載置部２０２に設置される。載置の際に試料８のＸＹ位置を試料載置部２０２に対して位置決めできるように突き当て部分が設けられている。また、ユーザによる手作業ではなく、試料８を収納しているカセットから自動ハンド等により試料８を搬送し、載置する方法も考えられる。図１では試料載置部２０２に試料８を載置した状態を示しているが、ステージ１０１の可動範囲を広げ、ステージ１０１上に試料８を載置した状態で広域撮像を行っても構わない。試料８の載置後に、広域撮像部２０１により、試料８全体が撮像される。

撮像終了した試料８は試料載置部２０２から回収され、次にステージ１０１への載置、及び固定が行われる。試料載置部２０２のときと同様に、ステージ１０１上で試料８は位置決めされる。また、ステージ１０１の移動時に試料８の位置ずれを抑止するために、メカ機構やバキューム等により試料８が固定される。
試料８をステージ１０１上に載置して撮像部１０４による撮像が開始されるまでの間に、図２のステップＳ１０２、Ｓ１０３が並列処理される。ステップＳ１０２では、ＸＹ存在範囲算出部４１０により、ステップＳ１０１で撮像された試料８の全体画像情報に基づき、ＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲が算出される。また、算出された組織片８０１の存在範囲を撮像範囲として処理し、組織片８０１の存在範囲を複数の小区画９０１に分割する処理がこのステップで実行される。詳細については後述する。

図２のステップＳ１０３では、ステップＳ１０２で算出された小区画９０１の位置情報に基づき、ＸＹ存在範囲算出部４１０により、組織片８０１に対する合焦位置を検出するときのＸＹ位置（検出位置）９０２が算出される。詳細については後述するが、後のステップＳ１０８で算出されるフォーカスマップ９０４の精度を上げるためにも、多くのＸＹ位置９０２において合焦位置検出を行うのが望ましい。また、後述する実施例２において、組織片８０１の厚さを検出する場合に関しても、このステップＳ１０３で組織片８０１の厚さを検出するときのＸＹ位置が算出される。

図２のステップＳ１０４では、ステップＳ１０３で算出された合焦位置を検出するときのＸＹ位置９０２と、撮像装置１００のＸＹ方向の撮像範囲９０３を一致させるようにス
テージ１０１の制御が行われる。
図２のステップＳ１０５では、撮像部１０４により試料８の画像が撮像される。組織に対する合焦位置の検出方法として、本実施例では、あるＸＹ位置に対して異なる複数のＺ位置の画像を取得し、それらの画像情報から合焦位置を推定する方法を用いる。詳細については後述するが、ステージ１０１をステージ制御部３０３によりＺ方向に一定量ずつステップ移動するように制御し、移動と撮像を繰り返して画像の取得を行う。

ところで、組織片８０１を試料８内に封入する封入剤８０４の厚さは数十〜数百μｍであり、それに対して組織片８０１の厚みは４〜８μｍ程度と非常に範囲が狭く、組織片８０１のＺ位置検出に時間がかかってしまう。一方で、試料８内のスライドグラス８０２の厚み誤差も０．３ｍｍ程度と組織片８０１に対して非常に大きく、サンプル毎に組織片８０１のＺ位置が大きく異なってしまい、やはりＺ位置検出に時間がかかってしまう。そのため、例えば、試料８に含まれるスライドグラス８０２やカバーグラス８０３のＺ位置をレーザ変位計等で別途計測する方法を用いるとよい。その場合、計測結果に基づきステージ１０１のＺ位置を制御し、スライドグラス８０２の表面やカバーグラス８０３の裏面のＺ位置に撮像部１０４のＺ方向における撮像範囲を合わせる方法が考えられる。それにより、組織片８０１のＺ位置検出の時間を短縮することができる。

図２のステップＳ１０６では、合焦位置算出部４２１により、ステップＳ１０５で撮像された画像情報に基づき、組織片８０１のＺ位置を合焦位置として算出される。合焦位置の算出方法の詳細については後述するが、撮像された複数の画像のコントラストの評価値から合焦位置を算出する。
図２のステップＳ１０７では、組織片８０１に対する合焦位置を検出する次のＸＹ位置９０２に移動するかどうかの判断が行われる。次のＸＹ位置９０２が存在する場合、図２のステップＳ１０４に戻り、ステージ１０１の位置制御が行われる。指定した全てのＸＹ位置９０２で組織片８０１に対する合焦位置の検出が終了した場合、図２のステップＳ１０８に移る。また、ステップＳ１０８、及びステップＳ１０９の処理と並列してステップＳ１１０のステージ１０１の位置制御を行っても構わない。

組織片８０１のＺ位置の検出方法として、ステージ１０１をＺ方向にステップ移動して撮像を行う方法を述べたが、それに限定されるものではない。例えば、図１の撮像装置１００において、あるＸＹ位置に対して異なる複数のＺ位置を同時に撮像できるような構成にすれば、ステージ１０１のＺ方向におけるステップ移動は不要になる。その方法として、例えば、対物レンズ１０３上の光路をハーフミラーやビームスプリッタ等により複数に分割し、それぞれの光路で異なるＺ位置に対して結像するように複数の撮像部１０４を配置する方法が考えられる。また、その構成を利用し、異なるＺ位置を撮像する複数の撮像素子の画像を比較することで、撮像するＸＹ位置に対して常に組織片８０１のＺ位置、すなわち合焦位置がどこに存在するか推定することができる。これにより、例えば、試料８をＸＹ方向にスキャン撮像し、同時に組織片８０１のＺ位置を追いながらステージ１０１のＺ位置を補正することで、組織片８０１のＺ位置の検出精度は下がってしまう可能性はあるが、高速に検出することができる。

図２のステップＳ１０８では、フォーカスマップ算出部４２２により、ステップＳ１０６で算出された組織片８０１に対する合焦位置情報に基づき、フォーカスマップ９０４が算出される。詳細については後述するが、図２のステップＳ１０２で算出された複数の箇所における各小区画９０１に対して合焦位置が算出され、それをマッピングすることで、組織片８０１の全体に対してフォーカスマップ９０４が算出される。また、同時にステップＳ１０８では、各小区画９０１におけるフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量が算出される。これについても詳細については後述する。

図２のステップＳ１０９では、Ｚスタック範囲算出部４２３により、各小区画９０１におけるＺスタック範囲が算出される。詳細については後述するが、本実施例では、ユーザによる入力値、又は組織片８０１の厚さ情報が、制御統括部３０１を介してＺスタック範囲算出部４２３に、基準となるＺスタック範囲９０５として入力され設定される。一方で、実施例２においては、合焦位置算出部４２１で算出された組織片８０１の厚さ情報が基準となるＺスタック範囲９０５として入力される。この基準となるＺスタック範囲９０５と、フォーカスマップ算出部４２２により伝送されたフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量に基づき、各小区画９０１におけるＺスタック範囲が算出される。

図２のステップＳ１１０では、撮像対象となる小区画９０１におけるＸＹ位置情報、及びフォーカスマップ９０４の情報に基づき、ステージ１０１の位置制御が行われる。撮像対象となる小区画９０１のＸＹ位置、及び合焦位置が撮像装置１００の撮像範囲９０３と一致するようにステージ１０１はステージ制御部３０３により位置制御される。
図２のステップＳ１１１では、撮像対象となる小区画９０１におけるＺスタック範囲情報に基づき、ステージ１０１をＺ方向に一定量ずつステップ移動しながら撮像部１０４による撮像が行われる。

撮像終了後に図２のステップＳ１１２では、次の小区画９０１に移動するかどうかの判断が行われる。次の小区画９０１が存在する場合、図２のステップＳ１１０に戻り、次の小区画９０１に対してステージ１０１が位置制御される。全ての小区画９０１での撮像が終了した場合、その試料８の撮像が終了になり、次の試料８が存在する場合には試料８が交換されて次の試料８の処理に移る。

（ＸＹ存在範囲の算出方法について）
図３は、本実施例の画像取得装置１におけるＸＹ存在範囲の算出方法を示す概略図である。図３は、試料８の組織片８０１を複数の小区画９０１に分割した様子を示す。
まず、広域撮像部２０１により、試料８の全体像が撮像される。撮像した画像に基づいて、ＸＹ存在範囲算出部４１０により、ＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲が算出される。

ＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲の算出方法として、本実施例では、次のような方法を採用している。それは、試料８の画像情報のコントラストの評価値に基づくもので、コントラストの高い範囲を組織片８０１の存在範囲として決定するものである。高コントラスト範囲の特定方法としては、試料８の画像情報に対して２値化処理を行い判別する。試料８内の細胞や組織片等は周囲の封入剤８０４と区別するために、染色されているのが一般的である。そのため、高コントラスト範囲を組織片８０１の存在範囲とすることができる。稀に、試料８にゴミや埃等が付着しており、それを組織片の存在範囲として特定してしまうことが考えられるが、そのような場合には、試料８の全体像の画像情報からゴミや埃のエッジ部分を抽出し、それを撮像対象としないプログラムを施すとよい。

次に、算出したＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲情報に基づき、ＸＹ存在範囲算出部４１０により、組織片８０１の存在範囲が複数の小区画９０１に分割される。組織片８０１の存在範囲を複数の小区画９０１に分割する処理については、ステージ１０１の位置決め精度や、隣接画像同士をスティッチングして画像合成することを考慮して、隣接画像間に重複領域を設けるのが望ましい。

（合焦位置を検出するＸＹ位置の算出方法について）
図４は、本実施例の画像取得装置１における合焦位置を検出するＸＹ位置の算出方法を示す概略図である。図４（ａ）、図４（ｂ）は、組織片８０１に対する合焦位置を検出するＸＹ位置９０２をそれぞれ示している。どちらの場合も、算出した小区画９０１の位置
情報に基づいて、合焦位置を検出するＸＹ位置９０２を算出している。
図４（ａ）は、分割した各小区画９０１における中心位置を、合焦位置を検出するＸＹ位置９０２としており、図４（ｂ）は、分割した各小区画９０１における格子状の交点を、合焦位置を検出するＸＹ位置９０２としている。

ここで、ＸＹ位置９０２は、図４（ａ）、図４（ｂ）のような２パターンに限定されるものではない。ＸＹ位置９０２は、ＸＹ方向における組織片８０１の存在範囲上に、少なくとも１箇所設けられるものであればよいが、より多くの小区画９０１の位置で合焦位置を検出した方が、後述するフォーカスマップ９０４の高精度化に繋がる。しかし、時間短縮のために、複数の小区画９０１のうち所定間隔毎に位置する小区画９０１に対して、組織片８０１に対する合焦位置を検出するものであるとよい。図４（ａ）、図４（ｂ）の場合は、小区画９０１を１つおきに間引いて合焦位置のＸＹ位置９０２を決定している。
また、合焦位置の検出に用いる撮像部１０４の撮像素子の画素数として、多い方が精度の観点より良いが、後述する合焦位置の演算時に時間がかかってしまうために、必要最小限に抑えるのが望ましい。その方法として、合焦位置の演算時に対象となる画素を選択するか、或いは、合焦位置の検出時において、ＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）撮像により画素を指定して撮像する方法等が考えられる。

（合焦位置の検出、及び算出方法について）
図５は、本実施例の画像取得装置１における合焦位置の検出方法を示す概略図である。図４で算出された合焦位置を検出するＸＹ位置９０２に基づき、合焦位置の検出を行う。図５に示すように、一般的に組織片８０１の厚さに対して撮像装置１００のＺ方向における撮像範囲９０３、すなわち被写界深度は狭い。そのため、撮像装置１００により、それぞれ異なる複数のＺ位置を撮像して、それらの画像のコントラストの評価値に基づき、組織片８０１のＺ位置を算出し、その位置を組織片８０１に対する合焦位置とする方法を用いる。尚、複数のＺ位置を撮像する際のＺ方向の撮像範囲９０３の間隔に関しては、組織片８０１の厚さよりも小さく設定しておくのが望ましい。想定する組織片８０１の厚さが４〜８μｍ程度であるために、ステージ１０１のＺ方向におけるステップ量はそれ以下に設定される。

図６は、本実施例の画像取得装置１における合焦位置の算出方法を示す概略図である。組織片８０１に対する合焦位置の算出方法として、具体的には、合焦位置算出部４２１により、試料８を撮像した画像のコントラストの評価値を用いて合焦位置を推定する。
本実施例では、図６に示すように、それぞれ異なる複数のＺ位置で撮像された各画像のコントラストの評価値を補間することで、Ｚ方向に対する位置、並びにコントラストの評価値を２軸とした評価関数を作成して推定する。図６では、ステージ１０１に対するＺ位置であるＺＡ、ＺＢ、及びＺＣの３箇所で撮像した画像から算出する例を示している。この場合、作成した評価関数の最大値、或いは、予め設定した閾値以上の範囲を組織片８０１に対する合焦位置として求めることができる。尚、本実施例では、コントラストの評価値として画像情報の輝度の分散値を用いるが、それに限定されるものではなく、例えば、ブレナー関数による画像の微分値を用いる方法も考えられる。

また、算出したコントラストの評価関数から最大値が算出できない等、組織片８０１に対する合焦位置が算出できない場合が考えられる。その場合、例えば、ステージ１０１のＺ方向におけるステップ量を小さくして再検出を行うか、或いは隣接するＸＹ位置に対して検出を行う等の方法が考えられる。
尚、後述する実施例２において、組織片８０１の厚さの検出、及び算出に関しても、同様の方法で求めることができる。

（フォーカスマップの算出方法について）
図７は、本実施例の画像取得装置１におけるフォーカスマップの算出方法を示す概略図である。図６で算出された組織片８０１に対する合焦位置情報に基づき、フォーカスマップ算出部４２２により、組織片８０１の全体における合焦位置を示すフォーカスマップ９０４が算出される。
図３では組織片８０１と小区画９０１の位置関係を２次元的に示したが、図７（ａ）では、組織片８０１と小区画９０１の位置関係を３次元的に示している。また、図７（ｂ）は、合焦位置を検出するＸＹ位置Ｐ１〜Ｐ１２に対して算出した合焦位置Ｚ１〜Ｚ１２を、小区画９０１が示された３次元上にプロットし、それらを補間したフォーカスマップ９０４を示す概略図である。図７（ｂ）の場合、合焦位置を検出するＸＹ位置９０２を各小区画における格子状の交点上に設けているが、それに限定されるものではない。

図７（ｃ）は、算出したフォーカスマップ９０４に基づき、注目する小区画９０１Ａに対応するフォーカスマップ９０４Ａを示した概略図である。合焦位置を直接検出していないＸＹ位置Ｐ４５、Ｐ４７、Ｐ４８における合焦位置Ｚ４５、Ｚ４７、Ｚ４８に関しては、隣接するＸＹ位置における合焦位置情報を補間して算出される。
このようにして、フォーカスマップ９０４の位置情報により、各小区画９０１における合焦位置を求めることができる。

（Ｚスタック範囲の算出方法について）
図８は、本実施例の画像取得装置１におけるＺスタック範囲の算出方法を示す概略図である。図７で算出された各小区画９０１に対するフォーカスマップ９０４の位置情報に基づき、Ｚスタック範囲算出部４２３により、各小区画９０１におけるＺスタック範囲が算出され決定される。図８では、図７（ｃ）において注目する小区画９０１Ａに対応するフォーカスマップ９０４Ａのみを示しており、また、フォーカスマップ９０４Ａの範囲内で、Ｚ位置の最大値を合焦位置Ｚ４８で示し、Ｚ位置の最小値を合焦位置Ｚ４で示している。この合焦位置Ｚ４８、Ｚ４間におけるＺ位置の差ΔＺ（フォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量）を算出することにより、Ｚスタック範囲の変化量を算出することができる。

撮像装置１００の被写界深度は、対物レンズ１０３の性能で決まっていることから、算出されたＺ位置の差ΔＺと被写界深度情報に基づき、Ｚスタックに必要な撮像枚数の変化量を算出することができる。また、基準となるＺスタック範囲９０５は組織片８０１の厚さ情報から既に決定しているため、各小区画９０１におけるフォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量に応じて、Ｚスタックに必要な撮像枚数（撮像する回数）を変更すれば良い。
これにより、各小区画９０１に対してＺスタックに必要な撮像枚数を決定することができるため、より最適、且つ精度良く組織片８０１のＺスタック画像（Ｚスタックで撮像された複数層の画像）を撮像することができる。

図９は、本実施例の画像取得装置１におけるＺスタック範囲の変更方法を示す概略図である。図９（ａ）は、各小区画９０１において、Ｚスタック範囲を変えずに撮像する様子を示しており、従来例に対応する。一方で、図９（ｂ）は、各小区画９０１において、フォーカスマップ９０４のＺ位置の変化量に応じてＺスタック範囲を変更しており、本実施例に対応する。

組織片８０１のうねり量が大きくなると、図９（ａ）の場合では、Ｚスタック範囲が常に一定であるため、撮像できない組織片８０１の範囲が存在してしまう。一方で、図９（ｂ）の場合では、フォーカスマップ９０４のＺ位置の差ΔＺに基づき、Ｚスタックに必要な撮像枚数を変更しているため、Ｚ方向における組織片８０１の存在範囲を全て撮像することができる。

ここで、図９についてさらに詳しく説明する。
図９では、撮像範囲９０３が１つの層として示され、基準となるＺスタック範囲９０５が、Ｚ方向に関して、撮像範囲９０３の層を５つ重ね合わせた５層分の範囲として示されている。そして、図９（ｂ）では、基準となるＺスタック範囲９０５の５層の上側に、Ｚ位置の差ΔＺに対応して撮像範囲９０３の層が３層分、追加された状態が示されている。
このように、図９（ｂ）では、Ｚ位置の差ΔＺに対応して、Ｚスタック範囲を５層から８層に変更することにより、Ｚ方向における組織片８０１の存在範囲を全て撮像することができる。

尚、図９（ａ）、図９（ｂ）のどちらの場合も、組織片８０１の表面における合焦位置を検出し、検出した合焦位置に基づきフォーカスマップ９０４を算出しているが、合焦位置の検出は組織片８０１の表面に限るものではない。すなわち、フォーカスマップ９０４は、組織片８０１に対する合焦位置を示すものであれば良い。
例えば、組織片８０１のＺ方向の中心領域において、組織片８０１に対する合焦位置を検出するものであってもよい。このような場合には、Ｚ位置の差ΔＺに対応する撮像範囲９０３の層に対して、基準となるＺスタック範囲９０５に対応する層が上下に分かれてそれぞれ追加されるものであるとよい。例えば、基準となるＺスタック範囲９０５の層を６層とすると、その半分の３層が、Ｚ位置の差ΔＺに対応する撮像範囲９０３の層に対して上下にそれぞれ追加されるとよい。
また、基準となるＺスタック範囲９０５は、組織片８０１の厚さ情報に対して所定の係数を乗じて決定されるものであってもよい。

以上説明したように、本実施例では、基準となるＺスタック範囲９０５と、フォーカスマップ算出部４２２により算出された合焦位置の範囲とに基づき、各小区画９０１におけるＺスタック範囲を区画ごとに決定している。
これにより、凹凸やうねりを有する組織片８０１に対して、光軸方向における組織片８０１の断面像を高速且つ確実に取得することが可能となる。

［実施例２］
以下に、実施例２について説明する。なお、実施例１と同様の構成部分については同一の符号を付して、その説明は省略する。
（装置構成について）
図１０は、本実施例の画像取得装置１のシステム構成を示す概略図である。実施例１では、組織片８０１の厚さ情報をユーザ入力していたが、実施例２の場合、画像取得装置１において組織片８０１の厚さを検出する処理が行われる。組織片８０１の厚さ検出については、合焦位置算出部４２１により、組織片８０１に対する合焦位置の検出と同様な方法で実行される。合焦位置算出部４２１により算出された組織片８０１の厚さ情報は、Ｚスタック範囲算出部４２３へと伝送され、その厚さ情報が基準となるＺスタック範囲９０５として処理される。

（装置プロセスについて）
図１１は、本実施例の画像取得装置１による画像取得プロセスを示すフローチャート図である。
図１１のステップＳ１０１〜Ｓ１０４までは、実施例１における図２のステップＳ１０１〜Ｓ１０４と同処理である。図１１のフローチャートには、実施例１の場合と異なり、ステップＳ１０４の次のステップにおいて、組織片８０１の厚さを検出する処理が含まれている。
すなわち、図１１のステップＳ１１３では、組織片８０１の厚さを検出するかどうかの判断が行われる。

ステップＳ１１３で肯定判定の場合は、ステップＳ１０５ａを介してステップＳ１１４に進み、組織片８０１に対する合焦位置の検出と同時に、組織片８０１の厚さの検出が行われ、その後、ステップＳ１０７へ進む。組織片８０１の厚さの検出、及び算出方法の詳細については後述する。ステップＳ１１３で否定判定の場合は、ステップＳ１０５ｂ、ステップＳ１０６、ステップＳ１０７と順に進む。なお、ステップＳ１０５ａ、ステップＳ１０５ｂの処理は、図２のステップＳ１０５と同処理である。
それ以降の処理に関しては、実施例１と同様であるために説明を省略する。

（厚さの検出、及び算出方法について）
次に、本実施例の画像取得装置１による組織片８０１の厚さの検出、及び算出方法について説明する。まず、組織片８０１の厚さを検出するＸＹ位置については、図４（ａ）、図４（ｂ）に示す合焦位置を検出するＸＹ位置９０２と同じ位置になる。しかし、一般的に組織片８０１は殆ど均等にスライスされているため、組織片８０１内での厚さムラは非常に小さい。そのため、合焦位置を検出するＸＹ位置９０２と比較すると、厚さを検出するＸＹ位置は少なくても良く、組織片８０１の存在範囲内における少なくとも１箇所のＸＹ位置で検出するものであればよい。組織片８０１の存在範囲内における少なくとも１箇所のＸＹ位置で、組織片８０１の厚さが検出された後に行われる画像取得プロセスにおいては、この厚さを用いることができるので、ステップＳ１１３では否定判定となる。

図１２は、本実施例の画像取得装置１による組織片８０１の厚さの算出方法を示す概略図である。組織片８０１に対する合焦位置を検出する場合と同様に、合焦位置算出部４２１により、それぞれ異なる複数のＺ位置の画像情報から算出されたコントラストの評価関数を用いて、組織片８０１の厚さが算出される。図１２は、図６を用いて説明した実施例１同様に、異なる複数のＺ位置ＺＡ、ＺＢ、及びＺＣの３箇所で撮像した画像から評価関数を算出した様子を示している。組織片８０１の厚さの算出方法としては、図１２のグラフ上における予め設定した閾値以上の範囲を組織片８０１の厚さとして推定する方法を用いる。また、厚さを検出する際に用いる異なるＺ位置の画像の取得間隔については、合焦位置の検出のときよりも狭くした状態でステップ撮像するのが望ましい。これにより、画像取得装置１を用いて組織片８０１の厚さの検出、及び算出を行うことができる。

本実施例においても、実施例１で説明した効果と同様の効果が得られる。
ここで、本実施例では、上述のように、組織片８０１に対する合焦位置を検出する場合と同様に、合焦位置算出部４２１により組織片８０１の厚さを算出するものであったが、それに限るものではない。組織片８０１の厚さを検出する厚さ検出手段が、画像取得装置１に別途設けられるものであってもよい。

［実施例３］
以下に、実施例３について説明する。なお、実施例１、２と同様の構成部分については同一の符号を付して、その説明は省略する。
（装置構成について）
本実施例の画像取得装置１は、実施例２で説明した図１０に示す画像取得装置１と同様に構成されている。
図１０において、実施例２の場合では、合焦位置算出部４２１により算出された組織片８０１の厚さ情報をＺスタック範囲算出部４２３に伝送し、基準となるＺスタック範囲９０５を算出していた。
それに対して、本実施例では、Ｚスタック範囲算出部４２３により算出された各小区画９０１におけるＺスタック範囲に基づき、撮像装置１００により実際に撮像した後の処理方法が異なる。本実施例では、撮像装置１００により撮像された画像情報に基づき、次に撮像する小区画９０１におけるＺスタック範囲の補正が行われる。

（装置プロセス、及びＺスタック範囲の補正方法について）
図１３は、本実施例の画像取得装置１による画像取得プロセスを示すフローチャート図である。
本実施例では、実施例１、２の場合と異なり、Ｚスタック画像から組織片８０１に対する合焦範囲を算出し、それに基づき次の小区画９０１におけるＺスタック範囲を補正する処理が施される。図１３のステップＳ１０１〜Ｓ１１２については、図２のステップＳ１０１〜Ｓ１１２の処理と同様であるので説明を省略する。

図１３のステップＳ１１５では、ある小区画９０１において実際にＺスタックを行い、取得した画像情報から組織片８０１に対する合焦範囲の算出が行われる。このとき、合焦位置算出部４２１により、実施例１、２で説明した組織片８０１に対する合焦位置、及び組織片８０１の厚さの算出と同様な方法で、組織片８０１に対する合焦範囲、すなわちＺ方向における組織片８０１の存在範囲が再算出される。

ここで、ステップＳ１０９で設定されるＺスタック範囲は、フォーカスマップ９０４に基づくものであるため、実際に組織片８０１が位置する範囲に対して、ずれてしまうことが懸念される。
Ｚスタック画像は、一般に、被写界深度以下の間隔でＺ方向にステップ移動して撮像するために、精度良く組織片８０１に対する合焦範囲を算出することができる。
本実施例では、ステップＳ１０９でＺスタック範囲算出部４２３により算出されたＺスタック範囲に対して、実際にＺスタックを行うことで取得した画像情報から算出した組織片８０１に対する合焦範囲情報を反映させている。
すなわち、ステップＳ１１５では、ステップＳ１０９で設定したＺスタック範囲を補正する処理を行う。この補正処理は、例えば、ステップＳ１０９で設定したＺスタック範囲を上に移動したり、下に移動したり、Ｚスタック範囲を広げたり（撮像範囲９０３の層を追加したり）する処理である。
なお、本実施例においては、ステップＳ１１５で、次に撮像する小区画におけるＺスタック範囲の補正を行うものであるが、これに限らず、実際にＺスタックを行った小区画自体に対して補正を行うものであってもよい。

このように本実施例によれば、次に撮像する小区画９０１におけるＺスタックの精度を、実施例１、２よりも向上させることができる。
ここで、稀に組織片８０１が試料８内で折れ曲がっていたり、或いは重なってしまっていることがある。その際に、実施例１、２のように、フォーカスマップ９０４の変化量情報のみを用いてＺスタック範囲を算出方法では対応できない場合がある。
本実施例のように、実際にＺスタックした画像からＺスタック範囲を補正することにより、このようなイレギュラーな試料８に対しても対応することができる。

（その他の実施例）
本発明は、上述の実施形態の１以上の機能を実現するプログラムを、ネットワーク又は記憶媒体を介してシステム又は装置に供給し、そのシステム又は装置のコンピュータにおける１つ以上のプロセッサーがプログラムを読出し実行する処理でも実現可能である。また、１以上の機能を実現する回路（例えば、ＡＳＩＣ）によっても実現可能である。

１…画像取得装置、１００…撮像装置、３００…制御部、３０１…制御統括部、４２１…合焦位置算出部、４２２…フォーカスマップ算出部、４２３…Ｚスタック範囲算出部、８０１…組織片、９０１…小区画、９０４…フォーカスマップ

Claims (9)

1. 被写体を複数の区画に分け、各区画に対して光軸方向の撮像範囲内で光軸方向の焦点位置を変えながら撮像手段で被写体を複数回撮像することにより、前記被写体内の複数のレイヤーの画像を取得する画像取得装置であって、
   被写体の複数の検出位置について光軸方向の合焦位置をそれぞれ検出する検出手段と、
   前記検出手段により検出された複数の検出位置における合焦位置からフォーカスマップを作成する作成手段と、
   前記作成手段により作成されたフォーカスマップから、注目区画において合焦位置が位置する光軸方向の範囲を算出する算出手段と、
   光軸方向の撮像範囲の基準となる基準撮像範囲を設定する設定手段と、
   前記設定手段により設定された基準撮像範囲と、前記算出手段により算出された合焦位置の範囲とに基づいて、光軸方向の撮像範囲を区画ごとに決定する決定手段と、
   を有することを特徴とする画像取得装置。
2. 前記決定手段により決定された光軸方向の撮像範囲と、前記撮像手段の被写界深度と、に基づいて、各区画において被写体を撮像する回数が決定されることを特徴とする請求項１に記載の画像取得装置。
3. 注目区画を撮像した後に引き続き、次の区画の撮像が行われる場合、前記次の区画に対して前記決定手段により決定された光軸方向の撮像範囲を、前記注目区画に対して撮像が行われることで得られた画像情報を用いて補正することを特徴とする請求項１又は２に記載の画像取得装置。
4. 前記設定手段は、被写体の厚さ情報に基づき、前記基準撮像範囲を設定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の画像取得装置。
5. 被写体の厚さを検出する厚さ検出手段を有し、
   前記設定手段は、前記厚さ検出手段により検出された被写体の厚さに基づき、前記基準撮像範囲を設定する
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の画像取得装置。
6. 前記厚さ検出手段は、前記撮像手段により撮像された画像の輝度に関する情報に基づいて、被写体の厚さ検出することを特徴とする請求項５に記載の画像取得装置。
7. 前記検出手段は、前記撮像手段により撮像された画像の輝度に関する情報に基づいて、被写体の合焦位置を検出することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の画像取得装置。
8. 被写体を複数の区画に分け、各区画に対して光軸方向の撮像範囲内で光軸方向の焦点位置を変えながら撮像手段で被写体を複数回撮像することにより、前記被写体内の複数のレイヤーの画像を取得する画像取得方法であって、
   コンピュータが、被写体の複数の検出位置について光軸方向の合焦位置をそれぞれ検出するステップと、
   コンピュータが、検出された複数の検出位置における合焦位置からフォーカスマップを作成するステップと、
   コンピュータが、作成されたフォーカスマップから、注目区画において合焦位置が位置する光軸方向の範囲を算出するステップと、
   コンピュータが、光軸方向の撮像範囲の基準となる基準撮像範囲を設定するステップと、
   コンピュータが、設定された基準撮像範囲と、算出された合焦位置の範囲とに基づいて、光軸方向の撮像範囲を区画ごとに決定するステップと、
   を含むことを特徴とする画像取得方法。
9. 請求項８に記載の画像取得方法の各ステップをコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。

Images