JP5923026B2 - 画像取得装置及び画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料等の画像取得に用いられる画像取得装置及びその画像取得方法に関する。

画像取得装置として、例えば試料の撮像領域を予め複数の領域に分割し、各分割領域を高倍率で撮像した後、これらを合成するバーチャル顕微鏡装置がある。このようなバーチャル顕微鏡での画像取得では、従来、生体サンプルなどの試料の画像を取得する際の撮像条件として、試料の全領域を対象とする焦点マップが設定され、焦点マップに基づく焦点制御を行いつつ試料の画像取得が行われている。

焦点マップの作成には、まず、マクロ光学系を備える画像取得装置を用い、試料全体をマクロ画像として取得する。次に、取得したマクロ画像を用い、試料の撮像範囲を設定すると共に、撮像範囲を複数の分割領域に分割し、各分割領域に対して焦点取得位置を設定する。焦点取得位置の設定の後、ミクロ光学系を備える画像取得装置に試料を移し、設定された焦点取得位置における焦点位置を取得し、これらの焦点位置から焦点マップを作成する。

しかしながら、このような焦点マップを作成するにあたっては、処理に時間を要するという問題があった。また、取得する焦点の間隔や数を抑えれば処理に要する時間は短縮されるが、その場合にはフォーカス精度が低下するという問題があった。そのため、焦点位置を取得しつつ試料の高倍率画像を取得するダイナミックフォーカスの開発が進められている。この方式は、画像取得用の撮像装置に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）との光強度差或いはコントラスト差に基づいて現在の対物レンズの高さに対する焦点位置のずれ方向を検出し、ずれをキャンセルする方向に対物レンズを移動させて画像を取得する方式である（例えば特許文献１参照）。

他方、ダイナミックフォーカスを用いない従来のバーチャル顕微鏡において、厚みのある試料に対する焦点位置の異なる複数のＺ平面画像（図１６において破線で示す位置で焦点の合う平面の画像）のセット（Ｚスタック画像）を取得する方式がある。例えば、下記特許文献２では、対物レンズを試料台に対して相対的に移動（例えば、Ｚ平面レベルを下方へと進行）させることで、Ｚスタック画像を取得する方式が開示されている。

特開２０１１−０８１２１１号公報 特開２００８−５００６４３号公報

上述した特許文献２のように対物レンズを試料台に対して相対的に移動させてＺスタックを取得するには、焦点マップなどの対物レンズの基準位置の情報が必要となる。しかしながら、ダイナミックフォーカスでは焦点マップを取得しないため、このような対物レンズの基準位置の情報を持たない。したがって、ダイナミックフォーカスを用いる場合には、単純に対物レンズを試料台に対して相対的に移動させる方法を採用してＺスタック画像を取得することは困難である。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、ダイナミックフォーカスによる画像取得を行う場合に、Ｚスタック画像を容易に取得できる画像取得装置及びその画像取得方法を提供することを目的とする。

上記課題の解決のため、本発明に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、所定の目標焦点間隔に基づいて第１の光路と第２の光路との光路長差を変更する光路長差変更手段と、を備え、光路長差変更手段が上記光路長差を変更するごとに、焦点制御手段が上記焦点位置を制御しながらステージ制御手段がステージを走査して、第１の撮像手段が第１の画像を取得することにより、試料の深さ方向における複数の第１の画像からなるＺスタック画像を取得することを特徴としている。

この画像取得装置では、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更する光路長差変更手段を備えている。第１の撮像手段による撮像の焦点位置は、光路長差変更手段により変更される上記光路長差に応じて試料の深さ方向に変化（移動）する。したがって、光路長差変更手段が所定の目標焦点間隔に基づいて上記光路長差を変更するごとに、焦点制御手段が第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御しながらステージ制御手段がステージを走査して、第１の撮像手段が第１の画像を取得することにより、上記光路長差の変更に応じた試料の深さ方向における第１の画像からなるＺスタック画像を容易に取得できる。なお、この手法では、上記光路長差を変更した上で焦点制御手段によるダイナミックフォーカスが実施されることにより、試料をステージ面と平行なＸＹ平面で切った画像ではなく試料の表面形状（起伏）と略相似する曲面に沿って切った画像からなるＺスタック画像が得られる。

また、光路長差変更手段は、下記式（１）により算出される移動距離に基づいて、第２の撮像手段を第２の光路の光軸方向に沿って移動させてもよい。このように、下記式（１）に基づいて第２の撮像手段を移動させることにより、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

また、光路長差変更手段は、下記式（２）により算出される移動距離に基づいて、第１の撮像手段を第１の光路の光軸方向に沿って移動させてもよい。このように、下記式（２）に基づいて第１の撮像手段を移動させることによっても、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

移動距離＝所定の目標焦点間隔×（第２の光路における光学倍率の２乗）・・・（１）
移動距離＝所定の目標焦点間隔×（第１の光路における光学倍率の２乗）・・・（２）

また、第２の撮像手段の撮像面に、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、第２の光路に配置され、撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有し、撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を更に備え、光路長差変更手段は、領域制御手段に、撮像面の面内方向に対する上記厚さの変化の割合と所定の目標焦点間隔とに基づいて第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定位置を変更させてもよい。このように第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定位置を変更することによっても、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

また、本発明に係る画像取得方法は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、所定の目標焦点間隔に基づいて第１の光路と第２の光路との光路長差を変更する光路長差変更手段と、を備えた画像取得装置による画像取得方法であって、光路長差変更手段によって上記光路長差を変更するごとに、焦点制御手段によって上記焦点位置を制御しながらステージ制御手段によってステージを走査して、第１の撮像手段によって第１の画像を取得することにより、試料の深さ方向における複数の第１の画像からなるＺスタック画像を取得することを特徴としている。

この画像取得方法では、変更される第１の光路と第２の光路との光路長差に応じて第１の撮像手段による撮像の焦点位置が試料の深さ方向に変化（移動）することを利用して、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更するごとに、第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御しながらステージを走査して、第１の撮像手段によって第１の画像を取得する。これにより、上記光路長差の変更に応じた試料の深さ方向における複数の第１の画像からなるＺスタック画像を容易に取得できる。なお、この手法では、上記光路長差を変更するごとにダイナミックフォーカスを実施することにより、試料をステージ面と平行なＸＹ平面で切った画像ではなく試料の表面形状（起伏）と略相似する曲面に沿って切った画像からなるＺスタック画像が得られる。

また、光路長差変更手段によって、下記式（１）により算出される移動距離に基づいて、第２の撮像手段を第２の光路の光軸方向に沿って移動させてもよい。このように、下記式（１）に基づいて第２の撮像手段を移動させることにより、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

また、光路長差変更手段によって、下記式（２）により算出される移動距離に基づいて、第１の撮像手段を第１の光路の光軸方向に沿って移動させてもよい。このように、下記式（２）に基づいて第１の撮像手段を移動させることによっても、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

移動距離＝所定の目標焦点間隔×（第２の光路における光学倍率の２乗）・・・（１）
移動距離＝所定の目標焦点間隔×（第１の光路における光学倍率の２乗）・・・（２）

また、画像取得装置が、第２の撮像手段の撮像面に、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、第２の光路に配置され、撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有し、撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を更に備え、領域制御手段によって、撮像面の面内方向に対する上記厚さの変化の割合と所定の目標焦点間隔とに基づいて第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定位置を変更してもよい。このように第１の撮像領域及び第２の撮像領域の設定位置を変更することによっても、第１の光路と第２の光路との光路長差を変更し、所定の目標焦点間隔ごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

本発明によれば、ダイナミックフォーカスによる画像取得を行う場合に、Ｚスタック画像を容易に取得できる。

本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 第２の撮像装置を示す図である。 光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの一例を示す図である。 第２の撮像装置の撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する光路差生成部材の例を示す図である。 画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離に一致している場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも長い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも短い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 ステージの走査時間に対する対物レンズとステージとの距離の関係を示す図である。 ステージ制御部によるステージの走査方向の制御を示す図である。 ステージ制御部によるステージの走査速度の制御を示す図である。 本発明の一実施形態に係る画像取得装置により取得されるＺスタック画像を説明するために用いる図である。 第１の撮像領域及び第２の撮像領域の位置を移動させることにより第１の光路と第２の光路との光路長差を変更する方法を説明するために用いる図である。 本発明の一実施形態に係る画像取得装置の動作を示すフローチャートである。 従来の画像取得装置により取得されるＺスタック画像を説明するために用いる図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置及びその画像取得方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。また、図２は、本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。図１及び図２に示すように、画像取得装置Ｍは、試料Ｓのマクロ画像を取得するマクロ画像取得装置Ｍ１と、試料Ｓのミクロ画像を取得するミクロ画像取得装置Ｍ２とによって構成されている。画像取得装置Ｍは、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得したマクロ画像に対して例えばライン状の複数の分割領域４０（図１１参照）を設定し、各分割領域４０をミクロ画像取得装置Ｍ２で高倍率に取得して合成することにより、バーチャルマイクロ画像を生成する装置である。

マクロ画像取得装置Ｍ１は、図１に示すように、試料Ｓが載置されるステージ１を備えている。ステージ１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータによって水平方向に駆動するＸＹステージである。画像取得装置Ｍで観察する試料Ｓは、例えば細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ１に載置される。このステージ１をＸＹ面内で駆動させることにより、試料Ｓに対する撮像位置を移動させることができる。

ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１とミクロ画像取得装置Ｍ２との間を往復可能となっており、両装置間で試料Ｓを搬送する機能を有している。なお、マクロ画像取得においては、試料Ｓの全体画像を１度の撮像で取得してもよく、試料Ｓを複数の領域に分割して撮像してもよい。また、ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１及びミクロ画像取得装置Ｍ２の双方にそれぞれ設けておいてもよい。

ステージ１の底面側には、試料Ｓに向けて光を照射する光源２と、光源２からの光を試料Ｓに集光する集光レンズ３とが配置されている。光源２は、試料Ｓに向けて斜めに光を照射するように配置されていてもよい。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系４と、試料Ｓの光像を撮像する撮像装置５とが配置されている。導光光学系４は、試料Ｓからの光像を撮像装置５の撮像面に結像させる結像レンズ６を有している。また、撮像装置５は、例えば２次元画像を取得可能なエリアセンサである。撮像装置５は、導光光学系４を経て撮像面に入射した試料Ｓの光像の全体画像を取得し、後述のバーチャルマイクロ画像格納部３９に格納する。

ミクロ画像取得装置Ｍ２は、図２に示すように、ステージ１の底面側にマクロ画像取得装置Ｍ１と同様の光源１２及び集光レンズ１３を有している。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系１４が配置されている。光源１２からの光を試料Ｓに照射させる光学系には、試料Ｓに励起光を照射するための励起光照射光学系や試料Ｓの暗視野画像を取得するための暗視野照明光学系を採用してもよい。

導光光学系４は、試料Ｓと対峙して配置された対物レンズ１５と、対物レンズ１５の後段に配置されたビームスプリッタ（光分岐手段）１６とを有している。対物レンズ１５には、ステージ１の載置面に直交するＺ方向に対物レンズ１５を駆動するステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータが設けられている。これらの駆動手段によって対物レンズ１５のＺ方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点位置が調整可能になっている。なお、焦点位置の調整は、ステージ１のＺ方向の位置を変えてもよく、対物レンズ１５及びステージ１の双方のＺ方向の位置を変えてもよい。

ビームスプリッタ１６は、試料Ｓの光像を画像取得用の第１の光路Ｌ１と焦点制御用の第２の光路Ｌ２とに分岐する部分である。このビームスプリッタ１６は、光源１２からの光軸に対しておよそ４５度の角度で配置されており、図２において、ビームスプリッタ１６を通過する光路が第１の光路Ｌ１となっており、ビームスプリッタ１６で反射する光路が第２の光路となっている。

第１の光路Ｌ１には、ビームスプリッタ１６を通過した試料Ｓの光像（第１の光像）を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７の結像位置に撮像面を配置した第１の撮像装置（第１の撮像手段）１８とが配置されている。第１の撮像装置１８は、試料Ｓの第１の光像による１次元画像（第１の画像）を取得可能な装置であり、第１の光路Ｌ１の光軸方向に沿って両方向に任意の距離だけ移動可能なように構成されている。第１の撮像装置１８は、例えばＴＤＩ（Ｔｉｍｅ Ｄｅｌａｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）駆動が可能な２次元ＣＣＤセンサやラインセンサが用いられる。また、ステージ１を一定の速度で制御しながら、試料Ｓの画像を順次取得する方式であれば、第１の撮像装置１８は、ＣＭＯＳセンサやＣＣＤセンサなどの２次元画像を取得可能な装置であってもよい。第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像は、レーンバッファなどの一時保存メモリに順次保存された後、圧縮されて後述の画像生成部３８に出力される。

一方、第２の光路Ｌ２には、ビームスプリッタ１６で反射した試料の光像（第２の光像）を縮小する視野調整レンズ１９と、第２の撮像装置（第２の撮像手段）２０とが配置されている。また、第２の撮像装置２０の前段には、第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１が配置されている。視野調整レンズ１９は、第２の光像が第１の光像と同程度の大きさで第２の撮像装置２０に結像するように構成されていることが好ましい。

第２の撮像装置２０は、試料Ｓの第２の光像による２次元画像（第２の画像）を取得可能な装置であり、第２の光路Ｌ２の光軸方向に沿って両方向に任意の距離だけ移動可能なように構成されている。第２の撮像装置２０は、例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）やＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）などのセンサが用いられる。また、ラインセンサを用いてもよい。

第２の撮像装置２０の撮像面２０ａは、第２の光路Ｌ２に直交するＸＺ面と略一致するように配置されている。この撮像面２０ａには、図３に示すように、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂが設定されている。第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂは、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（走査方向：Ｚ方向）に対して垂直となる向きに設定される。第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとは、所定の間隔をもって設定されており、いずれも第２の光像の一部をライン状に取得する。これにより、第１の撮像装置１８で取得される試料Ｓの第１の光像と同じ領域の光像を第２の光像として第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂで取得できる。なお、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを別々のラインセンサを用いて設定してもよい。この場合、各ラインセンサを別々に制御することで、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定に要する時間を短縮させることができる。

光路差生成部材２１は、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせるガラス部材である。図４に示す例では、光路差生成部材２１Ａは、断面三角形のプリズム状をなしており、撮像面２０ａのＺ方向の中央部分に頂部が略一致するように配置されている。したがって、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、撮像面２０ａにおけるＺ方向の中央部分で最も光路が長くなり、撮像面２０ａにおけるＺ方向の両端部分に向かうほど光路が短くなる。また、光路差生成部材２１は、第２の撮像装置２０と対向する面が第２の撮像装置の撮像面（受光面）２０ａと平行となるように配置されることが好ましい。これにより、第２の撮像装置２０と対向する面による光の屈折を低減でき、第２の撮像装置２０で受光する光量を確保することができる。

これにより、第２の撮像装置２０では、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置に基づいて、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とを取得できる。本実施形態では、例えば第１の撮像領域２２Ａが前ピンとなり、第２の撮像領域２２Ｂが後ピンとなるように第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置とが設定される。前ピンと後ピンとの間のフォーカス差は、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ１及び屈折率と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ２及び屈折率との差に依存する。

また、光路差生成部材２１として、図５に示すような断面直角三角形のプリズム状をなす光路差生成部材２１Ｂを用いて、撮像面２０ａの面内方向（Ｚ方向）に沿って連続的に厚さが増加するように配置してもよい。

図６は、画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。同図に示すように、画像取得装置Ｍは、ＣＰＵ、メモリ、通信インタフェイス、ハードディスクといった格納部、キーボードなどの操作部３１、モニタ３２等を備えたコンピュータシステムを備え、制御部３３の機能的な構成要素として、焦点制御部３４と、領域制御部３５と、対物レンズ制御部３６と、ステージ制御部３７と、画像生成部３８と、バーチャルマイクロ画像格納部３９と、光路長差変更部５０とを備えている。

焦点制御部３４は、第２の撮像装置２０で取得した第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御する部分である。より具体的には、焦点制御部３４は、まず、第２の撮像装置２０において、第１の撮像領域２２Ａで取得した画像のコントラスト値と、第２の撮像領域２２Ｂで取得した画像のコントラスト値との差分を求める。

ここで、図７に示すように、試料Ｓの表面に対して対物レンズ１５の焦点位置が合っている場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値と第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値とが略一致し、これらの差分値はほぼゼロとなる。

一方、図８に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも長い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が大きくなり、これらの差分値はプラスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに近づける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。

また、図９に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも短い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が小さくなり、これらの差分値はマイナスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに遠ざける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。

領域制御部３５は、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置を制御する部分である。領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、予め設定された位置にまず第１の撮像領域２２Ａを設定し、第１の撮像領域２２Ａでの撮像が行われた後、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除する。次に、第１の撮像領域２２ＡからＺ方向（走査方向）に所定の間隔をもって第２の撮像領域２２Ｂを設定し、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が行われた後、第２の撮像領域２２Ｂの設定を解除する。

このとき、第１の撮像領域２２Ａでの撮像から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像までの待ち時間Ｗは、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄと、ステージ１の走査速度ｖに基づいて設定される。例えば、待ち時間Ｗを第１の撮像領域２２Ａでの撮像開始から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像開始までの時間Ｗ１とすると、第１の撮像領域２２Ａでの撮像の露光時間ｅｌ、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔを考慮して、Ｗ１＝ｄ／ｖ−ｅｌ−ｓｔで求めることができる。

また、待ち時間Ｗを第１の撮像領域２２Ａでの撮像開始から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像完了までの待ち時間Ｗ２とすると、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔを考慮して、Ｗ２＝ｄ／ｖ−ｓｔで求めることができる。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄは、光路差生成部材２１によって生じる光路長差に基づいて設定される。ただし、この間隔ｄは、実際には試料Ｓのスライド上の距離に対応しており、最終的には間隔ｄを第２の撮像領域２２Ｂの画素数に変換する必要がある。第２の撮像装置２０の画素サイズをＡＦｐｓｚ、倍率をＡＦｍａｇとした場合、間隔ｄに対応する画素数ｄｐｉｘは、ｄｐｉｘ＝ｄ÷（ＡＦｐｓｚ／ＡＦｍａｇ）で求められる。

また、領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置の少なくとも一方を撮像面２０ａの面内の走査方向（ここではＺ方向）に沿って変更することができる。この場合、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置のいずれか一方のみを変更してもよく、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄを維持したまま、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。

第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置を変更することにより、例えば図４及び図５に示したようなプリズム状の光路差生成部材２１（２１Ａ及び２１Ｂ）を用いる場合には、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ１と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ａの厚さｔ２とを変化させることができる。これにより、前ピン及び後ピンの間隔が変わり、コントラスト値の差分を求める際の分解能を調整できる。

対物レンズ制御部３６は、対物レンズ１５の駆動を制御する部分である。対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４から出力される指示情報を受け取ると、指示情報の内容に従って、対物レンズ１５をＺ方向に駆動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ１５の焦点位置が調整される。

なお、対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４による焦点位置の解析中は対物レンズ１５の駆動は行わず、また、次の焦点位置の解析が開始されるまで、対物レンズ１５をＺ方向に沿って一方向にのみ駆動させる。図１０は、ステージの走査時間に対する対物レンズとステージとの距離の関係を示す図である。同図に示すように、試料Ｓの走査中は、焦点位置の解析期間Ａと、解析結果に基づく対物レンズ駆動期間Ｂとが交互に生じることとなる。このように、焦点位置の解析中に対物レンズ１５と試料Ｓとの位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。

ステージ制御部３７は、ステージ１の駆動を制御する部分である。より具体的には、ステージ制御部３７は、操作部３１からの操作に基づき、試料Ｓが載置されたステージ１を所定の速度で走査させる。このステージ１の走査により、第１の撮像装置１８及び第２の撮像装置２０での試料Ｓの撮像視野が相対的に順次移動する。ステージ１の走査方向は、図１１（ａ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了する度にステージ１の位置を走査開始位置まで戻してから次の分割領域４０を同一方向に走査する一方向走査であってもよく、図１１（ｂ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了した後、ステージ１を走査方向と直交する方向に移動させて次の分割領域４０を反対方向に走査する双方向走査であってもよい。

また、画像取得の間のステージ１の走査速度は一定であるが、実際には走査の開始直後にステージ１の振動等の影響によって走査速度が不安定な期間が存在する。このため、図１２に示すように、分割領域４０よりも長い走査幅を設定し、ステージ１が加速する加速期間Ｃ、ステージ１の走査速度が安定化するまでの安定化期間Ｄ、及びステージ１が減速する減速期間Ｆのそれぞれが、分割領域４０よりも外側を走査しているときに生じるようにすることが好ましい。これにより、ステージ１の走査速度が一定となる一定速度期間Ｅに合わせて画像取得を行うことが可能となる。なお、安定化期間Ｄ中に撮像を開始し、画像取得後に安定化期間Ｄ中に取得したデータ部分を削除するようにしてもよい。このような手法は、データの空読みが必要な撮像装置を用いる場合に好適である。

画像生成部３８は、取得した画像を合成してバーチャルマイクロ画像を生成する部分である。画像生成部３８は、第１の撮像装置１８から出力される第１の画像、すなわち、各分割領域４０の画像を順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の画像を合成する。そして、この合成画像に基づいてこれよりも低い解像度の画像を作成し、高解像度の画像と低解像度の画像とを関連付けてバーチャルマイクロ画像格納部３９に格納する。バーチャルマイクロ画像格納部３９では、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得した画像も更に関連付けてもよい。バーチャルマイクロ画像は、１枚の画像として格納してもよく、複数に分割された画像として格納してもよい。

光路長差変更部５０は、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更する部分である。光路長差変更部５０は、第１の撮像装置１８を第１の光路Ｌ１の光軸方向に沿って両方向に任意の距離だけ駆動させる機能を備える。また、光路長差変更部５０は、第２の撮像装置２０を第２の光路Ｌ２の光軸方向に沿って両方向に任意の距離だけ駆動させる機能を備える。また、光路長差変更部５０は、領域制御部３５に対して、第２の撮像装置２０の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を変更する旨の指示情報を出力する機能を備える。すなわち、光路長差変更部５０は、領域制御部３５を介して、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を変更する機能を備える。

光路長差変更部５０は、上述の機能を用いて、第１の撮像装置１８の位置、第２の撮像装置２０の位置、又は、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を変更することにより、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更することができる。光路長差変更部５０による光路長差変更処理を予め定めた目標焦点間隔ｄｚに基づいて行うことにより、第１の撮像装置１８によって試料Ｓの深さ方向に目標焦点間隔ｄｚずらした位置付近に焦点の合った第１の画像を取得することが可能となる。すなわち、画像取得装置Ｍが、試料Ｓの深さ方向（Ｚ方向）における複数の第１の画像からなるＺスタック画像を取得することが可能となる。以下、その具体的な方法について説明する。

図１３は、画像取得装置Ｍにより取得されるＺスタック画像を説明するために用いる図であり、ステージ１の走査方向（Ｘ方向）及び試料Ｓの深さ方向（Ｚ方向）のいずれにも平行な平面（ＸＺ平面）に沿って試料Ｓ及びステージ１を切断した断面形状を示す。同図において曲線で示されるラインＺ０は、試料Ｓの表面形状（起伏）に沿ったラインを示す。また、ラインＺ１及びＺ２は、ラインＺ０をＺ方向に所定の目標焦点間隔ｄｚずつ移動させたラインを示す。画像取得装置Ｍでは、上述したように、焦点制御部３４が第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御しながらステージ制御部３７がステージ１を走査する（すなわち、ダイナミックフォーカスを実施する）。したがって、画像取得装置Ｍによれば、試料をステージ面と平行なＸＹ平面で切った画像（図１６参照）ではなく、試料Ｓの表面形状（起伏）と略相似する曲面（例えば、ラインＺ０、Ｚ１及びＺ２等）に沿って切った画像からなるＺスタック画像が得られる。このように、画像取得装置Ｍによれば、各層で焦点の合った画像を取得することができる。このように、試料Ｓ内部の各層で焦点が合った状態でダイナミックフォーカスを行うことで、試料Ｓ内部の細胞に対して合焦点のＺスタック画像を取得できる。また、従来の画像取得装置により取得されるＺスタック画像と比較して、少ない枚数の画像（例えば、ラインＺ０、Ｚ１及びＺ２の３層）で試料Ｓの深さ方向についてより多くの情報を得ることができる。

以下、説明を簡単にするため、焦点制御部３４が第１の撮像装置１８による撮像における焦点位置を制御しながらステージ制御部３７がステージ１を走査することで得られる第１の画像の焦点位置の軌跡（以下、「焦点軌跡」という。）がラインＺ０に追従するように各装置が配置された状態を初期状態とする。そして、ラインＺ０を試料Ｓの深さ方向に目標焦点間隔ｄｚだけ平行移動したラインＺ１が示す位置付近に焦点の合った第１の画像を第１の撮像装置１８によって取得するために光路長差変更部５０が行う光路長差変更処理について説明する。

（第１の例）
光路長差変更部５０は、初期状態から、下記式（１）により算出される移動距離だけ光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０を第２の光路Ｌ２の光軸方向に沿って移動させる。例えば光軸に沿って光の進行方向に対して反対方向（図２の矢印Ａ）にＺスタック画像を取得する場合、光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０を光軸に沿って光の進行方向に対して反対方向（図２の矢印Ｂ）に移動させればよく、光軸に沿って光の進行方向（矢印Ａと反対方向）にＺスタック画像を取得する場合、光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０を光軸に沿って光の進行方向（矢印Ｂと反対方向）に移動させる。従って、光軸に沿った光の進行方向に対するＺスタックの取得方向と、光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０の移動方向の関係は同じ方向となる。
移動距離＝目標焦点間隔ｄｚ×（第２の光路Ｌ２における光学倍率の２乗）・・・（１）

ここで、第２の光路Ｌ２における光学倍率は、光源１から照射された光が、ビームスプリッタ１６により反射され、第２の光路Ｌ２を通って第２の撮像装置２０に至るまでに経由する対物レンズ１５及び視野調整レンズ１９の倍率の積により求まる。

（第２の例）
光路長差変更部５０は、初期状態から、下記式（２）により算出される移動距離だけ第１の撮像装置１８を第１の光路Ｌ１の光軸方向に沿って移動させる。例えば光軸に沿って光の進行方向に対して反対方向（矢印Ａ）にＺスタック画像を取得する場合、第１の撮像装置１８を光軸に沿って光の進行方向に対して反対方向（図２の矢印Ｃ）に移動させればよく、光軸に沿って光の進行方向（矢印Ａと反対方向）にＺスタック画像を取得する場合、第１の撮像装置１８を光軸に沿って光の進行方向（矢印Ｃと反対方向）に移動させる。従って、光軸に沿った光の進行方向に対するＺスタックの取得方向と、第１の撮像装置１８の移動方向の関係は同じ方向となる。
移動距離＝目標焦点間隔ｄｚ×（第１の光路Ｌ１における光学倍率の２乗）・・・（２）

ここで、第１の光路Ｌ１における光学倍率は、光源１から照射された光が、ビームスプリッタ１６を通過し、第１の光路Ｌ１を通って第１の撮像装置１８に至るまでに経由する対物レンズ１５及び結像レンズ１７の倍率の積により求まる。

（第３の例）
光路差生成部材２１として、撮像面２０ａの面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有する部材を用いる。また、光路長差変更部５０は、初期状態から、領域制御部３５を介して、撮像面２０ａの面内方向に対する光路差生成部材２１の厚さの変化の割合と目標焦点間隔ｄｚとに基づいて第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を変更する。例えば光路差生成部材２１として図５に示す光路差生成部材２１Ｂを用いる場合について、図１４を用いて具体的に説明する。

図１４（ａ）は、初期状態における第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を示す図である。距離Ｓ１は、撮像面２０ａの面内方向における、第２の撮像装置２０の一方端部（撮像面２０ａと対向する光路差生成部材２１Ｂの厚みが小さい側の端部）から第１の撮像領域２２Ａの中心位置までの距離を示す。角度θは、光路差生成部材２１Ｂにおいて、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａと対向する平面と斜面とがなす角度（鋭角）を示す。ここで、角度θは、撮像面２０ａの面内方向に対する光路差生成部材２１の厚さの変化の割合を示すパラメータとしての役割を果たす。

図１４（ｂ）は、初期状態から第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置をそれぞれ、撮像面２０ａの面内方向（矢印Ａ及び矢印Ｃと同方向）に沿って変更距離ΔＳ１だけ離れた位置に変更した後の状態を示す図である。距離Ｓ１´は、撮像面２０ａの面内方向における、第２の撮像装置２０の一方端部から変更後の第１の撮像領域２２Ａの中心位置までの距離を示す。距離Ｓ１´は、距離Ｓ１と変更距離ΔＳ１との和で示される（Ｓ１´＝Ｓ１＋ΔＳ１）。また、厚さｔ１´は、変更後の第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１Ｂの厚さを示す。厚さ差分Δｔ１は、変更後の厚さｔ１´と変更前の厚さｔ１との差分で示される（Δｔ１＝ｔ１´−ｔ１）。

ここで、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置の変更距離ΔＳ１は、光路差生成部材２１Ｂの屈折率を屈折率ｎとすると、下記式（３）により算出される。
ΔＳ１＝Ａ／Ｂ・・・（３）
Ａ＝目標焦点間隔ｄｚ×（第２の光路Ｌ２における光学倍率の２乗）
Ｂ＝（１−１／ｎ）×ｔａｎθ

光路長差変更部５０が上述の第１の例から第３の例までに示したいずれかの方法によって第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更した後、焦点制御部３４が第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御しながらステージ制御部３７がステージ１を走査すると、焦点軌跡は、ラインＺ０から目標焦点間隔ｄｚだけ試料Ｓの深さ方向にずれたラインＺ１を追従するようになる。これにより、第１の撮像装置１８が、試料Ｓの深さ方向に目標焦点間隔ｄｚずらしたラインＺ１が示す位置付近に焦点の合った第１の画像を取得することができる。

したがって、上述の例に示す方法により第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更するごとに、焦点制御部３４による焦点制御、ステージ制御部３７によるステージ走査、及び第１の撮像装置１８による第１の画像の取得を行うことによって、試料Ｓの各層（例えばラインＺ０、ラインＺ１、ラインＺ２等）で焦点の合った第１の画像を取得することができる。なお、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更する光路長差変更部５０としては、第１の例から第３の例に限らず、光路中に液晶レンズなどの光路長を変更できる光学部材を配置し、光学部材を制御する構成にしてもよいし、その他の構成でもかまわない。

また、上述の各例において示した式（１）〜（３）は理論式であり、第１の光路Ｌ１における光学倍率及び第２の光路Ｌ２における光学倍率等は、実際の装置構成によって微妙に異なり得る。したがって、いくつかのサンプルで測定を行って補正値を取得し、当該補正値に基づいてキャリブレーションを行ってもよい。

続いて、上述した画像取得装置Ｍの動作について説明する。

図１５は、画像取得装置Ｍの動作を示すフローチャートである。同図に示すように、画像取得装置Ｍでは、まず、マクロ画像取得装置Ｍ１による試料Ｓのマクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０１）。取得したマクロ画像は、例えば所定の閾値を用いて二値化された後、モニタ３２に表示され、所定のプログラムを用いた自動設定又は操作者による手動設定により、マクロ画像の中からミクロ画像を取得する範囲が設定される（ステップＳ０２）。

次に、試料Ｓがミクロ画像取得装置Ｍ２側に移送され、焦点取得条件の設定がなされる（ステップＳ０３）。ここでは、上述したように、ステージ１の走査速度ｖと、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔ｄとに基づいて、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が開始されるまでの待ち時間Ｗを設定する。より好ましくは、第１の撮像領域２２Ａでの撮像の露光時間ｅｌ、及び第１の撮像領域２２Ａの設定を解除してから第２の撮像領域２２Ｂを設定するまでの時間ｓｔ等を考慮する。

焦点取得条件を設定した後、ステージ１の走査を開始し、ミクロ画像取得装置Ｍ２による試料Ｓの各分割領域４０のミクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０４）。第１の撮像装置１８でのミクロ画像の取得の際、第２の撮像装置２０では第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂによって前ピンのコントラスト値と後ピンのコントラスト値の差分に基づいて試料Ｓに対する対物レンズ１５のずれ方向が解析され、対物レンズ１５の位置の調整がリアルタイムで実行される。全ての分割領域４０についてミクロ画像の取得が完了した後、取得したミクロ画像が合成され、バーチャルマイクロ画像が生成される（ステップＳ０５）。ステップＳ０４及びＳ０５の処理により、Ｚスタック画像を構成する１つの層におけるバーチャルマイクロ画像（例えば、図１３に示すラインＺ０が示す位置付近に焦点の合った画像）が取得される。

続いて、Ｚスタック画像を構成する全ての画像（バーチャルマイクロ画像）を取得したか否かを判定する（ステップＳ０６）。ここで、Ｚスタック画像を構成する全ての画像とは、例えば予め設定された所定の目標焦点間隔ｄｚごとの試料Ｓの全ての深さ位置における画像を意味する。所望するＺスタック画像を構成する全ての画像を取得していなければ（ステップＳ０６：ＮＯ）、所定の目標焦点間隔ｄｚに基づいて上述した任意の方法（又はその組み合わせ）によって第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更する（ステップＳ０７）。その後、再度ステップＳ０４及びＳ０５による処理を行うことにより、試料Ｓについての異なる深さ位置において焦点の合った画像（例えば、図１３に示すラインＺ１が示す位置付近に焦点の合った画像）が取得される。Ｚスタック画像を構成する全ての画像を取得したら、処理を完了する（ステップＳ０６：ＹＥＳ）。

以上説明したように、画像取得装置Ｍでは、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更する光路長差変更部５０を備えている。第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置は、光路長差変更部５０により変更される上記光路長差に応じて試料Ｓの深さ方向に変化（移動）する。したがって、光路長差変更部５０が所定の目標焦点間隔ｄｚに基づいて上記光路長差を変更するごとに、焦点制御部３４が第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御しながらステージ制御部３７がステージ１を走査して、第１の撮像装置１８が第１の画像を取得することにより、上記光路長差の変更に応じた試料Ｓの深さ方向における第１の画像からなるＺスタック画像を容易に取得できる。

具体的には、光路長差変更部５０が、目標焦点間隔ｄｚをパラメータに含む上述の式（１）により算出される移動距離だけ第２の撮像装置２０を第２の光路Ｌ２の光軸方向に沿って移動させることにより、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更し、目標焦点間隔ｄｚごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

また、光路長差変更部５０が、目標焦点間隔ｄｚをパラメータに含む上述の式（２）により算出される移動距離だけ第１の撮像装置１８を第１の光路Ｌ１の光軸方向に沿って移動させることによっても、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更し、目標焦点間隔ｄｚごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

また、光路差生成部材２１として、撮像面２０ａの面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有し、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１（例えば光路差生成部材２１Ｂ）を用いる場合、光路長差変更部５０が、撮像面２０ａの面内方向に対する上記厚さの変化の割合と目標焦点間隔ｄｚとに基づいて定まる変更距離だけ、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定位置を変更することによっても、第１の光路Ｌ１と第２の光路Ｌ２との光路長差を変更し、目標焦点間隔ｄｚごとの複数の焦点位置における第１の画像を取得することができる。

上述した実施形態では、バーチャルマイクロ画像を生成する装置を例示したが、本発明に係る画像取得装置は、ステージ等によって試料を所定の速度で走査しながら画像を取得する装置であれば、種々の装置に適用することができる。

１…ステージ、１２…光源、１４…導光光学系、１５…対物レンズ、１６…ビームスプリッタ（光分岐手段）、１８…第１の撮像装置（第１の撮像手段）、２０…第２の撮像装置（第２の撮像手段）、２０ａ…撮像面、２１（２１Ａ、２１Ｂ）…光路差生成部材、２２Ａ…第１の撮像領域、２２Ｂ…第２の撮像領域、３４…焦点制御部（焦点制御手段）、３５…領域制御部（領域制御手段）、３７…ステージ制御部（ステージ制御手段）、５０…光路長差変更部（光路長差変更手段）、Ｌ１…第１の光路、Ｌ２…第２の光路、Ｍ…画像取得装置、Ｍ１…マクロ画像取得装置、Ｍ２…ミクロ画像取得装置、Ｓ…試料。

Claims (8)

1. 試料が載置されるステージと、
   前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
   前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
   前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
   前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、
   所定の目標焦点間隔に基づいて前記第１の光路と前記第２の光路との光路長差を変更する光路長差変更手段と、を備え、
   前記光路長差変更手段が前記光路長差を変更するごとに、前記焦点制御手段が前記焦点位置を制御しながら前記ステージ制御手段が前記ステージを走査して、前記第１の撮像手段が前記第１の画像を取得することにより、前記試料の深さ方向における複数の前記第１の画像からなるＺスタック画像を取得することを特徴とする画像取得装置。
2. 前記光路長差変更手段は、下記式（１）により算出される移動距離に基づいて、前記第２の撮像手段を前記第２の光路の光軸方向に沿って移動させることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
   移動距離＝前記目標焦点間隔×（前記第２の光路における光学倍率の２乗）・・・（１）
3. 前記光路長差変更手段は、下記式（２）により算出される移動距離に基づいて、前記第１の撮像手段を前記第１の光路の光軸方向に沿って移動させることを特徴とする請求項１又は２記載の画像取得装置。
   移動距離＝前記目標焦点間隔×（前記第１の光路における光学倍率の２乗）・・・（２）
4. 前記第２の撮像手段の撮像面に、前記第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、
   前記第２の光路に配置され、前記撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有し、前記撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を更に備え、
   前記光路長差変更手段は、前記領域制御手段に、前記撮像面の面内方向に対する前記厚さの変化の割合と前記目標焦点間隔とに基づいて前記第１の撮像領域及び前記第２の撮像領域の設定位置を変更させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
5. 試料が載置されるステージと、
   前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
   前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
   前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
   前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、
   所定の目標焦点間隔に基づいて前記第１の光路と前記第２の光路との光路長差を変更する光路長差変更手段と、を備えた画像取得装置による画像取得方法であって、
   前記光路長差変更手段によって前記光路長差を変更するごとに、前記焦点制御手段によって前記焦点位置を制御しながら前記ステージ制御手段によって前記ステージを走査して、前記第１の撮像手段によって前記第１の画像を取得することにより、前記試料の深さ方向における複数の前記第１の画像からなるＺスタック画像を取得することを特徴とする画像取得方法。
6. 前記光路長差変更手段によって、下記式（１）により算出される移動距離に基づいて、前記第２の撮像手段を前記第２の光路の光軸方向に沿って移動させることを特徴とする請求項５記載の画像取得方法。
   移動距離＝前記目標焦点間隔×（前記第２の光路における光学倍率の２乗）・・・（１）
7. 前記光路長差変更手段によって、下記式（２）により算出される移動距離に基づいて、前記第１の撮像手段を前記第１の光路の光軸方向に沿って移動させることを特徴とする請求項５又は６記載の画像取得方法。
   移動距離＝前記目標焦点間隔×（前記第１の光路における光学倍率の２乗）・・・（２）
8. 前記画像取得装置が、前記第２の撮像手段の撮像面に、前記第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定する領域制御手段と、
   前記第２の光路に配置され、前記撮像面の面内方向に沿って連続的に厚さが変化する部分を有し、前記撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を更に備え、
   前記領域制御手段によって、前記撮像面の面内方向に対する前記厚さの変化の割合と前記目標焦点間隔とに基づいて前記第１の撮像領域及び前記第２の撮像領域の設定位置を変更することを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項記載の画像取得方法。

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