CN104755989A - 图像取得装置和图像取得方法 - Google Patents

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Abstract

在图像取得装置(M)中，具备变更第1光路(L1)与第2光路(L2)的光路长度差变更机构。由第1摄像装置(18)进行的摄像的焦点位置根据由光路长度差变更机构变更的上述光路长度差而在试样(S)的深度方向上变化(移动)。因此，在光路长度差变更机构基于规定的目标焦点间隔变更上述光路长度差中，焦点控制机构控制由第1摄像装置(18)得到的摄像的焦点位置同时载台控制机构扫描载台(1)，并且第1摄像装置(18)取得第1图像，由此，能够容易取得与上述光路长度差的变更对应的试样(S)的深度方向上的多个第1图像构成的Z叠层图像。

Description

图像取得装置和图像取得方法
技术领域
本发明涉及试样等的图像取得所使用的图像取得装置及其图像取得方法。
背景技术
作为图像取得装置，例如有将试样的摄像区域预先分割成多个区域，并在对各分割区域进行高倍率摄像后将它们进行合成的虚拟(virtual)显微镜装置。在这样的虚拟显微镜的图像取得中，以往，取得作为活体样品等试样的图像的时候的摄像条件，设定以试样的整个区域作为对象的焦点映射(mapping)，并一边进行基于焦点映射的焦点控制一边进行试样的图像的取得。
为了制作焦点映射，首先，使用具备宏观光学系统的图像取得装置来取得试样整体作为宏观图像。接着，使用所取得的宏观图像来设定试样的摄像范围，并且将摄像范围分割成多个分割区域，并对各分割区域设定焦点取得位置。在设定焦点取得位置之后，将试样移到具备宏观光学系统的图像取得装置，取得所设定的焦点取得位置中的焦点位置，并由这些焦点位置制作焦点映射。
然而，在制作这样的焦点映射时，存在处理需要时间这样的问题。另外，如果抑制所取得的焦点的间隔或者数目，则处理所需要的时间缩短，但是在该情况下存在聚焦精度下降这样的问题。因此，进行了一边取得焦点位置一边取得试样的高倍率图像的动态聚焦的开发。该方式是如下的方式，即，基于比入射到图像取得用的摄像装置的光像更前地匹配焦点的光像(前焦点(front focus))与更后地匹配焦点的光像(后焦点(rear focus))的光强度差或者对比度差来检测焦点位置相对于当前的物镜的高度的偏移方向，使物镜在抵消偏移的方向上移动来取得图像(例如参照专利文献1)。
另一方面，在不使用动态聚焦的现有的虚拟显微镜中，有如下方式，即取得相对于有厚度的试样的焦点位置不同的多个Z平面图像(在图16中由虚线表示的位置匹配焦点的平面的图像)的设置(Z叠层图像)。例如，在下述专利文献2中，公开了通过使物镜相对于试样台相对移动(例如使Z平面水平向下方行进)，从而取得Z叠层图像的方式。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-081211号公报
专利文献2：日本特开2008-500643号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
为了如上述的专利文献2那样使物镜相对于试样台相对移动来取得Z叠层，需要焦点映射等物镜的基准位置的信息。然而，由于在动态聚焦中不取得焦点映射，因此不具有这样的物镜的基准位置的信息。因此，在使用动态聚焦的情况下，单纯采用使物镜相对于试样台相对移动的方法来取得Z叠层图像是困难的。
本发明是为了解决上述技术问题而完成的，其目的在于提供在进行利用动态聚焦的图像取得的情况下能够容易取得Z叠层图像的图像取得装置及其图像取得方法。
解决技术问题的手段
为了解决上述技术问题，本发明所涉及的图像取得装置，其特征在于，具备：载台，其载置有试样；载台控制机构，其以规定的速度扫描载台；光源，其朝向试样照射光；导光光学系统，其包含将试样的光像向图像取得用的第1光路和焦点控制用的第2光路分支的光分支机构；第1摄像机构，其取得由向第1光路分支的第1光像得到的第1图像；第2摄像机构，其取得由向第2光路分支的第2光像得到的第2图像；焦点控制机构，其解析第2图像，并基于该解析结果控制由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置；以及光路长度差变更机构，其基于规定的目标焦点间隔变更第1光路与第2光路的光路长度差，每当光路长度差变更机构变更光路长度差时，焦点控制机构控制焦点位置同时载台控制机构扫描载台，并且第1摄像机构取得第1图像，由此取得由试样的深度方向上的多个第1图像构成的Z叠层图像。
在该图像取得装置中，具备了变更第1光路与第2光路的光路长度差的光路长度差变更机构。由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置根据由光路长度差变更机构变更的上述光路长度差，而在试样的深度方向上变化(移动)。因此，通过每当光路长度差变更机构基于规定的目标焦点间隔变更上述光路长度差时，焦点控制机构控制由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置，同时载台控制机构扫描载台，并且第1摄像机构取得第1图像，由此能够容易取得由根据上述光路长度差的变更的试样的深度方向上的第1图像构成的Z叠层图像。再有，在该方法中，通过在变更上述光路长度差的基础上实施由焦点控制机构进行的动态聚焦，从而得到不是以与载台面平行的XY平面切开试样的图像而是沿着与试样的表面形状(起伏)大致相似的曲面切开试样的图像构成的Z叠层图像。
另外，光路长度差变更机构可以基于由下式(1)算出的移动距离，使第2摄像机构沿着第2光路的光轴方向移动。如此，通过基于下式(1)使第2摄像机构移动，从而能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
另外，光路长度差变更机构可以基于由下式(2)算出的移动距离，使第1摄像机构沿着第1光路的光轴方向移动。如此，通过基于下式(2)使第1摄像机构移动，从而能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
移动距离＝目标焦点间隔×(第2光路的光学倍率的平方)……(1)。
移动距离＝目标焦点间隔×(第1光路的光学倍率的平方)……(2)。
另外，可以还具备：区域控制机构，其在第2摄像机构的摄像面，设定取得第2光像的一部分图像的第1摄像区域和第2摄像区域；以及光路差生成构件，其配置在第2光路，具有沿着摄像面的面内方向厚度连续变化的部分，并使第2光像沿着摄像面的面内方向产生光路差，光路长度差变更机构使区域控制机构基于相对于摄像面的面内方向的上述厚度的变化的比例和目标焦点间隔来变更第1摄像区域和第2摄像区域的设定位置。通过这样变更第1摄像区域和第2摄像区域的设定位置，也能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
另外，本发明所涉及的图像取得方法，其特征在于，是利用图像取得装置的图像取得方法，图像取得装置具备：载台，其载置有试样；载台控制机构，其以规定的速度扫描载台；光源，其朝向试样照射光；导光光学系统，其包含将试样的光像向图像取得用的第1光路和焦点控制用的第2光路分支的光分支机构；第1摄像机构，其取得由向第1光路分支的第1光像得到的第1图像；第2摄像机构，其取得由向第2光路分支的第2光像得到的第2图像；焦点控制机构，其解析第2图像，并基于该解析结果控制由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置；以及光路长度差变更机构，其基于规定的目标焦点间隔变更第1光路与第2光路的光路长度差，每当光路长度差变更机构变更光路长度差时，一边由焦点控制机构控制上述焦点位置一边由载台控制机构扫描载台，并且由第1摄像机构取得第1图像，由此取得由试样的深度方向上的多个第1图像构成的Z叠层图像。
在该图像取得方法中，利用由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置根据变更的第1光路与第2光路的光路长度差而在试样的深度方向上变化(移动)，每当第1光路与第2光路的光路长度差时，一边控制由第1摄像机构进行的摄像的焦点位置一边扫描载台，并通过第1摄像机构取得第1图像。由此，能够容易取得由与上述光路长度差的变更对应的试样的深度方向上的第1图像构成的Z叠层图像。再有，在该方法中，通过每当变更上述光路长度差时实施动态聚焦，从而得到不是以与载台面平行的XY平面切开试样的图像而是沿着与试样的表面形状(起伏)大致相似的曲面切开试样的图像构成的Z叠层图像。
另外，通过光路长度差变更机构，基于由下式(1)算出的移动距离，使第2摄像机构沿着第2光路的光轴方向移动。如此，通过基于下式(1)使第2摄像机构移动，从而能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
另外，光路长度差变更机构可以基于由下式(2)算出的移动距离，使第1摄像机构沿着第1光路的光轴方向移动。如此，通过基于下式(2)使第1摄像机构移动，从而也能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
移动距离＝目标焦点间隔×(第2光路的光学倍率的平方)……(1)。
移动距离＝目标焦点间隔×(第1光路的光学倍率的平方)……(2)。
另外，图像取得装置可以还具备：区域控制机构，其在第2摄像机构的摄像面，设定取得第2光像的一部分图像的第1摄像区域和第2摄像区域；以及光路差生成构件，其配置在第2光路，具有沿着摄像面的面内方向厚度连续变化的部分，并使第2光像沿着摄像面的面内方向产生光路差，光路长度差变更机构使区域控制机构基于相对于摄像面的面内方向的上述厚度的变化的比例和目标焦点间隔来变更第1摄像区域和第2摄像区域的设定位置。通过这样变更第1摄像区域和第2摄像区域的设定位置，也能够变更第1光路与第2光路的光路长度差，并取得每个规定的目标焦点间隔的多个焦点位置的第1图像。
发明的效果
根据本发明，能够在进行利用动态聚焦的图像取得的情况下容易取得Z叠层图像。
附图说明
图1是表示构成本发明所涉及的图像取得装置的宏观图像取得装置的一个实施方式的图。
图2是表示构成本发明所涉及的图像取得装置的微观图像取得装置的一个实施方式的图。
图3是表示第2摄像装置的图。
图4是表示光路差生成构件和第2摄像装置的组合的一个例子的图。
图5是表示沿着第2摄像装置的摄像面的面内方向厚度连续变化的光路差生成构件的例子的图。
图6是表示图像取得装置的功能上的构成要素的框图。
图7是表示在直至试样的表面的距离与物镜的焦点距离一致的情况下的对比度值的解析结果的图。
图8是表示在直至试样的表面的距离比物镜的焦点距离长的情况下的对比度值的解析结果的图。
图9是表示在直至试样的表面的距离比物镜的焦点距离短的情况下的对比度值的解析结果的图。
图10是表示物镜与载台的距离相对于载台的扫描时间的关系的图。
图11是表示利用载台控制部的载台的扫描方向的控制的图。
图12是表示利用载台控制部的载台的扫描速度的控制的图。
图13是为了说明由本发明的一个实施方式所涉及的图像取得装置取得的Z叠层图像而使用的图。
图14是为了说明通过使第1摄像区域和第2摄像区域的位置移动来变更第1光路与第2光路的光路长度差的方法而使用的图。
图15是表示本发明的一个实施方式所涉及的图像取得装置的动作的流程图。
图16是为了说明由现有的图像取得装置取得的Z叠层图像而使用的图。
符号的说明：
1…载台，12…光源，14…导光光学系统，15…物镜，16…光束分离器(光分支机构)，18…第1摄像装置(第1摄像机构)，20…第2摄像装置(第2摄像机构)，20a…摄像面，21(21A、21B)…光路差生成构件，22A…第1摄像区域，22B…第2摄像区域，34…焦点控制部(焦点控制机构)，35…区域控制部(区域控制机构)，37…载台控制部(载台控制机构)，50…光路长度差变更部(光路长度差变更机构)，L1…第1光路，L2…第2光路，M…图像取得装置，M1…宏观图像取得装置，M2…微观图像取得装置，S…试样。
具体实施方式
以下，一边参照附图，一边就本发明所涉及的图像取得装置及其图像取得方法的优选实施方式进行详细说明。
图1是表示构成本发明所涉及的图像取得装置的宏观图像取得装置的一个实施方式的图。另外，图2是表示构成本发明所涉及的图像取得装置的微观图像取得装置的一个实施方式的图。如图1和图2所示，图像取得装置M由取得试样S的宏观图像的宏观图像取得装置M1以及取得试样S的微观图像的微观图像取得装置M2构成。图像取得装置M是对由宏观图像取得装置M1取得的宏观图像设定例如线状的多个分割区域40(参照图11)，并由微观图像取得装置M2高倍率取得各分割区域40并合成从而生成虚拟微观图像的装置。
如图1所示，宏观图像取得装置M1具备载置有试样S的载台1。载台1是通过例如步进电机(脉冲电机)或压力致动器等电机或者致动器而在水平方向上驱动的XYZ载台。由图像取得装置M观察的试样S是例如细胞等活体样品，在密封于载玻片的状态下载置于载台1。通过在XY面内驱动该载台1，从而能够使相对于试样S的摄像位置移动。
载台1可以在宏观图像取得装置M1与微观图像取得装置M2之间往返，并具有在两装置间搬运试样S的功能。再有，在宏观图像取得中，可以以1次摄像取得试样S的整体图像，也可以将试样S分割成多个区域来摄像。另外，载台1可以分别设置在宏观图像取得装置M1和微观图像取得装置M2两者。
在载台1的底面侧，配置有朝向试样S照射光的光源2以及将来自光源2的光聚光于试样S的聚光透镜3。光源2可以以朝向试样S倾斜地照射光的方式配置。另外，在载台1的上面侧，配置有对来自试样S的光像进行导光的导光光学系统4、以及对试样S的光像摄像的摄像装置5。导光光学系统4具有使来自试样S的光像成像于摄像装置5的摄像面的成像透镜6。另外，摄像装置5是可取得例如二维图像的区域传感器(area sensor)。摄像装置5取得经导光光学系统4入射到摄像面的试样S的光像的整体图像，并储存于后述的虚拟微观图像储存部39。
如图2所示，微观图像取得装置M2在载台1的底面侧具有与宏观图像取得装置M1同样的光源12和聚光透镜13。另外，在载台1的上面侧，配置有对来自试样S的光像进行导光的导光光学系统14。在使来自光源12的光照射于试样S的光学系统中，可以采用用于对试样S照射激励光的激励光照射光学系统或者用于取得试样S的暗视野图像的暗视野照明光学系统。
导光光学系统4具有与试样S相对配置的物镜15、以及配置在物镜15的后段的光束分离器(光分支机构)16。在物镜15，设置有在与载台1的载置面正交的Z方向上驱动物镜15的步进电机(脉冲电极)或者压力致动器等电机或者致动器。通过这些驱动机构来改变物镜15的Z方向的位置，能够调整试样S的图像取得的摄像的焦点位置。再有，焦点位置的调整可以改变载台1的Z方向的位置，也可以改变透镜15和载台1两者的Z方向的位置。
光束分离器16是将试样S的光像分支成图像取得用的第1光路L1和焦点控制用的第2光路L2的部分。该光束分离器16以相对于来自光源1的光轴约45度的角度配置，在图2中，通过光束分离器16的光路成为第1光路L1，由光束分离器16反射的光路成为第2光路。
在第1光路L1，配置有使通过光束分离器16的试样S的光像(第1光像)成像的成像透镜17、以及在成像透镜17的成像位置配置摄像面的第1摄像装置(第1摄像机构)18。第1摄像装置18是可取得由试样S的第1光像得到的一维图像(第1图像)的装置，并以沿着第1光路L1的光轴方向在两个方向上可移动任意距离的方式构成。第1摄像装置18可以使用例如可以TDI(Time Delay Integration：时间延迟积分)驱动的二维CCD传感器或线性传感器。另外，如果是一边以一定的速度控制载台1一边依次取得试样S的图像的方式，则第1摄像装置18也可以是CMOS传感器或CCD传感器等可取得二维图像的装置。由第1摄像装置18摄像的第1图像在依次保存到通道(lane)缓冲器等暂时保存存储器后，进行压缩并输出到后述的图像生成部38。
另一方面，在第2光路L2，配置有缩小由光束分离器16反射的试样的光像(第2光像)的视野调整透镜19、以及第2摄像装置(第2摄像机构)20。另外，在第2摄像装置20的前段，配置有使第2光像产生光路差的光路差生成构件21。视野调整透镜19优选以第2光像按与第1光像同等程度的大小成像于第2摄像装置20的方式构成。
第2摄像装置20是可取得由试样S的第2光像得到的二维图像(第2图像)的装置，以沿着第2光路L2的光轴方向在两个方向上可移动任意距离的方式构成。第2摄像装置20可以使用CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor：互补金属氧化物半导体)或CCD(Charge Coupled Device：电荷耦合器件)等传感器等。另外，也可以使用线性传感器。
第2摄像装置20的摄像面20a以与第2光路L2正交的XZ面大体一致的方式配置。如图3所示，在该摄像面20a设定有取得第2光像的一部分图像的第1摄像区域22A和第2摄像区域22B。第1摄像区域22A和第2摄像区域22B设定在相对于伴随着试样S的扫描的摄像面20a上的第2光像的移动方向(扫描方向：Z方向)垂直的方向上。第1摄像区域22A与第2摄像区域22B具有规定的间隔而设定，均为线状地取得第2光像的一部分。由此，能够在第1摄像区域22A和第2摄像区域22B取得与由第1摄像装置18取得的试样S的第1光像相同区域的光像作为第2光像。再有，也可以使用分开的线状传感器来设定第1摄像区域22A和第2摄像区域22B。在该情况下，通过分开地控制各线性传感器，能够缩短第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定所需要的时间。
光路差生成构件21是沿着摄像面20a的面内方向使第2光像产生光路差的玻璃构件。在图4所示的例子中，光路差生成构件21A成为截面三角形的棱柱状，以顶部与摄像面20a的Z方向的中央部分大体一致的方式配置。因此，入射到摄像面20a的第2光像在摄像面20a的Z方向的中央部分其光路最长，越朝向摄像面20a的Z方向的两端部分光路越短。另外，光路差生成构件21优选以与第2摄像装置20相对的面与第2摄像装置的摄像面(受光面)20a平行的方式配置。由此，能够减少由与第2摄像装置20相对的面引起的光的折射，能够确保由第2摄像装置20接收的光量。
由此，在第2摄像装置20中，能够基于第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置来取得比入射到第1摄像装置18的第1光像更前地匹配焦点的光像(前焦点(pin))、以及更后地匹配焦点的光像(后焦点)。在本实施方式中，例如以第1摄像区域22A为前焦点且第2摄像区域22B为后焦点的方式设定第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置。前焦点与后焦点之间的聚焦差依赖于入射到第1摄像区域22A的第2光像所通过的光路差生成构件21A的厚度t1和折射率与入射到第2摄像区域22B的第2光像所通过的光路差生成构件21A的厚度t2和折射率之差。
另外，作为光路差生成构件21，可以使用图5所示的成为截面直角三角形的棱柱状的光路差生成构件21B，并以沿着摄像面20a的面内方向(Z方向)厚度连续增加的方式配置。
图6是表示图像取得装置的功能上的构成要素的框图。如该图所示，图像取得装置M具备具有CPU、存储器、通信接口、硬盘等的储存部、键盘等操作部31、监视器32等的计算机系统，作为控制部33的功能上的构成要素，具备焦点控制部34、区域控制部35、物镜控制部36、载台控制部37、图像生成部38、虚拟微观图像储存部39、以及光路长度差变更部50。
焦点控制部34是对由第2摄像装置20取得的第2图像进行解析，并基于该解决结果控制由第1摄像装置18进行的摄像的焦点位置的部分。更具体而言，焦点控制部34首先求得在第2摄像装置20中由第1摄像区域22A取得的前焦点的图像对比度值与由第2摄像区域22B取得的图像后焦点的图像对比度值的差分。
这里，如图7所示，在物镜15的焦点位置相对于试样S的表面匹配的情况下，由第1摄像区域22A取得的前焦点的图像对比度值与由第2摄像区域22B取得的后焦点的图像对比度值大体一致，它们的差分值大体为零。
另一方面，如图8所示，在直至试样S的表面的距离比物镜15的焦点距离长的情况下，与由第1摄像区域22A取得的前焦点的图像对比度值相比，由第2摄像区域22B取得的后焦点的图像对比度值大，它们的差分值为正。在该情况下，焦点控制部34对物镜控制部36输出将物镜15向接近于试样S的方向驱动的主旨的指示信息。
另外，如图9所示，在直至试样S的表面的距离比物镜15的焦点距离短的情况下，与由第1摄像区域22A取得的前焦点的图像对比度值相比，由第2摄像区域22B取得的后焦点的图像对比度值小，它们的差分值为负。在该情况下，焦点控制部34对物镜控制部36输出将物镜15向远离试样S的方向驱动的主旨的指示信息。
区域控制部35是控制第2摄像装置20的摄像面20a的第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置的部分。区域控制部35基于来自操作部31的操作，在预先设定的位置首先设定第1摄像区域22A，进行第1摄像区域22A的摄像之后，解除第1摄像区域22A的设定。接着，从第1摄像区域22A开始在Z方向(扫描方向)上具有规定的间隔地设定第2摄像区域22B，进行第2摄像区域22B的摄像之后，解除第2摄像区域22B的设定。
此时，从第1摄像区域22A的摄像到第2摄像区域22B的摄像的等待时间W，基于第1摄像区域22A与第2摄像区域22B之间的间隔d以及载台1的扫描速度v来设定。例如，当令等待时间W为从第1摄像区域22A的摄像开始到第2摄像区域22B的摄像开始的时间W1时，考虑第1摄像区域22A的摄像的曝光时间el、从解除第1摄像区域22A的设定到设定第2摄像区域22B的时间st，可以由W1＝d/v-el-st求得。
另外，当令等待时间W为从第1摄像区域22A的摄像开始到第2摄像区域22B的摄像结束的等待时间W2时，考虑从解除第1摄像区域22A的设定到设定第2摄像区域22B的时间st，可以由W2＝d/v-st求得。另外，第1摄像区域22A与第2摄像区域22B之间的间隔d基于由光路差生成构件21产生的光路长度差来设定。但是，该间隔d实际上对应于试样S的载玻片上的距离，最终需要将间隔d变换成第2摄像区域22B的像素数。在令第2摄像区域22B的像素尺寸为AFpsz且倍率为AFmag的情况下，对应于间隔d的像素数dpix由dpix＝d÷(AFpsz/AFmag)求得。
另外，区域控制部35能够基于来自操作部31的操作，沿着摄像面20a的面内的扫描方向(这里是Z方向)变更第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置的至少一者。在该情况下，也可以变更仅第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置的任一者，也可以变更第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置两者。另外，还可以照原样地维持第1摄像区域22A与第2摄像区域22B之间的间隔d而变更第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置两者。
通过变更第1摄像区域22A的位置和第2摄像区域22B的位置，从而在使用例如图4和图5所示的棱柱状的光路差生成构件21(21A和21B)的情况下，能够使入射到第1摄像区域22A的第2光像所通过的光路差生成构件21A的厚度t1、以及入射到第2摄像区域22B的第2光像所通过的光路差生成构件21A的厚度t2发生变化。由此，能够改变前焦点和后焦点的间隔，并调整求出对比度值的差分时的分辨率。
物镜控制部36是控制物镜15的驱动的部分。当物镜控制部36接收从焦点控制部34输出的指示信息时，遵照指示信息的内容，在Z方向上驱动物镜15。由此，调整物镜15相对于试样S的焦点位置。
再有，物镜控制部36在由焦点控制部34得到的焦点位置的解析中不进行物镜15的驱动，另外，直至下一个焦点位置的解析开始前，沿着Z方向仅在一个方向驱动物镜15。图10是表示物镜与载台的距离相对于载台的扫描时间的关系的图。如该图所示，在试样S的扫描中，焦点位置的解析期间A与基于解析结果的物镜驱动期间B交替产生。通过这样在焦点位置的解析中不使物镜15与试样S的位置关系发生变化，从而能够保证焦点位置的解析精度。
载台控制部37是控制载台1的驱动的部分。更具体而言，载台控制部37基于来自操作部31的操作，以规定的速度扫描载置有试样S的载台1。通过该载台1的扫描，第1摄像装置18和第2摄像装置20的试样S的摄像视野相对地依次移动。载台1的扫描方向如图11(a)所示可以是在一个分割区域40的扫描结束时直至载台1的位置返回至扫描开始位置后在同一方向上扫描下一个分割区域40的单向扫描，如图11(b)所示也可以是在一个分割区域40的扫描结束后使载台1在与扫描方向正交的方向上移动并在相反方向扫上描下一个分割区域40的双向扫描。
另外，图像取得之间的载台1的扫描速度是一定的，但是实际上扫描刚开始后由于载台1的振动等的影响而存在扫描速度不稳定的期间。因此，如图12所示，优选设定比分割区域40长的扫描宽度，使载台1加速的加速期间C、直至载台1的扫描速度稳定化的稳定化期间D、以及载台1减速的减速期间F的各个在扫描分割区域40的更外侧时产生。由此，可以匹配载台1的扫描速度为一定的一定速度期间E来进行图像取得。再有，可以在稳定化期间D中开始摄像，并在图像取得后删除在稳定化期间D中所取得的数据部分。这样的方法在使用需要数据的查找的摄像装置的情况下是适合的。
图像生成部38是生成将所取得的图像合成并生成虚拟微观图像的部分。图像生成部38依次接收从第1摄像装置18输出的第1图像即各分割区域40的图像，并将它们合成来合成试样S的整体图像。然后，基于该合成图像制作比其低的分辨率的图像，使高分辨率的图像与低分辨率的图像产生关联并储存于虚拟微观图像储存部39。在虚拟微观图像储存部39中，也可以进一步也使由宏观图像取得装置M1取得的图像产生关联。虚拟微观图像可以作为1幅图像储存，也可以作为分割成多个后的图像储存。
光路长度差变更部50是变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差的部分。光路长度差变更部50具备使第1摄像装置18沿着第1光路L1的光轴方向在两个方向上驱动达任意距离的功能。另外，光路长度差变更部50具备使第2摄像装置20沿着第2光路L2的光轴方向在两个方向上驱动达任意距离的功能。另外，光路长度差变更部50具备对区域控制部35输出第2摄像装置20的摄像位置20的摄像面20a的第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置进行变更的主旨的指示信息的功能。即，光路长度差变更部50具备经由区域控制部35来变更第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置的功能。
光路长度差变更部50通过使用上述功能来变更第1摄像装置18的位置、第2摄像装置20的位置或者第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置，从而能够变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差。通过基于预先确定的目标焦点间隔dz来进行利用光路长度差变更部50的光路长度差变更处理，从而可以通过第1摄像装置18取得在试样S的深度方向上偏移目标焦点间隔dz的位置附近焦点匹配的第1图像。即，图像取得装置M可以取得由试样S的深度方向(Z方向)上的多个第1图像构成的Z叠层图像。以下，就其具体的方法进行说明。
图13是为了说明由图像取得装置取得的Z叠层图像而使用的图，表示沿着与在载台1的扫描方向(X方向)和试样S的深度方向(Z方向)的任一者均平行的平面(XZ平面)切断试样S和载台1后的截面形状。在该图中由曲线表示的线Z0表示试样S的表面形状(起伏)的线。另外，线Z1和Z2表示使线Z0在Z方向上每偏移规定的目标焦点间隔dz而移动的线。在图像取得装置M中，如上述那样，焦点控制部34控制由第1摄像装置18进行的摄像的焦点位置，同时载台控制部37扫描载台1(即实施动态聚焦)。因此，根据图像取得装置M，得到由不是以与载台面平行的XY平面切开试样后的图像(参照图16)，而是沿着与试样S的表面形状(起伏)大致相似的曲面(例如线Z0、Z1和Z2等)切开试样后的图像构成的Z叠层图像。如此，根据图像取得装置M，能够取得在各层焦点匹配的图像。通过这样在试样S的内部的各层焦点匹配的状态下进行动态聚焦，从而能够取得相对于试样S内部的细胞焦点匹配的Z叠层图像。另外，与由现有的图像取得装置取得的Z叠层图像相比较，能够以更少的幅数的图像(例如线Z0、Z1和Z2三层)得到关于试样S的深度方向更多的信息。
以下，为了使说明变得简单，以通过焦点控制部34控制由第1摄像装置18进行的摄像的焦点位置同时载台控制部37扫描载台1而得到的第1图像的焦点位置的轨迹(以下称“焦点轨迹”)跟随线Z0的方式配置各装置的状态作为初始状态。然后，就为了由第1摄像装置18取得在将线Z0在试样S的深度方向上平行移动达目标焦点间隔dz的线Z1所表示的位置附近匹配焦点的第1图像，光路长度差变更部50进行的光路长度差变更处理进行说明。
(第1例)
光路长度差变更部50使光路差生成构件21和第2摄像装置20从初始状态沿着第2光路L2的光轴方向移动达由下式(1)算出的移动距离。例如在沿着光轴在相对于光的行进方向相反的方向(图2的箭头A)上取得Z叠层图像的情况下，只要使光路差生成构件21和第2摄像装置20沿着光轴在相对于光的行进方向相反的方向(图2的箭头B)上移动即可。再有，在沿着光轴在光的行进方向(与箭头A相反的方向)上取得Z叠层图像的情况下，只要使光路差生成构件21和第2摄像装置20沿着光轴在光的行进方向(与箭头B相反的方向)上移动即可。因此，Z叠层相对于沿着光轴的光的行进方向的取得方向与光路差生成构件21和第2摄像装置20的移动方向的关系成为相同方向。
移动距离＝目标焦点间隔dz×(第2光路L2的光学倍率的平方)……(1)。
这里，第2光路L2的光学倍率通过从光源12照射的光被光束分离器16反射，通过第2光路L2并直至到达第2摄像装置20而经过的物镜15和视野调整透镜19的倍率之积来求得。
(第2例)
光路长度差变更部50使第1摄像装置18从初始状态沿着第1光路L1的光轴方向移动达由下式(2)算出的移动距离。例如在沿着光轴在相对于光的行进方向相反的方向(箭头A)上取得Z叠层图像的情况下，只要使第1摄像装置18沿着光轴在相对于光的行进方向相反的方向(图2的箭头C)上移动即可。再有，在沿着光轴在光的行进方向(与箭头A相反的方向)上取得Z叠层图像的情况下，只要使第1摄像装置18沿着光轴在光的行进方向(与箭头C相反的方向)上移动即可。因此，Z叠层相对于沿着光轴的光的行进方向的取得方向与第1摄像装置18的移动方向的关系成为相同方向。
移动距离＝目标焦点间隔dz×(第1光路L1的光学倍率的平方)……(2)。
这里，第1光路L1的光学倍率通过从光源12照射的光通过光束分离器16，并通过第1光路L1并直至到达第1摄像装置18而经过的物镜15和视野调整透镜17的倍率之积来求得。
(第3例)
作为光路差生成构件21，使用具有沿着摄像面20a的面内方向厚度连续变化的部分的构件。另外，光路长度差变更部50从初始状态经由区域控制部35，基于相对于摄像面20a的面内方向的光路差生成构件21的厚度的变化的比例以及目标焦点间隔dz来变更第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置。就例如使用图5所示的光路差生成构件21B作为光路差生成构件21的情况，使用图14具体地说明。
图14(a)是表示初始状态下的第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置的图。距离S1表示从摄像面20a的面内方向上的第2摄像装置20的一个端部(与摄像面20a相对的光路差生成构件21B的厚度小的侧的端部)到第1摄像区域22A的中心位置的距离。角度θ表示在光路差生成构件21B中与第2摄像装置20的摄像面20a相对的平面与斜面所成的角度(锐角)。这里，角度θ起到作为表示相对于摄像面20a的面内方向的光路差生成构件21的厚度的变化的比例的参数的作用。
图14(b)是表示从初始状态将第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置分别沿着摄像面20a的面内方向(与箭头A和箭头C相同的方向)变更到相隔达变更距离ΔS1的位置后的状态的图。距离S1′表示在摄像面20a的面内方向上的从第2摄像装置20的一个端部到变更后的第1摄像区域22A的中心位置的距离。距离S1′由距离S1与变更距离ΔS1之和表示(S1′＝S1+ΔS1)。另外，厚度t1′表示入射到变更后的第1摄像区域22A的第2光像所通过的光路差生成构件21B的厚度。厚度差分Δt1由变更后的厚度t1′与变更前的厚度t1的差分表示(Δt1＝t1′-t1)。
这里，第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置的变更距离ΔS1在令光路差生成构件21B的折射率为折射率n时由下式(3)算出。
ΔS1＝A/B……(3)
A＝目标焦点间隔dz×(第2光路L2的光路倍率的平方)
B＝(1-1/n)×tanθ
当在光路长度差变更部50通过上述的第1例至第3例所示的任一种方法变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差之后，焦点控制部34控制由第1摄像装置18进行的摄像的焦点位置，同时载台控制部37扫描载台1时，焦点轨迹跟随在试样S的深度方向上与线Z0偏移达目标焦点间隔dz的线Z1。由此，第1摄像装置18能够取得在试样S的深度方向上偏移目标焦点间隔dz的线Z1所表示的位置附近焦点匹配的第1图像。
因此，每当通过上述的例子所示的方法变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差时，进行利用焦点控制部34的焦点控制、利用载台控制部37的载台扫描、以及利用第1摄像装置18的第1图像的取得，由此能够取得在试样S的各层(例如线Z0、线Z1、线Z2等)焦点匹配的第1图像。再有，作为变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差的光路长度差变更部50，不限于第1例至第3例，也可以成为在光路中配置液晶透镜等能够变更光路长度的光学构件，并控制光学构件的结构，也可以是其他结构。
另外，上述的各例中所示的式(1)～(3)为理论式，第1光路L1的光学倍率和第2光路L2的光学倍率等根据实际的装置结构可以有稍许不同。因此，也可以用若干样品进行测定来取得修正值，并基于该修正值进行校准。
接着，就上述的图像取得装置M的动作进行说明。
图15是图像取得装置M的动作的流程图。如该图所示，在图像取得装置M中，首先进行由宏观图像取得装置M1进行的试样S的宏观图像的取得(步骤S01)。所取得的宏观图像例如使用规定的阈值被二值化后，由监视器32显示，并通过使用规定的程序的自动设定或者操作者的手动设定，设定从宏观图像中取得微观图像的范围(步骤S02)。
接着，试样S被移送到微观图像取得装置M2侧，进行焦点取得条件的设定(步骤S03)。这里，如上述那样，基于载台1的扫描速度v、以及第1摄像区域22A与第2摄像区域22B之间的间隔d，设定直至第2摄像区域22B的摄像开始的等待时间W。更优选地，考虑第1摄像区域22A的摄像的曝光时间el、以及从解除第1摄像区域22A的设定开始到设定第2摄像区域22B的时间st等。
在设定焦点取得条件后，开始载台1的扫描，进行利用微观图像取得装置M2的试样S的各分割区域40的微观图像的取得(步骤S04)。第1摄像装置18的微观图像的取得时，在第2摄像装置20中通过第1摄像区域22A和第2摄像区域22B基于前焦点的对比度值与后焦点的对比度值的差分解析透镜15相对于试样S的偏移方向，实时实行物镜15的位置的调整。在就全部分割区域40微观图像的取得结束后，合成所取得的微观图像，生成虚拟微观图像(步骤S05)。通过步骤S04和S05的处理，取得构成Z叠层图像的一层中的虚拟微观图像(例如在图13所示的线Z0所表示的位置附近焦点匹配的图像)。
接着，判断是否取得构成Z叠层图像的全部图像(虚拟微观图像)(步骤S06)。这里，构成Z叠层图像的全部图像是指例如预先设定的每个规定的目标焦点间隔dz的试样的全部深度位置的图像。如果未取得构成所期望的Z叠层图像的全部图像(步骤06：否)，则基于规定的目标焦点间隔dz通过上述的任意的方法(或者其组合)来变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差(步骤S07)。其后，通过再次进行由步骤S04和步骤S05进行的处理，从而取得有关试样S的在不同深度位置焦点匹配的图像(例如在图13所示的线Z1所表示的位置附近焦点匹配的图像)。如果取得构成Z叠层图像的全部图像，则结束处理(步骤06：是)。
如以上说明所述，在图像取得装置M中，具备变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差的光路长度差变更部50。由第1摄像位置18进行的摄像的焦点位置对应于由光路长度差变更部50变更的上述光路长度差在试样S的深度方向上变化(移动)。因此，每当光路长度差变更部50基于规定的目标焦点间隔dz变更上述光路长度差时，焦点控制部34控制由第1摄像装置18进行的摄像的焦点位置同时载台控制部37扫描载台1，并且第1摄像装置18取得第1图像，由此能够容易取得由根据上述光路长度差的变更的试样S的深度方向上的第1图像构成的Z叠层图像。
具体而言，通过光路长度差变更部50使第2摄像装置20沿着第2光路L2的光轴方向移动达由将目标焦点间隔dz包含在参数中的上式(1)算出的移动距离，从而能够变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差，并取得每个目标焦点间隔dz的多个焦点位置的第1图像。
另外，通过光路长度差变更部50使第1摄像装置18沿着第1光路L1的光轴方向移动达由将目标焦点间隔dz包含在参数中的上式(2)算出的移动距离，从而也能够变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差，并取得每个目标焦点间隔dz的多个焦点位置的第1图像。
另外，在使用具有沿着摄像面20a的面内方向厚度连续变化的部分并且沿着摄像面20a的面内方向在第2光像产生光路差的光路差生成构件21(例如光路差生成构件21B)作为光路差生成构件21的情况下，通过光路长度差变更部50变更第1摄像区域22A和第2摄像区域22B的设定位置达基于相对于摄像面20a的面内方向的上述厚度的变化的比例以及目标焦点间隔dz所确定的变更距离，也能够变更第1光路L1与第2光路L2的光路长度差，并取得每个目标焦点间隔dz的多个焦点位置的第1图像。
在上述的实施方式中，例示了生成虚拟微观图像的装置，但是本发明所涉及的图像取得装置只要是通过载台等一边以规定的速度扫描试样一边取得图像的装置，便能够适用于各种装置。

Claims (8)

1.一种图像取得装置，其特征在于，
具备：
载台，其载置有试样；
载台控制机构，其以规定的速度扫描所述载台；
光源，其朝向所述试样照射光；
导光光学系统，其包含将所述试样的光像向图像取得用的第1光路和焦点控制用的第2光路分支的光分支机构；
第1摄像机构，其取得由向所述第1光路分支的第1光像得到的第1图像；
第2摄像机构，其取得由向所述第2光路分支的第2光像得到的第2图像；
焦点控制机构，其解析所述第2图像，并基于该解析结果控制由所述第1摄像机构进行的摄像的焦点位置；以及
光路长度差变更机构，其基于规定的目标焦点间隔变更所述第1光路与所述第2光路的光路长度差，
每当所述光路长度差变更机构变更所述光路长度差时，所述焦点控制机构控制所述焦点位置，同时所述载台控制机构扫描所述载台，并且所述第1摄像机构取得所述第1图像，由此取得由所述试样的深度方向上的多个所述第1图像构成的Z叠层图像。
2.如权利要求1所述的图像取得装置，其特征在于，
所述光路长度差变更机构基于由下式(1)算出的移动距离，使所述第2摄像机构沿着所述第2光路的光轴方向移动，
移动距离＝所述目标焦点间隔×(所述第2光路的光学倍率的平方)……(1)。
3.如权利要求1或2所述的图像取得装置，其特征在于，
所述光路长度差变更机构基于由下式(2)算出的移动距离，使所述第1摄像机构沿着所述第1光路的光轴方向移动，
移动距离＝所述目标焦点间隔×(所述第1光路的光学倍率的平方)……(2)。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的图像取得装置，其特征在于，
还具备：
区域控制机构，其在所述第2摄像机构的摄像面，设定取得所述第2光像的一部分图像的第1摄像区域和第2摄像区域；以及
光路差生成构件，其配置在所述第2光路，具有沿着所述摄像面的面内方向厚度连续变化的部分，并使所述第2光像沿着所述摄像面的面内方向产生光路差，
所述光路长度差变更机构使所述区域控制机构基于相对于所述摄像面的面内方向的所述厚度的变化的比例和所述目标焦点间隔来变更所述第1摄像区域和所述第2摄像区域的设定位置。
5.一种图像取得方法，其特征在于，
是利用图像取得装置的图像取得方法，
所述图像取得装置具备：
载台，其载置有试样；
载台控制机构，其以规定的速度扫描所述载台；
光源，其朝向所述试样照射光；
导光光学系统，其包含将所述试样的光像向图像取得用的第1光路和焦点控制用的第2光路分支的光分支机构；
第1摄像机构，其取得由向所述第1光路分支的第1光像得到的第1图像；
第2摄像机构，其取得由向所述第2光路分支的第2光像得到的第2图像；
焦点控制机构，其解析所述第2图像，并基于该解析结果控制由所述第1摄像机构进行的摄像的焦点位置；以及
光路长度差变更机构，其基于规定的目标焦点间隔变更所述第1光路与所述第2光路的光路长度差，
每当由所述光路长度差变更机构变更所述光路长度差时，一边由所述焦点控制机构控制所述焦点位置，一边由所述载台控制机构扫描所述载台，并且由所述第1摄像机构取得所述第1图像，由此取得由所述试样的深度方向上的多个所述第1图像构成的Z叠层图像。
6.如权利要求5所述的图像取得方法，其特征在于，
通过所述光路长度差变更机构，基于由下式(1)算出的移动距离，使所述第2摄像机构沿着所述第2光路的光轴方向移动，
移动距离＝所述目标焦点间隔×(所述第2光路的光学倍率的平方)……(1)。
7.如权利要求5或6所述的图像取得方法，其特征在于，
通过所述光路长度差变更机构，基于由下式(2)算出的移动距离，使所述第1摄像机构沿着所述第1光路的光轴方向移动，
移动距离＝所述目标焦点间隔×(所述第1光路的光学倍率的平方)……(2)。
8.如权利要求5～7中的任一项所述的图像取得方法，其特征在于，
所述图像取得装置还具备：
区域控制机构，其在所述第2摄像机构的摄像面，设定取得所述第2光像的一部分图像的第1摄像区域和第2摄像区域；以及
光路差生成构件，其配置在所述第2光路，具有沿着所述摄像面的面内方向厚度连续变化的部分，并使所述第2光像沿着所述摄像面的面内方向产生光路差，
通过所述区域控制机构，基于相对于所述摄像面的面内方向的所述厚度的变化的比例和所述目标焦点间隔来变更所述第1摄像区域和所述第2摄像区域的设定位置。
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