JP4700299B2 - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents
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Description
また、共焦点走査型顕微鏡は、試料をスポット光で二次元走査し、かつ、光軸方向となるZ軸方向に所定のピッチで焦点を移動して光軸方向に複数のスライス像を取得することで、結果的に三次元空間のスライス像(以下三次元画像と称す)が得られることになる。
本発明は上記のような実情に鑑みてなされたものであり、上記のように指示することで、注目する領域を走査するときに、各々の三次元走査領域を直感的に設定可能で、各走査領域に対し詳細な走査を行うことができる共焦点走査型顕微鏡、及び三次元走査領域指定方法を提供することにある。
本発明によれば、利用者はプレビューした三次元画像を立体的に見ることで、詳細な観察を行う際に、注目する領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。
さらに、取得した三次元情報から三次元像を構築し表示することで利用者は試料の観察を、簡単にまた詳細まで行うことが可能である。
前記表示された前記三次元像の複数の位置を指定し、前記指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する、前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する、ことを特徴とする
本発明によれば、利用者はプレビューした三次元画像を立体的に見ることで、詳細な観察を行う際に、注目する領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。
請求項6記載の発明は、コンピュータに、光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する機能と、前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築する三次元像構築機能と、前記三次元像を表示する表示機能と、前記表示機能で表示された前記三次元像の複数の位置を指定する指定機能と、前記指定機能によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する走査領域設定機能と、前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する詳細走査機能と、を実現させるためのプログラム。
以下、本発明の第1の実施形態を図を用いて説明する。尚、実施例においては共焦点走査型顕微鏡を例とするが、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限りその他の共焦点走査型顕微鏡にも適用可能である。
この場合、ステージ7は焦点位置制御部9からの位置情報に従って、Z方向に位置制御されるようになっている。
ここでCPU14、メモリ15、記憶装置13等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。後述する処理はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムは記録媒体であるCD−ROMやハードディスク等に記録されている。
始めに、ステップS1で試料の全体象を把握するために、広域を走査し三次元画像を取得する。このとき、低解像度で走査することでメモリ容量を減らすことができ、走査時間を短縮することも可能である。次に、ステップS2において、ステップS1で取得した広域の三次元画像を基にPC12上で試料の三次元表示像を構築し、表示装置16上に表示する。そして、ステップS3で表示装置16に表示された三次元画像中に利用者は注目領域を指示する。
ステップS5ではメモリ15に記録した詳細走査領域の情報に基づき、詳細走査領域に沿って再走査を行うことで上記注目領域の三次元情報を取得する。
次に、図2のフローチャートの各ステップを具体的に説明する。まず、図2のステップS1で広域の三次元像を取得する。
始めに、S2_1で焦点位置制御部9にX方向、Y方向、Z方向の初期位置情報を設定する。この位置情報に従ってX方向スキャナ4とY方向スキャナ5とステージ7は初期位置である広域走査開始位置に移動する。次に、S2_2で光源1からレーザ光を出力し、試料8にレーザ光を照射し、試料8から発せられる蛍光を検出する。蛍光の検出データは、前述のように光検出器10、A/D変換器11を経てPC12に送られる。
そして、Y方向への走査が終了するまで上記蛍光の検出処理を繰り返し、Y方向への走査が完了すると二次元スライス像が取得され、S2_7でステージ7を駆動し、Z方向に1ステップ移動する。
Z方向の走査が完了していれば、S2_9でPC12に入力した情報をメモリ15に格納する。このとき、試料の蛍光情報と共に、広域走査終了時の焦点位置情報P_endをメモリ15に格納しておく。
ここで、三次元画像は上記Z方向に1ステップ移動するごとに取得した複数の二次元スライス像を光軸方向に重ねた二次元スライス画像の束である。
また、表示装置16に表示する三次元画像の全ての軸には、原点である広域走査開始位置からの相対座標値が表示されており、各軸のサイズは走査領域のX軸、Y軸、Z軸を走査した距離と相似に表示することができる。つまり、X軸に20nm走査したのであれば画像上に20nmに対応した長さのX軸が表示される。尚、表示の仕方はこの表示方法に限るものではなく、三次元像を的確に示す表示であればよい。例えば、各軸上に目盛りを表示してもよいし、利用者がマウス等で指示した座標を表示してもよい。
また、ステップS1で行った広域の走査によって表示される画像は、試料の三次元形状が確認できるものであればよく、その構築方法や、表示手段は問わない。
また、PC12に接続した入力装置17としてコンピュータのマウスを使って指定する例を示したが、指定方法はマウスに限定されるものではなく、注目領域を指示する他の方法に種々変形可能である。
次に、観察者はマウスを使用して、表示装置16に表示された断面図c上に注目領域dを描画する。注目領域は、長方形、円など任意の形状でよい。ここでは長方形として説明する。
次に図2のステップS4における詳細走査領域計算について説明する。以下では代表例として、上記説明した注目領域eの詳細走査領域計算について、他の注目領域を除き、注目領域eに注目した図7を用いて説明をする。
また、メモリ15には三次元表示像取得時の走査終了位置情報P_endと、現在のレーザ焦点位置Pが、ハードウェアから取得した絶対位置で記憶されている。よって、注目領域e走査開始位置iまでの移動ベクトルVは式1を利用することで以下の式2で得られる。式2で求めたVに基づきレーザ焦点を注目領域の走査開始位置に移動することができる。
次に注目領域eの走査におけるX軸、Y軸、Z軸の走査幅を制御するために、X方向スキャナ4、Y方向スキャナ5、ステージ7の動作を制御する電気信号の変動を設定する。
V'y=Vy*(S/W)*(T/H) ・・・ (3)
同様にZ軸に対しても三次元表示像aのZ方向の画素数D、注目領域eのZ方向の画素数u、三次元表示像a取得時のステージ7制御用の電圧相Vzから、詳細走査時のステージ7制御用の電圧幅V'zは以下の式4で得る。
さらに、メモリ15に記憶しているZ方向のサンプリング数n(Z軸のスライス枚数)と、注目領域のZ方向距離Dzから1ステップ辺りのステージ移動距離Dz/nを算出する。
次に、図2のS5、S6における詳細走査の処理を図9を用いて具体的に説明する。
本実施例では最初にメモリ15から読み出す走査条件を注目領域eとして説明するが、走査条件を読み出す順序は任意選択可能である。
尚、上記構成において、Z方向の移動はステージ7を用いていたが、対物レンズを移動してもよい。
2 ・・・ 顕微鏡本体
3 ・・・ ダイクロイックミラー
4 ・・・ Xスキャナ
5 ・・・ Yスキャナ
6 ・・・ 対物レンズ
7 ・・・ ステージ
8 ・・・ 試料(標本)
9 ・・・ 焦点位置制御部
10 ・・・ 光検出器
11 ・・・ A/D変換器
12 ・・・ PC
13 ・・・ 記憶装置
14 ・・・ CPU
15 ・・・ メモリ
16 ・・・ 表示装置
17 ・・・ 入力装置
Claims (8)
- 光源から出射し試料上に集束する光を当該試料上で2次元走査する走査手段と、
前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する光軸方向移動手段と、
前記走査手段により広域を走査して得られる前記試料からの光の強度を検出し、前記光軸方向移動手段により集光位置を変化させて取得した複数の二次元情報から、広域の三次元像を構築する広域三次元像構築手段と、
前記広域の三次元像を立体的に表示する表示手段と、
前記表示手段で表示された広域三次元像の複数の位置を当該立体的な表示上で指定する指定手段と、
前記指定手段によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、前記広域三次元像の一部分である複数の三次元的な詳細走査領域を設定する詳細走査領域設定手段と、
前記複数の詳細走査領域を前記広域走査より高い解像度で、前記走査手段及び前記光軸移動手段により順次走査して当該走査領域からの光の強度を検出し、前記設定された各詳細領域の試料の三次元情報を取得する詳細三次元像取得手段と、
を具備することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。 - 前記広域走査の走査回数と前記詳細走査の走査回数とは異なることを特徴とする請求項1に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
- 前記指定手段は、表示された広域の三次元像の点または二次元領域の位置指定を入力するとともに、位置指定された前記点または前記二次元領域を中心とする三次元領域の光軸方向への伸縮の指定を行うことを特徴とする請求項1に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
- 前記指定手段は、点の周辺を指定することを特徴とする請求項1に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
- 前記指定手段は、二次元領域で指定することを特徴とする請求項1に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
- 前記指定手段は、三次元領域で指定することを特徴とする請求項1に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
- 光源から出射し試料上に集束する光を当該試料上で2次元走査し、
前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動し、
前記2次元走査により広域を走査して得られる前記試料からの光の強度を検出し集光位置を変化させて取得した複数の二次元情報から、広域の三次元像を構築し、
前記広域の三次元像を立体的に表示し、
前記表示された広域三次元像の複数の位置を当該立体的な表示上で指定し、
前記指定されたそれぞれの位置に基づいて、前記広域三次元像の一部分である複数の三次元的な詳細走査領域を設定し、
前記複数の詳細走査領域を前記広域走査より高い解像度で、順次走査して当該走査領域からの光の強度を検出し、前記設定された各詳細領域の試料の三次元情報を取得する、
ことを特徴とする走査領域指定方法。 - コンピュータに、
光源から出射し試料上に集束する光を当該試料上で2次元走査させる走査機能と、
前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動させる光軸方向移動機能と、
前記走査機能により広域を走査して得られる前記試料からの光の強度を検出し、前記光軸方向移動機能により集光位置を変化させて取得した複数の二次元情報から、広域の三次元像を構築させる広域三次元像構築機能と、
前記広域の三次元像を立体的に表示させる表示機能と、
表示された広域三次元像の複数の位置を当該立体的な表示上で指定させる指定機能と、
前記指定機能によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、前記広域三次元像の一部分である複数の三次元的な詳細走査領域を設定させる詳細走査領域設定機能と、
前記複数の詳細走査領域を前記広域走査より高い解像度で、前記走査機能及び前記光軸移動機能により順次走査して当該走査領域からの光の強度を検出し、前記設定された各詳細領域の試料の三次元情報を取得させる詳細三次元像取得機能と、
を実行させるためのプログラム。
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