JP2011237616A - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】より簡単かつ迅速に試料の観察対象の領域の画像を得ることができるようにする。
【解決手段】走査型の共焦点顕微鏡において、照明光で試料の観察面を走査させ、連続して各時刻の観察面の観察画像Ｒ１１を取得する。１回目の走査では、共焦点顕微鏡は、観察面全体を照明光で走査し、得られた観察画像Ｒ１１のｘ方向に並ぶ画素からなるラインのうち、所定の輝度値以上の画素があるラインを、観察対象とすべき観察対象ラインとして、観察対象ラインを示すライン情報を記録する。そして、２回目以降の走査では、共焦点顕微鏡は、ライン情報に示される観察対象ラインに対応する観察面の領域のみが走査されるように、観察面の走査を制御する。これにより、蛍光領域Ｗ１１など、観察すべき部位のある領域のみを走査して、より簡単かつ迅速に観察対象となる部位の画像を得ることができる。本発明は、走査型の共焦点顕微鏡に適用することができる。
【選択図】図３

Description

本発明は、より簡単かつ迅速に、試料における観察対象の領域の画像を得ることができるようにした走査型顕微鏡に関する。

従来、スキャナを利用して観察対象の試料の観察面を照明光で走査し、走査により生じた観察光を受光して、試料を観察する走査型の共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。

このような共焦点顕微鏡では、各時刻における観察面の画像が１フレーム分の観察画像として順次、取得される。例えば、所定のフレームが取得された時点で、ユーザによりそのフレームの観察画像から、観察すべき部位が含まれる興味領域、すなわちいわゆるROI（Region of Interest）領域が指定されたとする。すると、共焦点顕微鏡は、その後のフレームにおいて、指定された興味領域に対応する観察面上の領域（以下、興味対応領域と称する）のみ照明光での走査を行い、各フレームの観察画像を取得する。

このように、ユーザが興味領域を指定すれば、それ以降においては、試料の観察面上の興味対応領域だけに照明光が照射されるようになるため、より迅速に興味領域の観察画像を得ることができる。これにより、より短い時間間隔で観察画像の取得が可能となり、例えば、試料の興味対応領域の状態が微小時間で変化する場合であっても、詳細に興味対応領域の状態の変化を観察することができる。

特開２００６−３１０１１号公報

しかしながら、上述した技術では、興味領域の指定はユーザにより行なわれるため、特に興味領域が小さい場合や、興味領域が複数ある場合には、興味領域の指定に時間がかかってしまい、非効率的であった。ユーザが興味領域の指定に手間取ってしまうと、興味領域を指定している間に、興味対応領域の状態が変化してしまい、結局、興味対応領域の状態の変化を充分に観察することができなくなってしまう場合があった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単かつ迅速に試料における観察対象の領域の画像を得ることができるようにするものである。

本発明の走査型顕微鏡は、光源からの照明光で試料の観察面を走査させるスキャナと、前記照明光の走査により生じた前記観察面からの観察光を受光して、受光した前記観察光の強度に応じた電気信号を出力する検出手段と、前記観察面の観察画像上の所定方向に並ぶ画素からなるラインについて、前記電気信号を用いて、前記ラインを構成する前記画素の画素値からなるラインデータを生成し、前記ラインデータに基づいて、前記ラインに対応する前記観察面の領域に観察すべき領域があるかを特定し、前記観察すべき領域があるとされた前記ラインを示すライン情報を生成する画像生成手段と、前記ライン情報を記録する記録手段と、前記記録手段に記録された前記ライン情報が示す前記ラインに対応する前記観察面の領域が前記照明光で走査されるように、前記スキャナによる走査を制御する走査制御手段とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、より簡単かつ迅速に試料における観察対象の領域の画像を得ることができる。

本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。 １回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。 観察対象ラインについて説明する図である。 ２回目の走査について説明する図である。 ２回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。 試料の複数の観察面について説明する図である。 １回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。 ２回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

〈第１の実施の形態〉
［観察システムの構成］
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。

この観察システムは、走査型の共焦点顕微鏡１１、コントローラ１２、およびコンピュータ１３から構成される。

図１の観察システムでは、観察対象の試料１４が共焦点顕微鏡１１のステージ２１上に載置されて観察される。すなわち、共焦点顕微鏡１１では、レーザ２２から射出された励起光としての照明光が、ダイクロイックミラー２３で反射されてスキャナ２４に入射し、スキャナ２４により偏向される。そして、スキャナ２４で光路が変更された照明光は、対物レンズ２５を通って、試料１４の観察面に照射される。このとき、スキャナ２４が照明光を偏向させることで、試料１４の観察面が照明光で走査される。例えば、スキャナ２４は、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナから構成される。

試料１４の観察面が照明光で走査されると、観察面からは蛍光が生じ、この蛍光（以下、観察光と称する）は、対物レンズ２５を通ってスキャナ２４に入射する。そして、スキャナ２４によりデスキャンされた観察光は、ダイクロイックミラー２３を透過し、さらにピンホール２６を通って検出器２７により受光される。

なお、より詳細には、観察光のうち、試料１４の観察に必要な特定の波長の光だけが、ダイクロイックミラー２３を透過するようになされている。また、ピンホール２６は、対物レンズ２５の焦点位置、つまり試料１４の観察面と共役な位置に配置されており、ピンホール２６の位置に集光された観察光だけが検出器２７に入射するようになされている。

検出器２７は、入射した観察光を受光して光電変換することで、観察光を、観察光の受光強度を示す電気信号に変換する。光電変換により得られた電気信号は、検出器２７からコントローラ１２へと供給される。コントローラ１２は、検出器２７から供給された電気信号に基づいて、試料１４の観察面の画像である観察画像を生成し、コンピュータ１３に供給するとともに、共焦点顕微鏡１１の動作を制御する。例えば、観察画像は、各時刻における試料１４の観察面の画像、つまり複数フレームの画像からなる動画像とされる。

コントローラ１２は、コントローラ１２全体を制御するＣＰＵ（Central Processing Unit）２８、観察画像を生成する画像取得部２９、スキャナ２４の動作を制御する走査制御部３０、およびレーザ２２の動作を制御するレーザ制御部３１から構成される。

画像取得部２９は、検出器２７から供給された電気信号に基づいて、観察画像の各画素の輝度値（画素値）を算出することで、観察画像を生成する。また、画像取得部２９は、観察画像上の所定方向に並ぶ複数画素からなるラインのデータを用いて、そのラインに対応する試料１４の観察面上の領域に、観察すべき部位が含まれているか否かを判定する。

なお、以下、観察画像のラインに対応する試料１４の観察面上の領域を、ライン対応領域とも称することとする。つまり、試料１４におけるライン対応領域から生じた観察光を受光して得られる観察画像の領域が、ライン対応領域に対応するラインとなる。換言すれば、観察画像上のラインには、そのラインに対応する試料１４の観察面のライン対応領域の画像が表示される。また、以下、観察画像のラインを構成する各画素の輝度値（画素値）からなるデータを、ラインデータとも呼ぶこととする。

画像取得部２９は、試料１４における観察すべき部位が含まれるライン対応領域に対応する、観察画像上のラインを特定すると、特定したライン（以下、特に観察対象ラインと称する）を示すライン情報を走査制御部３０に供給する。例えば、ライン情報として、観察画像における観察対象ラインの位置を特定するライン番号が走査制御部３０に供給される。

走査制御部３０は、画像取得部２９から供給されたライン情報を、内蔵するＲＡＭ（Random Access Memory）３０Ａに供給して記録させる。また、走査制御部３０は、ＲＡＭ３０Ａに記録されているライン情報を読み出して、試料１４の観察面のうち、読み出したライン情報により示される観察対象ラインに対応するライン対応領域のみが、照明光で走査されるように、スキャナ２４の動作を制御する。

コンピュータ１３は、予め記録しているソフトウェア３２を実行することで、コントローラ１２を制御したり、コントローラ１２から供給された観察画像を表示したりする。

［観察システムの動作］
ところで、ユーザがコンピュータ１３を操作して、試料１４の観察を指示すると、コンピュータ１３は、ユーザの操作に応じて、コントローラ１２に試料１４の観察の開始を指示する。また、このとき、コンピュータ１３は、観察画像の各画素の輝度値の算出方法を示す情報や、観察対象ラインの判定に用いる閾値等のパラメータを、ＣＰＵ２８を介して画像取得部２９に供給する。

すると、コントローラ１２は、コンピュータ１３の指示に従って、走査制御処理を実行し、試料１４の観察を開始する。この走査制御処理は、観察画像のフレームごとに行なわれる。試料１４の観察時においては、コントローラ１２は、１回目の走査制御処理により、試料１４の観察面全体の観察画像を取得し、この観察画像から観察対象ラインを特定する。そして、２回目以降の走査制御処理では、コントローラ１２は、観察対象ラインに対応するライン対応領域のみ照明光で走査し、試料１４の観察画像を取得する。

以下、走査制御処理の具体的な処理内容について説明する。まず、図２のフローチャートを参照して、１回目の走査制御処理について説明する。

ステップＳ１１において、走査制御部３０は、スキャナ２４を制御して、照明光での試料１４の観察面の走査を開始させる。１回目の走査制御処理では、まだ観察対象ラインについての情報が得られていないので、観察面全体が走査されるように、スキャナ２４が制御される。

より詳細には、まずレーザ制御部３１が、光源としてのレーザ２２を制御し、所定のパワーでレーザ２２から照明光を射出させる。この照明光は、ダイクロイックミラー２３で反射され、スキャナ２４および対物レンズ２５を通って試料１４の観察面に照射される。このとき、走査制御部３０はスキャナ２４を制御して、照明光で観察面を走査させる。

観察面に照明光が照射されると、観察面からは観察光が生じ、この観察光は対物レンズ２５、スキャナ２４、ダイクロイックミラー２３、およびピンホール２６を通って検出器２７に受光される。検出器２７は、入射した観察光を受光して電気信号に変換し、画像取得部２９に供給する。

ステップＳ１２において、画像取得部２９は、コンピュータ１３から供給された輝度値の算出方法を示す情報を用いた演算を行って、検出器２７から供給された電気信号から観察画像の画素の輝度値を算出する。この輝度値の算出は、画素単位で行なわれる。つまり、電気信号が供給されるたびに、１画素分ずつ輝度値が算出されていく。

ステップＳ１３において、画像取得部２９は、得られた画素の輝度値から、予め定められた画像フォーマットに従って、観察画像上の１ライン分のラインデータを生成していく。そして、コントローラ１２全体の動作を制御するＣＰＵ２８から画像取得部２９に、観察画像の１ライン分に相当する領域の走査が終了した、つまり照明光がライン終端に到達した旨の信号が供給されると、処理はステップＳ１３からステップＳ１４へと進む。

ステップＳ１４において、画像取得部２９は、得られた１ライン分のラインデータを、ＣＰＵ２８を介してコンピュータ１３に供給する。コンピュータ１３に供給されたラインデータは、観察画像の１ライン分のデータとして、図示せぬ記録部に記録されたり、ディスプレイに表示されたりする。

ステップＳ１５において、画像取得部２９は、得られた１ライン分のラインデータに基づいて、そのラインに対応する試料１４のライン対応領域に、観察すべき部位が含まれているか否かを判定する。

例えば、画像取得部２９は、処理対象となっているラインを構成する各画素の輝度値と、コンピュータ１３から供給された観察対象ラインの判定用の閾値とを比較する。そして、画像取得部２９は、輝度値が閾値以上となる画素がライン上に１つでもある場合、ライン対応領域に観察すべき部位が含まれていると判定する。

一般的に、試料１４を蛍光観察する場合、観察者は、観察面に励起光を照射したときに蛍光が発せられる部位に注目して試料１４を観察する。したがって、一定の強度以上の蛍光が発せられた試料１４の領域に対応する観察画像上の領域が、観察者が注目する観察対象の部位の領域となるはずである。

観察画像上の画素のうち、一定の強度以上の蛍光が発せられた試料１４の領域の画素は、一定の値以上の輝度を有しているはずであるから、各画素の輝度値と閾値とを比較すれば、観察画像上において、観察すべき部位を含むライン対応領域を特定することが可能である。そこで、画像取得部２９は、閾値以上の輝度を有する画素が含まれるラインを、観察対象ラインとする。

なお、観察対象ラインの特定は、閾値以上の輝度値の画素があるか否かに限らず、ある程度の強度の蛍光が発せられるライン対応領域に対応するラインを特定できる方法であれば、どのような方法で特定されるようにしてもよい。

例えば、観察画像の１つのラインについて、そのラインを構成する画素の輝度値の積算値、平均値、最大値、最小値、中心値などの値と、予め定めた閾値とを比較することで観察対象ラインとするか否かが判定されてもよい。また、これらの判定方法を組み合わせて観察対象ラインの判定を行なってもよいし、試料１４自体や試料１４の観察条件等の状況に応じて、最適な判定方法が選択されるようにしてもよい。

ステップＳ１５において、ラインに対応するライン対応領域に、観察すべき部位が含まれていないと判定された場合、そのラインは観察対象ラインではないので、ライン情報の記録は行なわれず、処理はステップＳ１７に進む。

これに対して、ステップＳ１５において、ラインに対応するライン対応領域に、観察すべき部位が含まれていると判定された場合、画像取得部２９は、処理対象となっているラインを観察対象ラインとする。そして、画像取得部２９は、そのラインのライン番号をライン情報として走査制御部３０に供給し、その後、処理はステップＳ１５からステップＳ１６に進む。

ステップＳ１６において、走査制御部３０は、画像取得部２９から供給されたライン情報をＲＡＭ３０Ａに格納し、記録させる。

ステップＳ１６においてライン情報が記録されたか、またはステップＳ１５においてライン対応領域に観察すべき部位が含まれていないと判定されると、ステップＳ１７において、画像取得部２９は、試料１４の観察面の走査が終了したか否かを判定する。すなわち、最後に走査が行なわれたライン対応領域が、観察画像上の最終ラインに対応する領域であるか否かが判定される。

ステップＳ１７において、まだ走査が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ１２に戻り、上述した処理が繰り返される。すなわち、観察面上の次の領域が走査対象とされて、その領域の走査が行なわれる。

一方、ステップＳ１７において、走査が終了したと判定された場合、試料１４の観察面全体が走査され、１フレーム分の観察画像が得られたので、１回目の走査制御処理は終了する。

このように、１回目の走査制御処理が終了すると、例えば、図３に示すように、観察画像Ｒ１１に対応する試料１４上の観察面全体が照明光で走査されたことになる。

なお、図３において、観察画像Ｒ１１における１つの円（丸）は、観察面上の蛍光を発する蛍光領域、つまり観察すべき１つの部位を表している。また、図中、横方向をｘ方向とし、縦方向をｙ方向とすると、観察画像Ｒ１１のｘ方向に並ぶ画素からなる領域がラインとされる。

観察面を走査していくと、例えば、図中、右側に示すように観察画像Ｒ１１上の蛍光領域Ｗ１１を含むラインは観察対象ラインとされ、蛍光領域Ｗ１１の図中、上下にある蛍光領域を含まないラインは、観察対象ラインとはされない。図３の例では、蛍光領域Ｗ１１近傍のラインＬ１１乃至ラインＬ１６のうち、蛍光領域Ｗ１１を含むラインＬ１２乃至ラインＬ１５が観察対象ラインとされており、これらのラインを特定するためのライン情報がＲＡＭ３０Ａに格納されることになる。

このようにして、１回目の走査制御処理において、試料１４の観察面全体が走査されると、観察面上の観察すべき部位が含まれるライン対応領域に対応する観察対象ラインのライン情報が得られる。そこで、２回目以降の走査制御処理においては、図４に示すように、ライン情報が利用されて、観察対象ラインに対応する観察面上の領域のみの走査が行なわれる。なお、図４において、図３における場合と対応する部分には同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。

図４の例では、観察画像Ｒ１１の走査領域ＴＲ１１乃至走査領域ＴＲ１７に対応する観察面上の領域にのみ、一定の輝度以上の蛍光を発する蛍光領域が含まれており、走査領域ＴＲ１１乃至走査領域ＴＲ１７を構成するラインが観察対象ラインとされている。例えば、図４では、蛍光領域Ｗ１１を含む走査領域ＴＲ１５は、図３のラインＬ１２乃至ラインＬ１５から構成され、これらのラインが観察対象ラインとされる。

以上のようにして、１回目の走査制御処理が行われ、ＲＡＭ３０Ａにライン情報が格納されると、次に、得られたライン情報が利用されて、２回目の走査制御処理が行われる。以下、図５のフローチャートを参照して、２回目の走査制御処理について説明する。

ステップＳ４１において、走査制御部３０は、ＲＡＭ３０Ａからライン情報を読み出す。具体的には、走査制御部３０は、図３の観察画像Ｒ１１の図中、上側の観察対象ラインから順番に、下方向に処理対象（走査対象）とする観察対象ラインを選択していく。

例えば、観察画像Ｒ１１の図３中、上側の端からｎ番目（但し、１≦ｎ）のラインのライン番号が「ｎ」であり、図３中、上から下方向に走査が行なわれるとする。この場合、最初のライン情報の読み出し時、つまり１回目のステップＳ４１の処理では、走査制御部３０は、最も小さいライン番号を示すライン情報を読み出し、そのライン情報により示される観察対象ラインを処理対象とする。

なお、２回目の走査制御処理の開始時点で、既にレーザ２２から照明光が射出されている状態とされてもよいし、２回目の走査制御処理の開始時に、レーザ制御部３１がレーザ２２から照明光を射出させるようにしてもよい。

ステップＳ４２において、走査制御部３０は、読み出したライン情報に基づいてスキャナ２４を制御し、試料１４の観察面における照明光の照射位置を、処理対象とする観察対象ラインの端に対応する位置、つまりライン対応領域の端の位置に移動させる。

そして、ステップＳ４３において、走査制御部３０は、スキャナ２４の動作を制御して、処理対象とする観察対象ラインに対応するライン対応領域の走査を開始させる。これにより、レーザ２２からの照明光は、ダイクロイックミラー２３乃至対物レンズ２５を通って、試料１４上のライン対応領域に照射される。

ライン対応領域の走査が開始されると、ライン対応領域から生じた観察光は、対物レンズ２５乃至ダイクロイックミラー２３、およびピンホール２６を通って検出器２７に受光され、観察光の受光強度に応じた電気信号が検出器２７から画像取得部２９に供給される。

すると、ステップＳ４４において、画像取得部２９は、コンピュータ１３から供給された輝度値の算出方法を示す情報を用いた演算を行って、検出器２７から供給された電気信号から観察画像の画素の輝度値を算出する。この輝度値の算出は、画素単位で行なわれる。

ステップＳ４５において、画像取得部２９は、得られた画素の輝度値から、予め定められた画像フォーマットに従って、観察画像上の１ライン分のラインデータを生成し、得られたラインデータを、ＣＰＵ２８を介してコンピュータ１３に供給する。コンピュータ１３に供給されたラインデータは、観察画像の１ライン分のデータとして、図示せぬ記録部に記録されたり、ディスプレイに表示されたりする。

ステップＳ４６において、画像取得部２９は、試料１４の観察面の走査が終了したか否かを判定する。すなわち、ＲＡＭ３０Ａに記録されている全てのライン情報が読み出されて、各観察対象ラインに対応するライン対応領域が走査されたか否かが判定される。

ステップＳ４６において、まだ走査が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ４１に戻り、上述した処理が繰り返される。すなわち、次のライン情報が読み出されて、そのライン情報に示される観察対象ラインに対応するライン対応領域の走査が行なわれ、ラインデータが生成される。

一方、ステップＳ４６において、走査が終了したと判定された場合、試料１４の観察対象とすべき全ての領域が走査され、１フレーム分の観察画像が得られたので、２回目の走査制御処理は終了する。

そして、以後、ユーザにより試料１４の観察の終了が指示されるまで、２回目の走査制御処理と同様の処理が繰り返し行われて、各フレームの観察画像が取得され、観察画像の記録または表示が行なわれる。

以上のようにして、コントローラ１２は、観察画像のラインデータを用いて、各ラインに対応するライン対応領域に観察すべき部位があるかを特定し、観察対象ラインを示すライン情報を記録しておく。そして、コントローラ１２は、２回目以降の走査時に、記録されているライン情報を用いて、ライン情報により特定される試料１４上の領域のみ走査を行い、各フレームの観察画像を得る。

したがって、１回の走査が終了した時点で、試料１４における観察すべき領域が既に特定されているので、いわゆる興味領域の指定を必要とせずに、直ちに２回目の走査を開始することができる。また、２回目以降の走査では、ライン情報の利用によって、試料１４における観察すべき領域のみの走査が可能となるので、１度の走査に必要な時間を短縮することができ、より迅速に試料１４の観察対象の領域の観察画像を得ることができる。すなわち、観察画像のフレームレートを向上させることができる。

特に、試料１４における観察すべき領域の状態が短時間で変化する場合、充分に試料１４を観察するには、観察すべき領域を特定するのに必要な時間、および観察画像の取得に必要となる時間をより短くする必要がある。

上述したように、観察システムではライン情報の生成と、ライン情報の走査への利用により、観察対象とする領域の特定に要する時間と、観察画像の取得に要する時間をより短くすることができるので、充分に試料１４を観察することができるようになる。なお、１回目の走査で得られた情報を、それ以降の走査に利用して、各フレームの観察画像を得る方法は、試料１４の観察すべき領域の位置が、各時刻において同じである場合に特に有効である。

〈変形例〉
また、以上においては、観察対象ラインに対応するライン対応領域全体を走査すると説明したが、ライン対応領域の一部だけが走査されるようにしてもよい。

そのような場合、画像取得部２９は、１回目の走査制御処理において、ラインデータを用いて、処理対象となっているラインを構成する複数の画素のうち、輝度値が閾値以上となる画素を特定する。そして、輝度値が閾値以上となる画素がライン上に１つでもある場合、画像取得部２９は、そのラインにおける輝度値が閾値以上となる画素の位置を特定する画素位置情報と、ライン番号とからなる情報をライン情報として生成する。

例えば、画素位置情報は、図３中、ｘ方向の位置を示す情報などとされる。図３の例において、ラインＬ１２が処理対象となっているとし、ラインＬ１２の図中、左端からＮ番目に位置する画素Ｇ（Ｎ）と、左端から（Ｎ＋１）番目に位置する画素Ｇ（Ｎ＋１）とが、閾値以上の輝度値を有しているとする。

そのような場合、画像取得部２９は、例えば、ｘｙ座標系における画素Ｇ（Ｎ）および画素Ｇ（Ｎ＋１）のそれぞれのｘ座標を示す情報を画素位置情報とし、その画素位置情報と、ラインＬ１２を特定するライン番号とからなるライン情報を生成する。

また、ライン情報にライン番号と画素位置情報が含まれる場合、２回目の走査制御処理において、走査制御部３０は、読み出したライン情報を走査の制御に用いるだけでなく、読み出したライン情報をレーザ制御部３１にも供給する。なお、走査の制御時においては、図５を参照して説明した場合と同様に、観察対象ラインに対応するライン対応領域のみが走査されるように、スキャナ２４の動作が制御される。

さらに、走査制御部３０からライン情報の供給を受けたレーザ制御部３１は、２回目の走査制御処理において、ライン番号により示される観察対象ラインにおける、画素位置情報により示される画素（以下、観察対象画素とも称する）に対応する試料１４の領域にのみ照明光を照射させる。

すなわち、試料１４の走査時において、観察対象ラインに対応するライン対応領域全体に照明光が照射されるのではなく、ライン対応領域のうち、観察対象画素に対応する領域、つまり観察すべき部位のある領域にのみ照明光が照射されるように、レーザ２２による照明光の照射が制御される。これにより、試料１４の観察すべき領域にのみ照明光が照射されるようになるので、照明光の照射による試料１４の退色を防止するとともに、光毒性を低減させることができる。

なお、観察対象画素に対応する試料１４の領域への照明光の照射は、レーザ制御部３１によって、レーザ２２からの照明光の射出、不射出が直接制御されるようにしてもよいが、レーザ２２とダイクロイックミラー２３の間にシャッタを設けるようにしてもよい。そのような場合、例えば、走査制御部３０は、ライン情報を参照して、観察対象画素に対応する試料１４の領域にのみ照明光が照射されるように、シャッタを駆動して照明光を通過させたり、照明光を遮光させたりする。

さらに、上述した画素位置情報は、試料１４の蛍光が発せられる領域を特定することができる情報であれば、どのような情報であってもよい。

例えば、図３の例において、ラインＬ１２の画素Ｇ（Ｎ）と画素Ｇ（Ｎ＋１）のみが、閾値以上の輝度値を有する画素であったとする。この場合、画素Ｇ（Ｎ−２）と画素Ｇ（Ｎ＋３）のそれぞれのｘ座標を示す情報など、画素Ｇ（Ｎ）および画素Ｇ（Ｎ＋１）を含み、ｘ方向に連続して並ぶ画素からなる領域の図３中、左右の端の画素位置を示す情報が、画素位置情報とされるようにしてもよい。このような画素位置情報が生成される場合には、画素Ｇ（Ｎ−２）から画素Ｇ（Ｎ＋３）までの領域に対応する試料１４の観察面の領域に、照明光が照射されることになる。

このように、観察対象ライン上の観察対象画素に対応する領域よりも広い領域に、照明光が照射されるようにすれば、何らかの要因によって、試料１４上の観察すべき部位に照明光が照射されなくなってしまうことを防止することができる。

また、試料１４の観察すべき部位に照明光が照射されなくなってしまうことを防止するために、観察対象ラインとされた観察画像のラインに隣接するラインに、閾値以上の輝度値を有する画素がない場合でも、そのラインを観察対象ラインとするようにしてもよい。すなわち、この場合、輝度値が閾値以上である画素を有するラインを含む、連続して並ぶいくつかのラインが、それぞれ観察対象ラインとされてライン情報が生成され、それらのラインに対する走査が行なわれることになる。

〈第２の実施の形態〉
［観察システムの動作］
さらに、以上においては、試料１４の１つの観察面を観察する場合を例として説明したが、試料１４の奥行き方向に並ぶ複数の観察面が観察されるようにしてもよい。そのような場合、例えば、図６に示すように、試料１４の複数の断面が、観察画像の取得対象となる観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５とされる。

なお、図６において、１つの円は、試料１４にける観察対象とすべき１つの部位を表している。また、図中、横方向、奥行き方向、および縦方向は、それぞれ互いに直交するｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を示しており、図６のｘ方向およびｙ方向は、図３のｘ方向およびｙ方向に対応している。

すなわち、観察画像の取得対象となる観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５は、ｘｙ平面と並行な面とされ、これらの観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５が照明光により走査される。また、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５は、ｘｙ平面の法線と平行な方向に並んでおり、共焦点顕微鏡１１は、対物レンズ２５とステージ２１の間の距離、つまり対物レンズ２５から試料１４までのｚ方向の距離を変化させながら、各観察面の観察画像を取得する。ここで、ｚ方向は、スキャナ２４と試料１４の間に配置された、対物レンズ２５の光軸と平行な方向である。

このような場合、コントローラ１２は、例えば、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５の順番で、各観察面に対する１回目の走査を行い、各観察面に対してライン情報を生成する。このライン情報には、例えば、観察対象となる観察面のｚ方向の位置、つまり対物レンズ２５と試料１４とのｚ方向の位置関係を特定する観察位置情報と、その観察面を対象としたときの観察対象ラインを示すライン番号とが含まれる。

このようにして、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５について、ライン情報が得られると、以後、コントローラ１２は、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５の順番で、各観察面に対するｍ回目（但し、２≦ｍ）の走査を行って、各観察面の観察画像を得る。

以下、図７および図８のフローチャートを参照して、コントローラ１２による１回目の走査制御処理および２回目の走査制御処理の詳細について説明する。

図７は、１回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。

ステップＳ７１において、走査制御部３０は、処理対象の観察面に照明光が集光されるように、対物レンズ２５の光軸方向に、対物レンズ２５を移動させる。

例えば、図６の例に示した試料１４に対して１回目の走査制御処理を開始する場合、走査制御部３０は、最初に観察対象とされる観察面ＯＳ１１に照明光が集光されるように、対物レンズ２５をｚ方向に移動させる。より具体的には、例えば、対物レンズ２５には、ピエゾ素子が設けられており、走査制御部３０は、このピエゾ素子を駆動することで、対物レンズ２５をｚ方向に移動させる。

なお、試料１４における観察面とすべき面（断面）は、例えばコンピュータ１３により指定される。すなわち、図６の例であれば、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５がコンピュータ１３により指定される。

図７の説明に戻り、ステップＳ７１において、対物レンズ２５がｚ方向に移動されると、その後、ステップＳ７２乃至ステップＳ７８の処理が行われて、観察対象の観察面に対する走査が行なわれ、これにより得られた観察画像のライン情報が生成される。なお、これらのステップＳ７２乃至ステップＳ７８の処理は、図２のステップＳ１１乃至ステップＳ１７の処理と同様であるので、その説明は省略する。

なお、ステップＳ７７の処理においてＲＡＭ３０Ａに記録されるライン情報には、ライン番号と、処理対象の観察面のｚ方向の位置を特定する観察位置情報とが含まれる。例えば、観察位置情報は、処理対象の観察面上に照明光が集光するときの対物レンズ２５のｚ方向の位置を示す情報などとされる。

ステップＳ７８において、処理対象の観察面に対する走査が終了したと判定されると、ステップＳ７９において、画像取得部２９は、試料１４の全ての観察面を走査したか否かを判定する。

例えば、図６の例では、観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５に対する走査が終了し、これらの各観察面についてのライン情報がＲＡＭ３０Ａに記録された場合、全ての観察面を走査したと判定される。

ステップＳ７９において、まだ全ての観察面を走査していないと判定された場合、処理はステップＳ７１に戻り、上述した処理が繰り返される。

例えば、図６の例において、最初に処理対象とされた観察面ＯＳ１１の走査が終了した場合、まだ走査されていない次の観察面ＯＳ１２が処理対象とされる。そして、照明光が観察面ＯＳ１２に集光するように対物レンズ２５がｚ方向に移動され、観察面ＯＳ１２に対する走査が行なわれる。

これに対して、ステップＳ７９において、全ての観察面に対する走査が終了したと判定された場合、各観察面についてのライン情報が得られたので、１回目の走査制御処理は終了する。

このようにして、コントローラ１２は、試料１４の各観察面について１回目の走査制御処理を行うと、続いて２回目の走査制御処理を開始する。図８は、コントローラ１２による２回目の走査制御処理を説明するフローチャートである。

ステップＳ９１において、走査制御部３０は、ＲＡＭ３０Ａからライン情報を読み出す。具体的には、走査制御部３０は、図６の観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５の順番で、各観察面に対応する観察画像のライン情報を読み出していく。また、各観察画像のライン情報の読み出しにおいては、観察画像のｙ方向の一方の端から他方の端まで、ｙ方向に順番に観察対象ラインのライン情報が読み出される。

ステップＳ９２において、走査制御部３０は、読み出したライン情報に基づいてスキャナ２４を制御し、試料１４の観察面における照明光の照射位置を、処理対象となる観察対象ラインの端に対応する位置、つまりライン対応領域の端の位置に移動させる。

また、走査制御部３０は、ライン情報の観察位置情報に基づいて、必要に応じて対物レンズ２５をｚ方向に移動させる。例えば、図６の観察面ＯＳ１１に対する走査が終了し、観察面ＯＳ１２に対する走査を開始しようとする場合、対物レンズ２５の位置は、照明光が観察面ＯＳ１１に集光される位置となっている。そこで、走査制御部３０は、照明光が観察面ＯＳ１２に集光されるように、ピエゾ素子を駆動し、対物レンズ２５をｚ方向に移動させる。

ステップＳ９２において照明光の照射位置が移動されると、その後、ステップＳ９３乃至ステップＳ９５の処理が行われる。すなわち、ライン情報に示される観察対象ラインに対応するライン対応領域の走査が行なわれ、観察対象ラインのラインデータが生成される。なお、ステップＳ９３乃至ステップＳ９５の処理は、図５のステップＳ４３乃至ステップＳ４５の処理と同様であるため、その説明は省略する。

ステップＳ９６において、画像取得部２９は、試料１４の全ての観察面の走査が終了したか否かを判定する。すなわち、ＲＡＭ３０Ａに記録されている全ての観察面の全てのライン情報が読み出されて、ライン対応領域が走査されたか否かが判定される。

例えば、図６の観察面ＯＳ１１乃至観察面ＯＳ１５のそれぞれに対応する観察画像の各観察対象ラインについて、処理が行われた場合、全ての観察面の走査が終了したと判定される。

ステップＳ９６において、まだ全ての観察面の走査が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ９１に戻り、上述した処理が繰り返される。すなわち、次のライン情報が読み出されて、そのライン情報に示される観察対象ラインに対応するライン対応領域の走査が行なわれ、ラインデータが生成される。

一方、ステップＳ９６において、全ての観察面の走査が終了したと判定された場合、試料１４の観察対象とすべき全ての領域が走査され、各観察面の観察画像が得られたので、２回目の走査制御処理は終了する。

そして、以後、ユーザにより試料１４の観察の終了が指示されるまで、２回目の走査制御処理と同様の処理が繰り返し行われて、観察面ごとに、各フレームの観察画像が取得され、観察画像の記録または表示が行なわれる。

以上のように、ライン番号と観察位置情報とが含まれるライン情報を生成すれば、試料１４の観察対象とされる観察面が複数ある場合であっても、より迅速に試料１４の観察対象の領域の観察画像を得ることができる。

なお、以上においては、対物レンズ２５と試料１４（ステージ２１）とのｚ方向の相対的な位置関係を変化させる方法として、対物レンズ２５を移動させる場合を例として説明したが、ステージ２１がｚ方向に移動されるようにしてもよい。そのような場合、例えば走査制御部３０は、ライン情報に含まれる観察位置情報に基づいて、ステージ２１をｚ方向に移動させる。

また、１回目または２回目の走査制御処理において、対物レンズ２５とステージ２１のｚ方向の距離が時間とともに連続して変化するように、対物レンズ２５やステージ２１の動作が制御されるようにしてもよい。この場合、対物レンズ２５とステージ２１のｚ方向の距離の変化と同期して、各観察面の走査が行なわれる。すなわち、照明光が集光されるｚ方向の位置の変化に合わせて、各観察面の走査が行なわれる。

さらに、２回目の走査制御処理が行われると、その後、２回目の走査制御処理と同様の処理が繰り返し行われると説明したが、２回目の走査制御処理と同様の処理が所定回数だけ行われるたびに、１回目の走査制御処理と同様の処理が行われるようにしてもよい。この場合、所定フレーム分の観察画像が得られるたびに、ライン情報が再生成（リセット）され、観察対象とすべき部位が新たに特定されることになるので、観察面において蛍光が発せられる領域が変化する場合であっても、より確実に観察すべき領域の画像を得ることができる。

また、２回目の走査制御処理と同様の処理が行われる場合に、得られた観察画像のラインデータを用いて、各観察対象ラインに、閾値以上の輝度値を有する画素があるか否かが、画像取得部２９により判定されるようにしてもよい。

この場合、これまで観察対象ラインとされていたが、閾値以上の輝度値を有する画素がなくなったラインが、観察対象ラインから除外されるように、ライン情報の更新が行なわれる。すなわち、画像取得部２９は、走査制御部３０に、不要となったライン情報をＲＡＭ３０Ａから消去させる。このように、リアルタイムでライン情報の更新を行なうことで、さらに効率よく試料１４の走査を行なうことができ、より迅速に各フレームの観察画像を得ることができるようになる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１ 共焦点顕微鏡， １２ コントローラ， １３ コンピュータ， １４ 試料， ２２ レーザ， ２４ スキャナ， ２５ 対物レンズ， ２７ 検出器， ２８ ＣＰＵ， ２９ 画像取得部， ３０ 走査制御部， ３０Ａ ＲＡＭ， ３１ レーザ制御部

Claims (7)

1. 光源からの照明光で試料の観察面を走査させるスキャナと、
   前記照明光の走査により生じた前記観察面からの観察光を受光して、受光した前記観察光の強度に応じた電気信号を出力する検出手段と、
   前記観察面の観察画像上の所定方向に並ぶ画素からなるラインについて、前記電気信号を用いて、前記ラインを構成する前記画素の画素値からなるラインデータを生成し、前記ラインデータに基づいて、前記ラインに対応する前記観察面の領域に観察すべき領域があるかを特定し、前記観察すべき領域があるとされた前記ラインを示すライン情報を生成する画像生成手段と、
   前記ライン情報を記録する記録手段と、
   前記記録手段に記録された前記ライン情報が示す前記ラインに対応する前記観察面の領域が前記照明光で走査されるように、前記スキャナによる走査を制御する走査制御手段と
   を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
2. 前記画像生成手段は、前記ラインに画素値が所定の閾値以上である前記画素がある場合、前記ラインに対応する前記観察面の領域に前記観察すべき領域があるとして、その前記ラインを示す情報が含まれる前記ライン情報を生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記画像生成手段は、前記ライン上において、画素値が前記閾値以上である前記画素が含まれる領域を示す位置情報が含まれる前記ライン情報を生成し、
   前記ライン情報が示す前記ラインに対応する前記観察面の領域のうち、前記位置情報が示す領域に対応する前記観察面の領域に前記照明光が照射されるように、前記照明光の照射を制御する照射制御手段をさらに備える
   ことを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記画像生成手段は、前記ラインに画素値が所定の閾値以上である前記画素がある場合、その前記ラインを含む、前記観察画像上の連続して並ぶいくつかの前記ラインのそれぞれを、前記観察すべき領域があるとされた前記ラインであるとして、それらの前記ラインを示す前記ライン情報を生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記画像生成手段は、前記試料の複数の前記観察面が、前記スキャナと前記試料との間に配置された対物レンズの光軸方向に並んでいる場合、前記観察面ごとに、前記観察すべき領域があるとされた前記ラインを示す情報、および前記対物レンズと前記試料との前記光軸方向の位置関係を示す情報が含まれる前記ライン情報を生成し、
   前記ライン情報を用いて、前記観察面に前記照明光が集光されるように、前記対物レンズと前記試料との前記光軸方向の位置関係を変化させる位置制御手段をさらに備える
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
6. 前記画像生成手段は、所定回数だけ前記観察面の走査が行なわれるたびに前記ライン情報を再生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
7. 前記画像生成手段は、前記ライン情報を用いた走査により得られた前記観察画像における、前記ライン情報に示される前記ラインのうち、画素値が所定の閾値以上である前記画素がない前記ラインの前記ライン情報を前記記録手段から消去させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。

Images