CN108291873B - 用于对试样的以荧光记号标记的结构高分辨率成像的方法和设备 - Google Patents

Abstract

为了对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像，以光强度分布加载所述试样，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加成光强度分布(22)。在此，以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值选择性地扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值在所述试样中的相应的位置相对应。对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值的相应的位置，当已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最大光量时，和/或，当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量时，至少中断所述试样的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载。选择所述试样的感兴趣的部分区域，其方式是，使聚焦的荧光激发光在无荧光阻抑光(19)的情况下对准所述试样，其中，记录从所述试样发射的荧光(15)，其中，如果对于所述试样的一部分区域在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)，则将所述试样的所述部分区域定义为感兴趣的部分区域。

Description

用于对试样的以荧光记号标记的结构高分辨率成像的方法和 设备

技术领域

本发明涉及一种用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法，其中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载试样，其中，以光强度分布扫描试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从试样发射的荧光并且将其与光强度分布的相应的位置相对应。此外，本发明涉及一种用于执行该方法的设备。

本发明尤其涉及一种这样的用于高分辨率成像的方法，其中，用于扫描试样的感兴趣的部分区域的光强度分布除了具有聚焦的荧光激发光的强度极大值之外，具有与之叠加的、聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值，从而借助于荧光阻抑光缩小试样的以下体积：所记录的荧光可以来自于该体积。尤其可以以此方式通过在激发光的波长下的所谓的衍射边界减小该体积的尺寸并且因此减小空间分辨率。荧光阻抑光可以以不同的方式阻抑用于标记试样的感兴趣的结构的荧光记号的荧光，尤其通过在STED荧光显微镜中的受激发射或者通过将荧光记号转到无荧光能力的暗状态——如例如在具有可控的荧光体的RESOLFT荧光显微镜的情况下——来阻抑。

但在一些实施方式中，本发明也涉及用于对试样的结构进行高分辨率成像的方法，其中，不使用荧光阻抑光，也即例如共焦的激光扫描荧光显微镜。

在所有根据本发明的方法中，由于试样的以光强度分布的加载而存在以下危险：通过光强度分布的影响来改变试样。试样的明显的改变可以在于：使用于标记待成像的结构的荧光记号漂白，即持续地使其失活。但是，荧光记号的漂白所基于的光化学过程也对试样的其他的组成部分产生影响。尤其是活着的生物试样可能由于光强度分布的影响而受损害或者完全被杀死。

由于光强度分布的影响而改变试样的危险随着在光强度分布中的光强度和用于加载试样的光剂量而提高。在使用借助以激发光激发的荧光记号的受激发射起作用的荧光阻抑光的情况下，在光强度分布中的光强度必然特别高。相应地，对试样的所不期望的影响的危险也特别高。相反，STED荧光显微镜适合于，使在试样中的以荧光记号标记的结构在非常短的时间内成像，这对于变化的试样、如尤其活着的生物试样是特别感兴趣的。

背景技术

从R A Hoebe等人所著的Controlled light-exposure microscopy reducesphotobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging(自然生物技术，第25卷，第2期，2007年2月，第249至253页)已知一种用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法，其中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载试样，其中，以光强度分布扫描试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从试样发射的荧光并且将其与光强度分布的相应的位置相对应，其中，当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大光量时，或者先前当在预给定的时间段之内已经记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量时已经中断试样的以光强度分布对于相应的位置的加载。以此方式，试样的以光强度分布的加载相对于在所有的位置上到处同样长时间的加载在以下位置上受限：在所述位置上，相对多的荧光记号或者没有荧光记号位于试样中。由此可以显著地减小为了拍摄以荧光记号标记的结构的图像而用于加载试样的光剂量。在已知的方法中，试样的以光强度分布的加载的中断通过声光调制器在来自激光器的荧光激发光的光路中的控制来进行，所述光路根据用于记录荧光的探测器的光信号来控制。

R.A.Hoebe等人也描述了，可以如何校正荧光记号的仍然出现的漂白的效果的校正。为此，确定用于加载试样的像素的光剂量并且将其使用于校正所记录的荧光的强度。

在图像中，Hoebe等人记录在扫描了试样的完整的体积之后在焦平面内的每个单个的像素包含的、累积的光剂量，其中，相应的光剂量以错误的色彩示出。

从T.Staudt等人所著的Far-field optical nanoscopy with reduced numberof state transition cycles(光学快报第19卷，第6期，2011年3月14日，第5644至5657页)已知一种也称作RESCue-STED的、用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法。在这里，以光强度分布加载试样，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值以甜甜圈形式包围的强度极小值叠加。在此，以聚焦的荧光阻抑光的强度极小值扫描试样的感兴趣的部分，并且，记录从试样发射的荧光以及将其与聚焦的荧光阻抑光的强度极小值在试样中的相应的位置相对应。对于聚焦的荧光阻抑光的强度极小值的相应的位置，当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大量时，或者当已经在先前在预给定的时间段之内还未记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量时，中断试样的以由聚焦的荧光激发光和聚焦的荧光阻抑光组成的光强度分布的加载。由此，减少在拍摄试样的图像时在试样中的荧光记号经历的激发和退激(Abregung)的循环的数目并且因此减少荧光记号漂白的危险。

T.Staudt等人也描述了执行RESCue策略的一种替代的方式，其中，利用关于荧光记号的位置的预先信息，以便直接地接近需要荧光阻抑所在的坐标并且忽略以下位置：在所述位置上，荧光记号可能是没有功能的。例如，提出，首先拍摄较低的分辨率的图像，以便获得关于在试样中的空间结构和特征密度的粗略信息。更确切地说，一些特征被隔离并且其他特征紧密地群集(dicht gepackt)。可以(逐渐地)应用较高的空间分辨率并且有针对性地集中在以下区域：在所述区域中应分辨紧密的特征。同时，可以忽略以下坐标：在所述坐标上，不必分离任何对象并且相应地不需要关断。关于荧光记号的或者特征的密度的预先信息可以从亮度获得。

能够以两种方式实现：使改变的试样重复地成像或者沿着紧邻的平行的截面拍摄相同的试样的图像。

在两种已知的方法中，由所测量的光量和试样的以强度光分布的加载的所属的持续时间的商确定在试样的相应位置上的荧光记号的浓度，因为不同于在常规的激光-扫描荧光显微镜中那样，该持续时间从位置到位置地改变，在所述常规的激光-扫描荧光显微镜中，在每个位置上加载试样相同长的时间间隔。

发明内容

本发明基于以下任务：说明用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法和用于执行这些方法的设备，借助所述方法和所述设备，可以在所期望的图像质量方面还进一步减小为拍摄图像而用于加载试样的光剂量。

在用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本发明的第一方法中，以光强度分布加载所述试样，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加。在这里，“荧光激发光”也简称“激发光”。在此，明确地，在“一些强度极大值”中使用的复数不应排除荧光阻抑光的部分光强度分布，在所述荧光阻抑光中，强度极小值被一个环状的强度极大值围绕。该光强度分布在沿着光学轴线的每个截面中示出在荧光阻抑光的强度极小值的每个侧上的分别一个强度极大值。

在根据本发明的第一方法中，以所述聚焦的荧光阻抑光的强度极小值选择性地扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光以及将其作为荧光记号在相应的位置上的浓度的度量与所述聚焦的荧光阻抑光的强度极小值在所述试样中的相应的位置相对应。对于所述聚焦的荧光阻抑光的强度极小值的相应的位置，当已记录从所述试样发射的荧光的预给定的最大光量时，和/或，当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光的预给定的最小光量时，至少中断所述试样的以所述光强度分布的聚焦的荧光阻抑光的加载。在用于中断试样的以光强度分布的至少一部分的加载的先前提到的两个条件之间存在的“和/或”表明：在根据本发明的第一方法中，或者仅仅针对所述一个标准的满足或者仅仅针对另一个标准的满足或者针对两个标准的满足来监视在相应的位置上记录的荧光。

在根据本发明的第一方法中，选择试样的感兴趣的部分区域——所述部分区域仅仅借助完全的、包括聚焦的激发光和聚焦的荧光阻抑光的光强度分布扫描，其方式是，使聚焦的荧光激发光在无荧光阻抑光的情况下对准试样，其中，记录从试样发射的荧光，其中，如果对于试样的一部分区域在预给定的测试时间段之内已记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量，则将试样的该部分区域被定义为感兴趣的部分区域。换言之，将首先仅仅以荧光激发光加载的部分区域声明为感兴趣的部分区域，然后，如果对于该部分区域——至少在不存在典型地具有非常高的光强度的荧光阻抑光的情况下——确定最小荧光活性，则以由激发光和荧光阻抑光组成的完全的光强度分布加载该部分区域。如果所述最小荧光活性在没有荧光阻抑光的情况下已经不存在，则在具有荧光阻抑光的情况下也将不出现所述最小荧光活性。就此而言，无意义的是，以荧光阻抑光的极小值扫描相应的部分区域并且在此借助荧光阻抑光的一些强度极大值的高的强度给荧光阻抑光的强度极小值的周围环境加负荷。因此，在根据本发明的第一方法中，仅仅以荧光激发光加载试样的大的区域。荧光阻抑光使试样的感兴趣的部分区域完全地保留，在那里需要荧光阻抑光来提高位置分辨率。因此，相对于已知的方法可以还一次完全显著地减少为拍摄图像而总共用于给试样加负荷的光剂量。

在根据本发明的第一方法的具体的第一实施方式中，以所述聚焦的荧光激发光以具有与所述聚焦的荧光阻抑光的强度极小值的尺寸相协调的步宽的步扫描所述试样，其中，在每个步中，仅仅当在预给定的测试时间段之内已记录从所述试样发射的荧光的预给定的最小光量时，才接入所述荧光阻抑光。换言之，在每个像素中、即在每个位置上，首先仅仅以荧光激发光加载试样，并且，仅仅当总的来说基于荧光激发光记录荧光活性时，才接入荧光阻抑光。否则，对于相应的像素不发生荧光阻抑光的接入，并且，也可以关断荧光激发光，直到到达下一个像素、即位置。

在根据本发明的第一方法的具体的第二实施方式中，使聚焦的荧光激发光在无荧光阻抑光的情况下直接依次地对准试样的在扫描试样时的扫描方向上相继而置的部分区域，并且接着越过部分区域地扫描试样，其中，仅仅在感兴趣的部分区域中进行试样的以包括荧光阻抑光的光强度分布的加载。在根据本发明的第一方法的该实施方式中，首先仅仅以荧光激发光扫描试样的行。然后，以包括荧光阻抑光的光强度分布扫描试样的以下区段：在所述区段中，在所述第一扫描时已确定荧光活性，而对于所述行的其他的区段至少使荧光阻抑光减弱(ausgeblendet)。可选地，在接下来的越过部分区域的扫描中，可以在多个横向于扫描方向并排而置的行中扫描试样，从而，在以光强度分布的聚焦的荧光阻抑光的强度极小值扫描时，并非细小的网栅的每一行事先以未被限制的聚焦的荧光激发光扫描，以便确定试样的感兴趣的部分区域，而是例如仅仅细小的网栅的每第二行至第十行被扫描。

为了选择试样的感兴趣的部分区域而使用的荧光激发光可以是相同的荧光激发光，即具有与以下荧光激发光相同的波长：所述荧光激发光与荧光阻抑光叠加成光强度分布。但是，也可能涉及其他波长的荧光激发光，以所述其他波长的荧光激发光激发其他的荧光记号发射荧光，所述其他的荧光记号与由其他的荧光激发光激发的荧光记号同时出现。以此方式实现，在求取试样的感兴趣的部分区域时，后来在对所标记的结构进行成像时使用的荧光记号还丝毫没有受到负荷。

用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本发明的第二方法不但可以作为对于根据本发明的第一方法的补充地执行而且可以与之独立地执行，在该第二方法中，以包括聚焦的荧光激发光的光强度极大值的光强度分布加载所述试样，其中，以所述光强度分布扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光并且将其与所述光强度分布的相应的位置相对应。对于相应的位置，当在至少一个预给定的时间段之内还未达到从试样发射的荧光的预给定的最小量时，或者也还在当在至少一个预给定的、比所述时间段更长的另外的时间段之内，还未记录从所述试样发射的荧光的、大于所述预给定的最小光量的另外的预给定的最小光量时，也至少中断所述试样的以所述光强度分布的一部分的加载。换言之，对于是否值得在相应的位置上以强度分布进一步加载试样和相应地给式样加负荷，确定提高的多个极限值，所述多个极限值对应于多个提高的时间段。以此方式，不仅仅当在第一时间段之内例如完全没有记录荧光或者记录非常少的荧光时，而且也当直到现在为止记录的荧光在较长的第二时间段之内还未相加成一个显著的光量时，才中断试样的以光强度分布在相应的位置上的加载。以此方式也进一步减少为拍摄结构的图像而用于给试样加负荷的光剂量。

在根据本发明的第二方法中，当已经记录了从所述试样发射的荧光的预给定的最大光量时，也可以至少中断所述试样的以所述光强度分布的一部分的加载。

用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本发明的第三方法不但可以作为对于根据本发明的第一或者第二方法的补充地执行而且也与其不相关地执行，在所述第三方法中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载所述试样，其中，以所述光强度分布扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光并且将其与所述光强度分布的相应的位置相对应。对于相应的位置，当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大光量时并且——替代地或者附加地——当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光的预给定的最小光量时，至少中断所述试样的以所述光强度分布的一部分的加载。在此，越过感兴趣的部分区域的扫描的多次重复地，减小预给定的最大量和/或最小量中的至少一个。虽然，在根据本发明的方法中，为拍摄每个图像而将用于给试样加负荷的光剂量保持小。但是，在以荧光记号标记的结构的区域中，即在感兴趣的区域中仍然进行荧光记号的不显著的加以光化学的负荷。这在荧光记号中导致在拍摄每个图像时或较大或较不大的按比例的、即按百分比的漂白。也就是说，以越来越少的还活性的荧光记号来标记结构。通过预给定的最大量的和/或最小量的减小来确保：在每个图像中仍然同样可靠地识别结构并且同时在光剂量减小的情况下使位能(Potential)最大。试样的多个依次被扫描的平行的平面、即穿过试样的平行的截面、尤其试样的多个依次被扫描的、具有不同的z位置的x-y平面与感兴趣的部分区域的扫描的重复类似地起作用。在这里，在拍摄所述一个平面的图像时用于加载试样的光强度分布也对在其他的平面内的荧光记号产生漂白的影响。因此在这里，也有意义的是，减小预给定的最大量和/或最小量中的至少一个。

对最小光量的减小替代地或者附加地，在根据本发明的第三方法中，也可以提高所属的预给定的时间段。在任何情况下，通过减小最小光量和/或提高预给定的时间段来确保，也可靠地识别由于漂白而减小的、荧光记号的在光强度分布的相应的位置上的浓度，并且不提早地中断试样的以光强度分布对于试样的相应的位置的加载。

具体地，可以根据指数函数减小所述预给定的最大光量和/或最小光量，和/或，根据指数函数提高预给定的时间段。指数函数的指数可以与当前的方法条件相匹配，即与荧光记号、尤其其漂白的倾向和光强度分布的组成和绝对的光强度相匹配。只要这些条件保持相同，指数函数的指数通常不需要连续的匹配。

用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本发明的第四方法可以对根据本发明的第一至第三方法替代地或者附加地使用，在该第四方法中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载所述试样，其中，以所述光强度分布扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光并且将其与所述光强度分布的相应的位置相对应，其中，当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大量时并且——替代地或者附加地——当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光的预给定的最小光量时，至少中断所述试样的以所述光强度分布的一部分对于相应的位置的加载。检测和显示通过中断所述试样的以所述光强度分布的至少一部分对于所述相应的位置的加载和/或通过不以所述光强度分布加载所述试样的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布在每一个位置上对所述试样加载一预给定的时间间隔而节省的光剂量。所节省的光剂量的显示使得根据本发明的第四方法的使用者容易进行方法优化。该方法优化在所拍摄的图像的最大的质量和用于加载试样的最小的光剂量、即最大地节省的光剂量之间进行。

相对于以光强度分布在每个位置上加载试样一预给定的固定的时间段所节省并且根据本发明所显示的光剂量可以是越过最终拍摄的图像地节省的光剂量，其也可以是在正在进行的时间窗中节省的光剂量，其中，正在进行的时间窗的大小可以等于图像的拍摄的持续时间，或者，其可以是自从试样的以光强度分布的加载开始起总共节省的光剂量。也能够实现其他的确定：对于哪个时间间隔显示所节省的光量。为了运行方法优化，相对短的时间间隔、但优选至少图像的拍摄的持续时间的相对短的时间间隔是有意义的，因为，与在当例如显示自从试样的加载开始起所节省的光剂量时相比，所显示的值随着改变的方法条件更快速地改变。所节省的光剂量可以例如显示为在以光强度分布在每个位置上加载试样一预给定的固定的时间间隔的情况下产生的光剂量的绝对值或者百分比。

在根据本发明的第二至第四方法中，所述聚焦的荧光激发光的强度极大值也可以与聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加成所述光强度分布。有意义地，当在满足确定的标准的情况下至少中断试样的以光强度分布的一部分对于相应的位置的加载时，光强度分布的这部分为聚焦的荧光阻抑光。

借助聚焦的荧光阻抑光提高在对试样中的以荧光记号标记的结构成像时的空间分辨率。

在所有根据本发明的方法中，可以检测通过中断所述试样的以所述光强度分布的至少一部分在相应的位置上的加载和/或通过不以所述光强度分布加载所述试样的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布在试样的所有位置上加载所述试样一预给定的时间间隔而节省的光剂量，并且通过调整所述预给定的最小光量和/或最大光量中的至少一个和/或属于最小光量的预给定的时间段来优化所述光剂量。该优化可以手动地或者也可以自动地根据预给定的优化函数进行。

在所有根据本发明的方法中，可以根据以下确定所述预给定的最小光量和/或最大光量中的至少一个和/或属于预给定的最小量的时间段：在光强度分布的相邻的位置上、尤其在聚焦的荧光阻抑光的强度极小值的相邻的位置上记录的荧光的光功率多大。两个暗的位置或者两个亮的位置彼此相继的概率比一个亮的位置跟随一个暗的位置或者反之的概率大得多。相应地，与在一个亮的位置之后的一个新的位置上相比，在一个暗的位置之后的一个新的位置上较不容易预见确定的光量的荧光。在确定最小光量和/或最大光量时，可以正如在确定所属的时间段时那样考虑这一点，以便进一步优化所节省的光剂量。

在根据本发明的方法中，也不总是根据以下标准中的一个中断试样的以光强度分布对于相应的位置的加载：已记录从试样发射的荧光的预给定的最大光量或者在预给定的时间段之内还未记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量。当与在根据本发明的方法中相应的位置的最大的曝光相应的预给定的时间间隔过去时，通过以光强度分布对试样的扫描的进展进行加载的中断。典型地，该时间间隔是固定的。如果该时间间隔过短地选择，则仅仅罕见地达到与所期望的信噪比相应的预给定的最大光量。如果该时间间隔过长地选择，则为了拍摄图像而对试样的扫描持续不必要长的时间。然而，在根据本发明的方法中，在时间间隔过长的情况下也防止用于加载试样的过高的光剂量。可能有利的是，预给定的时间间隔如此长地选择，使得在通常情况下如果因为在预给定的时间段之内未达到最小光量而没有预先已经中断试样的以光强度分布在相应的位置上的加载，则达到预给定的最大光量。然后，通常可以借助所期望的信噪比由达到最大光量所需要的时间确定在相应的位置上的荧光记号的浓度。

实际上，可以中断所述试样的以所述光强度分布的至少一部分对于所述相应的位置的加载，其方式是，使所述光强度分布或者其相应的部分相对于所述试样转移，或者，其方式是，总体上中断所述试样的以所述光强度分布或者其相应的部分的加载。在此，使光强度分布相对于试样转移指的是，试样的扫描立即进展到下一个位置。而试样的以光强度分布或者其部分的加载的总体上的中断指的是，试样的扫描虽然还不进展，但在相应的位置上没有进一步以光强度分布或者其部分加载试样。无论是试样的以光强度分布的整体还是仅仅一部分的加载被中断，探测器可以对于时间间隔的剩余部分保持接通，直到试样的扫描进展到下一个位置。如果光强度分布的仅仅一部分被中断，则虽然探测器检测另外的荧光，但是，如果在所属的时间段内未达到最小光量，则荧光记号的对于相应的位置确定的浓度为零或者可忽略，或者其相应于由最大光量和为了记录其而需要的时间组成的商。由探测器在一个位置上总体上记录的光量仅仅当在试样相应的位置上的加载也没有部分地被中断时才是决定性的。

在根据本发明的方法中，可以由在现场可编程门阵列中编程的逻辑器件对中断所述试样的以所述光强度分布的至少一部分在相应的位置的加载作出决定。用于曝光一个像素的典型地最大的时间间隔，即所谓的像素停顿时间(Pixel Dwell Time)典型地位于几百个纳秒至几个微秒的范围内。也就是说，必须非常快速地进行并且也快速地实施关于中断以光强度分布的至少一部分的加载的决定。在此，在FPGA中编程的逻辑器件能够有帮助。

用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本发明的设备具有光提供装置，所述光提供装置包括光源和镜组，并且所述光提供装置构成包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布。此外，设备具有扫描装置以及探测装置，所述扫描装置以光强度分布扫描试样，所述探测装置包括所述镜组和探测器并且输出光信号，所述光信号取决于以所述探测器对于所述光强度分布的相应的位置记录的荧光量。设备的加载中断装置根据所述光信号中断所述试样的以所述光强度分布对于相应的位置的加载。所述加载中断装置构造用于执行根据本发明的方法中的一种。除了尤其包括编程的FPGA和声光调制器的加载中断装置之外，根据本发明的设备可以相应于STED荧光显微镜、RESOLFT荧光显微镜或者一种其他的激光器扫描显微镜。

本发明的有利的扩展方案从权利要求、说明书和附图得出。特征的和多个特征的组合的在说明书中提到的优点仅仅是示例性的，并且可以替代地或累积地起作用，而不必一定由根据本发明的实施方式实现这些优点。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，关于原始申请材料和专利的公开内容有以下：另外的特征可以从附图、尤其是所示的几何结构和多个部件相互间的相对尺寸及其相对布置和有效连接得出。同样与权利要求的所选择的引用关系有所偏差地能够实现本发明的不同实施方式的特征的或者不同权利要求的特征的组合，并且由此出发。这也涉及在单独的附图中示出的或在其描述中提到的这样的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。同样地，可以省去在权利要求中列举的、用于本发明的另外的实施方式的特征。

在权利要求和说明书中提到的特征关于其数目应理解为，恰好存在该数目或存在大于该数目的数目，而不需要明确使用副词“至少”。因此，当例如谈及一个元件时，应理解为存在恰好一个元件、两个元件或者更多的元件。这些特征可以通过其他特征来补充或者可以是用于组成相应的成品的各个特征。

在权利要求中包含的附图标记不是对通过专利权利要求保护的主题的范围的限制。其仅仅用于使得权利要求更易于理解。

附图说明

接下来根据在附图中示出的优选的实施例进一步阐述和描述本发明。附图示出：

图1示出根据本发明的设备的第一实施方式的示意图；

图2示出根据本发明的设备的第二实施方式的示意图；

图3示出包括全部四种根据本发明的方法的、用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法的方框图；

图4说明如何选择试样的像素作为感兴趣的部分区域的途径；

图5说明如何在根据图4的途径中沿着扫描行选择试样的不同的部分区域作为感兴趣的部分区域；

图6说明如何选择试样的感兴趣的部分区域的另一途径；

图7说明用于在一个位置上根据对于该位置记录的荧光的量来中断试样的以光强度分布的加载的标准；

图8说明在在多个在z方向上相继而置的x-y平面中扫描试样的情况下根据图7的中断标准的优化；

图9说明作为用于试样的例子的一个活着的细胞；以及

图10放大地示出根据图9的细胞的以荧光记号标记的结构。

具体实施方式

在图1中示出的、用于对试样2的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的设备1具有光提供装置，所述光提供装置包括光源3和镜组4并且所述光提供装置提供具有聚焦的荧光激发光14的强度极大值的光强度分布。以该光强度分布加载试样2。也称作扫描仪的扫描装置5以光强度分布在x方向和y方向上扫描试样2。包括镜组4、作为波长选择性的光束偏转单元的二色性的分光镜6和探测器7的探测装置记录从试样2发射的荧光15并且输出光信号8，所述光信号取决于对于光强度分布的相应的位置记录的荧光15。光信号8由分析处理装置9分析处理。分析处理装置9根据确定的标准控制声光调制器10形式的加载中断装置，以便当满足确定的标准时，中断试样2的以光强度分布对于相应的位置的加载。此外，检测通过试样的以光强度分布的加载的提前中断而节省的光剂量并且将其作为假设的光剂量的百分比显示在显示装置11上，如果在所有位置上以光强度分布加载试样2相同的预给定的时间间隔，则会得出所述假设的光剂量。将以荧光记号标记的结构的、借助试样2的以光强度分布的扫描来拍摄的图像以图像数据12的形式向所连接的计算机13传送。在此，考虑到由于以光强度分布的加载的提前中断而不同长的曝光时间，相对于荧光的针对试样的各个位置或者像素记录的光量来校正图像数据12。不言而喻地，光信号8的分析处理根据扫描装置5的位置来进行。然而，扫描装置5典型地根据与光信号8无关的方案扫描试样2。但原则上也可能的是，如此构造扫描装置5，使得其可以作为加载中断装置使用，在所述加载中断装置中，当满足用于中断试样的以光强度分布对于相应的位置的加载的标准时，所述扫描装置使光强度分布相对于试样2转移到下一个位置上。保持装置16——在其上支承有试样2能够在z方向上、即在镜组4的光学轴线的方向上高度可行进以便附加地扫描试样。

根据图2(a)的、用于对试样2的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的设备1的实施方式具有用于激发光14或者用于荧光阻抑光19的两个激光器17和18作为光源3的一部分。借助偏振分光镜20将激发光14和荧光阻抑光19聚集在一起。借助彩色的相板21选择性地使荧光阻抑光19的相位波前(Phasenfront)如此变形，使得在镜组4的焦点处产生在图2(b)中的截面内示出的、具有激发光14和荧光阻抑光19的所叠加的部分光强度分布的光强度分布22。在激发光14的强度极大值23的位置上，荧光阻抑光19具有强度极小值24，所述强度极小值由荧光阻抑光19的一些强度极大值25包围。以此方式，将以下区域——试样中的荧光记号能够从所述区域发射荧光15——有效地划界在强度极小值24的以下区域Δx上：在所述区域中，荧光阻抑光19不阻抑荧光。在设备1中，借助荧光阻抑光19的强度极小值24的该区域Δx扫描试样2。在此，在这里，在存在确定的标准的情况下借助于声光调制器10仅仅中断试样2的以荧光阻抑光19的加载，所述荧光阻抑光典型地并且不同于在图2(b)中标明的那样具有比激发光14高非常多的强度。借助于声光调制器10也能够实现：使荧光阻抑光19在激发光14之后才在相应的位置上对准试样2，如接下来还将详细描述的那样。在这里，用于中断试样2的在相应的位置上以荧光阻抑光19的加载的声光调制器10的控制通过配属于探测器7的FPGA 26进行，在所述FPGA中保存有所述标准。FPGA特别快速地对标准的满足作出反应，这在试样的每个位置或者像素的大约一微秒的扫描时间的情况下一定是必需的。

所有根据本发明的方法的实施方式的在图3中作为方框图示出的流程以选择试样的感兴趣的部分区域的步骤27开始，接着，在步骤28中以完全的光强度分布扫描所述感兴趣的部分区域。在此，在试样的每个位置上、即在每个扫描步骤中执行接下来的子步骤。在子步骤29中，以完全的光强度分布加载试样。在此，在子步骤30中，进行从试样发射的荧光的记录，所述荧光借助光强度分布来引起。在子步骤31中，将所记录的荧光15与预给定的最大光量和最小光量相比较，其中，最小光量与预给定的时间段关联。根据该比较，在子步骤32中，可以中断至少以光强度分布的一部分的加载。通过完整地扫描试样的或者试样的感兴趣的部分区域来生成以荧光记号的结构的图像。在步骤33中，检测和显示通过提前地中断以完全的光强度分布的加载而相对于对于试样的每个位置保持不变的曝光时间、即相对于保持不变的有效的像素停顿时间越过试样总共节省的光剂量。为了在同时实现所期望的图像质量的情况下使所节省的光剂量最大，在接下来的步骤34中优化用于最大光量和最小光量以及所属的时间段的预给定。在此，步骤34也可以包括逐渐地减小最大光量和最小光量和/或逐渐地提高所属的时间段，以便补偿在试样的感兴趣的部分区域中的还有活性的荧光记号的进展着的退化(Rückgang)。荧光记号的浓度的这样的进展着的退化仍然是试样的该部分区域的以完全的光强度分布的加载的结果，在根据本发明的方法中也尽可能快速地中断该加载。

图4说明根据图3的步骤27的实施、即试样的感兴趣的部分区域的选择的一种可能性。为此，在一个位置上仅仅以激发光14加载试样一预给定的测试时间段Δt1并且检验，荧光15的光量在该测试时间段Δt1之内是否达到预给定的最小光量LM1。如果是这种情况，如在图4(a)中标明的那样，则选择相应的位置作为试样的感兴趣的部分区域。如果不是这种情况，如在图4(b)中标明的那样，则不将试样的相应的位置选择作为试样的感兴趣的部分区域。在被选择作为试样的感兴趣的部分区域的位置上，如在图4(a)中标明的那样，将荧光阻抑光19接入激发光14。然后，重新在零处开始地记录从试样发射的荧光15，所述荧光现在仅仅还能够来自于根据图2(b)的、在空间上受限的区域Δx。反之，如果试样的相应的位置未被求取为感兴趣的部分区域，则在其上停止每次以激发光14和/或荧光阻抑光19的进一步的加载，如这在图4(b)中示出。

图5对于试样的位置的或者像素的在x方向上延伸的行示出以下时间：对于所述时间，在以激发光14和必要时附加地以通过斜线表明的荧光阻抑光扫描时在各个位置或者像素上加载试样。在此，在不同的时间后结束以激发光14和荧光阻抑光19的共同的加载，接下来还将详细地阐述这一点。

图6说明了在根据图3的步骤27中在选择试样的感兴趣的部分区域时的一种替代的处理方法。在这里，沿着行35，首先根据图6(a)沿着在x方向上延伸的行25以聚焦的激发光14扫描试样。在此，能够得出荧光15的强度I，如所述强度在图6(b)中说明。在所述强度超过由预给定的最小光量LM1和预给定的测试时间段Δt1组成的商LM1/Δt1的位置处，将行35的相应的区段36选择作为试样的感兴趣的部分区域。然后，在这些区段36中，可以以根据图2(b)的完全的光强度分布沿着行37扫描试样，所述行相比在仅仅以聚焦的激发光14扫描的情况下的行35在宽度上更紧密地并排而置。

图7说明用于中断试样的在一个位置上以完全的光强度分布的加载的标准的应用，其中，该光强度分布可以是根据图2(b)的这样具有荧光阻抑光19的光强度分布或者可以是这样仅仅来自激发光14的光强度分布。如果从试样记录的荧光15在一预给定的时间段Δt2之内不达到预给定的最小光量LM2，则对于该位置结束试样的以光强度分布的加载。这不但当根据图7(a)的所记录的荧光15′仅仅位于暗噪声的区域内时是这种情况，而且当荧光15″虽然表明在试样的相应的位置上的荧光记号但仅仅表明分散地、没有意义的出现时是这种情况。对于相应的位置，当在另外的预给定的时间段Δt3之内未达到另外的预给定的最小光量LM3时，也结束试样的以光强度分布的加载。由此，可以将如在图7(b)中示出的荧光15″′的变化曲线识别为不感兴趣的，在所述变化曲线中，虽然预给定的最小光量LM2在预给定的时间段Δt2中达到，但仅仅是随机的并且不基于在试样的相应的位置上的均匀地高的荧光活性。此外，当如在图7(a)中粗略绘出的这样，在达到预给定的时间间隔Δt4之前达到荧光15^Ⅳ的最大光量LM4时，中断试样的在相应的位置上的加载。仅仅当直到时间间隔Δt4结束未达到该最大光量LM4时，才在相应的位置上在完整的时间间隔Δt4上以光强度分布加载试样并且检测荧光15^V的在该时间间隔Δt4内累积的光量，如在图7(a)中示出。不言而喻地，荧光记号在试样的相应的位置上的浓度的度量为由荧光15的光量LM和所属的时间段或者所属的时间间隔Δt4组成的商。

图8(a)示出试样2，如沿着在z方向上间隔开的平面E1、E2和E3依次地在感兴趣的区域38中那样扫描该试样。在此，在分别跟随的平面内的荧光记号在扫描位于其上方的平面时已经以荧光阻抑光来加载并且因此按比例地曝光。为了补偿这一点，对于跟随的平面E2和E3减少最大光量LM4和最小光量LM2或者提高属于最小光量LM2的时间段Δt2，如在图8(b)中示出的那样。

图9说明具有细胞核40和以荧光记号标记的结构41的细胞39作为用于试样2的或者试样2的一部分的例子。在此，根据本发明，仅仅结构41的区域被选择作为试样2的感兴趣的区域并且至少暂时地以完全的光强度分布来加载。试样2的所有其他的区域仅仅以激发光来加载，直到确定，在测试时间段Δt1内未达到最小光量LM1。也就是说，用于给试样2的除结构41的感兴趣的区域以外的所有区域加负荷的光计量仅仅是最小的。

图10放大地示出结构41的以下区域：在所述区域中，确定的蛋白质42以荧光记号标记。在结构41的区域中，仅仅在蛋白质42的位置上比Δt2或者Δt3更长时间地以完全的光强度分布加载试样。在这些位置之外各处快速地中断加载，因为在时间段Δt2之内未达到最小光量LM2或者在时间段Δt3之内未达到另外的最小光量LM3。在蛋白质42的位置上，也仅仅罕见地以完全的光强度分布加载试样完全的时间间隔Δt4，因为中断在时间间隔Δt4结束之前达到最大光量LM4的情况下进行。即，用于在结构41的区域中加载试样的光剂量甚至在蛋白质42的以荧光记号标记的位置上明显地减小。如果根据图9的细胞39涉及活着的细胞，则其在试样的根据本发明的成像的情况下在其生物活性方面仅仅略微地通过由于光强度分布的影响引起的光化学过程而受损，主要是因为仅仅以最小光剂量加载细胞39的核40的区域，所述最小光剂量被需要用于识别，在这里根据本发明不涉及试样的感兴趣的部分区域。

所有根据本发明的方法也可以并行地以多个光强度分布执行，其中，根据本发明的方法的步骤基本上对于光强度分布中的每一个可以单独地执行。

附图标记列表

1 设备

2 试样

3 光源

4 镜组

5 扫描装置

6 二色性的分光镜

7 探测器

8 光信号

9 分析处理装置

10 声光调制器

11 显示装置

12 图像数据

13 计算机

14 激发光

15 荧光

16 试样保持装置

17 激光器

18 激光器

19 荧光阻抑光

20 偏振分光镜

21 彩色的相板

22 光强度分布

23 极大值

24 极小值

25 极大值

26 现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array，FPGA)

27 步骤

28 步骤

29 子步骤

30 子步骤

31 子步骤

32 子步骤

33 步骤

34 步骤

35 行

36 区段

37 行

38 感兴趣的部分区域

39 细胞

40 细胞核

41 结构

42 蛋白质

E1 平面

E2 平面

E3 平面

t 时间

I 强度

LM 光量

Δt1 测试时间段

Δt2 时间段

Δt3 另外的时间段

Δt4 时间间隔

LM1 最小光量

LM2 最小光量

LM3 另外的最小光量

LM4 最大光量

Claims (23)

1.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法，

其中，以光强度分布(22)加载所述试样(2)，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加，

其中，以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)选择性地扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)在所述试样(2)中的相应的位置相对应，以及

其中，对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的相应的位置，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，

至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载，

其特征在于，

以所述聚焦的荧光激发光(14)以具有与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的尺寸相协调的步宽的步扫描所述试样(2)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)，其中，在每个步中，仅仅当在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)时，才接入所述荧光阻抑光(19)。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

当在至少一个预给定的、比所述时间段(Δt2)更长的另外的时间段(Δt3)之内，还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的、大于所述预给定的最小光量(LM2)的另外的预给定的最小光量(LM3)时，也至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当已经记录了从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，也至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载。

4.根据权利要求1所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，

至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

越过所述感兴趣的部分区域(38)的扫描的多次重复地和/或越过所述试样(2)的多个依次被扫描的、具有不同的z位置的x-y平面地减小所述预给定的最大光量和/或最小光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或提高所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据指数函数减小所述预给定的最大光量和/或最小光量(LM1，LM2，LM3)中的至少一个，和/或，根据指数函数提高所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)。

6.根据权利要求1所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，

至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

检测和显示通过中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分在所述相应的位置上的加载和/或通过不以所述光强度分布(22)加载所述试样(2)的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布在所述试样的所有位置上对所述试样(2)加载一预给定的时间间隔(Δt4)而节省的光剂量。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测通过中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载和/或通过不以所述光强度分布(22)加载所述试样(2)的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布(22)在每个位置上对所述试样(2)加载一预给定的时间间隔(Δt4)而节省的光剂量，并且通过调整所述预给定的最小光量和/或最大光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)来优化所述光剂量。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据以下确定所述预给定的最小光量和/或最大光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)：对于所述光强度分布(22)的相邻的位置记录的荧光(15)的光功率多大，和/或，如果未预先中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载，则将其执行一预给定的时间间隔(Δt4)。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载，其方式是，使所述光强度分布(22)相对于所述试样(2)转移，或者，其方式是，总体上中断所述试样的以所述光强度分布(22)的加载，其中，通过控制至少一个声光调制器(10)来中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的加载。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由在FPGA(26)中编程的逻辑器件对中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载作出决定。

11.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法，

其中，以光强度分布(22)加载所述试样(2)，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加，

其中，以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)选择性地扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)在所述试样(2)中的相应的位置相对应，以及

其中，对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的相应的位置，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载，

其特征在于，

选择所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其方式是，使所述聚焦的荧光激发光(14)首先在无所述荧光阻抑光(19)的情况下直接依次地对准所述试样(2)的在扫描所述试样(2)时的扫描方向上相继而置的部分区域，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)，其中，如果对于所述试样(2)的一部分区域在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)，则将所述试样(2)的所述部分区域定义为感兴趣的部分区域(38)，并且接着越过在所述扫描方向上相继而置的部分区域地扫描所述试样(2)，其中，所述试样(2)的至少以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载仅仅在所述感兴趣的部分区域(38)中进行。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，首先仅仅以所述聚焦的荧光激发光(14)分别扫描所述试样(2)的行(35)，然后，以所述聚焦的荧光激发光(14)和荧光阻抑光(19)扫描所述行(35)的以下区段：对于所述区段，在所述预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)，而对于所述行(35)的所有其他的区段至少使所述荧光阻抑光(14)减弱，其中，在以所述聚焦的荧光激发光(14)和荧光阻抑光(19)扫描时，在多个横向于所述扫描方向并排而置的行(37)中对所述试样(2)的行(35)的所述区段(36)进行扫描。

13.根据权利要求11和12中任一项所述的方法，其特征在于，为了选择所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)而使用的荧光激发光相比与所述荧光阻抑光(19)叠加成所述光强度分布(22)的荧光激发光(14)具有不同的波长。

14.根据权利要求11所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

当在至少一个预给定的、比所述时间段(Δt2)更长的另外的时间段(Δt3)之内，还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的、大于所述预给定的最小光量(LM2)的另外的预给定的最小光量(LM3)时，也至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，当已经记录了从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，也至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载。

16.根据权利要求11所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，

至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

越过所述感兴趣的部分区域(38)的扫描的多次重复地和/或越过所述试样(2)的多个依次被扫描的、具有不同的z位置的x-y平面地减小所述预给定的最大光量和/或最小光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或提高所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，根据指数函数减小所述预给定的最大光量和/或最小光量(LM1，LM2，LM3)中的至少一个，和/或，根据指数函数提高所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)。

18.根据权利要求11所述的方法，

其中，以包括聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2)，其中，以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)，其中，记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应，以及

其中，

-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时，和/或，

-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时，

至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，

检测和显示通过中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分在所述相应的位置上的加载和/或通过不以所述光强度分布(22)加载所述试样(2)的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布在所述试样的所有位置上对所述试样(2)加载一预给定的时间间隔(Δt4)而节省的光剂量。

19.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，检测通过中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载和/或通过不以所述光强度分布(22)加载所述试样(2)的不感兴趣的部分区域而相对于以所述光强度分布(22)在每个位置上对所述试样(2)加载一预给定的时间间隔(Δt4)而节省的光剂量，并且通过调整所述预给定的最小光量和/或最大光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)来优化所述光剂量。

20.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，根据以下确定所述预给定的最小光量和/或最大光量(LM2，LM3，LM4)中的至少一个和/或所属的预给定的时间段(Δt2，Δt3)：对于所述光强度分布(22)的相邻的位置记录的荧光(15)的光功率多大，和/或，如果未预先中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载，则将其执行一预给定的时间间隔(Δt4)。

21.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载，其方式是，使所述光强度分布(22)相对于所述试样(2)转移，或者，其方式是，总体上中断所述试样的以所述光强度分布(22)的加载，其中，通过控制至少一个声光调制器(10)来中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的加载。

22.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，由在FPGA(26)中编程的逻辑器件对中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的至少一部分对于所述相应的位置的加载作出决定。

23.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的设备(1)，其具有：

光提供装置，所述光提供装置包括光源(3)和镜组(4)，并且所述光提供装置提供具有聚焦的荧光激发光(14)的光强度极大值(23)的光强度分布(22)，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加，

扫描装置(5)，所述扫描装置以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)，

探测装置，所述探测装置包括所述镜组(4)和探测器(7)并且输出光信号(8)，所述光信号取决于以所述探测器(7)对于所述光强度分布(22)的相应的位置记录的荧光，

加载中断装置，在存在预给定的条件的情况下，所述加载中断装置根据所述光信号(8)中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)对于所述相应的位置的加载，

其特征在于，所述加载中断装置构造用于执行根据以上权利要求中任一项所述的方法。

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