JP6556725B2 - 走査型顕微鏡検査方法および走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、第１の態様では、請求項１の前文に記載の走査型顕微鏡検査方法に関するものである。さらに、本発明は、請求項９の前文に記載の走査型顕微鏡に関するものである。

一般的な方法では、励起光の複数の照射スポットを同時に用いて試料を走査し、１つの照射スポットで照射された１つの試料箇所によって発せられる光を、他の照射スポットで照射された他の試料箇所によって発せられる光とは独立に検出する。複数の異なる試料箇所について検出された発光から、その試料の顕微鏡画像を編成することができる。

一般的な走査型顕微鏡は以下の構成部品であって、励起光を出射するための光源と、励起光を複数の照射スポットのための複数の照射ビームに空間的に分割するための光分割素子と、励起光を試料上に誘導するため、および試料によって発せられる光を検出器ユニットに誘導するための光学手段と、複数の照射スポットを用いて試料を走査するための走査装置と、異なる照射スポットで照射された試料箇所から発せられる光を個別に検出するための検出器ユニットとを備える。

そのような一般的な方法およびそのような一般的な走査型顕微鏡は、例えば特許文献１に記載されている。
複数の記録を必要とする走査型顕微鏡検査方法では、それらの画像記録は、通常、同じ励起ビームを用いて、時間的に連続して実施される。その場合、同じ励起スポットを用いて完全な画像または個々のラインのいずれかを、連続的に記録する。いわゆるＨＤＲ顕微鏡法（高ダイナミックレンジ顕微鏡法）の場合には、例えば、３通りの異なる励起強度による３つの連続した画像を記録し、その後、コンピュータ処理される。この場合、記録速度が限られていることから、１つの画像のみ記録される方法と比較して、時間分解能が劣り、すなわち、時間分解可能な試料の動的特性が制限される。

特にレーザ走査顕微鏡法の場合に、現在の光検出器のダイナミックレンジは、一方で、極めて微細かつ暗い構造体と、他方で、極めて明るい画像領域と、を同時に同じ精細度で解像するには不十分であることが多い。従って、蛍光顕微鏡法では、多くの場合、画像のいくつかの部分は過変調されること、および他の部分は背景ノイズと見分けがつかなくなることのうちの少なくとも一方が生じる。

また、これまで、強い照射による細胞および組織の光損傷は、生細胞の可能な画像記録数および測定時間を厳しく制限する主な要因の１つであった。
このように、レーザ走査顕微鏡法の分野では、退色効果の最小化および検出器の変調の最適化に関して、実現できることの限界に直面することが多い。これらの問題は、光子計数の原理によって特に適切に対処されるが、この場合、高い信号対ノイズ比という利点は、比較的低いダイナミックレンジという犠牲を払って実現される。計数は、約１０ＭＨｚの計数率からは非線形的となり、さらに、約３０ＭＨｚからは、補正することも、ほとんど不可能である。従って、ユーザは、特に最大電圧で動作する光電子増倍管を損傷から保護するために、試料への照射を常に最適なレンジに維持しなければならない。

現在、ダイナミックレンジを拡張するために、基本的に３つの技術が利用できる。第１に、例えば極めて高ダイナミックレンジのカメラなど、より優れた検出器を用いることが可能である。しかしながら、これまで、顕微鏡法のためのものとして、ダイナミックレンジの深さが１６ビットのものは、ほとんど実現されていない。極めて広いダイナミックレンジの高感度ＣＣＤカメラの使用は、迷光が理由で、レーザ走査顕微鏡法では、ほとんど導入されてはいない。

ダイナミックレンジが不十分である問題は、さらに、様々に異なる露光で複数の画像を記録し、その後、コンピュータ処理することによって、比較的簡単な形で回避することもできる。この方法の欠点は、試料への負担がはるかに大きいだけではなく、記録時間も要することである。これは、多くの応用において、特に生細胞での測定において、実施不可能であるか、いずれにしても最適ではない。

最後に、特許文献２では、「制御露光顕微鏡法」と呼ばれる方法であって、ＣＬＥＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも略称される方法を提案している。この場合、レーザ走査顕微鏡法では、走査画像記録の際に、各画素のための照射を、検出器で所定の閾値に達したときに、オフに切り替えることで、露光を終了させるという手順によって、露光時間を、高速フィードバック制御により画素ごとの精度で制御する。

いわゆるＤＩ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）顕微鏡法（動的照射顕微鏡法）として、これまで２つのアプローチがあった。第１の方法の実施形態では、試料または試料領域の完全な画像を記録し、その後、その画像に基づいて、個々の画素ごとに特定の励起強度を計算する。次に、この計算された強度を用いて、その試料または試料領域の第２の記録において、当該画素を照射する。この方法では、２つの記録が必要であり、従って、この場合も、時間分解能が劣り、これにより、生体試料において急速に変化する作用を観察する可能性が制限される。

ＤＩ顕微鏡法の第２の実施形態では、ある試料箇所から発せられる光の強度を、まさにその試料箇所への照射強度の制御のためのフィードバックとして直接用いる。この場合、特に、使用される検出器の飽和を避けるために、極めて高速な制御が必要となる。これは、例えば、特許文献３に記載されている。

米国特許第６０２８３０６号明細書 国際公開第２００４／１０２２４９号 独国特許出願公開第１０２００８０３４１３７号明細書

本発明の目的は、特にＨＤＲ顕微鏡法およびＤＩ顕微鏡法のために効果的に用いることができる走査型顕微鏡検査方法および走査型顕微鏡を提示することであると考えることができる。

本目的は、請求項１の特徴を有する方法、および請求項９の特徴を有する走査型顕微鏡によって達成される。
上記のような方法は、本発明により、複数の異なる照射スポットの強度が互いに独立に設定され、それらの照射スポットは、試料上を走査ライン内で順次誘導されるという点で改善される。

上記のような顕微鏡は、本発明により、複数の照射ビームの強度を独立に設定するための設定手段が設けられ、分割素子と、試料を走査するための走査装置は、複数の照射スポットが試料上を走査ライン内で順次誘導されるように構成されるという点で改善される。

本発明の第１の基本コンセプトは、励起スポットまたは照射スポットが、試料または試料領域上を異なるライン内で誘導されるのではなく、同じラインで順次進められることであると考えられる。この場合、個別の照射スポットは、光源からの励起光を複数の照射ビームに分割する光分割素子を用いて提供される。さらに、本発明に不可欠なのは、互いに隣接する試料箇所、すなわち同じ走査ラインで互いに隣接する試料箇所によって発せられる光の強度は、それぞれ独立に検出されるということである。

本明細書で記載される発明の意味の範囲内での励起光とは、電磁放射であり、この場合、特に、スペクトルの赤外線部分、可視部分、および紫外線部分を意味する。光源として、原理的には、十分な強度で所望の電磁放射を提供するあらゆる光源を用いることができる。通常は、この目的で、レーザが使用される。しかしながら、原理的には、発光ダイオードまたは他の光源を用いることもできる。

原理的には、検出器として、試料から反射して返される光を十分効果的に、および十分に良好な信号対ノイズ比で検出するあらゆる検出器を用いることができる。この目的で、原理的には、半導体検出器を用いることもできる。本顕微鏡検査技術は、一般的に計数率が比較的低い蛍光顕微鏡法に主に応用されるので、通常は光電子増倍管が用いられる。

本発明に係る方法の効果的な種々の実施形態、および本発明に係る顕微鏡の例示的な好ましい実施形態について、特に従属請求項および図面に関連させて、以下で説明する。
本発明に係る方法の第１の特に好ましい実施形態では、パイロットスポットと呼ばれることもあるリーディング照射スポット、およびトレーリング照射スポットが、試料上を誘導され、そして、リーディング照射スポットについて測定された、ある試料箇所から反射して返される、または発せられる光の強度を用いて、その試料箇所にトレーリング照射スポットが当たるときのトレーリング照射スポットの強度を設定する。

従って、試料の同じライン上で、ある距離で、より具体的には一定の距離で、走査する少なくとも２個の照射スポットが用いられる。この場合、第２の照射スポット、すなわちトレーリング照射スポットの強度は、動的照射顕微鏡法の基本コンセプトに従って、第１の照射スポットによって生成される応答信号に基づいて、すなわち試料の当該試料箇所から反射して返された光に基づいて、制御される。このとき、第２の照射スポットを用いて記録された画像において、ＤＩＭ法のあらゆる効果を得ることができる。例えば、信号対ノイズ比が特に高いレンジに的を絞って検出器を作動させることができ、さらには、色素の退色を最小限に抑えることができる。

本方法の実施形態で特に重要なことは、個々の照射スポットのそれぞれの強度が、独立に設定されることである。従って、本発明によれば、複数の異なる照射スポットの強度を個別に設定するための設定手段が設けられる。

具体的には、設定手段として、例えば、ＡＯＭ（音響光学変調器）、ＡＯＤ（音響光学偏向器）、およびＡＯＴＦ（音響光学可変フィルタ）のうちの少なくとも１つ等の音響光学素子である制御可能な要素を用いることができる。

本発明に係る方法の特に効果的なさらなる実施形態では、２個よりも多くの照射スポット、特に３つの照射スポットが、試料上を誘導され、それらの照射スポットの強度は、リーディング照射スポットまたは第１の照射スポットから最後の照射スポットに向って高くなる。本方法の実施形態により、特に高い強度ダイナミックレンジによる顕微鏡画像の記録が可能となる。この技術は、上述のように、ＨＤＲ顕微鏡法と呼ばれる。

本発明によるあらゆる実施形態において重要なことは、使用される対物レンズの後焦点面において高速走査方向における角度が異なる２つ以上の励起ビームを発生させることが可能であるということである。すなわち、１つの同じ走査ラインにおいて、いくつかの照射スポットが高速で順次続くということである。照射ビームとも呼ばれる励起ビームの強度は、本発明によれば、互いに独立に設定することができる。

特にＨＤＲ顕微鏡法の場合、複数の異なる照射スポットの強度は、異なるように、さらには特に固定で、設定することができる。この目的のため、異なる照射スポットの強度を個別に設定するための設定手段として、ビームスプリッタおよびビーム減衰器のうちの少なくとも一方を用いることができる。

原理的には、複数の照射スポットを生成するために、異なる走査装置および異なる光学素子を用いることができる。しかしながら、特に好ましくは、異なる照射スポットを試料上に誘導するために、それぞれ同じ顕微鏡対物レンズおよび同じ走査装置を使用する。

原理的には、励起光を複数の照射ビームに空間的に分割するための分割素子は、励起ビーム経路のどこに配置されてもよい。特に好ましくは、分割素子は、光源と走査装置との間のビーム経路に配置される。

複数の照射スポットを用いて取得された画像データは、１つの共通画像を形成するように、適切にコンピュータ処理され得る。
本発明に不可欠なのは、走査ライン内で互いに隣接する複数の照射スポットまたは励起スポットを生成することであり、その場合、それらの照射スポットを用いて照射される試料箇所によって発せられる光は、互いに独立に検出することができる。特に、本発明によれば、さらに、複数の異なる照射スポットは、それらの強度を互いに独立に設定することができる。

試料の同じ走査ラインにおいて複数の連続する照射スポットで走査することによるＨＤＲ顕微鏡法の応用例では、照射スポットの数に対応する係数により画像記録を全体として高速化することが可能である。従って、それに応じてより高い時間ダイナミックレンジで、生体試料における作用を観察することが可能である。このような測定のために、必要なことは、単に、個々の照射スポットの強度比について、リーディングビームが最も低い強度を有し、その走査ラインにおいて後に続く照射ビームの強度は、ビームからビームへと高くなることを確保するのみである。これは、例えば、ビームスプリッタおよびビーム減衰器によって実現することができる。

動的照射顕微鏡法の応用例では、パイロットスポットまたはパイロットビームとも呼ばれるリーディング照射スポットと、トレーリング照射スポットとの間の空間的ひいては時間的距離を利用して、第２の照射スポットが当該試料箇所に当たるときの第２の照射スポットに設定されるべき強度を計算する。従って、言い換えれば、リーディング照射スポットで照射された後の特定の試料箇所の試料の応答に基づいて、第２の照射スポットがその試料箇所に当たるときの第２の照射スポットの強度を計算する。

従って、本発明の方法によって、制御の速度に対する要求を軽減することが可能であり、その要求は、いずれにしても、照射スポットが試料箇所に留まっている間に照射強度をさらに再調整すべき状況の場合よりも低い。ｘ画素／マイクロ秒の速度で、走査ラインにおける２個の励起スポット間の距離がｙ画素である場合、信号が制御システムの通過に要するのに許される時間は、約ｙ／ｘである。これと比較して、直接制御の場合のこの時間は、１／ｘ未満であり、従って、係数ｙの分短くなる。

本発明に係る方法を実施するのに特に適した、本発明に係る顕微鏡は、共焦点顕微鏡であり得る。例えば、検出器ユニットは、共焦点検出器を有し得る。検出器は、検出器自体または上流の開口絞りが共焦点面内またはその近くに配置されている場合に、共焦点と呼ばれる。共焦点面という用語は、顕微鏡対物レンズの試料側焦点面に対して光学的に共役である検出ビーム経路の平面を指す。例えば検出器の上流で、共焦点面に配置される開口絞りによって、検出器の受光は、試料箇所における小さい標的体積に制限される。これに対応して、共焦点光源において、試料の照射は、試料上または試料内の小さい標的体積に制限される。

本発明に係る方法および本発明に係る走査型顕微鏡のさらなる効果および特徴について、次の図面を参照して以下で説明する。

図１は、本発明に係る走査型顕微鏡の第１の例示的な実施形態を示している。 図２は、本発明に係る走査型顕微鏡の第２の例示的な実施形態を示している。

本発明に係る方法および本発明に係る走査型顕微鏡１００の第１の例示的な実施形態について、図１を参照して説明する。不可欠な要素として、励起光１２を出射するための特にレーザである光源１０と、光学手段２０、３０、４０、５０と、さらに検出器ユニット６０と、を同図に示している。

光学手段の一部として、最初に光学分割素子２０が設けられ、これにより、励起光１２を複数の照射ビーム１４、１６、１８に分割し、このとき、これらの照射ビーム１４、１６、１８は、複数の異なる照射スポット５４、５６、５８を試料７０上に生成するように作用する。

光学手段のさらなる構成部品は、主カラースプリッタ４０であり、照射ビーム１４、１６、１８が主カラースプリッタ４０を通過する。その後、照射ビーム１４、１６、１８は、光学素子３４を通って走査装置３０に達し、これにより、本発明では、図１に概略的に示すように照射スポット５４、５６、５８が試料７０上を走査ライン７２内で相互に並んで、または同義的に順次誘導されるようにして、試料７０上を走査する。図１に示す例では、走査方向は、負のｘ方向であり、その走査方向は概略的に示す座標系から明らかである。

図１に示すように、顕微鏡対物レンズ５０によって、照射スポット５４、５６、５８は、試料上または試料内に合焦されて、照射スポット５４、５６、５８の場所で試料箇所７４、７６、７８が照射される。入射する励起光に反応して、試料箇所７４、７６、７８によってそれぞれ光８４、８６、８８が発せられて、それらの光は同じ顕微鏡対物レンズ５０を介して走査装置３０および主カラースプリッタ４０に戻るように誘導される。

重要な蛍光顕微鏡法の応用例では、反射して返される蛍光光は、一般的に励起光よりも長波長である。主カラースプリッタ４０は、そのより長波長の光を反射するように構成されている。従って、試料箇所７４、７６、７８によって発せられる光８４、８６、８８は、光学素子６７によって、共焦点絞り６９および検出器ユニット６０の方向に進められる。

検出器ユニット６０内には、照射スポット５４、５６、５８のそれぞれに対して個別の検出器６４、６６、６８が設けられており、これにより、照射スポット５４、５６、５８で生成された試料７０の発光８４、８６、８８を、個々に照射された試料箇所７４、７６、７８のそれぞれについて別々に検出することができる。図示の例では、図１に示す構成１００が全体として共焦点顕微鏡法を実施するのに適するように、検出器６４、６６、６８の上流に単一の共焦点絞り６９を配置している。原理的には、個別の共焦点絞りを、個々の検出器６４、６６、６８のそれぞれの上流に配置することもできる。

図１の例示的な実施形態における本発明に不可欠なのは、複数の照射スポット５４、５６、５８によって同時に試料７０を走査することであり、このとき、それらの照射スポット５４、５６、５８は、試料上を１つの同じ走査ライン７２内で誘導される。さらに、本発明にとって重要かつ不可欠なのは、それらの異なる照射スポットの強度を、互いに独立に設定可能であることである。図示の例示的な実施形態では、照射スポット５４の強度Ｉ（５４）は、照射スポット５６の強度Ｉ（５６）よりも低く、そして照射スポット５６の強度Ｉ（５６）は、照射スポット５８の強度Ｉ（５８）よりも低い。

これらの大小関係を、図１に不等式Ｉ（１４）＜Ｉ（１６）＜Ｉ（１８）で表している。
個々の照射スポット５４、５６、５８の強度をこのように選択することによって、効果的に色素の退色を最小限に抑えることができ、さらに、極めて高い輝度ダイナミックレンジで顕微鏡画像を実現することが可能である。この方法は、ＨＤＲ顕微鏡法と呼ばれる。強度の適切な設定は、図１に概略的に示す設定手段２４、２６、２８によって実施され、それらは分割素子２０の下流に配置されており、照射ビーム１４、１６、１８を所望の強度に減衰する。これは、原理的には、ビームスプリッタまたはビーム減衰器によって実現することができる。ＨＤＲ顕微鏡法で要求される退色の低減という効果を得るために重要なのは、走査方向に、第１の照射スポットまたはリーディング照射スポット５４は最も低い強度を有し、最後の照射スポット５８は最も高い強度を有するということである。図１では、走査ライン７２に沿った走査方向を矢印７３で示している。

検出器ユニット６０は、制御・評価ユニット９０に接続されており、これを図１に矢印９６で概略的に示している。制御・評価ユニット９０では、例えば、検出器６４、６６、６８によって供給される測定データを１つの画像を形成するようにコンピュータ処理することができる。原理的には、この制御・評価ユニット９０を、例えば音響光学素子等の特に制御可能な構成要素であり得る設定手段２４、２６、２８に動作的に接続することができる。

ＤＩ顕微鏡法（動的照射顕微鏡法）を実施するのに適した、本発明に係る走査型顕微鏡のさらなる例示的な実施形態について、図２を参照して説明する。同図に示す走査型顕微鏡１００の主要な構成部品は、図１に示す第１の例のものに対応している。一般的に、同等の構成部品または同等に機能する構成部品は、これらの図面において同じ参照符号で示している。

図１に示す走査型顕微鏡１００の実施形態とは異なり、図２では、２個のみの照射スポット、すなわちリーディング照射スポット５４とトレーリング照射スポット５８が、試料７０上を１つの同じ走査ライン７２内で誘導される。従って、本例の検出器ユニット６０は、２個のみの検出器６４、６８を、その上流に配置された共焦点絞り６９と共に、有している。原理的には、図１の例にあるように、本例の場合にも、各々の検出器が、専用の共焦点絞りおよび専用の検出器光学素子のうちの少なくとも一方を備えることが可能である。

検出器ユニット６０の測定情報、すなわち検出器６４、６８からの測定情報は、制御・評価ユニット９０に供給され、これを図２に矢印９６で概略的に示している。検出器６４によって供給される測定情報は、図２に示す状況においてリーディング照射スポット５４で照射された試料箇所７４によって、この照射スポット５４に対する応答として発せられる光、または反射して返される光８４に相当している。

制御・評価ユニット９０は、制御信号を供給するために、照射ビーム１４のための設定手段２５および照射ビーム１８のための設定手段２９に動作的に接続されており、これを図２に矢印９２で示している。試料箇所７４について、検出器６４によって供給された測定情報に基づいて、制御・評価ユニット９０は、設定手段２９のための操作量を計算し、これにより、照射ビーム１８がトレーリング照射スポットとして試料箇所７４に当たるときの照射ビームの強度を設定する。

設定手段２５、２９は、好ましくは、ＡＯＭおよびＡＯＴＦ等の音響光学設定手段であり得る。ＡＯＴＦによって、原理的には、複数の色の強度を、的を絞って迅速に設定することもできる。ＤＩ顕微鏡法のための周知の構成と比較して、本明細書に記載の方法によれば、特定の試料箇所に励起スポットが留まっている間に励起強度の制御をさらに実施しなければならない場合ほど制御が高速である必要はなくなるため、制御の速度に対する要求を軽減することができる。一方、試料の全体画像を最初に記録し、その後、計算された新たなポイントごとの強度が試料に再度適用される実施形態と比較して、本明細書で提案されるソリューションは、はるかに高速である。

光８４に関して測定された強度に対する照射ビーム１８の強度Ｉ（１８）の基本的な関数従属性を、図２に等式Ｉ（１８）＝ｆ（Ｉ（８４））で表している。
本発明により、走査型顕微鏡および走査型顕微鏡検査方法を提供し、これにより、特にＨＤＲ顕微鏡法およびＤＩ顕微鏡法の場合に、顕著な改善および単純化を可能とし、これを少ない装置費用で実現することができる。

図１および２に示す光学構成は、例示的なものである。その変形例では、例えば透過光で、試料に照射することもできる。さらに、原理的には、主カラースプリッタ４０に対する試料および検出器の相対配置を、主カラースプリッタ４０で照射ビーム１４、１６、１８は反射されるが、蛍光光は主カラースプリッタを透過するような配置とすることができる。

１０ 光源
１２ 励起光
１４ 照射ビーム
１６ 照射ビーム
１８ 照射ビーム
２０ 光分割素子
２４，２５，２６，２８，２９ 強度を個別に設定するための設定手段
３０ 走査装置
３４ 光学素子
４０ 主カラースプリッタ
５０ 顕微鏡対物レンズ
５４ 照射スポット
５６ 照射スポット
５８ 照射スポット
６０ 検出器ユニット
６４ 検出器ユニット
６６ 検出器ユニット
６７ 光学素子
６８ 検出器ユニット
６９ 共焦点絞り
７０ 試料
７２ 走査ライン
７３ 走査方向
７４ 試料箇所
７６ 試料箇所
７８ 試料箇所
８４ 試料箇所７４によって発せられる光
８６ 試料箇所７６によって発せられる光
８８ 試料箇所７８によって発せられる光
２０，３０，４０，５０ 光学手段
９０ 制御・評価ユニット
９２ 矢印
９６ 矢印

Claims (9)

1. 走査型顕微鏡検査方法であって、
   励起光の複数の照射スポット（５４，５６，５８）を同時に用いて試料（７０）を走査し、
   １つの照射スポット（５４）で照射された１つの試料箇所（７４）によって発せられる光（８４）を、他の照射スポット（７６）で照射された他の試料箇所（７６）によって発せられる光（８６）とは独立に検出し、
   複数の異なる試料箇所について検出された発光から、前記試料（７０）の顕微鏡画像を編成する方法において、
   複数の異なる照射スポット（５４，５６，５８）の強度を互いに独立に設定することと、
   前記複数の照射スポット（５４，５６，５８）を、前記試料（７０）上を走査ライン（７２）内で順次誘導すること、
   リーディング照射スポット（５４）およびトレーリング照射スポット（５８）を、前記試料（７０）上を誘導すること、
   前記リーディング照射スポット（５４）に関して測定された、ある試料箇所（７４）によって発せられた光（８４）の強度を用いて、該試料箇所（７４）に前記トレーリング照射スポット（５８）が当たるときの前記トレーリング照射スポット（５８）の強度を設定すること、を特徴とする方法。
2. ２個よりも多くの、特に３個の照射スポット（５４，５６，５８）を、前記試料（７０）上を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記複数の照射スポット（５４，５６，５８）に関して取得された測定値は、１つの共通画像を形成するようにコンピュータ処理されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記複数の異なる照射スポット（５４，５６，５８）を前記試料（７０）上に誘導するために、それぞれ同じ顕微鏡対物レンズ（５０）および同じ走査装置（３０）を使用することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 特に請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法を実施するための走査型顕微鏡であって、
   励起光（１２）を出射するための光源（１０）と、
   前記励起光（１２）を複数の照射スポット（５４，５６，５８）のための複数の照射ビーム（１４，１６，１８）に空間的に分割するための光分割素子（２０）と、
   前記励起光（１２）を試料（７０）上に誘導するため、および前記試料（７０）によって発せられる光（８４，８６，８８）を検出器ユニット（６０）に誘導するための光学手段（２０，３０，４０，５０）と、
   前記複数の照射スポット（５４，５６，５８）を用いて前記試料（７０）を走査するための走査装置（３０）と、
   前記複数の異なる照射スポット（５４，５６，５８）で照射された試料箇所（７４，７６，７８）によって発せられる光（８４，８６，８８）を個別に検出するための前記検出器ユニット（６０）とを備える走査型顕微鏡において、
   前記複数の照射ビーム（１４，１６，１８）の強度を独立に設定するための設定手段（２４，２６，２８；２５，２９）が設けられることと、
   前記光分割素子（２０）および前記試料（７０）を走査するための前記走査装置（３０）は、前記照射スポット（５４，５６，５８）が前記試料（７０）上を走査ライン（７２）内で順次誘導されるように構成されていること、を特徴とする、走査型顕微鏡。
6. 前記光分割素子（２０）は、前記光源（１０）と前記走査装置（３０）との間のビーム経路に配置されることを特徴とする、請求項５に記載の走査型顕微鏡。
7. ビームスプリッタおよびビーム減衰器のうちの少なくとも一方が、設定手段（２４，２６，２８）として設けられることを特徴とする、請求項５または６に記載の走査型顕微鏡。
8. ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、およびＡＯＤから選択された１つを含む音響光学素子である制御可能な構成要素が、設定手段（２５，２９）として設けられることを特徴とする、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡。
9. 共焦点走査型顕微鏡である、請求項５ないし８のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡。

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