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Die Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop. Dieses kann zum Abbilden einer fluoreszierenden Probe oder einer mit fluoreszierenden Einheiten (Fluorophoren) markierten Struktur in einer Probe oder zum Beobachten von Fluktuationen von Fluorophoren, welche in einer Probe enthalten sind, mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet werden. Die Fluorophore, d. h. die Teile, die mit Anregungslicht zur Fluoreszenz anregbar sind, können hierbei insbesondere als fluoreszierende Moleküle, fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Quantendots ausgebildet sein. Weiterhin können alle intrinsischen Bestandteile der Probe als Fluorophor wirksam werden.
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Im Rahmen der vorgestellten Erfindung erfolgt ein schneller Wechsel zwischen rein konfokaler Laseranregung und konfokaler Laseranregung mit gleichzeitiger optischer Manipulation einer fluoreszierenden Probe verbunden mit einer zeitlich aufgelösten Aufnahme des Fluoreszenzlichts sowie eine separate und/oder kombinierte Analyse des Verhaltens der Probe in getrennten Zeitfenstern.
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Damit können beispielsweise Prozesse, die langsamer als der genannte Wechsel in der Anregung ablaufen, quasi zeitgleich und unter gleichen Messbedingungen sowohl mit als auch ohne zusätzliche Manipulation verfolgt und analysiert werden. Dadurch kann insbesondere auch der Einfluss der Manipulation, der sich über Zeiträume, die mindestens eine Wechselperiode andauern, untersucht werden und unbeabsichtigte Verfälschungen durch die Manipulation identifiziert und berücksichtigt werden.
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Insbesondere im Bereich der konventionellen STED-Mikroskopie ist es ein Problem, dass man typischerweise nicht simultan den Zustand der Probe ohne STED-Laserlicht abfragen kann. Das STED-Laserlicht im Sinne einer zusätzlichen optischen Manipulation kann aber beispielsweise die Abbildung durch Photobleichen während der Aufnahme und Induzierung weiterer photophysikalischer Effekte wie zum Beispiel Blinking sowie direkte Anregung durch das STED-Laserlicht verfälschen.
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Die hier vorgestellte Erfindung löst dieses Problem und bewerkstelligt insbesondere die gleichzeitige Aufnahme eines Datensatzes ohne STED-Laserlicht und eines Datensatzes unter Beleuchtung mit STED-Laserlicht. Durch Vergleich der Datensätze kann so der verfälschende Einfluß des STED-Laserlichts beispielweise in der Bildgebung und bei Punktmessungen wie zum Beispiel bei Diffusionsmessungen identifiziert und berücksichtigt werden. Durch Verwendung weiterer Laserstrahlen anderer Wellenlänge und/oder Intensität können auch Fluorophore der Messung zugänglich gemacht werden, welche sonst keine Photonen emittieren.
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Stand der Technik:
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Ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop ermöglicht bereits eine hohe räumliche Auflösung beim Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur in einer Probe. Weiterhin wird hiermit das Beobachtungsvolumen bei FCS konkret begrenzt. Eine Möglichkeit zur weiteren Erhöhung der räumlichen Auflösung oder zur Verringerung des Beobachtungsvolumens bei FCS bietet die STED-Mikroskopie, welche eine Erweiterung der Konfokalmikroskopie darstellt. Bei der STED-Mikroskopie erfolgt die Anregung der Fluorophore in der Probe typischerweise in Form gepulsten Laserlichts. Das zur Anregung (engl. depletion) verwendete Licht kann entweder gepulst oder auch permanent eingestrahlt werden. Hierbei ist der Fokus des Abregungslichtes in Form eines Donuts, d. h. mit einer Nullstelle der Anregungsintensität im Zentrum des Anregungsspots ausgebildet. Hat der Abregungslaser eine sehr hohe Intensität, so werden alle Fluorophore welche vom Abregungslaser erfasst werden stimuliert aus dem angeregten Zustand abgeregt. Dies führt dazu, dass bei (nahezu) gleichzeitigem Einstrahlen des An- sowie des Abregungspulses nur die Fluorophore zum Messsignal beitragen, welche sich im Inneren des Donut befinden. Somit kann typischerweise eine um den Faktor 10–20 (in Einzelfällen auch Faktor 100) höhere räumliche Auflösung erzielt werden.
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Beschreibung:
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In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine mikroskopische Vorrichtung zum wiederholten gepulsten Anregen einer Probe mit einem ersten Laserlichtpuls und einem von dem ersten Laserlichtpuls verschiedenen zweiten Laserlichtpuls vorgesehen. Die Laserlichtpulse haben dabei eine Wellenlänge zwischen 250–5000 nm, bevorzugt zwischen 400–1200 nm. Die Laserlichtpulse sind insbesondere gekennzeichnet durch eine Wellenlänge in einem schmalen Wellenlängenbereich sowie eine bestimmte Intensität, Dauer und Polarisation. Die Dauer der Laserlichtpulse liegt im Bereich zwischen 10 fs–2000 ps.
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Die mikroskopische Vorrichtung weist typischerweise alle notwendigen Komponenten auf um die folgenden Schritte durchführen zu können:
Zunächst wird eine Probe (46) bereit gestellt, die mindestens einen Fluorophor aufweist der wiederum mindestens zwei photo-physikalische Zustände, beispielsweise einen elektronischen Grundzustand und einen ersten elektronisch angeregten Zustand aufweist. Der Fluorophor kann darüber hinaus weitere Zustände aufweisen, beispielsweise elektronische Triplet-Zustände, geladene Zustände oder allgemein Dunkelzustände die entweder reversibel oder irreversibel erreicht werden. Diese Fluorophore können in zumindest einem dieser photo-physikalischen Zustände, wie beispielsweise dem Grundzustand, einem elektronischen Singulett- oder Triplet-Zustand, einem angeregten Zustand oder einem Dunkelzustand, mit dem ersten und/oder dem zweiten Laserlichtpuls wechselwirken. Diese Probe wird nun insbesondere im Sinne eines Konfokalmikroskops (58) mit einer Pulssequenz (3) beleuchtet. Diese besteht zumindest aus einem ersten Pulsmuster und einem vom ersten Pulsmuster zeitlich disjunkten zweiten Pulsmuster, wobei das erste Pulsmuster den ersten Laserlichtpuls enthält, und das zweite Pulsmuster den ersten und den zweiten Laserlichtpuls enthält. Die Laserlichtpulse führen zur Wechselwirkung mit der Probe die beispielsweise eine Absorption oder stimulierte Emission sein kann. Zeitlich disjunkt soll hier insbesondere nicht überlappend und/oder deutlich zeitlich versetzt bedeuten. Schließlich werden die von der Probe stammenden Photonen, die aus dem Wechselwirken des ersten Laserlichtpulses und/oder des zweiten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugt werden, zeitaufgelöst und mit dem ersten und zweiten Pulsmuster zeitkorreliert erfasst. Die Erfassung erfolgt mit Detektoren (51) die in der Lage sind einzelne Photonen zu detektieren, beispielweise bestimmte Kameras oder im Falle eines konfokalen Mikroskops beispielsweise Photomultiplier oder Avalanchephotodioden. Die Zeitauflösung für die Erfassung ist dabei insbesondere mindestens 1 ms, mindestens 100 μs, mindestens 1 μs, mindestens 1 ns oder mindestens 10 ps. Zeitkorreliert bedeutet, dass für jedes Photon dessen Ankunftszeit auf dem Detektor bestimmt wird diese Ankunftszeit in Bezug gesetzt werden kann mit den Zeitpunkten zu denen die Laserlichtpulse generiert wurden. Da die Laufzeiten des Laserlichtpulses vom Laser zur Probe und die Laufzeit des Photons von der Probe zum Detektor berücksichtigt werden können, läßt sich auf diese Weise mindestens statistisch jedes Photon dem dazugehörigen Laserlichtpuls zuordnen und damit auch die Zeit zwischen Absorption eines Photons aus dem Laserlichtpuls in der Probe und Aussenden eines dadurch hervorgerufenen beispielsweise Fluoreszenzphotons zeitlich messen. Zudem lassen sich auch die Ankunftszeiten der Photonen untereinander zeitlich in Bezug setzen um daraus beispielsweise die Fluoreszenzintensitätskorrelation zu berechnen. Zum Erfassen der Photonen gehört neben der Ankunftszeit insbesondere auch die Aufzeichnung von assoziierten Daten und weiteren Parametern wie beispielsweise der Scannerposition und der Detektornummer, die Informationen über den Ort des Fluorophors in der Probe, der dieses Photon ausgesendet hat und die Wellenlänge und Polarisation des detektierten Photons enthalten.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Pulssequenz ein drittes Pulsmuster aufweist, wobei das dritte Pulsmuster vom ersten und vom zweiten Pulsmuster disjunkt ist, und wobei das dritte Pulsmuster den zweiten Laserlichtpuls enthält. Dadurch läßt sich der Einfluß des zweiten Laserlichtpulses, der typischerweise den Manipulationslaser darstellt, auf die Probe in Abwesenheit des Anregungslasers (erster Laserlichtpuls) ermitteln.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster jeweils eine zeitliche Dauer von 1 ns bis 5000 ns aufweist, wobei insbesondere die zeitliche bevorzugte Dauer im Bereich von 10 ns bis 100 ns liegt. Die Pulssequenz, die sich aus den einzelnen Pulsmustern zusammensetzt wird mit einer Wiederholrate im Bereich von 10 kHz bis 100 MHz wiederholt.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster einen vom ersten und zweiten Laserlichtpuls unterschiedlichen dritten Laserlichtpuls aufweist, oder wobei die Pulssequenz ein viertes Pulsmuster aufweist das den dritten Laserlichtpuls enthält wobei insbesondere die aus dem Wechselwirken des dritten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugten Photonen zeitaufgelöst und mit der Pulssequenz zeitkorreliert erfasst werden. Die Zeitauflösung für die zeitkorrelierte Erfassung ist dabei insbesondere mindestens 1 ms, mindestens 100 μs, mindestens 1 μs, mindestens 1 ns oder mindestens 10 ps. Die Datenaufnahme hat so zu Erfolgen, dass die Photonen aufgrund der Zeitauflösung unterscheidbar sind und dem ersten, zweiten oder dritten Laserlichtpuls zumindest statistisch zugeordnet werden können. Der dritte Laserlichtpuls kann beispielsweise ein Aktivierungslaserlichtpuls sein, der Fluorophore aus einem langlebigen Dunkelzustand zurück in einen Zustand überführt aus dem der Fluorophor wieder angeregt werden kann und fluoreszieren kann und damit wieder in der oben beschriebenen Weise mit dem ersten und zweiten Laserlichtpuls wechselwirken kann.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der erste Laserlichtpuls ein Anregungspuls ist, welcher so beschaffen ist, dass er von dem Fluorophor absorbierbar ist, wobei der erste Laserlichtpuls insbesondere weiterhin so beschaffen ist, dass er von einem Grundzustand des Fluorophors absorbierbar ist, wobei insbesondere der Fluorophor durch den Anregungspuls von dem Grundzustand des Fluorophors in einen ersten angeregten Zustand versetzbar ist.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der zweite Laserlichtpuls ein Abregungspuls ist, der so beschaffen ist, dass er den Fluorophor von einem energetisch höheren Zustand des Fluorophors in einen energetisch niedrigeren Zustand überführen kann, wobei insbesondere der energetisch höhere Zustand der erste angeregte Zustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der energetisch niedrigere Zustand der Grundzustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der Abregungspuls dazu geeignet ist, den Fluorophor über stimulierte Emission abzuregen. Der Abregungspuls kann damit zum Beispiel ein STED-Puls sein, der spektral in der langwelligen Flanke des Fluoreszenzspektrums des Fluorophors positioniert wird und damit etwa 50 nm–330 nm (Farbstoffe mit großem Stokesversatz, engl. long stokesshift dyes), bevorzugt 80 nm–150 nm langwellig verschoben zum ersten Laserlichtpuls, dem Anregungspuls, ist. Der spektrale Abstand beider Laser sollte so gewählt werden, dass ein Optimum zwischen effizienter stimulierter Abregung, minimaler direkter Anregung, maximaler spektralen Detektionsfenster für die Fluoreszenz sowie minimalen Photobleichen der Fluorophore erreicht wird.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die erfassten Photonen demjenigen Pulsmuster zugeordnet werden, welches den Laserlichtpuls enthält, der das jeweilige erfasste Photon, insbesondere zumindest statistisch betrachtet, verursacht hat. Beispielsweise kann festgestellt werden ob das Photon im ersten, zweiten, dritten oder vierten Pulsmuster detektiert worden ist. Erfolgt die Auswertung der Photonenankunftszeiten beispielsweise statistisch so kann ein Photon mit entsprechenden Wahrscheinlichkeiten auch mehr als einem Laserlichtpuls und damit mehr als einem Pulsmuster zugeordnet werden.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die folgenden Datensätze erstellt werden: Ein erster Datensatz wird aus den Daten der dem ersten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Ein zweiter Datensatz wird aus den Daten der dem zweiten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Insbesondere wird ein dritter Datensatz aus den Daten der dem dritten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Die Daten der zugeordneten Photonen können beispielsweise je Photon die absolute Ankunftszeit des Photon am Detektor und/oder relativ zum zugeordneten Laserlichtpuls und/oder eine statistische Wichtung des Photons und/oder eine Scannerposition und/oder die Detektionskanalnummer und/oder eine Wellenlängeninformation und/oder eine Polarisationsinformation enthalten. Der erste Datensatz wird dazu verwendet, einen Einfluss des zweiten Pulsmusters, insbesondere des zweiten Laserlichtpulses, auf eine Verteilung der Photonen des zweiten Datensatzes zu ermitteln und insbesondere den zweiten Datensatz zu filtern, so dass bei einer weiteren Verarbeitung des zweiten Datensatzes nur die gefilterten Daten berücksichtigt werden. Durch die Auswertung des ersten Datensatzes wird eine Verfälschung des zweiten Datensatzes aufgrund eines durch den zweiten Laserlichtpulses hervorgerufenen, insbesondere irreversiblen, Photobleichens des Fluorophors ermittelt und ausgeschlossen. Die Verfälschung kann sich bei Diffusionsmessungen insbesondere in einer scheinbar verkürzten Verweildauer im konfokalen Untersuchungsvolumen manifestieren und dadurch zu falsch ermittelten Diffusionszeiten, typischerweise zu kleinen Diffusionszeiten, führen. Der Verfälschung kann sich weiterhin in der Bildgebung beispielsweise von einzelnen Fluorophoren als zu kleine und/oder unsymmetrische Abbildung manifestieren, die das räumliche Auflösungsvermögen des Mikroskops damit falsch, im Sinne von tendenziell besser als tatsächlich vorhanden, wiedergibt.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der erste Datensatz dazu verwendet wird, Fluorophore der Probe zu identifizieren, die während der Beleuchtung der Probe mit der Pulssequenz in einen Dunkelzustand übergegangen sind. Diese in einen Dunkelzustand übergegangenen Fluorophore können dann von einer nachfolgenden Analyse gezielt ausgeschlossen werden um diese Analyse nicht zu verfälschen. Die Analyse kann beispielsweise die Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens des Mikroskops sein, bei der die Größe, mit der einzelne Fluorophore abgebildet werden, ausgewertet wird.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Computerprogramm vorgesehen, dass einen Programmcode zur Durchführung der oben genannten Schritte aufweist, wenn das Computerprogramm durch einen Computer ausgeführt wird. Die Probe wird dabei händisch oder mit einem automatisierten Verfahren bereitgestellt.
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Eine typisches Experiment im Sinne der beschriebenen Erfindung besteht beispielweise aus folgenden 3 Teilen:
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(1) Anregung
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Die Probe wird mit unterschiedlichem, gepulsten Laserlicht zeitlich versetzt beleuchtet. Verschieden bedeutet hier z. B. mit Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen, Intensitäten oder Polarisationen. Mindestens eine Sorte der dabei verwendeten Laserlichtpulse wird als Manipulationspuls bezeichnet und diese wird zeitnah mit mindestens einer weiteren Sorte (Anregungspuls) zum Beleuchten der Probe verwendet. Die Manipulation kann z. B. eine zusätzlich eingestrahlte STED-Abregung sein. Typischerweise ist es Strahlung, die den Fluorophor oder einen der beteiligten Fluorophore in einen veränderten photophysikalischen Zustand versetzen kann.
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Zeitnah bedeutet hier nicht unbedingt exakt simultan, aber in einer festen zeitlichen Beziehung die gegeben ist durch einen Prozess, der in der Probe durch einen der beiden Pulse ausgelöst wird. Der zweite Puls wird in die Probe eingestrahlt, solange der Prozeß in der Probe noch nicht vollständig abgeklungen ist. Einer der beiden Pulse beeinflusst diesen Prozess stark und wird als Manipulationspuls bezeichnet. Der Manipulationspuls kann also zeitlich vor, gleichzeitig oder auch nach dem Anregungspuls liegen.
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Eine Pulssequenz ist hier definiert als eine sich regelmäßig wiederholende Folge von Pulsmustern (siehe 1). Die Pulsmuster einer Pulssequenz unterscheiden sich ihrerseits in ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung aus verschiedenen Laserlichtpulsen. Eine Pulssequenz enthält mindestens ein Pulsmuster ohne zusätzliche Manipulation und ein Pulsmuster mit gleichzeitiger Laserlichtmanipulation.
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Die hier beschriebene Erfindung ist zur Generierung der folgenden Pulssequenzen mit Hilfe eines Pulsmustergenerators (53) in der Lage (siehe 2 und 7):
- 1. Den einfachsten Fall stellt eine regelmäßig gepulste Anregung (1) dar, bei der jeder zweite Anregungspuls zeitnah mit einem Manipulationpuls (2) kombiniert wird:
(1), (1) + (2), (1), (1) + (2), (1), (1) + (2), ...
- 2. Möglich ist auch ein regelmäßiger Wechsel von mehreren a (a = 1, 2, 3, 4, ...) Anregungspulsen (1), gefolgt von mehreren m (m = 1, 2, 3, 4, ...) Anregungspulsen, die jeweils zeitnah mit einem Manipulationspuls (2) kombiniert sind: z. B. a = 2 und m = 4:
(1), (1), (1) + (2), (1) + (2), (1) + (2), (1) + (2), (1), (1), (1) + (2), (1) + (2), (1) + (2), (1) + (2), ...
- 3. Möglich sind auch Pulssequenzen, die die in 1. und 2. beschriebenen Pulsmuster enthalten, darüber hinaus aber weitere Pulsmuster enthalten, z. B. weitere Anregungspulse mit weiteren Wellenlängen und/oder Polarisationen sowie weitere Manipulationspulse mit weiteren Wellenlängen und/oder Polarisationen oder auch weitere Einzelpulse, z. B. lediglich den Manipulationspuls ohne zugeordneten Anregungspuls.
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Das räumliche Beleuchtungsprofil der Probe mit verschiedenen Pulsen muss nicht identisch sein. Ist der Manipulationspuls beispielsweise ein STED-Puls für die laterale Auflösungsverbesserung, wird hierzu in der Mikroskopie eine ringförmige Beleuchtung in der Fokalebene verwendet.
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Unabhängig von den zu untersuchenden Prozessen kann der regelmäßige Wechsel des Pulsmusters auf der Nanosekunden-Zeitskala stattfinden, z. B. alle 1 ns–500 ns. Ein in diesem Sinne langsamerer Prozess ist z. B. die Verweildauer eines diffundierenden Teilchens im Laserfokus von etwa 0,1 Millisekunden. Die beschriebene Erfindung und insbesondere der Pulsmustergenerator (53) ist nicht nur in der Lage verschiedene Pulssequenzen zu generieren sondern auch den zeitlichen Abstand der Pulse innerhalb der Pulsmuster im Bereich mehrerer 10 Pikosekunden bis in den Nanosekundenbereich hinein anzupassen.
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(2) Datenaufnahme
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Die Datenaufnahme hat so zu erfolgen, dass die untersuchte Eigenschaft des Fluorophors zeitaufgelöst aufgezeichnet wird, damit zwischen der untersuchten Eigenschaft in An- und Abwesenheit der Manipulation unterschieden werden kann. Die Eigenschaft kann z. B. die Zahl der emittierten und detektierbaren Fluoreszenzphotonen, deren Wellenlänge und/oder auch deren Polarisation pro Zeiteinheit sein. Die Datenaufnahme kann z. B. als zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung realisiert sein.
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(3) Auswertung
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Die zeitlich getrennten Pulsmuster in Verbindung mit der entsprechend zeitaufgelösten Datenaufnahme erlauben eine separate Analyse des Einflusses der Manipulationspulse auf die Fluoreszenz an denselben Molekülen bzw. am selben Molekülensemble (siehe 3). Die Auswertung erfolgt separat für die verschiedenen Pulsmuster, z. B. durch Nutzung von Zeitfenstern oder auch spektraler sowie zeitaufgelöster linearer Entmischung, bei denen die detektierten Fluoreszenzphotonen einem Puls(muster) zugeordnet werden.
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Durch Setzen bestimmter Zeitfenster (”time-gates”) in Bezug auf die Photonenankunftszeiten können die detektierten Photonen jeweils einem bestimmten Pulsmuster zugeordnet werden. Die Eigenschaften der Photonen (z. B. Anzahl, Ankunftszeit, Polarisation, Wellenlänge) können somit separat für Pulsmuster mit und ohne Manipulationspulse identifiziert und analysiert werden.
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Begriffserläuterungen
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Mit STED (von engl. Stimulated Emission Depletion) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere die stimulierte Emission zur Entvölkerung angeregter Zustände bezeichnet. Dazu verwendet man eine mikroskopische Vorrichtung zur Verbesserung der Auflösung unter die klassische Beugungsgrenze, bei der die angeregten Zustände von Fluorophoren in den Randbereichen des beugungsbegrenzten Anregungsvolumens durch Einstrahlung eines weiteren Laserlichts stimuliert entvölkert und damit Fluorophore in den Randbereichen der beugungsbegrenzten Anregung der Detektion entzogen werden. Detektiert wird lediglich die Fluoreszenz aus den verbliebenen, nicht stimuliert entvölkerten, Zuständen im Zentrum des konfokalen Fokusses.
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Mit FCS (von engl. Fluorescence Correlation Spectroscopy) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere eine Methode zur quantitativen Messung von Molekülbewegungen bezeichnet, bei der u. a. Diffusionskoeffizient und Konzentration einer diffundierenden, fluoreszenzmarkierten Probe bestimmt werden können.
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Mit PIE (von engl. Pulsed Interleaved Excitation) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere eine alternierend gepulste Anregung bezeichnet, bei der z. B. abwechselnd nacheinander die einzelnen Farbstoffe eines FRET-Paares angeregt werden.
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Mit Blinking wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere ein photophysikalischer Effekt bezeichnet, bei dem ein einzelnes Molekül zwischen einem fluoreszierenden und einem nicht fluoreszierenden Zustand reversibel wechselt.
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Mit Photobleichen wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere eine lichtinduzierte, irreversible Veränderung eines Fluorophors aus einem angeregten Zustand heraus bezeichnet, sodaß dieser typischerweise bei Beleuchtung mit der ursprünglichen Anregungswellenlänge nicht mehr fluoresziert.
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Anwendungsbeispiele
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Einige mögliche Anwendungsbeispiele der hier beschriebenen Erfindung sind im Folgenden beispielhaft aufgeführt. Es wird darauf hingewiesen, dass in den folgenden Beispielen der Begriff STED-Laser als Synomym für Manipulationslaser jeder Art verwendet wird.
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Anwendung 1: PIE-STED FCS
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- • In FCS wird die Diffusion von Fluorophoren durch ein konfokales Untersuchungsvolumen untersucht. Durch STED lässt sich das konfokale Volumen verkleinern und damit die Diffusion in kleineren räumlichen Einheiten untersuchen. Die Manipulation besteht mindestens in einer ringförmigen Beleuchtung in der Fokalebene, welche das effektive Untersuchungsvolumen mittels stimulierter Emission verkleinert (STED) [Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009)].
- • Als unerwünschter Nebeneffekt kann die STED-Abregung zu einem irreversiblen Photobleichen der Fluorophore während des Durchgangs durch das Untersuchungsvolumen führen und damit zu einer verringerten Anzahl detektierbarer Fluoreszenzphotonen und einer scheinbar kürzeren Verweildauer im effektiven Untersuchungsvolumen (siehe 4).
- • Das Ausmaß irreversiblen Bleichens bei einer definierten STED-Beleuchtungsleistung kann bestimmt werden, indem man z. B. die mittlere Anzahl der Moleküle im Untersuchungsvolumen N, oder die mittlere Diffusionszeit t(diff), [Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829–837 (2001), Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429–440 (2007)] aus nacheinander erfolgten Messungen mit und ohne STED-Manipulation bestimmt und vergleicht (siehe 5).
- • Eine typische Vorrichtung hierfür ist in 7. dargestellt und eine typische Pulssequenz für ein derartiges PIE-STED-FCS Experiment ist in 2, oben (1) dargestellt.
- • Dies kann auch angewendet werden auf Varianten der FCS-Messung, bei der der gemessene Punkt nicht stationär ist, wie z. B. Scanning FCS [Ries et al, Biophys. J. 96, 1999–2008 (2009)] oder Raster Imaging Correlation Spectroscopy (RICS) [Digman et al, Biophys. J. 88, 133–136 (2005)].
- • Substanzen oder experimentelle Bedingungen, die einen Einfluss auf das STED-induzierte Photobleichen haben bzw. dieses partiell verhindern, können auf diese Weise mittels Diffusionsmessungen gezielt identifiziert werden.
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Anwendung 2: PIE-STED-Imaging an einzelnen, immobilisierten Molekülen
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- • Das Auflösungsvermögen eines optischen Mikroskops wird typischerweise über die Abbildung einer Punktlichtquelle bestimmt, wobei die Auflösung aus der räumlichen Ausdehnung des Abbilds der Punktlichtquelle bestimmt wird. In der klassischen Konfokalmikroskopie werden dazu oft fluoreszenzmarkierte Nanostrukturen (z. B. kleine Latexkugeln, sogenannte Beads) verwendet, deren Durchmesser mit kleiner 100 nm deutlich unterhalb des Auflösungsvermögens liegt.
- • In der STED-Mikroskopie mit einer optischen Auflösungen im Bereich von unter 50 nm entspricht die Auflösung in etwa aber der räumlichen Ausdehnung dieser Strukturen, wodurch diese Strukturen nicht mehr als Punktlichtquelle sondern als räumlich ausgedehnte Lichtquelle betrachtet werden müssen.
- • Um dies zu umgehen kann man in der STED-Mikroskopie nun ein einzelnes fluoreszierendes Farbstoffmolekül abbilden, das mit einer räumliche Ausdehnung von ca. 1 nm wiederum eine hierfür nahezu ideale Punktlichtquelle darstellt.
- • Wenn das Molekül allerdings während der konfokalen Abbildung in einen Dunkelzustand übergeht (Blinken oder Bleichen) ist die Abbildung des Moleküls unvollständig und die anhand der Größe der Abbildung bestimmte mikroskopische Auflösung falsch.
- • Über PIE-STED-Imaging können diese für die Auflösungsbestimmung unerwünschten photophysikalischen Prozesse wie Blinken und Bleichen der einzelnen Moleküle nun direkt identifiziert werden.
- • Eine typische Vorrichtung hierfür ist in 7. und eine typische Pulssequenz für ein derartiges PIE-STED-Imaging Experiment ist in 2, oben (1) dargestellt.
- • Mit alternierender Anregung mit und ohne STED-Beleuchtung werden die Daten aufgenommen.
- • Anschließend werden zunächst für die untersuchten Moleküle die Bilder für die Anregung mit dem Pulsmuster ohne STED-Puls dargestellt. Nur Moleküle, die während der Messung in diesen Bildern weder Blinken noch Bleichen aufweisen, werden zur folgenden Bestimmung der Auflösung unter STED-Bedingungen ausgewählt (siehe 6).
- • Für die genannten Moleküle werden dann die Abbildungen unter Anregung mit dem STED-Pulsmuster berechnet. In diesen Bildern wird dann die Auflösung unter STED-Bedingungen bestimmt.
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Anwendung 3: PIE-STED-Imaging einzelner Moleküle mit gezielter Vereinzelung
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- • Falls die Fluorophore in einer Probe zu dicht gepackt sind um Anwendung 2 durchzuführen kann die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle auch (temporär) reduziert werden.
- • Diese Vereinzelung kann z. B. durch Zugabe eines geeigneten ROXS-Puffers erreicht werden, der einen Großteil der Fluorophore in einem langlebigen Dunkelzustand hält.
- • Die Vereinzelung ist auch möglich in dem die Moleküle zuerst alle in einen Dunkelzustand überführt werden und aus diesem heraus dann nur einige wenige Moleküle durch Photoaktivierung wieder in einen fluoreszierenden Zustand überführt werden.
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Anwendung 4: PIE-STED-Imaging an Ansammlungen von wenigen, immobilisierten Molekülen
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- • Ziel dieser Anwendung ist es, eine Aussage über die Anzahl unabhängiger Fluorophore in einem STED-Bild zu treffen. Ist der Abstand zwischen mindestens 2 Fluorophoren kleiner als das Auflösungsvermögen im STED-Bild, können diese nicht mehr getrennt voneinander abgebildet werden.
- • Durch Analyse des Fluoreszenz-Antibunchings läßt sich allerdings die Anzahl unabhängiger Emitter auch in diesem Fall noch genau ermitteln (bei < 5 Fluorophoren) bzw. abschätzen (bei 5–20 Fluorophoren).
- • Die Photonenausbeute und Stabilität der Fluorophore ist allerdings typischerweise unter STED-Bedingungen für eine aussagekräftige Antibunching-Analyse zu gering.
- • Durch Wahl eines geeigneten alternierenden Pulsmusters kann man nun aber gleichzeitig unter konfokalen Bedingungen Photonen für die Antibunching-Analyse einsammeln und unter STED-Bedingungen für ein hochaufgelöstes Fluoreszenzbild.
- • Mit der Information aus der Antibunching-Analyse lassen sich dann Rückschlüsse über die Anzahl der unabhängigen Fluorophore in den Strukturen im STED-Bild treffen.
- • Dabei werden typischerweise Pulssequenzen verwendet wie in 2, Mitte (2) die in diesem Fall aber deutlich mehr Pulsmuster ohne STED-Puls enthalten um die notwendige Photonenstatistik für die Antibunching-Analyse zu erhalten.
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Anwendung 5: Kombination aus STED-Intensitätsbild und dem Mapping einer weiteren Eigenschaft ohne STED-Puls
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- • Ziel dieser Anwendung ist die Kombination der hochaufgelösten intensitäts-basierten Ortsinformation aus dem STED-Bild mit funktionaler Information aus einem Bild ohne Manipulations-STED-Pulse, da die STED-Pulse die Abfrage dieser Eigenschaft beeinflussen oder verhindern können.
- • Die Eigenschaft kann z. B. das Fluoreszenzabklingverhalten sein (→ FLIM) das im Zeitbereich der Beleuchtung mit dem STED-Puls von Effekten überlagert sein kann die durch diesen STED-Puls hervorgerufen werden. Oder es handelt sich um eine Eigenschaft deren Untersuchung eine hohe Photonenstatistik erfordert, die andernfalls durch STED induziertes Photobleichen verhindert wird.
- • Die bildliche Darstellung der Informationen aus dem Bild ohne und mit STED-Puls kann z. B. in einem weiteren Bild in der Art erfolgen, dass in diesem Bild die Helligkeit eines Pixels aus der Intensitätsinformation aus dem STED-Bild kodiert wird und die Farbe eines Pixels aus dem Wert der Eigenschaft aus dem Bild ohne STED-Puls kodiert wird.
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Anwendung 6: STED-Bild kombiniert mit einem Bild, dass nur durch den Manipulationslaser (STED-Laser) erzeugt wird
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- • Die Farbstoffe, die für einen STED-Laser bestimmter Wellenlänge zur Bildgebung herangezogen werden, müssen verschiedene Eigenschaften erfüllen.
- 1. Das Emissionsspektrum sollte möglichst gut mit der STED-Wellenlänge überlappen. Je höher der spektrale Überlapp, desto weniger STED-Leistung ist für eine hochauflösende Bildgebung notwendig.
- 2. Das Anregungsspektrum des Farbstoffs soll möglichst überhaupt nicht mit der STED-Wellenlänge überlappen. Je höher der Überlapp, desto stärker wird eine störende direkte Anregung sichtbar, die sich ein einem verwaschenen Bild bemerkbar macht, da auch im Bereich der ringförmigen STED-Beleuchtung Fluorophore angeregt werden.
- • Daher ist die Farbstoffwahl meist ein Kompromiss aus 1) und 2). Dies ist jedoch unbefriedigend, da dadurch
- • dem gleichzeitigen Vermessen verschiedener Labels und Farbstoffe enge Grenzen gesetzt sind.
- • die eingesetzte STED-Laserleistung z. T. sehr hoch gewählt werden muss, was zum Bleichen der Farbstoffe und damit zu einer Einschränkung der Beobachtungsdauer führt.
- • Eine Lösung des Problems ist es, an die Pulssequenz für die Einzel- oder Mehrfarbenmessung am Ende ein oder mehrere zusätzliche Pulsmuster mit einem STED-Puls ohne dazugehörigen Anregungspuls anzuschließen. Dieses zusätzliche Pulsmuster erlaubt die Vermessung der direkten Anregung durch den STED Laser.
- • Mit Hilfe von Zeitfenstern und entsprechender Analyse (z. B. Intensitäts- als auch zeitaufgelöster linearer Entmischung) lässt sich das von direkter Anregung durch den STED-Puls ungestörte Bild berechnen.
- • Dies führt zu einer Erhöhung der Anzahl von gleichzeitig mit einer STED-Wellenlänge zu vermessender Farbstoffe und verbessert damit die gleichzeitige Erfassung von verschiedenen Farbstofflabeln in der Probe.
- • Es führt für ausgewählte Farbstoffe zu einer Reduktion der notwendigen STED-Laserleistung bei gleichbleibender Erhöhung der Auflösung.
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Anwendung 7: Zurückholen von Fluorophoren aus einem STED induzierten, intermediären Dunkelzustand
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- • Das Photobleichen während einer STED-Messung kann mittels Absorption mehrerer Photonen über mehrere Zustände hinweg erfolgen bis hin zu einem irreversiblen Zustand in dem der Fluorophor so verändert ist, dass er entweder das Anregungslicht nicht mehr absorbiert oder unabhängig davon zumindest nicht mehr fluoresziert.
- • Mit einem dritten Laserlichtpuls (neben Anregung und Manipulation = STED) kann man den Fluorophor auf diesem Weg in Richtung des final irreversiblen Zustands auch aus einem der dazwischen liegenden Zustände optisch induziert wieder zurückholen, sodaß er erneut mit dem Anregungslaser zur ursprünglichen Fluoreszenz angeregt werden kann.
- • Auf diese Weise läß sich die Wahrscheinlichkeit des Photobleichens verringern und somit die Lichtausbeute erhöhen.
- • Dazu wird eine Pulssequenz verwendet die neben einem Pulsmuster mit einem Anregungspuls, einem Pulsmuster mit Anregungs- und Manipulationspuls auch ein Pulsmuster mit einem dritten Laserlichtpuls enthält.
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Figurenbeschreibung
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Fig. 1:
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Beispiel einer aus Pulsmustern (4), (5), 6) zusammengesetzten Pulssequenz (3). Die unterschiedlich schraffierten Anregungs- (1) und Manipulationspulse (2) können unterschiedlichen Wellenlängen aber auch Intensitäten oder Polarisationen der verwendeten Laser entsprechen.
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Fig. 2:
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Beispiele verschiedener Pulssequenzen (3): Die dargestellen Sequenzen 1) bis 3) sind nur Beispiele für verschiedene Varianten und stellen nicht alle möglichen Pulssequenzen dar.
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Fig. 3:
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Ablaufschema einer Messung.
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Fig. 4:
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Normalisierte Diffusionszeiten t(diff) von fluoreszenzmarkierten Lipiden (in einer Membrandoppelschicht auf Glas) bei ansteigender STED-Beleuchtungsleistung. Die abnehmenden Diffusionszeiten in Anwesenheit der STED-Manipulation (16) sind ein direktes Resultat der Reduzierung des effektiven Untersuchungsvolumes durch die STED-Beleuchtung (25). Photobleichen, induziert durch die STED-Beleuchtung, kann hier ausgeschlossen werden, da die Diffusionszeiten in Abwesenheit der STED-Manipulation (15) gleichbleibend sind.
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Fig. 5:
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- 1) Illustration der Anregungsvolumina für die alternierende Anregung ohne (links) und mit (rechts) gleichzeitigem STED-Puls: In Anwesenheit der STED-Beleuchtung (22) ergibt sich ein effektiv kleineres Volumen (25), in welchem die Moleküle (21) sichtbar sind.
- 2) Fluoreszenzzerfälle bei alternierender Anregung: Im frühen Zeitfenster links (26) der Zerfall nach der Anregung ohne Manipulationslaser, im späten Zeitfenster rechts (27) der Zerfall nach der Anregung bei gleichzeitiger Einstrahlung eines Manipulationslasers mit unterschiedlichen Leistungen (28), (29), (30).
- 3) Fluoreszenzintensitätskorrelationskurven: Links berechnet mit der Photoneninformation nach Anregung ohne Manipulationslaser (26). Rechts berechnet mit der Photoneninformation nach Anregung mit gleichzeitigem Manipulationslaser (27). Aus den Korrelationskurven (31), (32), (33) kann durch Anpassung geeigneter Modellfunktionen die mittlere Anzahl der Moleküle (21) im Untersuchungsvolumen N, oder die mittlere Diffusionszeit t(diff) bestimmt werden.
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Fig. 6:
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Prinzip der Auflösungsbestimmung an einem einzelnen Molekül:
- 1) Links dargestellt ist das Bild bei Anregung ohne STED (Bildausschnitt 0,8 × 0,65 Mikrometer). Es sind zwei Moleküle sichtbar. Rechts dargestellt ist das Bild der gleichen Moleküle mit zusätzlicher STED-Beleuchtung.
- 2) Intensitätsquerschnitte (35) und (37) entlang der Linie (34) in den beiden Bildern in 1) mit angepassten Fitfunktionen (36) und (38) zur Bestimmung der Halbwertsbreite als Maß für die Auflösung.
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Fig. 7:
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7. zeigt ein Fluoreszenzlichtmikroskop (58) gemäß einer möglichen Ausführung der vorliegenden Erfindung für jede Art von Fluoreszenzmikroskopie, inbesondere für die STED Mikroskopie. Das Mikroskop (58) kann zur Bildaufnahme und zur FCS verwendet werden. Dabei wird die Probe (46) mit Anregungslicht (40) aus der Anregungslichtquelle (39) beleuchtet. Das Anregungslicht (40) wird über den dichroitischen Strahlteiler (47) zum Objektiv (45) geleitet und mit diesem auf die Probe (46) beugungsbegrenzt fokussiert. Zusätzlich wird die Probe (46) mit Manipulationslicht (42) aus der Manipulationslichtquelle (41) beleuchtet. Dabei fallen die Schwerpunkte der fokussierten Beleuchtungsmuster von Anregungslicht (40) und Manipulationslicht (42) in der Probe (46) in einem Punkt zusammen. Im vorliegenden Beispiel eines STED-Mikroskops wird das Manipulationslicht für STED verwendet und dazu mit einem optionalen Strukturierungselement (43) verändert. Für STED beispielsweise verändert das Strukturierungselement (43) die Wellenfronten des Manipulationslichts (42) derart, dass es bei Fokussierung mit dem Objektiv (45) das STED-typische ringförmige Beleuchtungsmuster in der Probe (46) ergibt. Mit dem Strukturierungselement (43) lassen sich die Wellenfronten des Manipulationslichtstrahls in Teilen unterschiedlich verändern, beispielsweise ausgeführt als Phasenplatte oder als räumlicher Lichtmodulator (englisch spatial light modulator SLM). Der dichroitische Strahlteiler (44) reflektiert das Manipulationslicht (42) zum Objektiv (45), ist aber für das Anregungslaserlicht (40) und das Fluoreszenzlicht (50) mindestens weitgehend transparent. Das optionale Strukturierungselement (43) kann entweder zwischen Manipulationslaser (41) und dem Strahlteiler (44) angeordnet sein, oder zwischen dem Strahlteiler (44) und dem Objektiv (45). Im letzteren Fall ist das Strukturierungslement (43) derart gestaltet, dass es nur das Manipulationslicht (42) verändert aber das Anregungslaserlicht (40) unverändert passieren läßt. Von der Probe (46) emittierte Photonen werden mit dem Objektiv (45) eingesammelt und passieren anschließend das Strukturierungselement (43), sowie die dichroitischen Strahlteiler (44) und (47). Im Falle eines STED-Mikroskops handelt es sich dabei um Fluoreszenzlicht (50) das nach räumlicher Filterung durch eine Lochblende (48) und spektraler Filterung durch entsprechende Filter (49) auf einen Detektor (51) fällt. Der Detektor (51) ist in der Lage einzelne Photonen zeitaufgelöst zu detektieren. Die Daten der detektierten Photonen werden von diesem an eine Datenerfassungselektronik mit Zeitauflösung (52) übergeben. Diese Datenerfassungselektronik (52) erhält auch in Form von Synchronisationssignalen (59) ein Ortsinformation vom Scanner (57) sowie in Form von weiteren Synchronisationspulsen (56) eine Zeitinformation zu den Laserlichtpulsen der Pulssequenzen die durch den Pulsmustergenerator (53) ausgelöst werden. Der Pulsmustergenerator (53) erzeugt insbesondere die in 1 und 2 dargestellten Pulsmuster und Pulssequenzen mit hoher zeitlicher Präzision und führt diese als Triggerpulse (54) der Anregungslichtquelle (39) und als Triggerpulse (55) der Manipulationslichtquelle (41) zu. Der Pulsmustergenerator (53) kann entweder als eigenständige Einheit oder als Baugruppe einer Anregungslichtquelle (39) oder der Manipulationslichtquelle (41) ausgeführt werden. Zur Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes wird entweder die Probe (46) oder das Anregungs- und Manipulationslicht (40), (42) relativ zum Untersuchungsvolumen schrittweise bewegt und somit ein Bereich auf oder in der Probe abgerastert. Ein hierzu benötigter Scanner, der entweder die Probe bewegt oder beispielsweise mittels Objektiv-Scanning oder Strahl-Scanning das Untersuchungsvolumen in der Probe in den Richtungen x, y, z bewegt ist durch die Pfeile (57) schematisch angedeutet.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Anregungspuls
- 2
- Manipulationspuls
- 3
- Pulssequenz
- 4
- Pulsmuster 1
- 5
- Pulsmuster 2
- 6
- Pulsmuster 3
- 7
- Lichteinkopplung einer generierten Pulssequenz
- 8
- konfokales Mikroskop mit Probe und zeitaufgelöster Datenerfassung
- 9
- Bildgebende Messung: Punktmessung oder andere Messung unter Bewegung der Probe, des Objektivs oder des eingekoppelten Lichtes
- 10
- zeitaufgelöste Datenspeicherung incl. Speicherung der Position der beleuchteten Probe an Referenzpositionen
- 11
- Zeitaufgelöste Rekonstruktion der Detektorantwort
- 12
- zeitaufgelöste Bilder, Fluoreszenzkorrelationskurven, Fluoreszenzzerfälle, Antibunching-Messungen, Anisotropie-Messungen, spektrale Messungen bezogen auf jedes Pulsmuster
- 13
- Optional: Verrechnung des Detektorsignals nach einer Pulsfolge mit dem Signal nach einer anderen Pulsfolge
- 14
- z. B. STED-Bild mit verbesserter Auflösung
- 15
- Diffusionszeiten in Abwesenheit der STED-Manipulation
- 16
- Diffusionszeiten in Anwesenheit der STED-Manipulation
- 17
- axialer Schnitt durch die Strahltaille der fokussierten Anregung
- 18
- effektiver Anregungsbereich
- 19
- Fluorophor außerhalb des Anregungsbereichs
- 20
- Diffusionspfad des Fluorophors
- 21
- fluoreszierender Fluorophor im effektiven Anregungsbereich
- 22
- axialer Schnitt durch die in dieser Darstellung doppelte Strahltaille des Manipulationslasers
- 23
- Überlapp zwischen Anregungs- und Manipulationslaser
- 24
- Anregungslaser ohne überlappenden Manipulationslaser
- 25
- verkleinertes effektives Anregungsvolumen
- 26
- Zeitfenster für die konfokale Auswertung (ohne STED Laser)
- 27
- Zeitfenster für die STED-Auswertung (mit drei verschiedenen STED Laserleistungen)
- 28
- Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 0 mW
- 29
- Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 1.3 mW
- 30
- Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 20 mW
- 31
- Korrelationskurve für STED-Leistung = 0 mW
- 32
- Korrelationskurve für STED-Leistung = 1.3 mW
- 33
- Korrelationskurve für STED-Leistung = 20 mW
- 34
- Lage des ausgewählten Intensitätsquerschnitts
- 35
- Intensitätsquerschnitt bei Anregung ohne STED
- 36
- Gaussfit an (35) (Halbwertsbreite = 270 nm)
- 37
- Intensitätsquerschnitt mit zusätzlicher STED-Beleuchtung
- 38
- Lorentzfit an (37) (Halbwertsbreite = 17 nm)
- 39
- Anregungslichtquelle
- 40
- Anregungslicht
- 41
- Manipulationslichtquelle
- 42
- Manipulationslicht
- 43
- Strukturierungselement
- 44
- dichroitischer Strahlteiler
- 45
- Objektiv
- 46
- Probe
- 47
- dichroitischer Strahlteiler
- 48
- Pinhole
- 49
- Filter
- 50
- Fluoreszenzlicht
- 51
- Detektor
- 52
- Datenerfassungselektronik mit Zeitauflösung
- 53
- Pulsmustergenerator
- 54
- Triggerpulse
- 55
- Triggerpulse
- 56
- Synchronisationspulse
- 57
- Proben- oder Strahlscanner
- 58
- Mikroskop
- 59
- räumliche Synchronisationssignale (x, y, z)
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009) [0033]
- Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829–837 (2001), Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429–440 (2007) [0033]
- Ries et al, Biophys. J. 96, 1999–2008 (2009) [0033]
- Digman et al, Biophys. J. 88, 133–136 (2005) [0033]
