Verfahren zur Untersuchung der Lumineszenz chemischer und /oder biotoqischer Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Lumineszenz, insbesondere der Fluoreszenz chemischer und/oder biologischer Proben.
Eine der wichtigsten technischen Grundlagen für die Untersuchung biologischer und biochemischer Proben ist die Analyse von (oftmals laserinduzierter) Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz. Als fluoreszierende Moleküle werden z.T. Farbstoffe den Proben zugefügt (z.b. Fluoreszin, hodarmine u.v.m), fluoreszierende Proteine (z.B. GFP, green fluorescent protein) von biologischen Proben selbst erzeugt (natürlich oder nach entsprechender Manipulation) oder auch die häufig auftretende Autofluoreszenz bei Anregung mit meist kurzwelligem Licht genutzt. Durch molekulare Wechselwirkungen der fluoreszierenden Moleküle mit ihrer Umgebung ändern sich häufig die Fluoreszenzeϊgenschaften, insbesondere führen nicht-leuchtende
Energieübergänge zu einer veränderten Photonenausbeute und somit Helligkeit der Farbstoffe.
Die am einfachsten zu messende Größe, die Helligkeit der Fluoreszenz, lässt i.A. keine Unterscheidung zu zwischen den Ursachen Konzentrationsänderung der Farbstoffe, experimentellen Parametern (Änderung der Beleuchtungsstärke) oder Änderung der Photonenausbeute auf Grund molekularer Wechselwirkungen. Um hier zusätzliche Informationen aus den
Proben zu erhalten sind unterschiedliche Messmethoden entwickelt worden, die je nach Probensystem mehr oder weniger gut geeignet sind.
Einzeimolekülanalysen, etwa FIDA, sind sehr gut geeignet für Analyse von flüssigen, biochemischen Proben. Für die Untersuchung zellulärer Präparate sind Einzeimolekülanalysen nur bedingt eϊnsetzbar, da sie für jeden örtspunkt in der Probe eine relativ große Messzeit benötigen und daher für eine
Bildaufnahme zu langsam sind.
Die Lebenszeit der Fiuoreszenzfarbstoffe, d.h. die mittlere Zeit, die sie nach der Absorption eines Photons im angeregten Zustand bleiben, wird durch Änderungen der chemischen (iMah-)Umgebung der Moleküle in ähnlicher Weise beeinflusst wie die Helligkeit der Farbstoffe. Sie kann daher ein Maß liefern, um zwischen Konzentrations- und Wechselwirkungseffekten zu unterscheiden. Ferner ist sie unabhängig von der Intensität des anregenden Lichtes. Prinzipiell kann sie sowohl auf Eϊnzel olekülbasis (z.B. FILDA), bei der Gesamtprobenanalyse („Bulk-Messungen,,) oder bei bildgebenden Verfahren (z.B. Mikroskopie - Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM) angewandt werden (vgl. Szmacinski, J. . Lakowϊcz, Cell Calϊcium 1995, Jul 18(1); 64-75, Possibility of Simultaneously measuring low and high calcium concentratlons using Fura-2 and lifetime-based sensing).
Die Lebenszeit typischer Farbstoffe liegt dabei im Bereich um eine oder einige wenige Nanosekunden. Für ihre Messung werden Lichtquellen und Detektoren mit entsprechender Zeitauflösung eingesetzt.
Bei abbildenden Verfahren, die nicht auf dem Abscannen eines Probenbereiches mit einem einzelnen Fokus beruhen, müssen räumliche und hohe zeitlich Auflösung miteinander kombiniert werden. Insbesondere zwei Verfahren sind dabei (auch) in der Mikroskopie üblich.
Bei der ,gegateten Signalaufnahme' wird eine gepulste Lichtquelle zur Anregung und eine Kamera mit kurzen, gegen den Anregungspuls verzögerten Sensitivitätsfenstern (,gates') genutzt. Bei einem 'gate' handelt es sich somit
um eine Beobachtungsdauer bzw. ein Zeitfenster, in dem die Probe beobachtet wird. Hier ist die Auswertung konzeptionell relativ einfach, für mehrere
Datensätze (Fluoreszenzbilder) unterschiedlicher Verzögerungszeit kann z.B. pϊxelweise das Abklingen der Helligkeit bestimmt werden. Hierbei wird unter
Verzögerungszeiten der Zeitraum von der Anregung der Probe, d.h. der
Abgabe eines Anregungspulses bis zum Beginn der Beobachtungsdauer, verstanden. Die Unterdrückung von besonders kurzlebiger und unerwünschter
Autofluoreszenz ist einfach. Allerdings nimmt man einen hohen Signalverlust in
Kauf, da die Fensterbreite (gate width) bzw. die Beobachtungsdauer deutlich kleiner sein muss als die Lebenszeit der Farbstoffe, um zu unterschiedlichen
Verzögerungszeiten Helligkeitsänderungen messen bzw. untersuchen zu können. D.h. ein Großteil der Fiuoreszenzphotonen treffen auf den Detektor, während dieser nicht sensitiv ist.
Beim , Modulationsverfahren* werden die Beleuchtungshelligkeit, d.h. die Stärke des Anregungspulses, und die Kameraempfindlichkeit moduliert. Ist die Frequenz beider Modulationen identisch, gibt das unterschiedliche Signal bei verschiedenen Phasenverzögerungen eine Möglichkeit zur Bestimmung der Fluoreszenziebenszeiten (vgl. Szmacinski, 3.R. Lakowicz, Ceil Caücϊum 1995, Jui 18(1): 64-75, Possϊbility of Simultaneously measuring low and high calcium concentrations using Fura-2 and lifetime-based sensing). Zwar ist hier der sensitive Zeitbereich des Detektors sehr groß, allerdings wird das Photonenrauschen trotz des höheren Signalnϊveaus nicht unbedingt unkritischer, da sich die , effektiven Zeitfensteri stark überlappen.
Unter Effizienzaspekten ideal wäre die Einzelphotonenspektroskopie. Hier sind die Eintreffzeitpunkte aller Photonen bekannt, so dass die Verluste minimal sind. Allerdings ist derzeit kein Eϊnzelphotonendetektor erhältlich der gleichzeitig Orts- und Zeitauflösung im μm- bzw. ns-Bereich ermöglicht. So ist dieser Ansatz insbesondere für Messungen mit nur einem Fokuspunkt (etwa Laser Scanning Mikroskopie) prädestiniert.
Für die gegatete Signalaufnahme (und auch für die Phasenverschiebung) wird eine schnell schaltbare ICCD (intenstfied CCD, Bildverstärker) als Detektor genutzt. Diese besteht im Wesentlichen aus einer lichtempfindlichen Kathode, einer dahinter liegenden Multi-Channet-PIate (MCP) mit anschließendem
Phospor-Biidschirm und einer Optik, die den Bildschirm auf eine anschließende
CCD-Kamera abbildet. Auf die Kathode treffende Photonen lösen dort
Elektronen ab, die, getrieben von einer Potentialdifferenz (meist einige 10-100
Volt), auf die Vorderseite der MCP treffen. Am Auftreffort auf der MCP erzeugt diese eine (lokale) Elektronenlawine, die dahinter auf den Phosphorbϊldschirm trifft. Abhängig von der über der MCP anliegenden Verstärkungsspannung (z.B. einige hundert Volt) kann aus einem auftreffenden (Kathoden-)Elektron ein mehr oder weniger heller Fluoreszenzfleck auf dem Phosphor und dann durch die CCD-Kamera ein mehr oder weniger heller Bildpunkt erzeugt werden.
Neben anderen Parametern ist die Spannung zwischen Kathode und MCP entscheidend für die erreichte Lichtempfϊndlichkeit der Kamera - im empfindlichsten Fall kann nahezu jedes auf der Kathode erzeugte Elektron auf die MCP gelangen und dann zum Bild beitragen.
Durch schnelle Veränderung dieser Spannung ist es möglich die Empfindlichkeit der ICCD im Sub-ns-Bereich zu modulieren (beim Phasenverschiebungsverfahren) bzw, ein- und auszuschalten (zu ,gatenv), Der Schaltvorgang kann in einer festen zeitlichen Verschiebung zur Änderung des Anregungslϊchtes erfolgen. Das Verändern der Spannung dient somit als Verschlusseinrichtung.
Informationen über das Abklingverhalten der Fluoreszenz in der Probe erhält man durch Messen der Fluoreszenzhelligkeit bei verschiedenen Verzögerungszeiten (delays) zwischen Anregungspuls und Sensitivität der Kamera. Typische Parameter sind für Fluoreszenzfarbstoffe mit Lebenszeiten von einigen ns gepulste Laserquellen mit ca. 80 MHz Wiederholrate und 10 ps Pulsbreϊte, gate-Breiten von 0.5 ns und Sequenzen von 5-50 Bildern mit Verzögerungszeiten von 0.1 ns bis 10 ns. Bei der Fluoreszenzlebenszeit
handelt es sich um eine charakteristische Größe für die zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzϊntensität, Im Allgemeinen nimmt die Intensität entsprechend einer exponentϊellen Zerfallskurve ab.
Zur Auswertung der Fluoreszenzlebenszeiten ist es bekannt, in einer Bϊldsequenz pixelweise die Helligkeiten aufeinanderfolgender Bilder miteinander zu vergleichen. Um den Eϊnfluss des Rauschens zu verringern und bei lichtschwachen Signalen werden häufig mehrere benachbarte Pixel der Bilder durch Binning zusammengefasst. Hierdurch wird zwar die Signalstärke erhöht, jedoch die Bildauflösung verringert. Dies führt zu einem „Verschmieren" der Daten und somit zu Messungenauigkeiten.
Das Binding, d.h. Zusammenfassen, benachbarter Pixel führt zwar zu einem verringerten Anteil des Rauschens in der Auswertung, allerdings wird die räumliche Auflösung willkürlich, ohne Bezug auf die im Bild erkennbaren Strukturen, verringert, Insbesondere in Bereichen großer Kontraste der Helligkeit oder der Lebenszeit führt dies zu verschmierten Strukturen oder fehlerhaften Ergebnissen,
Sind die betrachteten Strukturen nicht fest relativ zum Bild, sondern bewegen sie sich, z.B. durch Diffusion oder Strömung, führt eine pixelorientierte Auswertung u.U. zu großen Fehlern.
Die Fluoreszenzhelligkeit fällt zumeist exponentiell mit der Verzögerungszeϊt ab. Daher tragen bei den Bildern mit größerer Verzögerungszeit, d.h, größerem zeitlichem Abstand vom Anregungsimpuls, nur noch relativ wenige Photonen zum Signal bei. Die (relative) Genauigkeit der Helligkeitswerte wird großteils durch die Poisson-Statϊstik der detektierten Photonen aus der Probe bestimmt, d.h, das Verhältnis aus Unsicherheit (DN) des Messwertes zum Mittelwert (N) sinkt proportional zur Quadratwurzel des Mittelwertes, DN/N = l/sqrt(N).
Bei den bekannten Aufnahmemethoden wird die Genauigkeit, mit der die
Fluoreszenzlebenszeiten bestimmt werden können, durch die großen
Unsicherheiten bei großen Verzögerungszeiten begrenzt. Um auch bei großen
Verzögerungszeiten eine hinreichende Präzision der Daten zu erhalten, können z.B. bei mehr Verzögerungswerten die Daten aufgenommen werden und/oder die Messzeϊt vergrößert werden. Hierdurch wird die Untersuchungsdauer jedoch erheblich verlängert. Dies ist bei automatischen
Untersuchungsverfahren, wie Medium- oder High-Troughput-Screening, nicht erwünscht.
Bei einer vergrößerten Messzeϊt wird jedoch für kurze Verzögerungen leicht der Detektor bis zur Sättigung gebracht, so dass die entsprechenden Messwerte nicht mehr zur üblichen Auswertung beitragen können.
Eine Erhöhung der Verstärkungsspannung deutlich über das Maß, dass "ein count der Kamera entspricht einem detektlerten Photon" hinaus führt mit όer Erhöhung der bestimmten Helligkeit (= counts der CCD) auch zu einer entsprechenden Steigerung des Photonenrauschens, da dies bereits vor der Verstärkungsstufe (MCP) auf der Kathode entsteht.
Die Mess- und Auswertemethoden nach dem Stand der Technik sind für den bei Forschungsaufgaben üblichen Probendurchsatz geschaffen. Hier steht meist eine sorgfältige, teilweise , manuelle' Auswertung im Vordergrund, Die Messzeϊt je Probe ist von untergeordneter Bedeutung.
Für das automatische Screenen, insbesondere Medium- und High-Throughput- Screening chemischer und/oder biologischer, insbesondere pharmazeutischer Proben sind jedoch andere Anforderungen von hoher Priorität. Ein hoher Probendurchsatz, typisch einige 103 bis 105 Proben je Tag, Reduktion der Daten auf die wichtigsten Parameter und minimale personengebundene Kontrolle der Messdaten sind wesentlich.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein derartiges Verfahren zur Untersuchung der
Lumineszenz chemischer und/oder biologischer Proben, derartig zu verbessern, dass es auch für Medium- und/oder High-Throughout-Screening geeignet ist.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruchs 1 bzw. 8.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt zuerst ein Anregen der Probe zu Lumineszenz, insbesondere Fluoreszenz durch das Abgeben mindestens eines elektromagnetischen Anregungspulses auf die Probe. Vorzugsweise erfolgt die Anregung durch Laserpulse, Die von der Probe abgegebene Lumineszenzstrahlung wird mittels eines oder mehrerer Detektoren detektiert Hierbei trifft innerhalb eines Detektionszeitraums mindestens ein Änregungspuls auf die Probe auf, so dass innerhalb des Detektionszeitraums mindestens eine Lumineszenz-Abklingphase detektiert werden kann, Vorzugsweise werden innerhalb eines Detektionszeitraums eine Vielzahl von Aπregungspulsen auf die Probe abgegeben, so dass auch eine Vielzahl von Lumineszenz-Abklingphasen erzeugt und detektierbar werden, Vorzugsweise werden innerhalb eines Detektionszeitraums mindestens 10\ insbesondere mindestens 10* Anregungspuise auf die Probe abgegeben. Hierbei handelt es sich bei einer Abklingphase beispielsweise um das vollständige Abklingen eines zur Lumineszenz oder Fluoreszenz angeregten, in der Probe vorhandenen Teilchens, beispielsweise eines Farbstoffmarkers, Je nach Art der zu untersuchenden Probe sowie des eingesetzten Untersuchungsverfahrens kann es sich bei einer Abklingphase auch nur um einen Teil der gesamten Abklingphase handeln.
Zur Detektion der Lumineszenzstrahlung ist dem Detektor eine Verschlusseinrichtung vorgeschaltet, die für eine Beobachtungsdauer ('gate') zu unterschiedlichen Verzogerungszeiten aktiviert wird.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Beachtungsdauer in Abhängigkeit von der Verzögerungszeit variiert.
Vorzugsweise wird die Beobachtungsdauer mit zunehmender Verzögerungszeit verlängert. Dies hat den Vorteil, dass zu einem Zeitpunkt, zu dem das Abklingen der Lumineszenz bereits fortgeschritten ist, d.h. zu einem relativ späten Verzögerungszeitpunkt, ein ggf. längeres Beobachten der Probe erfolgt, so dass die Anzahl der von dem Detektor mittelbar oder unmittelbar wahrgenommenen Photonen erhöht wird.
Erfindungsgemäß wird bei der ersten bevorzugten Ausführungsform zusätzlich mindestens ein zusammengehörendes Probenelement in der Probe bestimmt. Bei einem derartigen Probenelement handelt es sich beispielsweise um eine Zeile, einen Zellkern, eine Zellmembran oder um mehrere als zusammengehörend definierte Partikel. Das Bestimmen derartiger Probenetemente erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Bϊldanalyseverfahren, insbesondere anhand eines Referenzbildes der Probe, Das Referenzbiid zur Bestimmung dieser Probenelemente kann ggf. aus einem oder mehreren Bildern der Messung erzeugt werden. Erfindungsgemäß wird ferner auf dem Detektor zu dem mindestens einen Probenelement ein korrespondierender Detektorbereϊch bestimmt. Wird als Detektor beispielsweise ein CCD-Array eingesetzt, ist der Detektorbereich durch mehrere Pixel definiert. Auf diesen Pixeln wird das als zusammengehörend bestimmte Probenelement abgebildet. Der definierte Detektorbereich kann beispielsweise auch nur ein Teil des als zusammengehörend bestimmten - Probenelements ausmachen, so dass beispielsweise bei einer Zeile nur ein zentraler Bereich der Zelle durch den Detektorbereich detektiert wird. Hierdurch werden negative Randeinflüsse, die zu Verfälschungen von Messergebnissen führen können, vermieden,
Des Weiteren erfolgt erfindungsgemäß ein Auswerten der zeitabhängigen Informationen anhand der Detektorbereiche. Die in dem definierten Detektorbereich zu unterschiedlichen Verzögerungszeiten erhaltenen Informationen, bei denen es sich beispielsweise bei einem entsprechenden Detektor um elektrische Signale handelt, werden somit zeitabhängig ausgewertet, so dass insbesondere eine verbesserte Bestimmung der Lebenszeit erfolgen kann. Durch das erfindungsgemäße Bestimmen
zusammengehörender Probenelemente kann ein objektorientiertes Bestimmen der Lebenszeit erfolgen. Durch das Definieren von Probenelementen und korrespondierenden Detektorbereichen ist es möglich, Messungen nur in diesen bestimmten Bereichen durchzuführen bzw, auszuwerten. Hierdurch kann die Untersuchungszeit verringert werden, da das auszuwertende Signal durch die Integration über die jeweiligen Probenbereϊche wesentlich weniger Rauschen aufweist als bei einer Auswertung einzelner Pixel. Insbesondere ist es beim Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, die Auswertezeit erheblich zu verringern, da beispielsweise bei Verwenden eines CCD-Arrays nicht sämtliche Pixel, sondern nur beispielsweise die Mittelwerte der Pixel der vorbestimmten Detektorbereiche ausgewertet werden müssen.
Zur Bestimmung zusammengehörender Probenelemente mittels Bildanalyseverfahren ist die Bϊldanafyse mittels Schwellwertbildung bevorzugt.
Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Beobachtungshäufigkeϊt bei unterschiedlichen Verzögerungszeiten variiert. Hierbei wird ein Detektor, dem eine Verschlusseinrichtung vorgeschaltet ist, entsprechend dem vorstehenden Verfahren für eine Beobachtungsdauer zu unterschiedlichen Verzögerungszeiten aktiviert. Die Probe wird je Verzögerungszeit bei unterschiedlichen Lu ϊneszenz-Abklingphasen mehrmals beobachtet. Bei beispielsweise exponentiell abklingenden Lumineszenz-Abklingphasen ist es zweckmäßig, bei geringen Verzögerungszeiten, zu denen die Lumineszenz der Probe noch relativ hoch ist, die Probe seltener zu beobachten. Hierbei kann eine ausreichende Anzahl an Photonen mittelbar oder unmittelbar detektiert werden, um ein zufriedenstellendes bzw, interpretierbares Messergebnis zu erhalten. Bei größeren Verzögerungszeiten ist bei dieser Art des Abklingverhaltens jedoch bereits ein Großteil der Lumineszenz abgeklungen, so dass die Helligkeit relativ gering ist. Erfindungsgemäß wird beispielsweise zu späten oder langen Verzögerungszeiten die Beobachtungshäufigkeit erhöht, so dass auch zu späten Verzögerungszeiten ausreichend Photonen detektiert werden.
Besonders bevorzugt ist es, die zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die Bestimmung mindestens eines zusammengehörenden Probenelements und eines hierzu korrespondierenden Detektorbereichs sowie der anschließenden Auswertung der zeitabhängigen Information anhand des mindestens einen Detektorbereichs weiterzubilden. Dies kann insbesondere, wie vorstehend anhand der ersten bevorzugten Ausführungsform beschrieben, erfolgen.
Durch die beiden vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, diese Verfahren bei Medium- und/oder High-Throughput-Screening einzusetzen. Besonders bevorzugt ist es, die beiden Verfahren zu kombinieren.
Eine Lösung der durch die großen Helligkeϊtsunterschiede bei kurzen und langen Verzogerungszeiten verursachten Ungenauigkeiten ist somit das Anpassen der Bϊldaufnahmezett, d.h. der Häufigkeit der Beobachtung, an die jeweilige Verzögerungszeit (bzw. an die Helligkeit zu dieser Verzögerungszelt). Die gemessenen Helligkeiten werden dann vorzugsweise in der Auswertung noch geeignet umskaliert, um bekannte Auswerteverfahren benutzen zu können.
Im Vergleich zur Verlängerung der Belichtungszeit erhält man beim Anpassen bzw. Variieren der Beobachtungsdauer geringere Gesamtmesszeiten. Die zeitliche Auflösung würde bei großen Verzögerungszeiten natürlich geringer werden, bei dem typischen exponentiellen Abklingverhalten der Helligkeit sind aber für größere Verzögerungszeiten auch die relativen Helligkeitsänderungen kleiner. Idealerweise würde die Fensterbreite logarithmisch mit der Verzögerungszeϊt anwachsen. Für exponentielle Abklingkurven wäre dann bei allen Zeϊtskalen die gleiche oder zumindest annähernd die gleiche Signalhelligkeit und zeitliche (relative) Auflösung von Fluoreszenzänderungen gewährleistet. Für die weitere Auswertung können selbstverständlich auch in diesem Fall die Helligkeiten bei den einzelnen Verzögerungszeiten geeignet skaliert werden.
Die Kombination beider o.g. Verfahren ist besonders dann vorteilhaft, wenn die zur Verfügung stehenden Fensterbreiten, d.h. Beobachtungsdauern (i.A. vorgegeben durch die Kontrollelektronik) nicht zufriedenstellend an die zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzhelligkeit angepasst werden können.
Wird zusätzlich mindestens ein zusammengehörendes Probenelement, insbesondere anhand eines Referenzbildes der vorhandenen Strukturen erzeugt - je nach biochemischem System mit einem anderen Fluoreszenzkanal (Referenzfarbstoff), einer , icht gegateten' Belichtung (maximales Signal) oder einer Aufsummϊerung der einzelnen Bilder der Zeitserie - kann eine Zusammenfassung der Pixel anstatt auf der Basis benachbarter Kamerapϊxe) auf όer Basis zusammengehörender Probenelemente bzw. Biidstrukturen erfolgen. Aus der Lebenszeitsequenz für alle Pixel eines Strukturelementes bei einer Belichtung kann so ein sehr viel genauerer Datenpunkt in der Zeitreihe erzeugt werden. Die Lebenszeitauswertung kann dann jeweils für die einzelnen Bildstrukturen anstatt für die Kamerapixel durchgeführt werden.
Die Bestimmung des mindestens einen Probenelements sowie des korrespondierenden Detektorbereichs kann vor dem Detektionszeitraum, d.h. dem Zeitraum, in dem zu unterschiedlichen Verzogerungszeiten Messungen erfolgen, vorgenommen werden, Dies ist beispielsweise bei im Wesentlichen stationären, sich nicht verändernden Proben zweckmäßig. Bei beispielsweise flüssigen und/ oder sich verändernden Proben, beispielsweise diffundierenden Partikeln, wachsenden Zellen etc. ist es bevorzugt, die Bestimmung der Probenelemente und der korrespondierenden Detektorbereiche häufiger vorzunehmen. Insbesondere erfolgt dies mindestens einmal während eines Detektionszeitraums. Besonders bevorzugt ist eine entsprechende Bestimmung unmittelbar vor jeder Messung. Selbstverständlich ist es auch möglich, in vorgegebenen, insbesondere regelmäßigen Zeitabständen eine derartige Bestimmung durchzuführen. Dies ist insbesondere von der Art der Probe abhängig. Wenn beispielsweise bekannt ist, dass eine Probe sich insbesondere in einem bestimmten zeitlichen Bereich verändert, erfolgt
vorzugsweise in diesem Bereich eine häufigere Bestimmung der
Probenelemente.
Ebenso ist es möglich, die Probenelemente auf Grundlage einer vorangegangenen, insbesondere der unmittelbar vorrangegangenen Abklingphase zu bestimmen. Innerhalb einer Abklϊngphase erfolgt somit eine Beobachtung zu einer bestimmten Verzögerungszeit und ferner eine Aufnahme der übrigen auftretenden Fluoreszenz zur Bestimmung der Probenelemente, d.h. der Lage άer Probenelemente in der Probe. Die von der Probe abgegebene Fluoreszenz wird somit vollständig ausgenutzt, Vorzugsweise wird während der Beobachtungsdauer die gesamte von der Probe abgegebene Fluoreszenz ausschließlich zur Lebenszeϊtbestlmmung oder zur Durchführung anderer Untersuchungen genutzt und die Bestimmung der Probenelemente ausschließlich auf Grundlage der nicht während der Beobachtungsdauer abgegebenen Strahlung bestimmt,
Zur Bestimmung der zusammengehörenden Probenelemente ist vorzugsweise ein gesonderter Detektor vorgesehen. Ggf. wird mit Hilfe eines Auskoppelelements wie eines wellenlängenselektiven Spiegels ein Teil άer von der Probe abgegebenen Fluoreszenz aus dem Strahlengang ausgekoppelt und auf den gesonderten Detektor abgelenkt« Dies erfolgt vorzugsweise nur dann, wenn der Hauptdetektor nicht aktiv ist, d.h. nur außerhalb der Beobachtungsdauer.
Die Verschmierungen und Ungenauigkeiten des o.g, Binnings können auf diese Weise deutlich reduziert werden, Werden die Lebenszeiten durch ein Anpassen von Parametern eines numerischen Modells für den zeitlichen Intensϊtätsverlauf (Fit) berechnet, wird gleichzeitig der numerische Aufwand der pixelweisen Auswertung verringert.
Wird für jede Verzögerungszeit ein eigenes Referenzbild erzeugt und können die Strukturen in den Bildsequenzen einander zugeordnet werden, ist es möglich auch den Einfluss von Bewegungen in der Probe zu minimieren.
Unter Beobachtungsdauer wird insbesondere ein Zeϊtfenster verstanden, in dem der Bildverstärker sensitiv ist, d.h. in dem eine Verschlusseinrichtung, die dem Detektor vorgeschaltet ist, geöffnet ist, Z.B. ist die Verschlusseinrichtung bei einem Detektionszeitraum von 1 sec. 80 x 106 mal geöffnet, wobei die Öffnung einmal je Anregungspuls erfolgt.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist insbesondere der vorstehend beschriebene ICCD-Detektor geeignet, wobei die mit dem Detektor verbundene Elektronik bzw. die Steuereinrichtung entsprechend angepasst werden kann.
Unter Verzögerungszeit wird die Zeit zwischen dem Änregungspuls und der Beobachtungsdauer verstanden.
Der Detektionszeitraum ist derjenige Zeitraum, in dem der Detektor, vorzugsweise eine CCD-Kamera, für eine feste Verzögerungszeϊt geöffnet Ist.
Die Beobachtungshäufigkeit ist die Anzahl der Beobachtungsdauern pro Detektionszeitraum.
Des Weiteren ist es möglich, in den vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens zusätzlich weitere Parameter zu variieren. Möglich wäre es beispielsweise, die' Probe bei unterschiedlichen Verzögerungszeiten mit Anregungspulsen unterschiedlicher Intensität anzuregen, Soll beispielsweise die Beobachtung bei relativ langen Verzögerungszeiten erfolgen, bei denen die Fluoreszenz schon relativ stark abgeklungen ist, kann es zweckmäßig sein, die Intensität des Anregungspulses zu erhöhen. Ferner ist es möglich, die Verstärkungsspannung der ICCD, also den Skalierungsfaktor zwischen counts der CCD-Kamera und detektierten Faktoren, zu variieren.
Ferner wäre es möglich, die Spannung über die Vielkanalplatte bei der
Elektronenerzeugung während des Detektionszeitraums anzupassen, um die
Zahl der Elektroden, und damit die Helligkeit, zu variieren,
Bevorzugte Weiterbildungen der vorstehend beschriebenen Verfahren sind in den Unteransprüchen enthalten,
Die vorstehenden Verfahren können durch ein konfokales Mikroskop durchgeführt werden, welches nach dem Prinzip der Nipkow-Scheibe funktioniert und mit einer zeitauflösenden Detektionseinrichtung ausgestattet ist. Die Beleuchtung erfolgt in diesem Fall mit einem modengekoppelten frequenzverdoppelten Nd:YAG Laser, der eine Repetltionsrate von etwa 80MHz hat, Die Detektionseinrichtung, eine gegatete ICCD ist dabei in der Lage, Signale in definierten Zeitfenstern, d.h. Beobachtungsdauern im Bereich von 100 ps bis 100 ns aufzuzeichnen und im Unterschied zu bekannten Einrichtungen auch die Fensterbreite bzw. Länge der Beobachtungsdauer für unterschiedliche Verzogerungszeiten hinreichend schnell und automatisiert ■ umzuschalten. Während jeder Belichtung wird die Empfindlichkeit des Bildverstärkers mit einem voreingestellten, festen Zeitversatz zum anregenden Laserpuls synchron ein- bzw. ausgeschaltet. Das Ein- bzw. Ausschalten der Empfindlichkeit des Bildverstärkers stellt eine technische Realisierung einer Verschlusseinrichtung, die dem Detektor vorgeschaltet ist, dar.
Für die Aufnahme von Referenzbildern können z.B. die Proben mit einem Referenzfarbstoff markiert werden. Dieser kann gleichzeitig mit der Lebenszeitmessung durch einen Laser anderer Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt werden, das Referenzsignal wird über dichroitische Spiegel auf eine zweite Kamera abgebildet. Ggf. können so zu jeder Verzögerungszeit getrennte Referenzbilder erzeugt werden.
Das Zuordnen der Pixel zu Bildstrukturen erfolgt durch eine geeignete Bϊldanalysesoftware.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform näher erläutert Es zeigen:
Fig, 1 eine Zeϊtskala einer einzelnen Kamerabelichtung,
Fig. 2 die Variation der Beobachtungsdauer in Abhängigkeit der Verzögerungszeϊt, wobei in dem linken Teil von Fig, 2 das gegenwärtig bekannte Verfahren und in dem rechten Teil von Fig. 2 das erfindungsgemäße Verfahren dargestellt ist,
Fig. 3 eine schematische Ansicht bzw. eine Prϊnzipskizze einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
Fig. 4 eine prinzipielle skizzenhafte Abbildung einer Zelle auf einem Detektor.
Aus Flg. 1 Ist ersichtlich, dass eine Vielzahl von Änregungspulsen Fluoreszenz in der Probe hervorruft, wobei die Fluoreszenz innerhalb der Fluoreszenz- Lebenszeit, d.h. in Abklϊngphasen, abklingen. Innerhalb dieser Abklingphasen erfolgt im dargestellten Beispiel bei einer Belichtungszeit bzw. in einem Detektionszeitraum zu konstanten Verzögerungszeiten, ein Beobachten der Proben, d.h. ein Aktivieren der dem Detektor vorgeschatteten Verschlusseinrichtung. Hierbei Ist die Beobachtungsdauer, d.h. die Fensterbreϊte zwischen den einzelnen Verzogerungszeiten, konstant.
Bei dem in Fig. 1 dargestellten bekannten Verfahren wird somit innerhalb eines Detektionszeitraums 10 die Probe durch eine Vielzahl von Anregungspulsen 12 angeregt, wobei die Anregung beispielsweise durch Laserlicht geeigneter Wellenlänge erfolgt und jeder Anregungspuls eine Länge von beispielsweise 0,1 ns aufweist. Die Anregungspulse 12 werden beispielsweise in einem Abstand von 12 ns wiederholt, so dass eine Wiederholzeit 14 bzw. Frequenz vorzugsweise über den gesamten Detektionszeitraum 10 konstant ist.
Jede Anregung der Probe durch einen Änregungspuls 12 regt beispielsweise die in der Probe vorhandenen Farbmarker zur Fluoreszenz an. Die Fluoreszenz klingt innerhalb einer Abklingphase 16 im Wesentlichen exponentiell wieder ab, Nach dem Abklingen der Fluoreszenz erfolgt ein erneutes Anregen durch den nachfolgenden Anregungspuls 12. Innerhalb der Abklingphase 16 erfolgt das Abklingen der Fluoreszenz im dargestellten Ausführungsbeispiel entlang der gestrichelt dargestellten Kurve 18,
Zur Untersuchung der Probe erfolgt zu festen Verzögerungszelten 20, beispϊeisweise 1,3; 1,4; 1,5 oder 1,6 ns, jeweils ein Beobachten der Probe für eine feste Beobachtungsdauer 22. Die Beobachtungsdauer 22 ist Im dargestellten Ausführungsbeispiel über den gesamten Detektionszeitraum 10 konstant und beträgt, wie durch die Pfeile 24 dargestellt, beispielsweise 0,5 ns.
Innerhalb eines relativ langen Detektionszeitraums 10 von beispielsweise 109 ns wird die Probe somit mehrfach durch Anregungspulse 12 angeregt. Innerhalb eines Detektionszeitraums erfolgt dann ein Beobachten der Probe stets zu derselben Verzögerungszeit 20 für dieselbe Beobachtungsdauer 22. In einem zweiten Detektionszeitraum erfolgt sodann ein Beobachten der Probe zu einer späteren Verzogerungszelt. In dem zweiten Detektionszeitraum wird die Probe wiederum mehrfach durch Anregungspulse 12 angeregt, wobei die Beobachtungsdauer zwar zu einer anderen Verzögerungszeit stattfindet, jedoch wieder gleich lang ist. Dies ist beispielsweise aus Fig. 2, linke Seite, ersichtlich. Zur Verdeutlichung ist hierbei jeweils nur ein Anregungspuls 12 dargestellt, wobei selbstverständlich je Detektionszeitraum eine Vielzahl von Anregungspulsen auf die Probe abgegeben werden, wie vorstehend beschrieben.
Auf der rechten Seite der Fig. 2 Ist ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Hieraus ist ersichtlich, dass die Länge der Beobachtungsdauer 22 je nach Detektionszeitraum variiert wird, So
nimmt die Länge der Beobachtungsdauer 22 mit jedem Detektionszeitraum zu, wobei gleichzeitig die Verzogerungszelt 20 (Fig, 1) erhöht wird,
Das weitere wesentliche Merkmal der Erfindung, die Variierung der Häufigkeit der Beobachtungsdauer 22 je Detektionszeitraum ist in Fig. 2 nicht explizit dargestellt.
Bei der in Fig, 3 dargestellten schematischen Ansicht einer Vorrichtung wird die von einem Laser 30 erzeugte Laserstrahlung über eine Glasfaser 32 in das Mikroskop 34 eϊngekoppelt und beleuchtet die Pinholes einer rotierenden Nipkow-Scheibe 36. Die Laserstrahlung wird durch eine Tubuslinse 38 und ein Objektiv 40 in die (nicht dargestellte) Probe abgebildet. Das Fluoreszenzlicht aus der Probe wird wieder durch die Nipkow-Scheibe 36 (konfokal) begrenzt, Ein dichroitϊscher Spiegel 42 lenkt das Fluoreszenzlicht auf den Bildverstärker 44, Im Bildverstärker 44 wird Licht, das während der eingestellten Fensterbreϊte bzw. Beobachtungsdauer mit der eingestellten Verzögerungszeit gegen den Laser 30 (bzw. den Trϊgger-)Puls eintrifft, auf die CCD-Kamera 46 abgebildet; Licht, das außerhalb dieser Zeitfenster eintrifft, wird abgeblockt.
Zur Steuerung, Insbesondere zur Parameterauswahl u.dgl., ist die CCD-Kamera 46 mit einem Computer oder Mikroprozessor 48 verbunden. Ferner ist eine Steuerelektronik 50 vorgesehen, die mit dem Bildverstärker 44 sowie mit dem Computer 48 verbunden ist. Die Steuerelektronϊk dient zur Steuerung und Kontrolle des Triggersignals, zur Weitergabe und Steuerung der Verzögerungszeit und der Verzögerungsspannung sowie zur Steuerung der Beobachtungsdauer.
Das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren weist vorzugsweise den Schritt auf, ein Probenelement 52 (Fig. 4), wie beispielsweise eine Zelle, mit Hilfe von Bildanalyseverfahren zu bestimmen. Über die Optik des Mikroskops wird das Probeneiement 52 auf einen Detektor 54, insbesondere eine CCD- Kamera, abgebildet. Vorzugsweise erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sodann nur ein Auswerten bestimmter Pixel 56 der CCD-Kamera,
Hierbei handelt es sich um Pixel 56, die mit dem Probenelement 52, z.B, einer
Zelle korrespondieren, Hierbei kann es sich um Pixel handeln, die beispielsweise vollständig innerhalb einer äußeren Grenze 58 des Probenelements liegen.
Ebenso kann es sich um Pixel handeln, die innerhalb einer Zellmembran 60 liegen. Ebenso könnten die Pixel der Untersuchung zu Grunde gelegt werden, in denen beispielsweise zumindest ein Teil des Zellkerns 62 abgebildet wird.
Bei einem Vergleichsbeispiel zwischen einem herkömmlichen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde festgestellt, dass bei Verwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens die Standardabweichung sowie auch die Auswertezeit erheblich geringer ist. Femer wurde festgestellt, dass insbesondere bei mit Rauschen beaufschlagten Daten oft zu große Werte für die Lebenszeit festgestellt werden. Bei pixelweiser Auswertung ist die gemittelte Lebenszeit somit deutlich größer und schwankt gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren deutlich stärker. Ferner wird bei der pixelweisen Auswertung die Lebenszeit systematisch überschätzt. Das systematische Überschätzen der gemessenen Lebenszeiten wird durch den asymmetrischen Einfluss des Rauschens auf die Ergebnisse der (nicht-linearen) Fitprozedur hervorgerufen. So führt beispielsweise eine kleine Erhöhung des Intensitätswertes bei der größten Verzogerungszelt zu einer deutlich vergrößerten Lebenszeit. Eine ebenso geringfügige Reduktion dieses Intensitätswertes führt jedoch nur zu einer moderaten Verringerung der bestimmten Lebenszeit. Berechnet man anschließend den Mittelwert der Lebenszeiten aus diesen beiden Fitresultaten, ist auch dieser zu größeren Werten hin verfälscht.
Die vorstehenden Ergebnisse konnten beispielsweise durch folgende Untersuchungen herbeigeführt werden:
Zum Vergleich wurde die mikroskopische Fluoreszenzlebenszeit-Messung zu einer zellulären Probe sowohl pixelweise als auch bezogen auf die Zellen ausgewertet, Für die auf beiden Wegen bestimmten Lebenszeiten der einzelnen Zellen wurden Mittelwerte und Variation über alle betrachteten Zellen berechnet:
Pixelweise Auswertung Zeilweϊse
Auswertung Mittlere Lebenszeit aller Zellen 2646ps 2294ρs
Standardabweichung aller Zellen 362ps 232ps
Auswertezeit 11.2sec 0,5sec
In der objektbezogenen Auswertung sind die Rauscheinflüsse deutlich geringer als für die pixelweise Auswertung, Daher ergeben sich für die pixelweise Auswertung eine deutlich überschätzte mittlere Lebenszeit und deutlich stärkere Schwankungen zwischen den Zellen. Zusätzlich ist auch der Rechenaufwand für die Auswertung wesentlich höher als bei der zellorientierten Auswertung.