DE4427438C2

DE4427438C2 - Verfahren zur Charakterisierung des Photosynthesesystems von Pflanzen zum Nachweis der Wirkung von Herbiziden und/oder zum Nachweis von Wassermangel

Info

Publication number: DE4427438C2
Application number: DE19944427438
Authority: DE
Inventors: Bernhard Dr Ruth
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1994-08-03
Filing date: 1994-08-03
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2014-08-04
Also published as: DE4427438A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung des Photosynthesesystems von Pflanzen zum Nachweis der Wirkung von Herbiziden und/oder zum Nachweis von Wassermangel.

Solche Fluoreszenzverfahren dienen dazu, die Effektivität des Photosynthese-Systems nicht-destruktiv zu quantifizieren. Im wesentlichen sind drei verschiedene Verfahren bekannt.

1. Gepulstes Anregungslicht und Erfassen der mittleren Fluo reszenz-Intensität während der Anregung. Diese prompte Fluoreszenz wird von der Antenne der strahlungsaufnehmenden Pflanze bestimmt, wobei auch andere Komponenten des PS einen wesentlichen Einfluß ausüben. Allerdings lassen sich die einzelnen Quellen dieser Einflußnahme nicht separieren, weil die mittlere Intensität der prompten Fluoreszenz z. B. nicht nur von den Elektronen-Akzeptoren, sondern auch von anderen Komponenten beeinflußbar ist. (Bolhar-Nordenkamp, H.R., Long, S.P., Baker, N. R., Öquist, G., Schreiber, U., and Lechner, E.G. (1989): Chlorophyll Fluorescence as a probe of the photosynthetic competence of leaves in the field: a review of current instrumentation. Functional Eco logy 3 : 497-514).
2. Gepulstes Anregungslicht und Erfassen der Fluoreszenz-In tensität nach Ende der Anregung, der verzögerten Fluores zenz.
Es wird sowohl die mittlere Intensität wie auch die Zeitab hängigkeit der verzögerten Fluoreszenz erfaßt. Wie bei der prompten Fluoreszenz erlaubt das Registrieren der mittleren Intensität der verzögerten Fluoreszenz keine spezifischen Rückschlüsse auf bestimmte Komponenten des Photosynthese- Systems. Der gemessene Zeitbereich für die verzögerte Fluo reszenz beschränkt sich auf einige 10 ns, weil für längere Zeiten die Intensität zu gering wird, als daß sie noch er faßt werden könnte. Die Schwierigkeit besteht darin, eine Detektoranordnung zu finden, die einerseits durch die prompte Fluoreszenz nicht gestört wird, andererseits aber für die Fluoreszenz-Intensität im Bereich von einigen 10 ns bis etwa 1 ms noch eine genügende Empfindlichkeit aufweist. Erst im ms-Bereich ist es wieder möglich die verzögerte Fluoreszenz zeitabhängig zu messen, weil hier mechanische Chopper eingesetzt werden können, die den Detektor von dem starken Anregungslicht und dem prompten Fluoreszenzlicht abschirmen. Messungen der verzögerten Fluoreszenz können aufgrund der geringen Intensität nur bei vollständiger Dun kelheit des Meßobjekts durchgeführt werden. (Gerhardt, V., and Krause, H. (1984): Delayed fluorescence of algae. Jour nal of Luminescence 31 & 32, 895-898).
3. Kontinuierliches Anregungslicht mit Erfassen der Zeitab hängigkeit des Fluoreszenzlichts (Kautsky-Effekt). Voraus setzung des Kautsky-Effekts ist eine Adaptation des ge samten Photosynthese-Systems an die Dunkelheit, die im All gemeinen 10-20 min beansprucht. Erst dann können der An fangswert F_o direkt nach Beginn der Anregung, der Peak-Wert F_p im Bereich von etwa 1 s und der Steady-State-Wert F_s, der nach etwa 5 min approximiert wird, bestimmt werden. Bei wesentlich kürzeren Verdunklungszeiten tritt kein Peak-Wert F_p auf, den man von F_s unterscheiden könnte. Damit dauert eine Einzelmessung zwischen 15 und 25 min. Der Verlauf der Kautsky-Kurve wird im Bereich zwischen ms und min regi striert, und ist damit wesentlich durch biochemische Vor gänge (Membran-Potentiale, Sauerstoff-Freisetzung, CO₂-Ver brauch) bestimmt. (Krause, G.H., and Weis, E. (1991): chlo rophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annu.Rev.Plant Mol. Biol. 42 : 313-349).

Aus der WO 93/12415 ist ein Verfahren bekannt, bei welchem Al gen in einer Küvette periodisch mit Rechteckimpulsen bestrahlt werden. Die Fluoreszenz wird erfaßt und daraus die Algenakti vität bestimmt. Es ist bei diesem Verfahren nicht möglich, sehr kurze Anstiegszeiten der Fluoreszenz zu ermitteln und diese zu interpretieren.

Aus Meas. Sci. Technol. 1 (1990) S. 517-521 ist ein ähnli ches Verfahren bekannt, bei dem die Verdunkelungszeit jedoch einige Minuten beträgt. Exponentialfunktionen werden nicht an die Fluoreszenzkurven angepaßt.

Aus Journal of Experimental Botany 40 (1989) S. 239-245 sind Fluoreszenzmessungen bekannt, bei welchen die kleinste ermit telte Zeitkonstante 0,32 sec beträgt.

Aus Current Research in Photosynthesis 1 (1990) S. 467-470 ist ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung bekannt, bei dem die Dunkelphase im Minutenbereich liegt. Eine Anpassung der Meßwerte an eine Kurve ist nicht vorgesehen.

Aus einer Veröffentlichung des Instituts für Wasserforschung GmbH Dortmund und der Hydrologischen Abteilung der Dortmunder Stadtwerke AG, Nr. 37 (1989) S. 96-177 ist zwar bekannt, den Was sermangel aus Fluoreszenzmessungen zu ermitteln, eine Anpas sung der Meßkurven an Exponentialfunktionen erfolgt jedoch nicht.

Des weiteren ist aus Meas. Sci. Technol. 3 (1992) S. 196-199 zwar die Verwendung einzelner Anregungsimpulse bekannt, eine Kurvenanpassung an die Fluoreszenzmeßwerte erfolgt ebenfalls nicht.

Keines der letztgenannten Verfahren ermöglicht Aussagen über Herbizideffekte und mit einer Ausnahme auch keine Aussagen über Wassermangel.

Keines der Verfahren ist damit in der Lage, spezifisch Aus sagen über die Elektronen-Akzeptoren liefern zu können. Ab gesehen von Punkt 1, ist auch keine Messung aus einer Distanz möglich.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzugeben mit welchem spezifische Aussagen über die Wirkung von Herbiziden und/oder ein Nachweis von Wassermangel möglich sind. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens.

Das Verfahren wurde an verschiedenen Pflanzen eingesetzt:

Algen,
Gräser,
Mais,
Fichten,
Laubbäume.

Dabei wurde die Wirkung der Herbizide Terbuthylazin, Atrazin und DCMU auf die Pflanzen untersucht.

Insbesondere ist es möglich, in den Pflanzen die Wanderung der Herbizide zu beobachten.

Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß es möglich ist, den Übergang der Elektronen nach der Ladungs trennung in die Elektronen-Transportkette zu beobachten. Die Wirkung von Herbiziden am Hauptangriffspunkt ist damit direkt meßbar.

Das Verfahren hat gegenüber den bekannten Verfahren folgende Vorteile:

1. Spezifische Beobachtung des Elektronenübergänge zwischen Antenne und PQ-Pool

Durch die zeitaufgelöste Messung im Bereich zwischen mehre ren µs und einigen ms während des Anregungsimpulses werden die Vorgänge beim Übergang der Elektronen nach der Ladungs- Separation von dem Reaktions-Zentrum zum primären und se kundären Elektronen-Akzeptor direkt beobachtbar. Vorgänge in der Antenne laufen schneller ab und sind schon im Gleichgewicht, Vorgänge im Zusammenhang mit dem Membran-Po tential, sowie biochemische Vorgänge laufen langsamer ab und haben somit keinen Einfluß auf die Fluoreszenz in die sem Zeitbereich.

Durch die Beobachtung der Zeitabhängigkeit während der An regung wird der Einfluß des Streulichts auf das Fluores zenzsignal eliminiert, weil diese Größe konstant ist. Die Beobachtung von F_o erlaubt aufgrund der Beziehung F_o α I_a eine Normierung auf die Intensität I_a des Anregungs lichts.

Die Beobachtung des Anstiegs, der durch die erste Exponen tialfunktion beschrieben wird (F_a1 und T_a1), erlaubt eine Quantifizierung der Effektivität des sekundären Elektronen- Akzeptors Q_b.

Die zweite Exponentialfunktion (F_a2 und T_a2) charakteri siert den Elektronenfluß zum PQ-Pool.

Die selektive Beobachtung des Vorgangs bei dem sekundären Elektronen-Akzeptor Q_b wird verbessert (F_a1 und T_a1), indem auch die zweite Exponential-Funktion (F_b2 und T_a2) mitbe stimmt wird. Der störende Einfluß von F_b2 und T_a2 auf die Bestimmung der Größen F_a1 und T_a2 aus dem Beginn des Fluo reszenzverlaufs in den ersten 5 ms kann kompensiert werden.

Wirkung von Herbiziden

Die Wirkung von Herbiziden wird dadurch angezeigt, daß die Amplitude der ersten Exponentialfunktion F_a1 deutlich an steigt. Als Vergleich kann die Grundfluoreszenz F_o herange zogen werden. Der Effekt wird dadurch erklärt, daß bei die sem Typ von Herbiziden der Elektronenakzeptor Q_b blockiert wird.

Damit wird nicht allein die Existenz des Herbizids in einer Pflanze nachgewiesen, sondern direkt die Wirkung des Herbi zids am Hauptangriffspunkt.

Wirkung von Wassermangel

Wassermangel bewirkt, daß die Fluoreszenzintensität nach dem Erreichen der Grundfluoreszenz F_o praktisch nicht mehr ansteigt. Entsprechend der obigen Beschreibung bedeutet das ein drastisches Absinken von F_a1.

2. Zeitaufwand

Im Gegensatz zum Kautsky-Effekt, bei dem zwischen 10 und 20 min verdunkelt werden muß und bei dem die Messung minde stens 5 min dauert bis der steady-state-Wert F_s angenähert ist, reicht es mit der Puls-Methode aus, das System z. B. nur 0.5 s zu verdunkeln. Zusammen mit einer Meßzeit von we nigen ms und einer Auswertezeit von einigen Sekunden (Rech ner-abhängig) ergibt sich damit ein beträchtlicher Zeitge winn.

Die kürzere Dunkelphase reicht deshalb aus, weil die Zeit konstanten der betrachteten Prozesse im ms-Bereich liegen und daher die Zeit von einigen 100 ms ausreicht, die Zu stände, die während der Belichtung angeregt sind, energe tisch zu deaktivieren.

3. Variation der Intensität des Anregungslichts

Durch die Variation der Intensität des Anregungslichtes wird zusätzliche Information über das Photosynthese-System gewonnen. F_o, F_a1 und F_a2 verändern sich in unterschiedli cher Weise, wenn die Intensität des Anregungslichts vari iert wird. Diese Abhängigkeit gibt Auskunft über die Kopp lung zwischen den PS-Komponenten Antenne, Elektronen-Akzep tor Q_b und PQ-Pool.

Zudem wird ein zusätzlicher Einfluß des Herbizids erkenn bar.

4. Analyse des Signals

Der Anstieg der Fluoreszenz nach Beginn der Anregung kann durch zwei Exponential-Funktionen beschrieben werden. Ein Fit der gemessenen Kurve mit Exponential-Funktionen erlaubt damit die Extraktion von Parametern, die direkt das Über gangsverhalten der Elektronen in die Elektronen-Transport kette beschreiben.

Mit F_o, F_a1, T_a1, F_a2 und T_a2 wird eine Kurve mit 5 Parame tern angefittet. Um das Verfahren zu vereinfachen und um bei der Fit-Prozedur nicht in bedeutungslose Nebenminima zu kommen, werden folgende Gegebenheiten ausgenutzt

- die Zeit-Konstanten T_a1 und T_a2 variieren wenig,
- F_o ist durch den Kurvenanfang bestimmt,
- F_a1 muß die Kurve in den ersten 4 ms beschreiben und
- F_a2 muß die Kurve in den letzten 10 ms beschreiben.

5. Anforderungen an die Dunkelphase

Voraussetzung für die zeitliche Variation der Fluoreszenz- Intensität während des Anregungsimpulses konstanter Energie ist die Adaptation des Photosynthese-Systems an eine vor hervorhandene Lichtintensität. Im einfachsten Fall ist das eine Adaptation an die Dunkelheit, wie es Voraussetzung beim Kautsky-Effekt ist.

Wenn das Photosynthese-System nicht an Dunkelheit adaptiert ist, sondern an eine im Vergleich zum vollen Tageslicht niedrige Lichtintensität, dann tritt bei Einstrahlen von Licht höherer Intensität nicht nur ein einfaches Ansteigen der Fluoreszenz ein, sondern nach Erreichen der Grundfluo reszenz ebenfalls ein Anstieg, der mit Exponential-Funktio nen beschrieben wird. Für einen deutlichen Effekt ist es aber notwendig, daß die zusätzlich eingestrahlte Lichtin tensität deutlich höher ist als die Intensität, an die das Photosynthese-System adaptiert ist.

In der Dunkelphase, die vor bzw. zwischen den Messungen liegt, muß nicht notwendigerweise vollständige Dunkelheit herrschen. Vielmehr genügt es, daß eine deutlich niedrigere Intensität vorhanden ist als während der Anregungsphase.

Der Vorteil besteht darin, daß damit auch Messungen im Freiland aus einer Distanz von etwa 0,5 m möglich sind. Es würde also genügen, wenn die Pflanzen vor der Messung wäh rend der "Dunkelphase", nur abgeschattet sind.

6. Höhere Intensität des Fluoreszenzlichts

Im Vergleich zu Beobachtungen nach Ende der Anregung (zeit aufgelöste verzögerte Fluoreszenz) ist die Fluoreszenzin tensität während des Anregungsimpulses wesentlich höher. Die Separation vom Anregungslicht wird durch unterschiedli che Wellenlängen ermöglicht (Anregungslicht z. B. 632,8 nm, Fluoreszenzlicht 685 nm). Die höhere Intensität des Fluo reszenzlichts erlaubt eine genauere zeitliche Analyse des Signals und einen größeren Meßabstand.

7. Messung im Abstand

Es ist auch möglich, ganz auf eine Vorverdunklung zu ver zichten. Eine Zeitabhängigkeit der Fluoreszenz im µs- und ms-Bereich tritt auch dann auf, wenn bei belichtetem Photo synthese-System ein oder mehrere Pulse appliziert werden. Das entstehende Fluoreszenz-Signal kann in gleicher Weise analysiert werden und es können auch die Parameter F_o, F_a1, T_a1 usw. bestimmt werden, die ebenfalls Aussagen über die Elektronen-Akzeptoren liefern.

Allerdings ist es notwendig, daß die Intensität des Anre gungslichts um ein mehrfaches höher ist als die Lichtinten sität, an die das Photosynthese-System adaptiert ist.

Umwandlung der Energie des absorbierten Lichts in biochemisch verwendbare Energie (z. B. ATP) und Emission durch Fluores zenzlicht sind konkurrierende Prozesse im Photosynthese-Sy stem. Ein schnelles und starkes Ansteigen der Fluoreszenz-In tensität während der Anregung zeigt damit eine Störung der Um wandlung des absorbierten Lichts in biochemisch verwendbare Energie an.

Der zeitliche Fluoreszenzverlauf F(t) im Bereich von wenigen µs bis zu einigen ms wird während der Anregung durch einen Lichtimpuls mit bekanntem Intensitätsverlauf registriert. Der Verlauf kann durch zwei Exponential-Funktionen beschrieben werden und ein Fit der gemessenen Kurve bestimmt Parameter (Zeitkonstanten, Amplituden), die die Effektivität der Elek tronen-Akzeptoren am Anfang der Elektronen-Transportkette cha rakterisieren.

Die beiden Exponential-Funktionen haben Zeitkonstanten von T_a1 = 2 ms bzw. T_a2 = 20 ms. Diese Zeitkonstanten sind nur gering fügig von der Konzentration der eingesetzten Herbizide abhän gig. Die zugehörige Amplitude F_a1 steigt mit der Herbizid-Kon zentration drastisch an, bis ein Sättigungsbereich erreicht wird, während F_a2 mit zunehmender Konzentration abnimmt und praktisch 0 erreicht.

Die beiden Amplituden F_a1 und F_a2, sowie die Grundfluoreszenz F_o hängen von der Intensität I_a des Anregungslichts ab: Es ist bekannt, daß die Grundfluoreszenz F_o linear von I_a abhängt (F_o α I_a). Die Abhängigkeiten F_a1 α I_a ^e1 und F_a2 α I_a ^e2 haben Ex ponenten mit den Größen e1 ≈ 2 und e2 ≈ 1. Der genaue Wert dieser Exponenten hängt von der Pflanzenart und dem Zustand der Pflanze ab.

Diese Exponenten e1 und e2, die durch die Variation der An regungs-Intensität I_a gewonnen werden, zeigen an, wieviele Elektronen der Elektronen-Transportkette in einer Komponente akkumuliert werden müssen, bevor die Elektronen weitergegeben werden können.

e1 = 2 heißt damit, daß im Mittel zwei Elektronen gebraucht werden, um den Elektronen-Transport fortsetzen zu können. Dies ist für den Elektronen-Akzeptor Q_b der Fall. Mit der zweiten Exponential-Funktion (T_a2, F_a2, e2) wird vermutlich der PQ- Pool beschrieben.

Die Zugabe von Herbizid führt bei der Abhängigkeit von der Einstrahlungsintensität I_a zu folgendem: F_o α I_a bleibt er halten, während e1 zunimmt. e2 dagegen nimmt deutlich ab.

Neben der Quantifizierung der Abhängigkeit zwischen den PS- Komponenten besteht damit eine zusätzliche Möglichkeit, den Einfluß von Herbiziden auf weitere Komponenten des PS-Systems zu quantifizieren.

Die Erfindung wird im folgenden mit Hilfe der Figuren näher erläutert.

Dabei zeigt die Fig. 1a den prinzipiellen Aufbau einer Meßan ordnung zur Durchführung des Verfahrens und schematische An wendungsbeispiele, Fig. 1b und 1c zeigen schematisch zwei mög liche Vorrichtungen zur Fluoreszenzmessung.

Die Fig. 2 bis 8 zeigen verschiedene Fluoreszenzverläufe.

Der Prinzip-Aufbau ist Fig. 1a zu entnehmen. Eine schaltbare Lichtquelle erzeugt das Licht zur Anregung der Fluoreszenz entsprechend der Steuerimpulse der Elektronik. Ein Zusatzde tektor registriert den zeitlichen Verlauf des erzeugten Anre gungslichts und gibt das Signal an die Elektronik weiter, wo es als I(t) gespeichert wird.

Das optische Übertragungssystem dient zur Übertragung des An regungslichts zum Objekt wie auch zur Sammlung des Fluo reszenzlichts für die Detektion. Der Detektor mißt das Fluo reszenzlicht kurz vor, während und kurz nach den Impulsen zur Anregung der Fluoreszenz. Das gemessene Signal wird ebenfalls an die Elektronik -zum Speichern übergeben. Es gibt die Mög lichkeit, die Empfindlichkeit des Detektors durch Signale der Elektronik zu steuern.

In der Elektronik werden die Signale I(t) und das Detektor-Si gnal analysiert und es werden Parameter erzeugt, die den Zu stand der Elektronen-Akzeptoren des Photosynthese-Systems cha rakterisieren.

1. Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung

In Fig. 1b ist das erste Beispiel einer Meßvorrichtung dargestellt. Das Licht eines CW-Lasers (He-Ne-Laser, 632.8 nm) wird über einen akusto-optischen Modulator ein- und ausgeschaltet. Die Steuerung des akusto-optischen Modulators wird durch die Elektronik durchgeführt, die den Zeitpunkt und die Dauer für das Einschalten bestimmt. Spiegel 1 koppelt einen geringen Teil des Anregungslichts aus und Detektor D_I nimmt die Zeitabhängigkeit des Anregungslichts auf und gibt sie als I(t) an die Elektronik weiter. Das folgende Faserbündel leitet das Anregungslicht zum Objekt. Ein zweites Faserbün del leitet das Fluoreszenzlicht vom Objekt zur Detektor- Einheit. Der Filter absorbiert das gestreute Anregungslicht und läßt das Fluoreszenzlicht bei 685 nm passieren. Als De tektor dient der Photomultiplier, dessen Signal von der Elektronik registriert wird. Die Elektronik registriert das Photomultiplier-Signal und I(t) 500 µs, bevor ein Steuerim puls den akusto-optischen Modulator für ein bestimmtes Zei tintervall (z. B. 4 ms) einschaltet. Während des Anregungs impulses wird F(t) mit einer maximalen Abtastrate von 10 µs registriert. Diese Abtastrate kann nach 1 oder 2 ms redu ziert werden, um den Umfang der Daten so gering wie möglich zu halten. Nach Ende der Anregung wird das Registrieren von I(t) und dem Photomultiplier-Signal noch für weiteres Zeit intervall fortgesetzt. Das Photomultipliersignal vor und nach dem Anregungsimpuls dient als Kontrolle.

In einem ersten Verarbeitungsschritt in der Elektronik wird die Differenz zwischen dem Mittelwert der Kontrolle und dem Detektor-Signal gebildet, so daß damit das Fluoreszenz- Signal F(t) errechnet wird. Dieses beständige Mit-Erfassen der Kontrolle erlaubt es, auch geringe Fluoreszenz-Intensi täten zu erfassen. Es ist damit möglich, die Detek tionsschwelle zu senken und z. B. den Zustand von Algen ge ringer Dichte zu erfassen (10 Zellen/mm³).

Im idealen Fall erfolgt die Anregung durch einen Rechteck impuls. Dieser ideale Fall wird beim akusto-optischen Modu lator mit geeigneten Zusatzvorkehrungen angenähert.

Das Signal F(t) hat eine Form, wie sie in Fig. 2 am Bei spiel eines Grashalms dargestellt ist.

F(t) läßt sich durch den Ausdruck

F(t) = F_o + F_a1 _*(1 - exp(-t/T_a1)) + F_a2 _*(1-exp(-t/T_a2)) + . . . (Gleichung 1)

beschreiben. Für den Zeitbereich bis 4 ms reichen die er sten beiden Glieder, da die auftretenden Zeitkonstanten Größen von etwa 2 ms und 20 ms haben.

In einem zweiten Verarbeitungsschritt erfolgt dann der Fit der gemessenen Daten mit dem Ansatz in Gleichung (1).

Um die Fit-Prozedur zu beschleunigen, wird kein Standard- Programm benutzt, sondern es wird ausgenutzt, daß die Para meter ganz unterschiedliche Zeitbereiche im Meßintervall beeinflussen. Dazu wird der Fit erst in Teilbereichen aus geführt:
F_o, F_a1 und T_a1 werden im Zeitintervall (0,2 ms) approxi miert,
F_a2 und T_a2 werden im Zeitbereich [2 ms, 4 ms] approximiert, wobei die Ergebnisse vom Zeitbereich [0,2 ms] berücksich tigt werden.

Erst zum Schluß wird der gesamte Zeitbereich für die Fit- Prozedur berücksichtigt. Neben dem Zeitgewinn wird durch dieses Verfahren verhindert, daß ein unsinniges Nebenmini mum für Chi-Quadrat erreicht wird.

Die Fit-Prozedur wird auch deshalb beschleunigt, weil die langsamere Komponente mit einer niedrigeren Abtastrate ge messen wurde, so daß weniger Daten verarbeitet werden müs sen.

Fig. 8 zeigt den Einfluß der Intensitätsvariation auf den Fluoreszenzverlauf. Man erkennt deutlich, daß sich die Am plitude der ersten Exponential-Funktion F_a1 deutlich stär ker ansteigt, als die Grundfluoreszenz F_o. Damit hat die Anregungsintensität einen deutlichen Einfluß auf die Kur venform des Fluoreszenzverlaufs.

Wie in Fig. 2 dargestellt ist, verändert die Zugabe von DCMU (Herbizid-Wirkstoff) das Fluoreszenzverhalten:
F_o und F_a1 werden ganz offensichtlich erhöht und der Fit zeigt zusätzlich, daß T_a1 erniedrigt wird. Damit kann die Größe F_a1/T_a1 gebildet werden, die als quantitatives Maß für die Herbizid-Wirkung angesehen werden kann.

Die Berücksichtigung der zweiten Exponential-Funktion F_a2 _* (1-exp(-t/T_a2)) ist notwendig, weil F_a2 bei Herbizid- Zugabe sinkt und damit den Effekt von F_a1 überdeckt.

In Fig. 3 ist der Effekt der Herbizids Terbuthylazin in verschiedenen Konzentrationen auf Algen dargestellt. Auch hier ist ein Anstieg von F_o und F_a1 und eine Reduktion von T_a1 festzustellen.

Fig. 4 zeigt den Fluoreszenzverlauf F(t) nach einer Verdun kelungszeit von nur 0.5 s. Auch hier können die Parameter F_o, F_a1, T_a1 usw. durch ein Fit-Programm bestimmt werden. Für eine Einzelmessung ist damit der Zeitaufwand sehr ge ring.

Fig. 5 zeigt nun das Fluoreszenz-Signal, wenn eine Folge von Anregungsimpulsen auf die Probe gegeben werden. Der Ab stand dieser Impulse beträgt in diesem Beispiel 200 ms, die Impulsbreite 550 µs. Jeder dieser Impulse kann nun analy siert werden und es können die Werte F_o, F_a1 und T_a1 be stimmt werden. Obwohl die Intensität der Anregungsimpulse konstant blieb, zeigt sich für F_o, F_a1 und T_a1 eine Varia tion von Puls zu Puls. Diese Variation hängt unter anderem von dem Zeitintervall zwischen den Impulsen ab.

Sie kann ausgenutzt werden, um Information über weitere Komponenten des PS zu erhalten wie z. B. das Membranpoten tial.

2. Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung

Fig. 1c zeigt ein weiteres Beispiel einer Meßvorrichtung:
Das optische Übertragungs-System wird nicht durch zwei Fa serbündel realisiert, sondern durch ein abbildendes System zur Erfassung der Fluoreszenz aus größeren Distanzen. Durch einen Spiegel (2) wird der Laserstrahl in die optische Achse des Systems eingekoppelt und regt das Objekt zu einer Fluoreszenz an. Das optische System (Linse) sammelt das Fluoreszenzlicht und fokussiert es auf die Eintrittsöffnung des Detektors (Abbildung des Laserflecks am Objekt auf den Detektor). Es ist damit möglich, Messungen durchzuführen, ohne daß man eine Sonde direkt auf das Objekt aufsetzen muß. Eine Messung mit dieser Methode ist in Fig. 6 darge stellt. Allerdings wird auch hier die Lichtquelle von Fig. 1b.) (CW-Laser und akusto-optischer Modulator) verwendet. Aufgrund der Entfernung ist die Intensität des Fluoreszenz lichts am Detektor niedriger, so daß das Rauschen des De tektors deutlicher wird. Durch die Fit-Prozedur können aber auch aus diesem verrauschten Signal die charakteristischen Parameter (F_o, F_a1, T_a1,. . .) bestimmt werden.

Fig. 7 zeigt noch einmal den Einfluß vom Herbizid DCMU und von Wassermangel auf den Fluoreszenzverlauf. DCMU ver größert F_a1 und Wassermangel verringert F_a1 beträchtlich.

Claims

1. Verfahren zur Charakterisierung des Photosynthesesystems von Pflanzen zum Nachweis der Wirkung von Herbiziden und/oder zum Nachweis von Wassermangel, bei welchem die Pflanzen nach einer Dunkelphase von einer Lichtquelle mit einem rechteckförmigen Lichtimpuls bestrahlt werden, wobei die dadurch induzierte Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird, wobei

a) die Dunkelphase kürzer als eine sec ist,
b) der rechteckförmige Lichtimpuls von einem Laser erzeugt wird, wobei die Impulsdauer zwischen 1 msec und 30 msec liegt,
c) das Meßintervall zum Erfassen der Fluoreszenz bereits in der Dunkelphase beginnt, wobei die Fluoreszenz zeit aufgelöst mit einer maximalen Abtastrate von 10 µsec in der Zeit vor dem Impuls und während der Impulsdauer er faßt wird und
d) der erfaßte Intensitätsverlauf der Fluoreszenz durch zwei Exponentialfunktionen angepaßt wird, wobei die Ex ponentialfunktionen den Kurvenverlauf in den ersten 4 msec mit Zeitkonstanten von etwa 2 msec und 20 msec be schreiben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach 1 oder 2 msec die Ab tastrate reduziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Fluoreszenz nach dem ersten Lichtimpuls mit mindestens einem weiteren rechteckförmigen Lichtimpuls mit geänderter Intensität im Abstand von höchstens einer Sekunde angeregt wird und die Änderung des Fluoreszenzverlaufs ermittelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Fluoreszenz nach dem ersten Lichtimpuls mit mindestens einem weiteren rechteckförmigen Lichtimpuls gleicher Intensität im Abstand von 5 bis 20 msec angeregt wird und wobei die Änderung des Fluoreszenzverlaufs ermittelt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die rechteckförmigen Lichtimpulse durch eine Folge identischer Laserimpulse angenähert werden, welche eine Impulsfolge von mindestens 10 kHz besitzen.