DE2543124A1

DE2543124A1 - Verfahren zur unterscheidung zwischen diskreten teilchen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2543124A1
Application number: DE19752543124
Authority: DE
Inventors: Frank Roger Whitehead
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1974-09-26
Filing date: 1975-09-26
Publication date: 1976-04-08
Also published as: FR2286380A1; US3941479A; CA1043123A; NL7511303A; JPS5163669A; GB1519312A

Description

PATENTANWALT DIPL-ING. LEO FLEUCHAUS 2543124

8 MÖNCHEN 71, den 25. Sept.

Melchlorstraße 42

G. D. Searle & Co.

P.O. Box 5110

Chicago, Illinois 60680,USA

Eig. Z.: SR13P-1323

Verfahren zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen diskreten, zu untersuchenden Teilchen in einem fluiden Medium.

Außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen aus unterschiedlichen Materialien, die sich in einem fluiden Medium befinden, das ein spezifisches Ansprechverhalten für einen physikalischen Reiz hat.

Allgemein bezieht die vorliegende Erfindung sich auf die Anwendung von modulierten Reizen, um die Meßempfindlichkeit für Signale von Teilchen in einer Strömungskammer zu verbessern.

Insbesondere bezieht die vorliegende Erfindung sich auf eine Vorrichtung und ein ι Verfahren für die Analyse von Blut oder anderen biologi-

Ma/fu - 1 - ^schen

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sehen fluiden Medien, bei dem kleine Teilchen, wie beispielsweise einzelne Zellen oder !Törperchen, festgestellt bzw. gemessen und klassifiziert werden. Mit der vorliegenden Erfindung läßt sich die Meßempfindlichkeit erhöhen, um die Ansprechempfindlichkeit der Teilchen auf einen physikalischen Reiz, wie beispielsweise Licht, zu bestimmen, wenn die Teilchen durch eine schmale Strömungskammer geführt werden. Ein typischer Anwendungsfall ist die Meßung der Intensität der Fluoreszenz-Emission von Blutzellen, die mit einem Farbstoff versetzt sind .

Da die Teilchen einzeln, und üblicherweise relativ rasch, durch die Strömungskammer geführt werden, ist das Ansprechsignal oft so schwach, daß eine adäquate Feststellung und Meßung schwierig ist. Wird jedoch der Reiz wiederholt und periodisch angelegt, und werden die aufeinanderfolgenden Reaktionen in geeigneter Weise festgestellt bzw. genießen, so ist es möglich, die aufeinander-folgenden Reaktionen für jedes einzelne Teilchen zu addieren und eine einzige, große Reaktion zu erhalten, die für die Feststellung und riassifikation der Zahl und Arten von Teilchen in der Probe besser geeignet ist.

Die Analyse von Zellen, wie beispielsweise Blutzellen, kann durchgeführt werden, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff versetzt werden und dann die Fluoreszenz-Emission gemessen wird, wenn sich die einzelnen Zellen durch eine schmale, bestrahlte Strömungskammer bewegen. Herkömmliche Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind in den US-PS3 788 744 bzw. US-PS3 819 275 erläutert; eine Vorrichtung zur Durchführung einer solchen Photoanalyse wird in der US-PS3 788 744 beschrieben. Diese Photoanalyse wird üblicherweise bei mehreren Millionen Teilchen in einer bestimmten Probe durchgeführt. Da die gesamte Probe möglichst in wenigen Minuten gemessen werden sollte, liegt die Meßzeit für ein einzelnes Teilchen in der Größenordnung von MikroSekunden. Als Ergebnis hiervon ist das integrierte Gesamtausgangssignal von einem Phototetektor, der auf die Fluoreszenz-Emissionen der einzelnen Zellen anspricht, oft relativ schwach. Ist ein stärkeres Signal erforderlich, um die verschiedenen !lassen von Teil-

- 2 - chen

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chen unterscheiden zu können, so muß die Meßzeit erhöht werden, indem die Strömungsgeschwindigkeit der Teilchen durch die Strömungskammer verringert wird. Als Alternative hierzu kann die Länge der Meßkammer vergrößert und die Teilchenkonzentration verringert werden, um zu verhindern, daß sich gleichzeitig zwei Teilchen im Meßbereich der Strömungskammer befinden. In jedem Fall nimmt dabei jedoch die Gesamtzeit für die Analyse der gesamten Probe zu. Das gleiche Problem tritt dann auf, wenn ein Zellenzähler verwendet wird, der eine photometrische Analyse durchführt, oder wenn andere Unterschiede als die Fluoreszenz-Emission festgestellt werden. So sind beispielsweise Blutzellenzähler erhältlich, bei denen die Unterscheidung zwischen den Zellen auf der elektrischen Leitfähigkeit, der Lichtstreuung, der Blockierung bzw. Absorption von Licht oder der elektrischen Kapazität beruht. In der US-PS3 811 841 wird ein System beschrieben, bei dem zur Feststellung bzw. Meßung von Zellen die Blockierung bzw. Unterbrechung von Licht verwendet wird.

Mit der vorliegenden Erfindung soll deshalb eine Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen der angegebenen Gattung geschaffen werden, bei der für die Strömungskammermeßungen Impulscodetechniken eingesetzt werden, so daß im Vergleich mit den herkömmlichen Systemen eine erhöhte Empfindlichkeit und höhere Zählraten möglich sind.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der angegebenen Gattung gei löst durch einen schmalen Kanal, durch den das die Materialteilchen enthaltende fluide Medium strömt, durch einen Strömungsregler zur Beibehaltung einer vorher bestimmten Strömungsgeschwindigkeit durch den Kanal, durch eine Anordnung zur Erzeugung eines räumlich diskontinuierlichen physikalischen Reizes an den Materialteilchen, die sich in dem fluiden Medium befinden, an Stellen, die longitudinal in vorher bestimmten Abständen längs des Kanals angeordnet sind,um bei jedem Materialteilchen an jeder der oben erwähnten Stellen ein getrenntes Ansprechverhalten hervorzurufen, das insgesamt eine codierte Reaktion bildet, durch einen Umformer zur Feststellung der getrennten Reaktionen von

- 3 - den

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den diskreten Materi al teilchen an ,leder der oben erwähnten Stellen und zur Erzeuouner von entsprechenden Si analen, und durch einen mit dem Umformer verbundenenund mit der Strömungsgeschwindigkeit und dem Abstand zwischen den oben erwähnten Stellen korrelierten Decodierer, um die codierten Reaktionen zu decodieren und zu einem einzigen decodierten Signal zu kombinieren, wobei die getrennten Signale, die den getrennten, von jedem Materialteilchen ausgehenden Reaktionen entsprechen, in Abhängigkeit von dem physikalischen Reiz festgestellt werden.

Bei einem Verfahren zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen in einem fluiden Medium wird diese Aufgabe dadurch gelöst, das die Teilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff in Kontakt gebracht werden, so daß sie unter der Einwirkung eines Lichtstrahls fluoreszieren, daß ein fluides Medium, das diese Teilchen enthält, durch eine transparente Strömungskammer geführt wird, daß diese Strömungskammer mehreren querverlaufenden Lichtstrahlen an Stellen ausgesetzt wird, die in vorher bestimmten Abständen längs der Strömungskammer angeordnet sind, um von den Teilchen als Reaktion auf jeden Lichtstrahl codierte Signale in Form von diskreten Fluoreszenz-Emissionen hervorzurufen, daß die codierten Signale unter Verwendung eines Umformers gemessen werden, der für jedes codierte Signal Ausgangssignale erzeugt, daß die codierten Ausgangssignale für einzelne Teilchen decodiert werden, indem die Signale zusammengefaßt werden, um für jedes untersuchte Teilchen ein zusammengesetztes Ausgangssignal zu erzeugen, daß die Teilchen in Abhängigkeit von Unterschieden in dem zusammengesetzten Ausgangssignal klassifiziert werden, und daß die Teilchen in Abhänoigkeit von der ausgewählten Klassifikation quantitativ tabeilarisiert werden.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile lieoen insbesondere darin, daß eine erhöhte Meßemufindlichkeit erreicht wird, ohne daß die Bestrahlung oder ein anderer physikalischer Reiz, der auf die gemessenen Zellen einwirkt, in entsprechender Weise gesteigert werden muß. Denn der naheliegendste Weg, die Empfindlichkeit bei der photometri-

- 4 - sehen

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sehen Analyse von Blutzellen zu erhöhen, wäre die einfache Erhöhung der Intensität der Lichtquelle. Eine hellere Quelle ist jedoch kostspieliger, erzeugt zusätzliche Wärme und erfordert eine sorgfältige Abschirmung, damit Streulicht den Fluoreszenz-Detektor nirht erreichen Vann. Darüber hinaus begleiten noch weitere nachteilige Nebenwirkungen eine Erhöhung der Lichtintensität. Denn durch eine leistungsstärkere Bestrahlungsintensität können unerwünschte photochemische Reaktionen zwischen dem fluoreszierenden Farbstoff und dem Protein in den Zellen eingeleitet werden. Dadurch wird jedoch das Ergebnis der Analyse verzerrt und ausgeschlossen, daß die Zellen, nachdem sie in der Strömungskammer verarbeitet worden sind, noch untersucht oder analysiert werden können.

Mit einer Steigerung der zugeführten Bestrahlungsintensität erhöht sich die Wahrscheinlichkeit für eine photochemische Reaktion aus zwei Gründen. Erstens steigt die mittlere Verweilzeit der Zellen in der Strömungskammer im angeregten Zustand an, so daß während dieser Zeitspanne eine größere Wahrscheinlichkeit für einen Zusammenstoß zwischen einem angeregten Teilchen und einem anderen Molekül besteht. Als Ergebnis hiervon nimmt die Rate bzw. Häufigkeit von unerwünschten chemischen Reaktionen zu. Darüberhinaus bewirkt eine solche Steigerung der zugeführten Reize eine Erwärmung der Zelle, wodurch ebenfalls unerwünschte chemische Reaktionen beschleunigt werden, da es nur sehr wenige Fälle gibt, in denen die erhöhten Reizpegel in den jeweiligen Teilchen zu 100% umgewandelt werden.

Mit der vorliegenden Erfindung läßt sich also ein verbessertes Signal/Rauschen-Verhältnis von dem Ansprechdetektor erreichen, ohne daß eine erhöhte Bestrahlungsintensität oder ein elektrisches Potential erforderlich ist.

Dabei können Teilchen aus unterschiedlichen Materialien in Abhängigkeit von ihren Reaktionen auf den physikalischen Reiz klassifiziert werden.

- 5 - Ein

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Ein Verfahren zur Behandlung von solchen Teilchen mit einem geeigneten Farbstoff wird in der US-PS3 819 270.erläutert.

Eine weitere, sehr spezielle Anwendung der vorliegenden Erfindung betrifft den Einsatz mehrerer physikalischer Reize, wie beispielsweise Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Wellenlänge, bei den zu untersuchenden Teilchen. Mehrfache physikalische Reize können entweder gleichzeitig oder nacheinander auf die Teilchen ausgetibt werden, wobei eine oder mehrere Codefunktionen eingesetzt werden, um in entsprechenden Umformern mehrfache Reaktionen zu erhalten. Diese Ausgangssignale der Umformer werden mit entsprechenden Decodierern decodiert, so daß ein einziges Teilchen mehrfache Signale liefert. Diese Signale können zu geeigneten Kombinationen und/oder Verhältnissen zusammengefaßt werden, so daß die Probenteilchen in Abhängigkeit von diesen Kombinationen und Verhältnissen klassifiziert werden können. In der US-PS3 822 095 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Wellenlänge für die Erzeugung von mehreren kombinierten Reaktionen bzw. Ausganqsignalen eingesetzt werden, um verschiedene Teilchenklassen zu identifizieren.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich auch aus der nun folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen und den Ansprüchen.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das typische Ansprechverhalten eines PhotodeteJctors auf mehrere einzelne Zellen in anem herkömmlichen photoanalytischen Detektor;

Fig. 2 das Ansprechverhalten des Photodetektors auf mehrere einzelne Zellen in einem herkömmlichen photoanalytischen Detektor, bei dem die Strömungsgeschwindigkeit erhöht worden ist;

Fig. 3 da3 Ausgangssignal eines Photodetektors und eines Decodierers

- 6 - bei

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bei der in Fig. 2 verwendeten Strömungsgeschwindigkeit,
wobei die Maßnahme!nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden;

Fig. 4 eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 5 eine alternative Ausführungsform eines Teils der Vorrichtung nach Fig. 4;

Fig. 6 eine vergrößerte Ansicht eines Teils der Vorrichtung nach
Fig. 4;

Fig. 7 das ideale Ausgangssignal des Photodetektors von einer einzigen Zelle bei Anwendung der vorliegenden Erfindung;

Fig. 8 eine graphische Darstellung der Decodierung des codierten
Signals nach der vorliegenden Erfindung; und

Fig. 9 eine graphische Darstellung des Ausgangssignals des Decodierers, wie er bei der vorliegenden Erfindung verwendet
wird.

Eine herkömmliche photoanalytische Vorrichtung, mit der bestimmt werden kann, in welchem Maße Zellen mit unterschiedlichen Typen in einer bestimmten Blutprobe vorhanden sind, haben im allgemeinen den folgenden Aufbau: die Zellen fließen nacheinander und einzeln durch ein kleines Kapillarröhrchen, das beleuchtet wird, indem eine helle Lichtquelle durch ein Mikroskopobjektiv auf das Kapillarröhrchen abgebildet wird. Dabei verläuft also ein einziger Lichtstrahl quer durch das Kapillarröhrchen. Durch entsprechende Auslegung der optischen Bauteile ist es möglich, innerhalb des Kapillarröhrchens einen gleichförmig bestrahlten Bereich zu erhalten, so daß das Ausgangssignal des fluoreszierenden Lichtes als einziger Ausgangsimpuls erscheint, wenn eine einzelne Zelle diesen Bereich passiert. Die Amplitude dieses Impulses ändert
sich in Abhängigkeit davon, wieviel fluoreszierenden Farbstoff die ZeI-

- 7 - Ie

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le in dem Bestrahlungsbereich absorbiert hat.

Bei der typischen Anwendung einer solchen herkömmlichen photoanalytischen Vorrichtung wird eine Analyse durchgeführt, indem eine Differenzzählung der weißen Zellen bzw. Blutkörperchen einer Blutprobe vorgenommen wird. Vor der Analyse wird das Blut mit einem fluoreszierenden Farbstoff gemischt, wie in der TTS-PS3 819 270 im einzelnen erläutert wird. Die verschiedenen Typen der weißen Blutkörperchen absorbieren unterschiedliche Färbstoffmengen, so daß sich Fluoreszenz-Emissionen mit unterschiedlicher Intensität oder Wellenlänge ergeben, wenn die Probeiunter einem Fluoreszenz-Mikroskop bestrahlt werden. Dadurch kann eine ähnliche Analyse durchgeführt werden, indem die Zellen bzw. Blutkörperchen nacheinander durch eine schmale Strömungskammer geführt werden, wie oben beschrieben wurde; zur Bestimmung des Zellentyps, der gerade das Kapillarröhrchen passiert, kann die Amplitude des Impulses festgestellt werden, der von dem Photodetektor empfangen wird. Diese von dem Photodetektor gemessene Impulsamplitude ist direkt proportional zu der Größe bzw. Stärke der Fluoreszenz-Emission von dem JTörperchen, die auf den Photodetektor fällt.

Während einer bestimmten gegebenen Zeitspanne ist das Ausganssignal eine Photodetektors bei einem Differenzzähler für die weißen Blutkörperchen, der eine herkömmliche photoanalytische Vorrichtung verwendet, ähnlich dem Ausgangssignal, wie es in Fig. 1 dargestellt ist. Fig. läßt sich entnehmen, daß drei Zellen nacheinander durch die Strömungskammer geführt wurden. Die beiden ersten Zellen haben auf den Beleuchtungsstrahl angesprochen, indem sie eine Fluoreszenz-Strahlung aussandten und während der angegebenen Zeitspannen Ausgangssignale 45 des Photodetektors mit dem Amplitudenwert B erzeugten. Die letzte untersuchte Zelle reagierte durch Erzeugung eines Ausgangssignals des Photodetektors mit einer größeren Amplitude A. Zwischen den untersuchten bzw. gemessenen Zellen herrschte ein bei 43 angedeutetes Signal vor, das auf dem Pegel des Umgebungsrauschens beruhte.

Aus Fig. 1 läßt sich entnehmen, daß es unter Verwendung der herkömm-

- 8 - liehen

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lichen Verfahren möglich ist, die Zahl der Zellen_r die Detektorausgangssignale mit der Amplitude A erzeugen, getrennt von der Zahl der Zellen zu zählen, die Photodetektor-Ausgangssignale mit der Amplitude B erzeugen. Diese Differenz in der Zahl der jeweils untersuchten Zellentypen ist insbesondere für die medizinische Diagnose wesentlich. Bei herkömmlichen Zellen- bzw. ITÖrperchenzählern läßt sich jedoch nur eine begrenzte Strömungsgeschwindigkeit durch das Kapillarröhrchen erreichen. Wird die Strömungsgeschwindigkeit über eine obere Grenze erhöht, so wird der Detektor unempfindlich für die verschiedenen Zellentypen, die durch das Kapillarröhrchen geführt werden. Das Detektorausgangssignal für diesen Fall ist in Fig. 2 dargestellt. Aus Fig. 2 läßt sich entnehmen, daß es praktisch unmöglich ist, zwischen den Zellen eines Typs, die Photodetektorimpulse 4 t erzeugen, und Zellen eines anderen Typs zu unterscheiden, die ein Ausgangssignal 40 des Photodetektors erzeugen. Denn das Rauschen (das in Fig. 2 durch das Bezugszeichen 42 angedeutet ist) macht die Bestimmung schwierig, welcher Zellentyp vorhanden ist, falls nicht die Dauer des Ausgangsimpulses lang-genug ist, so daß eine genaue Abschätzung seines Mittelwertes vorgenommen werden kann. Dazu muß jedoch die Länge des beleuchteten Bereichs in der Strömungskammer sowie die Geschwindigkeit, mit der die Zellen durch diesen Bereich bewegt werden, relativ zueinander genau eingestellt werden, um die notwendige Impulsdauer zu erhalten. Damit die beiden Zellentypen bei höherer Strömungsgeschwindigkeit unterschieden werden können, muß die Amplitude der Fluoreszenz-Ausgangssignale auf irgendeine Weise erhöht werden, so daß der Unterschied des Fluoreszenzsignals stärker hervortritt. Die naheliegendste Lösung wäre, einfach die Intensität der Quelle zu erhöhen. Wie oben erklärt wurde, stellt dies jedoch keine für diePraxis zweckmäßige Lösung dar, weil sich dadurch die Wahrscheinlichkeit von photochemischen Reaktionen erhöht. Durch die Verwendung des Impulscode-Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung ist es jedoch möglich, das Verhältnis Signal/Rauschen ohne eine Steigerung der Beleuchtungsintensität zu erhöhen.

Wenn die Strömungskammer statt eines gleichförmig beleuchteten Be-

- 9 - reichs

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reichs einen viel längeren, beliebig und willkürlich strukturierten Beleuchtungsbereich enthält, so erzeugt eine die Strömungskammer passierende Zelle ein unterschiedliches Ausgangssignal, wenn mehrere Lichtstrahlen an bestimmten, vorgegebenen Stellen, die longitudinal in vorher bestimmten Abständen längs der Strömungskammer angeordnet sind, quer durch die Strömungskammer verlaufen. Dabei erzeugt also eine die Strömungskammer passierende Zelle statt eines einzigen langen Impulses eine Reihe von kurzen Impulsen, wie in Fig. 7 dargestellt ist. Diese Impulse treten immer dann auf, wenn sich die Zelle durch einen dieser Lichtstrahlen bewegt. Das Beleuchtungsmuster der Lichtstrahlen ist so strukturiert, daß es einen eindeutig definierten Flächenmittelpunkt gibt, der sogar dann ermittelt werden kann, wenn sich die Ausgangssignale von nacheinander durchlaufenden Partikeln teilweise überdecken. Das Beleuchtungsmuster, das durch diese Lichtstrahlen erzeugt wird, kann als Code betrachtet werden, der bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. Das in Fig.7 dargestellte Beleuchtungsmuster dient nur als Beispiel zur Erläuterung der Funktionsweise der Erfindung, wobei der Fachmann auf dem Gebiet der Theorie der Signal-Meßung bzw. -Feststellung erkennen wird, daß die hier beschriebene Ausführungsform die Verfahren der Pulscodetfbertragung und Signalerfassung mit angepaßten Filtern verwendet; deshalb können auch verschiedene andere Codemuster eingesetzt werden.

Die in Fig. 4 dargestellte Ausführungsform ist so ausgelegt, daß sich das in Fig. 7 gezeigte Ansprechverhalten des Photodetektors ergibt-Eine Lichtquelle 1, die eine Bogenlampe, ein Laser oder eine andere ausreichend helle Quelle sein kann, wird durch eine geeignete Yondensorlinse 2 so abgebildet, daß sich eine gleichförmige Beleuchtung einer Codiermaske 3 ergibt. Diese Maske enthält die Code-Funktion als Übertragungsmuster. Ein Mikroskopobjektiv 4 erzeugt eine verkleinerte Abbildung der Maske 3 in einer Strömungskammer oder einem Fanal T4, der durch ein Kapillarröhrchen 13 gebildet wird. Die Breite des Strömungskanals 14 ist so gering, daß diskrete Teilchen, wie beispielsweise die Zelle 12, gezwungen werden, in einer Reihe hintereinander durch den IT anal zu strömen. Wäre dies nicht der Fall, so würden gleich-

- 1o - zeitige

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zeitige bzw. zusammentreffende Signale von mehreren Zellen auftreten, die die Verarbeitung der Daten stören würden. Die Maske 3 bewirkt die Erzeugung mehrerer Lichtstrahlen B1 bis B7. Diese Strahlen B1 bis B7 verlaufen quer durch die Strömungskammer 14 an bestimmten, fest vorgegebenen Stellen, die in vorher bestimmten Abständen longitudinal längs der Strömungskammer angeordnet sind. Wenn eine einzelne Zelle 12 in der durch den Pfeil in Fig. 4 angedeuteten Strömungsrichtung zugeführt wird, trifft sie zunächst auf den Strahl B1. Wenn sie durch den Strahl B1 beleuchtet wird, emittiert die Zelle 12 ein Fluoreszenz-Ausgangssignal, das ein Photodetektor-Ausgangssignal P1 erzeugt, wie in Fig. 7 dargestellt ist. In ähnlicher Weise erzeugt der Strahl B2 ein Photodetektor-Ausgangssignal P2, der Strahl B3 erzeugt ein Ausgangssignal P3, usw. Selbstverständlich sind geeignete Einrichtungen zur Strömungsregelung vorgesehen, um eine konstante Strömungsgeschwindigkeit durch den Fanal 14 beizubehalten.

Das abgegebene Fluoreszenz-Licht (siehe Fig. 7) wird durch ein zweites Mikroskopobjektiv 15 gesammelt und zu einem Photodetektor übermittelt, der als Photoelektronenvervielfacherröhre 17 dargestellt ist. Ein Sperrfilter 16 verhindert, daß Licht direkt von der Quelle 1 auf den Photoelektronenvervielfacher 17 entfallen kann. Das Sperrfilter 16, das zwischen der Strömungskammer 14 und dem Photodetektor 16 angeordnet ist, blockiert wahlweise den Durchgang des Lichts von den Strahlen B1 bis B7 und läßt nur Licht durch, das durch die Fluoreszenz der Zelle 12 in dem Fluid strom in der Strömungskammer 14 erzeugt wird. Diese Sperrwirkung des Filters 16 ergibt sich daraus, weil das Fluoreszenz-Ausgangssignal in der Form der Impulse P1 bis P7 eine Wellenlänge hat, die anders als die der Strahlen B1 bis B7 ist. Das Sperrfilter 16 ist so ausgewählt, daß Licht mit der gleichen Wellenlänge wie die Fluoreszenz-Emissionen durchgelassen wird, jedoch Licht mit einer Wellenlänge blockiert wird, die der direkten Licht-Übertragung von der Lichtquelle 1 entspricht. Als Alternative hierzu kann bei Fluoreszenz-Emissionen der Beleuchtungsstrahl effektiv blockiert werden, indem der Detektor senkrecht zu der Fortpflanzungsachse des Beleuchtungslichtes in einer Ebene ausgerichtet ist, die sowohl quer

- 11 - zu

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zu der Strömunsgrichtung in der Strömungsquelle liegt als auch die Portpflanzungsachse des Beleuchtungslichtes enthält. Gemäß Fig.4 ist als Decodieranordnung eine Verzögerungsleitung 19 mit Abgriffen und Verstärkern 21 bis 27 vorgesehen, die mit einer Addierschaltung 20 verbunden sind. Die Ausgangssignale des Decodierers werden zu einer elektronischen Verarbeitungseinrichtung 28 geführt, die die Zellen auf die gewünschte Weise zählt und klassifiziert und die tabellarisch geordneten Zählwerte für die interessierenden Teilchen gemäß den ausgewählten Klassifikationen in den Registern 29,3o und 31 speichert.

Bei der dargestellten Ausführungsform der Einrichtung nach der Erfindung ist die Maske 3 zwischen der Strömungskammer 14 und der Lichtquelle 1 anoeordnet und weist öffnungen auf, die in codierten Intervallen im Abstand in der Maske angeordnet sind, so daß die Lichtstrahlen B1 bis B7 aus den öffnungen austreten und an vorher bestimmten, im Abstand angeordneten Stellen auf die Strömungskammer 14 treffen können, wie in Fig. 6 dargestellt ist. Bei dieser Ausführungsform nimmt der Abstand zwischen benachbarten Lichtstrahlen in Strömungsrichtung ab. Dabei wird im Einzelnen der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Strahlen bestimmt, indem die Differenz der Quadratwurzeln ihrer jeweiligen Nummern in der Folge ermittelt und mit einem Eichfaktor multipliziert wird. So haben der erste und zweite Strahl einen Abstand voneinander, der gleich/2 -/imal dem Eichfaktor ist; der zweite und dritte Strahl haben einen Abstand voneinander, der gleich/3^-/2 mal dem Eichfaktor ist, usw. Aus diesem Abstandsmuster der Strahlen B1 bis B7 läßt sich erkennen, daß bei einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit in .der Strömungskammer 14 eine einzige Zelle 12 in dem Detektor 17 eine Folge von Ausgangsimpulsen erzeugt, wie sie in Fig. 7 dargestellt ist. Diese Impulse werden in dem Verstärker 18 verstärkt und dann auf die Verzögerungslei*· tung 19 geführt.

Die Verzögerungsleitung 19 hat N-1 Abgriffe,wobei N die Zahl der Impulse in dem Code ist. Diese Abgriffe haben jeweils Verzögerungen,

- 12- · _dle

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die dem Abstand zwischen Beleuchtungstrahlen B6 und B7, B5 und B6, usw., entsprechen. Mit anderen Worten erzeugen für einen allgemeinen Code die Abgriffe an der Verzögerungsleitung eine Verzögerung, die dem Impulsabstand entspricht, den man enthält, wenn man die Codefolge in Zeit rückwärts laufen läßt. Diese Ausgangssignale von der Verzögerungsleitung 19 werden, wie oben erwähnt, auf die Verstärker geführt, wobei die Ausgangssignale der Leitungen 21 bis 27 und ihrer zugeordneten Verstärker 26 bis 27a auf die Addierschaltung 2o geaeben werden. Die DecodieranOrdnung nach der Erfindung ist dadurch mit dem Abstand der Strahllagen korreliert. Dabei wird darauf hingewiesen, daß auf der Leitung 27 keine künstliche bzw. fremderregte Verzögerung auftritt.

Die Funktionsweise der Leitungen 21 bis 27 läßt sich unter Bezugnahme auf den Inhalt der Addierschaltung 20 erläutern, tfie in Fig. 8 dargestellt ist. Für eine durch den Strömungskanal 14 fliesenden Zelle 12 wird eine Reihe von Impulsen erzeugt, wie in Fig. 7 dargestellt und oben erläutert ist. Durch die Leitung 27 und die Abgriffe 21 bis 26 der Verzögerungsleitung wird jeder der Impulse P1 bis P7 siebenmal nachgebildet bzw. wiederholt. Als Beispiele sind Verzögerungszeiten und Impulsankunftszeiten . auf der Abszisse von Fig. 8 aufgetragen. Die Nachbildung des Impulses P1 von der Leitung 27 ist der erste Impuls, der die Addierschaltung 20 erreicht. Der Impuls P1 von dem Abgriff 26 der Verzögerungsleitung ist der zweite Impuls, der die Addierschaltung 20 erreicht. Die Impulse P2 von der Leitung 27 und F1 von der Leitung 25 erreichen die Addierschaltung 27 nahezu gleichzeitig, so daß in Fig. 9 eine kleine Spannungsspitze 36 entsteht. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß nicht mehr als maximal zwei Impulse gleichzeitig bis zur Zeit T in Fig. 8 von der Addierschaltung 20 empfangen werden. Zur Zeit T fallen die Impulse P1 von der Leitung 21, P2 von der Leitung 22, P3 von der L_eitung 23, P4 von der Leitung 24, P5 von der Leitung 25, P6 von der Leitung 26 und P7 von der leitung alle zeitlich zusammen. Als Ergebnis tritt eine sehr große Impulsspitze 35 auf, wie in Fig. 9 angedeutet ist. Die Spitze 35 ist viel größer als die kleineren Spitzen 36, die durch das zufällige Zusammenfallen

- 13 - von

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von gleichzeitigen Impulsen, wie beispielsweise des Impulses P1 von Leitung 25 und des Impulses P2 von leitung 27, wie oben erwähnt wurde, erzeugt werden.

Die Decodierung des Inhaltes der Addierschaltung 20 in Fig. 8 zur Erzeugung desinFig.9 dargestellten Ausgangssignals der Addierschaltung wird auch als Autokorrelation bezeichnet. Unter Verwendung von Autokorrelation hat das Ansprechverhalten des Decodierers eine einzige, schmale Spannungsspitze 35 mit einer lage in Bezug auf die Zeitachse, die durch den zeitlichen Flächenmittelpunkt des ursprünglichen Codes bestimmt ist. Die Gesamtsignalstärke dieser Spitze 35 hängt von der Zahl von Impulsen in dem Code ab, die durch die Länge der Strömungskammer 14 gesteuert wird, während die Breite der Spitze von der Breite der Strahlen B1 bis B7 abhängt. Diese zwei Parameter sind im wesentlichen unabhängig voneinander. Deshalb müssen aufeinanderfolgende Teilchen 12, die sich durch das Kapillarröhrchen 13 fortpflanzen, nur ausreichend voneinander getrennt werden, damit sich die schmalen Spitzen ihrer autokorrelierten Ausgangssignale nicht überlappen; dabei kann die Länge der Strömungskammer auf jeden gewünschten, in der Praxis noch möglichen Wert erhöht werden, damit für die gewünschte Tl^t er sch ei dung der Teilchen eine ausreichende Signalstärke erhalten wird.

Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Code ist so ausgewählt, daß sich zu jedem Zeitpunkt nicht mehr als zwei Impulse (wie beispielsweise der Impuls P1 von Leitung 25 und der Impuls P2 von der Leitung 27) überlappen bzw. zeitlich zusammenfallen. Die Amplitude der Spitze oder die Signalstärke der Spannungspitze 35 von der Addierschaltung ist proportional zu der Zahl der Impulse im Code. Das heißt also, daß die (unverstärkte) Spannungsspitze 35 eine Amplitude haben würde, die siebenmal so groß wie eine einzige Amplitude der Impulse in Fig. 7 wäre.

Das decodierte Ausgangssignal des Photodetektors während einer bestimmten Zeitspanne ist in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3 zeigt das Ansprechverhalten der linrichtung beim Durchgang mehrerer aufeinanderfolgender Zellen von unterschiedlichem Typ durch die Kapillarrohre 13- Die bei der Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung des Aus-

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gangssignals von Fig. 3 verwendete Strömungsgeschwindigkeit ist näherungsweise gleich der Strömungsgeschwindigkeit, wie sie in Herkömmlichen Einrichtungen, beispielsweise zur Erzeugung des in Fig.2 dargestellten Ausgangssignals des Photodetektors, verwendet wird. Es läßt sich erkennen, daß im Gegensatz zu dem Ausgangssignal nach Fig, 2 das Ausgangssignal nach Fig. 3 aufgelöst werden kann, so daß Zellen eines Typs A, die Tmpulsspitzen 37 erzeugen, von den Zellen eines Typs B unterschieden werden können, die die Impulsspitzen 38 mit kleinerer Amplitude erzeugen. Die Amplitude der Spitzen 37 ist

gleich T. . A, während die Amplitude der Spitze 38 gleich Γ . B ist; η η

dabei ist K ,eine Zahl_;die größer als 1 und proportional zu der Zahl der Impulse in dem Code ist. A und B sind die gleichen Amplituden, die in Fig. 1 dargestellt sind.

Obwohl die in Fig. 4 gezeigte Einrichtung wahrscheinlich den bevorzugten Aufbau einer Einrichtung nach der Erfindung darstellt, ist in Fig. 5 eine alternative Ausführungsform der Decodieranordnung gezeigt. Codes, die mehrfache Ordnungen enthalten, wie beispielsweise Rechteckwellen-Frequenzmodulation "zirpen" (F .M ."chirp") können so ausgelegt werden, daß sich die Frequenzen der mehrfachen Ordnungen nicht überlappen. In diesem Fall kann eine Decodieranordnung aufgebaut werden, indem das Ausgangssignal des Detektors von dem Verstärker 18 durch einen Bandpaß bzw. ein Bandfilter 32 geführt wird, das eine dieser Ordnungen,üblicherweise die Grundordnung basw. die Grundwelle, auswählt. Das Ausgangssignal von dem Bandpaß 32 kann durch eine Impulskompressions-Anordnung 33 in Form einer dispersiven Verzögerungsleitung geführt werden, um für die einzelnen Teilchen autokorrelierte Ausgangssignale zu erzeugen. Der Tiefpaß blockiert die hochfrequenten Ausgangssignale, einschließlich des größten Teils des Rauschens, von dem Photoelektronenvervielfacher 17, läßt jedoch die niederfrequenten Ausgangssignale, wie beispielsweise die Impulse P1 bis P7, durch. Die Impulskompressionsandordnung 33 erzeugt also ein Signal, das für ein bestimmtes Teilchen oder eine Zelle 12 im Strömungskanal 14 proportional zu der integrierten Summe der Impulse P1 bis P7 ist} dieses Signal wird auf einen Verstärker 34 gegeben.

- 15 - In

βΟ991B/1212

Γ" '

. \.ι ι ;SR13 P - 1323

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Tn jeder AusführuncfSform bildet die elektronische Verarbeitungseinrichtung 28 eine" Einrichtung zur Signalklassifikation, um die decodierten Ausgangssignäle in Abhängigkeit von vorher gewählten Bereichen von Impulsamplituden einzuteilen. Die elektronische Verarbeitungseinrichtung 28 dient auch zur tabellarischen Anordnung der Impulse, um die.Zahl der decodierten Ausgangssignale in jeder ausgewählten Tlassifikation zu zählen, wobei die Zählergebnisse in den Registern 29, 30 und 31 tabellarisch angeordnet werden. Auf dise Weise können unterschiedliche Typen von interessierenden Teilchen mit sicher identifizierbaren Fluoreszenz-Eigenschaften getrennt listenförmig zusammengestellt werden.

Es gibt verschiedene unterschiedliche Betriebsbedingungen, bei denen die Strömungszellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eine Impulscodierungstechnik verwenden, wesentliche Vorteile im Vergleich mit herkömmlichen Strömungszellen bringen. Es gibt jedoch umgekehrt auch einige ungünstige Bedingungen für die Strömungszellenmeßungen, bei denen die Verwendung der Einrichtung nach der Erfindung wahrscheinlich keine Verbesserung bringen wird, obwohl die Ergebnisse auch nicht schlechter als beijden herkömmlichen Einrichtungen sein werden. Im einzelnen ergibt¹ sich bei der hier beschriebenen impulscodierten Strömungszellentechnik dort ein wesentlicher Vorteil, wo die Unterscheidung der Teilchen auf dem Ergebnis verschiedener, unterschiedlicher Meßungen, beispielsweise der Meßung von Mehrfach-Fluoreszenzen, beruht; in diesem Fall wird angestrebt, einen einzigen Detektor zur Durchführung aller Meßungen zu verwenden. In einem solchen Fall sollten an jedem Teilchen verschiedene Meßungen durchgeführt werden, beispielsweise Fluoreszenz-Meßungen bei unterschiedlichen Wellenlängen. Dabei werden üblicherweise für jede Wellenlänge getrennte Fanale in der Strömungszelle abgebildet, wonach das Ausgangssignal eines jeden Fanals durch Abtrennfilter auf einen getrennten Detektor abgebildet wird. Wird statt dessen ein Satz von orthogonalen Codewörtern eingesetzt, dann können sie so in die Strömungskammer abgebildet werden, daß sie,einander überlappen. Die Ausgangssignäle können dann auf einen einzigen Detektor gegeben werden, ohne daß Abtrennfilter erforderlich ist; die sich ergebenden Signale können

- 16 - dann

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dann wegen ihrer Orthogonal!täts-Eigenschaft getrennt werden. Selbstverständlich ist dabei notwendig, daß es keine Wechselwirkung, wie beispielsweise übertragung der inneren Energie, bei der gleichzeitigen Erregung der verschiedenen Fluoreszenz-Mechanismen gibt. Als Alternative hierzu könnte für jeden Fanal das gleiche Codewort eingesetzt und einfach in die Strömungszelle mit einer geringen Versetzung zwischen den Kanälen abgebildet werden. Durch Ausblenden bzw. Zeitsteuerung mit einem zusätzlichen Detektor sollte es möglich sein, die Ausgangssignale für jeden Fanal zu trennen.

Die Einrichtung nach der vorliegenden Erfindung läßt sich besonders vorteilhaft dort anwenden, wo wegen des Rauschens der Quelle oder eines thermischen Detektors nur ein unzureichendes Signal zur Verfügung steht. Denn bei der Verwendung von Impulscodetechniken ergibt sich eine wesentliche Verbesserung des Verhältnisses Signal/Rauschen. Die Signalleistung pro Bandbreiteneinheit erhöht sich mit einer Vergrößerung der Länge der Impulsfolge, während die Rauschleistung pro Bandbreiteneinheit konstant bleibt.

Unter Umständen müssen Strömungszellen-Meßungen auch unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen praktisch kein Rauschen auftritt, das Signal jedoch nur eine kleine Änderung von einem hohen Vorspannungs- bzw. Abgleichwert darstellt, der sich langsam im Laufe der Zeit verschieben kann. Wenn der Impuls kurz und ausreichend stark bzw. intensiv ist, dann genügt eine einfache WechselSpannungskopplung des Ausgangssignals des Detektors für eine Trennung des Signals vom Untergrund. Wenn jedoch der Signalimpuls nicht ausreichend intensiv bzw. stark ist, so läßt sich die Signalenergie nur mittels einer Zeitintegration erhöhen. Dabei treten jedoch zwei Nachteile auf: zunächst wird die Zählrate bzw. Zählgeschwindigkeit gesenkt, und zweitens reicht ein einfacher, wechselspannungsgekoppelter Detektor nicht mehr für die Trennung des Signals vom Untergrund aus. Durch Verwendung einer Impulscodetechnik kann das gewünschte Signal zu einem Breitbandsignal umgeformt werden, das um eine versetzte Trägerfrequenz zentriert ist; dadurch wird eine hohe Zählgeschwindigkeit und eine leichte Trennung

- 17 -

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des Signals vom Untergrund möglich. Wenn das Signal als kurzer Impuls auftritt, dann kann ein einfacher wechselspannungsgekoppelter Detektor verwendet werden. Wenn das Signal lang gehalten und mittels einer Zeitintegration gemessen werden muß, dann erlaubt die Verwendung einer impulscodierten Technik sowohl eine hohe Zählgeschwindigkeit als auch eine leichte Trennung des Signals und des Untergrundes.

Andererseits ergibt sich bei der Verwendung der impulscodierten Technik dort kein wesentlicher Vorteil, wo aufgrund von Mengenbeschränkungen nur ein unzureichendes Signal vorliegt·. Dies kann dort auftreten, wo es einen Untergrundρegel gibt oder wo einzelne Impulse von einzelnen Teilchen aufgrund der Menge begrenzt sind, jedoch praktisch kein Untergrund vorhanden ist. In dem zuerst erwähnten Fa21 ergibt sich dann keine Verbesserung des Verhältnisses Signal/Rauschen, wenn impulscodierte Techniken verwendet werden, während im zuletzt genannten Fall die Verbesserung des Verhältnisses Signal/Rauschen von der Zählgeschwindigkeit abhängt. Bei der maximal möglichen Zählgeschwindigkeit ergibt sich praktisch keine Verbesserung, wenn impulscodierte Techniken verwendet werden, da der konstante Teilchenstrom in der Nähe des gerade untersuchten Teilchens als Untergrund erzeugendes Rauschen auftritt.

In ähnlicher V_eise ergeben die impulscodierten Techniken dann keinen besonderen Vorteil, wenn sich das Signal dadurch ändert, daß sich die Lage oder .Orientierung des Teilchens während der Zeitspanne, in der es sich in der Strömungskammer befindet, ändert.

Wenn jedoch die Impulsfolge lang genug gemacht werden kann, damit ein guter Mittelwert der Teilchenausrichtung erhalten werden kann, so ergibt; sich eine gewisse Verbesserung des Verhältnisses Signal/ Rauschen, insbesondere in kombination mit dem Rauschen des Detektors oder der Quelle. Dartiberhinaus können Signal und Untergrund im Vergleich mit einem Verfahren, bei dem einfach in einem langen Impuls integriert wird, leicht voneinander getrennt werden.

- 18 - Selbstverständlich

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Selbstverständlich sind auch lombinatipnen der oben erwähnten Bedingungen möglich, so daß der Vorteil, der sich bei der Verwendung der impulscodierten Technik ergibt, im wesentlichen durch das Glied der Kombination bestimmt wird, das die geringste Verbesserung bieten dürfte.

Die bestimmte, hier beschriebene Ausführungsform der Erfindung soll nur zur Erläuterung dienen. Andere Ausgestaltungen der Einrichtung und der Techniken können bei der Durchführung des Verfahrens dazu eingesetzt werden, das gestreute Licht, Absorption · oder ITombinationen der Streuabsorption und der Fluoreszenz zu messen. Darüberhinaus können auch andere Eigenschaften neben den optischen Eigenschaften mit entsprechenden Instrumenten gemessen werden. Zu diesen Eigenschaften gehören die elektrische Ladung, die dielektrische Polarisation oder die elektrische Leitfähigkeit. Sollen mit der vorliegenden Erfindung diese Eigenschaften gemessen werden, so ist zwangsweise eine entsprechende Modifikation der Strömungskammer, der Form der Erregung eines Signals, die von der gewünschten Eigenschaft abhängt und der Anordnung zur Feststellung bzw. Meßung des so erzeugten Signals erforderlich.

Patentansprüche

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Claims

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Patenten sprtiche

Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen aus unterschiedlichen Materialien, die sich in-einem fluiden Medium befinden, das ein spezifischesAhsprechverhalten für einen physikalischen Reiz hat, gekennzeichnet durch einen schmalen JTanal (14), durch den das die Materialteilchen enthaltende fluide Medium strömt, durch einen Strömungsregler zur Beibehaltung einer vorher bestimmten Strömungsgeschwindigkeit durch den JTanal (14), durch eine Anordnung zur Erzeugung eines räumlich diskontinuierlichen physikalischen Reizes an den Materialteilchen, die sich in dem fluiden Medium befinden, an Stellen, die longitudinal in vorher bestimmten Abständen längs des Kanals (14) angeordnet sind, um bei .ledern Materialteilchen an jeder der oben erwähnten Stellen ein getrenntes Ansprechverhalten hervorzurufen, das insgesamt eine codierte Reaktion bildet, durch einen Umformer zur Feststellung der getrennten Reaktionen von den diskreten Materialteilchen an jeder der oben erwähnten Stellen und zur Erzeugung von entsprechenden Signalen, und durch einen mit dem Umformer (17) verbundene und mit der Strömungsgeschwindigkeit und dem Abstand zwischen den oben erwähnten Stellen Vorrelierten Decodieren, um die codierten Reaktionen zu decodieren und zu einem einzigen decodierten Signal zu kombinieren, wobei die getrennten Signale, die den¹ Getrennten, von ,1edem Materialtei lrhen ausgehenden Reaktionen entsprechen, in Abhängigkeit von dem physikalischen Reiz festgestellt werden.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der

- 20 - Decodierer

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Decodierer einen mit dem Ausgang des Umformers (17) verbundenen Bandpaß (32) und eine mit dem Bandpaß (32) verbundene Impulskompressions-Anordnung (33) aufweist, um ein decodiertes Signal mit einer Amplitude zu erzeugen, die proportional zu der Vumulativen Amplitudensumme der Signale ist, die von dem Bandpaß (32) ausgehen.

Vorrichtung zur Feststellung der Anwesenheit von bestimmten Teilchen in einem fluiden Medium, wobei die Teilchen so behandelt sind, daß sie unter dem Einfluß eines Lichtstrahls fluoreszieren, gekennzeichnet durch eine transparente, schmale Strömungskammer (13) mit einer Länge, die wesentlich größer als ihre Breite ist, durch eine Einrichtung (1,2,3,4), die mehrere Lichtstrahlen quer durch die Strömungskammer (13) an bestimmten Stellen richtet, die längs der Strömungskammer (i3) longitudinal in vorher bestimmten Abständen angeordnet sind, durch eine Vorrichtung zur Beibehaltung einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit des zu analysierenden fluiden Mediums durch die Strömungskammer (13), durch einen die Strömungskammer (13) überwachenden Photodetektor (17), der in Abhängigkeit von den festgestellten Lichtemissionen elektrische Impulse erzeugt, durch ein Sperrfilter (16), das zwischen der Strömungskammer (13) und dem Photodetektor (17) an den oben erwähnten, im Abstand angeordneten Stellen vorgesehen ist, um wahlweise den Durfhqanq des Lichtes, das direkt aus den Lichtstrahlen austritt, zu blockieren und das Licht bevorzuqt durchzulassen, das durch die Fluoreszenz dieser Teilchen in dem zu analysierenden fluiden Medium in der StrHmunoskammer (13 ) erzeuat wird, und durch einen mit dem Photodetektor (17) verbundenen, mit der konstanten Strömunosgeschwindiakeit und den Abständen zwischen den Stellen korrelierten Decodierer, der decodiert* Ausgangssignale erzeugt, die das kumulative Licht-Ausgangssignal von der Fluoreszenz der Teilchen angeben, die die Strömungskammer (13) passieren.

- 21 - 4.Vorrichtung

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4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Decodierer eine Verzögerungsanordnung (19) für die Impulse aufweist, die mit dem Ausgang des Photodetektors (17) verbunden ist, daß getrennte Ausgangsleitungen (21,22,23,24, 25,26,27) jeweils einer einzigen der stationären Stellen längs der Strömungskammer (13) entsprechen, wobei jeder Ausgangsleitung eine Verzögerungszeit zugeordnet ist, und daß jede Verzögerungszeit proportional zu der Lage der zugeordneten Stelle in der Folge von Stellen ist, auf die die Teilchen in dem fluiden Medium bei dem Durchgang durch die Strb'mungskammer (13) treffen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Ausrichtung der Lichtstrahlen eine einzige Lichtquelle (i) und eine Maske (3) aufweist, die zwischen der Strömungskammer (13) und der Lichtquelle (1) angeordnet ist und öffnungen aufweist, die in codierten Abständen in der Maske (3) angeordnet sind, so daß die Lichtstrahlen aus den öffnungen austreten und an den oben erwähnten, im Abstand vorgesehenen Stellen auf die Strömungskammer (13) treffen.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, gekennzeichnet durch eine Anordnung zur Signalklassifikation, um die decodierten Ausgangssignale in Abhängigkeit von vorher ausgewählten Impulsamplitudenbereichen zu klassifizieren, und durch eine Anordnung zur Tabellarisierung der Impulse, um die Zahl der decodierten Ausgangssignale in jeder ausgewählten flassifileation zu zählen, wobei unterschiedliche Teilchentypen mit einer identifizierbaren Fluoreszenz-ITennlinie getrennt tabellarisiert werden.

7. Vorrichtung zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen aus unterschieldichen Materialien, die sich in einem fluiden Medium befinden, das ein spezifisches Ansprechverhalten für unterschied-

- 22 - liehe

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liehe physikalische Reize zeigt, gekennzeichnet durch einen schmalen Kanal (14), durch den das die Materialteilchen enthaltende fluide Medium strömt, durch einen Strömungsregler zur Beibehaltung einer vorher bestimmten Strömungsgeschwindigkeit durch den Fanal (14), durch eine Anordnung, die mehrere, räumlich diskontinuierliche physikalische R_eize auf die Materialteilchen in dem fluiden Medium an Stellen ausübt, die longitudinal in vorher bestimmten Abständen längs des Kanals (14) angeordnet sind, um getrennte Reaktionen von jedem Materialteilchen an jeder der Stellen hervorzurufen, wobei die Reaktionen auf jeden physikalischen Reiz insgesamt ein codiertes Ansprechverhalten auf diesen Reiz aufweisen, durch einen Timformer (17) zur Peststellung der getrennten Reaktionenauf die Reize von den diskreten Materialteilchen an jeder der oben erwähnten Stellen und zur Erzeugung entsprechender Signale, die sich in Abhängigkeit von den zugehörigen R_eizen unterscheiden, und durch einen mit dem Umformer (17) verbundenen und mit der Strömungsgeschwindigkeit und dem Abstand zwischen den oben erwähnten Stellen korrelierten Decodiereer, um jede der codierten Reaktionen zu decodieren und zu einem einzigen, decodierten Signal zu kombinieren, wobei die getrennten Signale, die den getrennten, ven jedem Materialteilchen ausgehenden Reaktionen entsprechen, in Abhängigkeit von jedem physikalischen Reiz festgestellt bzw. gemessen werden.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Umformer (17) alle getrennten Signale, die den getrennten Reaktionen von jedem untersuchten Materialteilchen auf alle Reize entsprechen, kombiniert, um ein zusammengesetztes Unterscheidungssignal für das zugeordnete Material zu erzeugen.

9. Verfahren zur Unterscheidung zwischen diskreten, zu untersuchenden T_eilchen in einem fluiden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff in Kontakt gebracht werden, so daß sie unter der Einwirkung eines Lichtstrahls

- 23 - . fluoreszieren

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fluoreszieren, daß ein fluides Medium, das diese Teilchen

enthält, durch eine transparente Strömungskammer (13) geführt wird, daß die Strömungskammer (13) mehreren querverlaufenden Lichtstrahlen an Stellen ausgesetzt wird, die in vorher bestimmten Abständen längs der Strömungskammer (13) ■ angeordnet sind, um von den Teilchen als Reaktion auf jeden Lichtstrahl codierte Signale in Form von diskreten Fluoreszenz-Emissionen hervorzurufen, daß die codierten Signale unter Verwendung eines Umformers (17) gemessen werden, der für jedes codierte Signal Ausgangssignale erzeugt, daß die codierten Ausgangssignale für einzelne Teilchen decodiert werden, indem die Signale zusammengefaßt werden, um für jedes untersuchte Teilchen ein zusammengesetztes Ausgangssignal zu erzeugen, daß die Teilchen in Abhängigkeit von Unterschieden in dem zusammengesetzten Ausgangssignal klassifiziert werden, und daß die Teilchen in Abhängigkeit von der ausgewählten lTlaesifikation quantitativ tabellarisiert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die codierten Ausgangssignale um ein Zeitintervall verzögert werden, das proportional zu der relativen longitudinalen Lage des zugehörigen Lichtstrahls längs der Strömungskammer (13) ist.

11. Verfahren zur Unterscheidung zwischen diskreten Teilchen in einem fluiden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff in Kontakt gebracht werden, so daß sie unter dem Einfluß eines Lichtstrahls auf eine Weise fluoreszieren, die durch die Wellenlänge des Lichtes bestimmt wird, daß ein die Teilchen enthaltendes fluides Medium durch eine transparente Strömungskammer (i3) geführt wird, daß die Strömungskammer mehreren, querverlaufenden Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Wellenlänge an Stellen ausgesetzt wird, die längs der Strömungskammer (13) in vorher bestimmten Abständen angeordnet sind, um bei den Teilchen als Reaktion auf je-

- 24 - _dcn

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de» Lichtstrahl codierte Signale in Form von Fluoreszenz-Emissionen, die sich durch ihre Wellenlänge unterscheiden, hervorzurufen, daß die codierten Signale unter Verwendung eines Umformers (17) abgetrennt und gemessen werden, der für jedes codierte Signal Ausgangssignale erzeugt, daß die codierten Ausgangssignale für die einzelnen Teilchen decodiert werden, indem die Signale zur Erzeugung eines zusammengesetzten Ausgangssignals für jedes gemessene Teilchen zusammengefaßt werden, daß die Teilchen in Abhängigkeit von den Unterschieden in den zusammengesetzten Ausgangssiqnalen klassifiziert werden, und daß die Teilchen in Abhängigkeit von den ausgewählten riassifikation«»n quantitativ tabellarisiert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Wellenlänge gleichzeitig auf die Teilchen gerichtet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß Lichtstrahlen mit unterschiedlicher Wellenlänge nacheinander auf ,iedes der Teilchen gerichtet werden.

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