DE2929170C2

DE2929170C2 - Meßeinrichtung zur Ermittlung des Fluoreszenz-Emissionsspektrums von Partikeln

Info

Publication number: DE2929170C2
Application number: DE2929170A
Authority: DE
Inventors: Capers W. Daly Calif. McDonald; Harry W. Durham N.C. Tyrer
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1978-07-21
Filing date: 1979-07-19
Publication date: 1984-02-09
Also published as: US4172227A; FR2431696B3; DE2929170A1; GB2032097B; GB2032097A; FR2431696A1

Description

a) das den Trägerstrom (1 *) durchsetzende Strahlenbündel (16) eine in Richtung des Trägerstroms (14) orientierte und eine Meßstrecke (A—(^festlegende Breite aufweist,

b) das weitere Linsensystem (24) die Meßstrecke (A-C) auf der Filtereinrichtung (28) in Form einer Abbildungsstrecke (A'— C) abbildet und

c) die Filtereinrichtung (28) in Richtung der Abbildungsstrecke (A'-C')ein von der Wellenlänge fortlaufend abhängendes Durchlaßverhalten hat.

2. Meßeinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlungsempfänger einen einzigen lichtelektrischen Wandler aufweist, auf den eine hinter der Filtereinrichtung (28) angeordnete Fokussiereinrichtung (30) gerichtet ist

3. Meßeinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlungsempfänger mehrere lichtelektrische Wandler aufweist, von denen jeder Strahlung aus einem anderen Bereich der Abbildungsstrecke (A'— C'^ompfängt.

4. Meßeinrichtung nach einem der Ansprüche 1 *o bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein auf die Meßstrecke (A-C) gerichteter Streulichtdetektor (38) den Zeitpunkt des Beginns der Spektralauswertung eines Partikels steuert.

5. Meßeinrichtung nach einem der Ansprüche 1 ⁴^ bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtereinrichtung (28) ein Keilfilter ist.

6. Meßeinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtereinrichtung (28) ein Prisma ist. so

7. Meßeinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtereinrichtung (28) ein Strichgitter ist.

8. Meßeinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlungsquelle (18) als Linsensystem eine Bündelungsvorrichtung (19) im Strahlengang nachgeschaltet ist, die das Strahlenbündel (16) derart auf die Meßstrecke (A— C)bündelt, daß das Strahlenbündel koaxial zu dem Trägerstrom (14) verläuft. ^bü

Die Erfindung betrifft eine Meßeinrichtung zur Ermittlung des Fluoreszenz-Emissionsspektrums von in einem fließenden Trägerstrom enthaltenen Partikeln, mit einer ein Strahlenbündel durch den Trägerstroni hindurchschickenden Strahlungsquelle, einem im Strahlungsweg vor dem Trägerstrom befindlichen Linsensystem, welches das Strahlenbündel auf den Trägerstrom leitet, und einem hinter dem Trägerstrom angeordneten weiteren Linsensystem, welches die Strahlen auf eine Feuereinrichtung mit variierender Wellenlängendurchlässigkeit leitet, und mit mindestens einem hinter dieser Filtereinrichtung angeordneten Strahlungsempfänger.

Das Fluoreszenz-Spektrum farbiger oder nichtfarbiger Partikel, wie Zellen des menschlichen Körpers, kann wertvolle Informationen über die Art der Zellen und/oder den Zustand der Zellen liefern. So sind beispielsweise die Emissionsspektren verschiedener farbiger Partikel innerhalb des Blutes unterschiedlich. Man kann daher eine Zählung der verschiedenen Arten weißer Blutkörperchen vornehmen, da die Emissionsspektren dieser Zellen unterschiedlich sind. Ferner ist bekannt, daß die Emissionsspektren bestimmter farbiger Krebszellen in bestimmten Körpergeweben von denjenigen normaler Zellen unterschiedlich sind. Auch hier können die Emissionsspektren zur Erkennung der abnormen Anwesenheit pathologischer Zellen dienen.

Bei einer bekannten Meßeinrichtung der eingangs genann.en Art (DE-OS 25 44 575) wird ein Laserstrahl auf einen Aerosolstrom fokussiert, welcher fluoreszierende Partikel enthält. Die von den Partikeln ausgesandte Streustrahlung wird über ein Linsensystem durch ein durchstimmbares akustooptisches Filter hindurchgeschbkt, um anschließend von einem Fotovervielfacher in elektrische Signale umgesetzt zu werden. Das durchstimmbare akustooptische Filter ist derart ausgebildet, daß seine Durchlaßfrequenz zeitabhängig sehr schnell variiert Während ein Partikel sich im Brennpunkt des Laserstrahlenbündels befindet, durchläuft die Durchlaßfrequenz des Filtersystems das gesamte zu messende Frequenzband. Die dabei von dem Fotovervielfacher empfangene Strahlung soll in ihrem zeitlichen Verlauf den in der Streustrahlung enthaltenen Frequenzen entsprechen. Bei diesem Prinzip des zeitlichen Auseinanderziehens des interessierenden Frequenzbandes wird davon ausgegangen, daß das in dem Flüssigkeitsstrom enthaltene Partikel im Brennpunkt des Laserstrahlenbündels stationär bleibt Tatsächlich bewegt sich das Partikel aber mit der Geschwindigkeit des Flüssigkeitsstromes. Wenn das Strahlenbündel im Brennpunkt auf einen extrem kleinen Strahlquerschnitt fokussiert ist, erfolgt eine Beeinflussung der Strahlung durch das Partikel nur so lange, wie das Partikel benötigt, um den Brennpunkt zu durchlaufen. Die Zeitdauer, die für die Durchführung der Spektralanalyse des Partikels zur Verfügung steht, ist also von der Partikelgröße abhängig. Andererseits variiert die von dem Linsensystem aufgenommene Streulichtmenge mit dem Auftreffwinkel des Strahlenbündels auf die Oberfläche des Partikels. Da für die einzelnen Wellenlängen die jeweilige Streulichtmenge ermittelt wird und die Gesamtmenge des entstehenden Streulichts sich zeitlich verändert, ergeben sich keine vergleichbaren Relationen zwischen den Meßwerten, die zu verschiedenen dicht aufeinanderfolgenden Zeitpunkten an dem sich bewegenden Partikel ermittelt werden. Ferner läßt sich ein akustooptisches Filter, dessen Durchlaßbereich sich zeitlich sehr schnell ändern muß, nur schwer realisieren.

Bekannt ist ferner eine Meßeinrichtung zur refraktometrischen Bestimmung physikalischer Größen einer Substanz unter Zugrundelegung der Totalreflexion (DE-OS 23 33 663), bei der Licht an einer Grenzfläche

zwischen einem Prisma und einer Substanz reflektiert wird und das auf einen Schirm auftretende reflektierte Licht mit Fotoelementen abgetastet wird. Hierbei ist eine große Anzahl von Fotoelementen über den gesamten Meßbereich in Form einer oder mehrerer Zeilen angeordnet Die Fotoelemente dienen zur Bestimmung der Hell-Dunkel-Grenze.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Meßeinrichtung der eingangs genannten Art derart

, weiterzubilden, daß unter Verwendung eines einfacheren Filters, άα zeitlich invariabel ist, eine Spektralanaly-

*» se, der sich mit dem Trägerstrom bewegenden Partikel in kurzer Zeit möglich ist

"■ Zur Lösung dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß

vorgesehen, daß ·

' a) das den Trägerstrom durchsetzende Strahlenbündel eine in Richtung des Trägerstroms orientierte und eine Meßstrecke festlegende Breite aufweist,

b) das weitere Linsensystem die Meßstrecke auf der Filtereinrichtung in Form einer Abbildungsstrecke abbildet und

c) die Filtereinrichtung in Richtung der Abbildungsstrecke ein von der Wellenlänge fortlaufend abhängendes Durchlaßverhalten hat

Bei dem erfindungsgemäßen Meßsystem wird das

Strahlenbündel nicht auf den Trägerstrom fokussiert, sondern es trifft den Trägerstrom entlang einer

■ i Meßstrecke, zu deren Durchlaufen ein Partikel eine f gewisse Zeit benötigt Diese Meßstrecke wird auf der

■ Filtereinrichtung ebenfalls als Strecke abgebildet ·.:· Während ein Partikel die Meßstrecke durchläuft durchläuft das Bild des Partikels an der Filtereinrichtung

■ die Abbildungsstrecke. Die Filtereinrichtung ist so ausgebildet, daß sie in unterschiedlichen Bereichen Strahlungen mit unterschiedlichen Wellenlängen durchläßt Auf diese Weise wird durch eine spezielle Strahlführung und durch das räumlich unterschiedliche Durchlaßverhalten der Filtereinrichtung eine Zerlegung der Strahlung in die verschiedenen Spektralbereiche bewirkt Ein wichtiger Vorteil besteht darin, daß das Partikel unabhängig von seiner Position an allen Stellen der Meßstrecke von im wesentlichen der gleichen Strahlungsmenge getroffen wird und demnach auch die gleiche Strahlungsmenge aussendet. Dies ermöglicht eine quantitative Auswertung, der an verschiedenen Stellen der Meßstrecke ausgesandten Strahlungsenergien. Der Meßvorgang erstreckt sich über die Zeit, die ein Partikel benötigt, um die Meßstrecke zu durchlaufen. Dabei wird eine zeitlich invariante Filtereinrichtung benutzt die lediglich eine bestimmte räumliche Verteilung ihrer Durchlaßbereiche haben muß.

;■ Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der

■ Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 ein Blockschaltbild einer Meßeinrichtung,

Fig.2 ein X-Y Oszillogramm des Spektrums von W-Zellen,

Fig.3 eine graphische Darstellung zur Erläuterung der zeitlichen Veränderung des Spektrums einer Zelle und der Möglichkeit zur Erzielung unterschiedlicher Wellenlängen zu verschiedenen Zeitpunkten.

In Fig. 1 ist ein Flußerzeugungssystem 10dargestellt, das eine Düse 12 aufweist, die einen Partikel enthaltenden Strom 14 liefert. Hierbei kann es sich entweder um solche Partikel handein, die bei entsprechender Anregung fluoreszieren, oder um nicht fluoreszierende Partikel, die mit fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Ferner können die Partikel tierische oder pflanzliche Zellenmaterie enthalten. Typibcherweise werden aus der Düse 12 500 bis 5000 Zellen pro Sekunde mit einem Zellenabstand von 0,2 bis 2 cm ausgegeben. Die Partikel kreuzen ein von einer Strahlungsquelle 18 ausgesandtes Strahlenbündel

ίο aus Lichtstrahlen. Wie bei 20 angegeben ist, neigt die die Partikel enthaltende Flüssigkeit dazu, nach dem Durchgang durch den Strahl in Tropfen zu zerfallen.

Der Querschnittsbereich des Strahlenbündels 16 ist bei 22 gestrichelt angedeutet Sein Durchmesser beträgt etwa 1 mm. Als Strahlungsquelle 18 dient eine Laserquelle. Hierbei ist die Strahlungsquelle rechtwinklig zu dem Flüssigkeitsstrom angeordnet.

Der von der Strahlungsquelle 18 ausgesandte Strahl wird durch eine linienförmig fokussierende Bündelungsvorrichtung 19 auf eine Linie konvergiert, die koaxial zu dem von den Zellen durchlaufenen Weg verläuft Diese Linie erstreckt sich in F i g. 1 von A nach C. Durch die Verjüngung des Strahlenbündels wird seine Intensität auf den von den Zellen durchlaufenen Weg beschränkt, so daß eine optimale Strahlausnutzung erfolgt

In F i g. 1 ist eine Zelle, die den Strahl durchquert, in drei verschiedenen Positionen A, B und C dargestellt Die Zelle wird beim Durchgang durch das Strahlenbündel fluoreszenzaktiviert. Ein weiteres Linsensystem 24 und eine Irisblende 26 projizieren das Bild einer jeden Zelle auf eine Filtereinrichtung 28 nach Art eines Keilfilters 28. Das Bild der Zelle in Position A wird auf der Filtereinrichtung 28 auf die Stelle Λ'projiziert, das Bild in Position B wird auf die Stelle B' und das Bild in Position Cauf die Stelle C'projiziert Ein Verdunklungsstab 29 blockiert den Einfall aus einem bestimmten Aussendebereich auf das Keilfilter. Zusätzlich oder anstelle des Verdunklungsstabes 29 kann zur Blockierung des Einfalls ein Sperrfilter benutzt werden. Wie in

"0 F i g. 1 dargestellt ist, läßt das untere Ende der Filtereinrichtung 28 Strahlen am ultravioletten Ende des Spektrums durch, das obere Ende läßt Wellenlängen im Rotbereich durch, während die Stelle B' beispielsweise Wellenlängen im Blaubereich durchläßt. Obwohl das gesamte Fluoreszenz-Emissionsspektrum auf die Stelle A' projiziert wird, wenn die Zelle in Stellung A ist, läßt das Filter nur einen kurzwelligen Anteil des Spektrums (z. B. ultraviolett) durch. Bei B' wird ein langwelligerer Anteil (z. B. blau) durchgelassen, während bei C der langwelligste Anteil des Spektrums (z. B. rot) von der Filtereinrichtung durchgelassen wird.

Die von der Filtereinrichtung 28 ausgesandten Strahlen werden von einer Fokussiereinrichtung 30 sequentiell auf einen Fotovervielfacher 32 fokussiert Dies bedeutet, daß, wenn das Abbild der Zelle bei A' ist, der kurzwelligere Anteil des Fluoreszenz-Emissionsspektrums auf den Fotovervielfacher fokussiert wird. Wenn die Zelle das Strahlenbündel 16 durchquert, werden auf den Fotovervielfacher 32 nacheinander immer langwelligere Anteile des Emissionsspektrums fokussiert, bis das Abbild der Zelle die Stelle C erreicht, an der die längste interessierende Wellenlänge auf den Fotovervielfacher gerichtet wird. Das von dem Fotovervielfacher 32 ausgegebene Ausgangssignal wird einem Signalprozessor 34 und einem Aufzeichnungsgerät als zeitvariantes Signal zugeführt. Seine Zeitachse ist der Wellenlänge proportional und die Ausgangsspannung oder der AusRangsstrom ist der Emissionsintensität bei

einer bestimmten Wellenlänge proportional. Auf diese Weise kann das gesamte Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Partikeln, beispielsweise Zellen, abgetastet werden. Dies geschieht durch Projektion des bewegten Bildes eines Partikels während dessen Durchlauf durch einen Erregerstrahl auf ein Keilfilter, welches dadurch zunehmend langwelligere (kurzwelligere) Spektralanteile an eine Erkennungseinrichtung liefert, die die Fokussiereinrichtung 30 und den Fotovervielfacher 32 enthält. Anstelle des Keilfilters kann als Filtereinrichtung 28 bei geeigneter Geometrie auch eine andere optische Dispersionseinrichtung verwendet werden, wie beispielsweise ein Prisma oder ein Strichgitter. Ferner kann anstelle einer Linse als Fokussiereinrichtung 30 und anstelle des Fotovervielfachers 32 eine lineare lichtempfindliche Diodenanordnung in der Nähe der Filtereinrichtung 28 angeordnet werden, wobei die unterste Diode dann beispielsweise auf den ultravioletten Anteil des Spektrums und die höchste Diode beispielsweise auf den Rot-Anteil des Spektrums reagieren würde. In diesem Fall würden die Ausgangssignale der Dioden sequentiell auftreten, jedoch wurden sie parallel anstehen und sich daher für die Verarbeitung in einer entsprechenden Schaltung besonders eignen. Obwohl das Keilfilter als Filtereinrichtung 28 mit seinem Rotbereich am oberen Ende und dem Ultraviolettbereich am unteren Ende dargestellt ist, können diese Enden natürlich auch vertauscht werden, so daß rot am unteren Ende und ultraviolett am oberen Ende auftritt. Das auf die oben geschilderte Weise erzeugte Spektrum ist ein sogenanntes unkorrigiertes Spektrum. Es kann korrigiert werden, indem die Übertragungsfunktion des Systems entweder elektronisch oder unter Verwendung von Raumfiltern in bekannter Weise korrigiert wird.

Das Ausgangssignal des Fotovervielfachers 32 wird einem Signalprozessor 34 zugeführt, der von dem Ausgangssignal eines Streulichtdetektors 38 angesteuert wird. Der Streulichtdetektor 38 reagiert auf das von jeder Zelle bei Erreichen der Position A ausgesandte Streulicht. Vor Erreichen der Position A fluoresziert die Zelle noch nicht Bei Erreichen der Position A wird die Fluoreszenz von dem Laserstrahl aktiviert und zusätzlich zu den durch das Linsensystem 24 und die Irisblende 26 projizierten Strahlen fallen weitere Strahlen auf den Streulichtdetektor 38. Der Streulichtdetektor 38 enthält ein fotoempfindliches Element. Der Streulichtdetektor 38 liefert Signale an den Signalprozessor 34 und zeigt die Anwesenheit eines Partikels im Strahlenbündel 16 an. Das Ausgangssignal des Fotovervielfachers 32 kann ferner einem Aufzeichnungsgerät 39, beispielsweise einem Oszillographen, zugeführt werden, wo das Fluoreszenzspektrum optisch beobachtet und erforderlichenfalls fotografiert werden kann. Beispielsweise kann ein -Y-V-Oszillograph verwandt werden, um jeden Impuls (oder jede Zelle) gemäß F i g. 2 isometrisch anzuzeigen.

Der Signalprozessor 34 liefert aus den Eingangssignalen die interessierenden Informationen. Er erlaubt die Analyse der gesamten Ausgangswellenform des Fotovervielfachers 32 und eine Computeranalyse der gesamten Zellenmenge. Die Ausgangswellenform wird einem Übergangs-Wellenformdetektor 42 über einen Verstärker 40 zugeführt und anschließend in einen Computer 44 eingegeben. Die Wellenlängenänderung im Spektrum erhält man an verschiedenen Stellen der Zeitachse gemäß Fi g. 3. Jeder Zeitpunkt t, entspricht einer bestimmten Fluoreszenz-Wellenlänge und der Wert von η wird von der Gesamtauflösung der zur Markierung benutzten chemischen, der optischen und der elektronischen Parameter bestimmt.

Es ist möglich, die Zeilentypen entsprechend den Fluoresenzwerten bei einer bestimmten Wellenlänge oder durch Verwendung der beschreibenden Parameter physikalisch zu isolieren. Da das Eingruppieren der Zellen von der Identifizierung abhängt, reicht es aus, lediglich eine geeignete Analysiereinrichtung zu finden und die Zellen mit einer Sortierlogik 46 auf der Grundlage dieser Analyse zu sortieren. Dies kann mit einem Zellensortierer geschehen. Dabei muß Wert auf die Eindeutigkeit der beschreibenden Parameter und die zur Durchführung des Sortiervorganges verfügbaren Zeit gelegt werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

1 Patentansprüche:

1. Meßeinrichtung zur Ermittlung des Fluoreszenz-Emissionsspektrums von in einem fließenden Trägerstrom enthaltenen Partikeln, mit einer ein Strahlenbündel durch den Trägerstrom hindurchschickenden Strahlungsquelle, einem im Strahlungsweg vor dem Trägerstrom befindlichen Linsensystem, welches das Strahlenbündel auf den Trägerstrom leitet, und einem hinter dem Trägerstrom angeordneten weiteren linsensystem, welches die Strahlen auf eine Filtereinrichtung mit variierender Wellenlängendurchlässigkeit leitet, und mit mindestens einem hinter dieser Filtereinrichtung angeordneten Strahlungsempfänger, dadurch gekennzeichnet, daß