DE69422908T2 - Optische vorrichtung fuer durchflusszytometer - Google Patents

Optische vorrichtung fuer durchflusszytometer

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine optische Vorrichtung bzw. Anordnung für Durchflußzytometer.
  • Ein Durchflußzytometer ist ein Gerät zur Messung der Fluoreszenz und Lichtstreuung einzelner biologischer Zellen und anderer Arten mikroskopischer Teilchen. Im Durchflußzytometer werden die Zellen mittels einer laminaren Wasserströmung durch den Brennpunkt einer Lichtquelle hoher Intensität geführt. Normalerweise sind die Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der sich spezifisch an einen speziellen Zellbestandteil anlagert. Damit emittiert jede den Brennpunkt durchlaufende Zelle einen kurzen Fluoreszenz- und Streulichtimpuls. Die Intensität der Fluoreszenz ist proportional zum Zellgehalt des Fluoreszenzfarbstoffs und damit zum Zellgehalt des markierten Bestandteils. Die Intensität des Streulichts und seine Winkelverteilung ist eine komplexe Funktion der Größe, Form, Struktur und chemischen Zusammensetzung der Zelle. Durch Messen der Lichtstreuung mit kleinen bzw. großen Streuwinkeln mittels getrennter Detektoren lassen sich somit Zellen auf der Grundlage von Größe, Form und Struktur unterscheiden.
  • Für einige Zwecke können die Zellen durch zwei oder drei unterschiedliche Farbstoffe markiert sein, die sich an unterschiedlichen Zellbestandteilen anlagern und mit unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren. Die entsprechenden Spektralkomponenten der Fluoreszenz lassen sich durch dichroitische Spiegel und Bandfilter trennen und durch getrennte Detektoren messen. Folglich kann jede Zelle mehrere Signale erzeugen: normalerweise zwei Lichtstreusignale - Streuung mit kleinem und großem Winkel- sowie zwei oder drei Fluoreszenzsignale. Diese Technik ist gut bekannt und wurde in zahlreichen Beiträgen publiziert, z. B. in "Flow cytometry and sort ing" Melamed, M. R.; Lindmo, T.; Mendelsohn, M. L., Hrsg.), Wiley-Liss, New York 1990.
  • Der Zellgehalt des (der) zu messenden Bestandteils (Bestandteile) kann recht klein sein, das heißt nur etwa 1 · 10&supmin;¹&sup8; g/Zelle. Entsprechend hoch sind die Anforderungen an die Empfindlichkeit des Geräts. Um eine solche Empfindlichkeit zu erreichen, muß das Anregungslicht in einem sehr kleinen und entsprechend intensiven Brennpunkt konzentriert sein. Ferner muß die Optik, die die Fluoreszenz und das Streulicht empfängt, die höchstmögliche numerische Apertur haben. Entscheidend ist auch, daß jegliches Licht aus anderen Quellen als den Zellen, z. B. - der Hintergrund infolge von Fluoreszenz und Lichtstreuung von der Optik und anderen Komponenten im optischen Weg, möglichst gering ist.
  • Es gibt zwei Hauptarten von Durchflußzytometern: a) Geräte unter Verwendung eines Lasers als Quelle für Anregungslicht und b) Geräte unter Verwendung einer Hochdruck-Bogenlampe mit Xenon oder Quecksilber. Die laserbasierten Geräte haben den Vorteil, daß das Anregungslicht in einem sehr kleinen und entsprechend intensiven Brennpunkt fokussiert werden kann. Außerdem ist der Anregungslichtstrahl nahezu parallel, was die Unterscheidung von Licht vereinfacht, das in unterschiedlichen Winkeln gestreut wird. Geräte auf Bogenlampenbasis haben den Vorteil, daß das Sektrum der Lichtquelle alle Wellenlängen von UV durch das sichtbare Spektrum enthält. Dadurch kann mittels geeigneter Filter die richtigen Wellenlänge zur Anregung jedes Fluoreszenzfarbstoffs ausgewählt werden, was diese Art von Geräten vielseitiger macht.
  • Alle laserbasierten Durchflußzytometer haben im wesentlichen die gleiche optische Konfiguration, d. h. so, daß der senkrechte Probenstrom den Brennpunkt eines waagerechten Laserstrahls durchschneidet, und so, daß dieser Brennpunkt in einem 90º-Winkel von der optischen Achse der Optik geschnitten wird, die die Fluoreszenz und das in großen Winkeln, d. h. rund 90º, gestreute Licht auffängt. Hinter der Lichtempfangsopzik werden Fluoreszenz und Streulicht durch einen dichroitischen Siegel getrennt und zu gesonderten Lichtde tektoren geleitet. Die Fluoreszenz läßt sich in unterschiedliche Spektralkomponenten durch zusätzliche dichroitische Spiegel weiter aufteilen und durch getrennte Detektoren messen.
  • Das Licht des fokussierten Laserstrahls ist nahezu parallel, d. h., es fällt in einen Lichtkegel von höchstens etwa 2º. Somit wird die Lichtstreuung mit kleinen Streuwinkeln durch eine andere Linse gemessen, deren optische Achse mit dem Laserstrahl zusammenfällt. Daß der Laserstrahl in die Linse eintritt, wird mit einer vor der Linse befindlichen Feldblende verhindert.
  • Einige laserbasierte Durchflußzytometer nutzen zwei Laser, die mit unterschiedlichen Wellenlängen emittieren und auf getrennte Brennpunkte fokussiert sind, so daß die Zellen nacheinander mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden. Dadurch lassen sich zwei unterschiedliche Farbstoffe messen, die nicht durch die gleiche Wellenlänge angeregt werden können oder in einer Weise interferieren, die mit der Messung unverträglich ist. Eine solche "Zwei-Brennpunkt-Anregung" hat zahlreiche interessante biologische Anwendungen.
  • Alle Durchflußzytometer auf Bogenlampenbasis verwenden Auflichtbeleuchrung, was bedeutet, daß die Optik, die das Licht im Anregungsbrennpunkt konzentriert, auch die Fluoreszenz empfängt. Um die höchstmögliche Anregungsintensität sowie den optimalen Wirkungsgrad für den Fluoreszenzempfang zu erreichen, sollte diese Optik die höchstmögliche numerische Apertur (NA) haben. Daher wird eine Mikroskoplinse mit Ölkapselung und einer NA von etwa 1,3 für diesen Zweck genutzt.
  • Der große Feldwinkel des Beleuchtungsfelds einer solchen Linse macht es unmöglich, die Lichtstreuung mit kleinen und großen Streuwinkeln durch die gleiche Art von optischer Konfiguration zu unterscheiden, die in den laserbasierten Geräten verwendet wird. Die NO-A-145176 und 156917 sowie die US- A-4408877 und 4915501 offenbaren, wie Lichtstreuung in der optischen Konfiguration mit Auflichtbeleuchtung gemessen werden kann, die in bogenlampenbasierten Geräten zum Einsatz kommt. Mit Hilfe einer mittleren Feldblende nahe der hinteren Brennebene dieser Linse wird ein Dunkelfeld erzeugt, das eine Messung von Lichtstreuung mit sowohl kleinen als auch großen Streuwinkeln durch eine zweite Mikroskoplinse erlaubt, die gegenüber der ersten angeordnet ist, wobei ihre Apertur innerhalb des Dunkelfelds liegt, das durch die Feldblende in der ersten Linse erzeugt wird.
  • Jedoch hat diese Konfiguration bestimmte Mängel. So erlaubt sie die Messung der Lichtstreuung mit großen Winkeln nur innerhalb einer sehr kleinen Apertur, d. h. NA ≥ 0,04. Diese kleine Apertur begrenzt die Meßempfindlichkeit dieses Parameters. Zudem hat bei dieser Konfiguration der "Großwinkel"-Bereich eine Untergrenze, die etwa 20º nicht übersteigt.
  • Ein weiterer Nachteil der Auflichtbeleuchtungskonfiguration derzeitiger bogenlampenbasierter Durchflußzytometer besteht darin, daß die keine Anregung in zwei getrennten Brennpunkten unterschiedlicher Wellenlänge erlaubt, also den Anwendungsbereich solcher Geräte in gewissem Maß einschränkt. Die Auflichtbeleuchtung bedeutet auch, daß die Optik, die die Fluoreszenz empfängt, d. h. das Mikroskopobjektiv, sehr hohen Anregungslichtintensitäten ausgesetzt ist. Auch mit Mikroskopobjektiven der allerbesten Qualität bewirkt dies eine gewisse Fluoreszenz von den Elementen des Objektivs, die sich zum Hintergrund addiert, vor dem die Zellfluoreszenz detektiert wird, und damit das Signal-Rausch-Verhältnis senkt, was einer Verringerung der Empfindlichkeit gleichkommt.
  • Bei der Erfindung handelt es sich um eine neue optische Konfiguration, die einige der genannten Beschränkungen derzeitiger Gestaltungen bogenlampenbasierter Durchflußzytometer beseitigt. Somit erleichtert die Erfindung Lichtstreuungsmessungen bei großen Winkeln mit erheblich höheren Streuwinkeln und mit einer viel höheren numerischen Apertur, als dies bei bisherigen Konfigurationen erreichbar war, die im genannten veröffentlichten Beitrag "Flow cytometry and sorting" beschrieben sind. Gegenüber derzeitigen Gestaltungen ist die Lichtstreuintensität somit stark erhöht. Außerdem erzeugt sie weniger Hintergrundlicht im Fluoreszenzlichtweg und erlaubt eine "Zwei-Brennpunkt-Anregung".
  • Der Stand der Technik ist außerdem in der US-A-5162863 offenbart, die ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe durch optische Detektion von Antikörper/- Antigen-sensibilisierten Trägern beschreibt, sowie in der WO- A-8700628, die eine Vorrichtung zum Messen der Lichtstreuung biologischer Zellen in Durchflußzytometern offenbart.
  • Insbesondere stellt die Erfindung eine optische Anordnung für Durchflußzytometer bereit, wobei intensives Licht durch ein erstes Mikroskopobjektiv oder eine ähnliche Linse mit einer numerischen Apertur NAi auf einen Zellenstrom fokussiert wird, der durch eine laminare Wasserströmung durch die Brennpunktsebene des ersten Objektivs geführt wird; und wobei sich ein zweites Mikroskopobjektiv gegenüber dem ersten Objektiv befindet, wobei seine optische Achse und Objektebene mit denen des ersten Objektivs zusammenfallen, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mikroskopobjektiv eine numerische Apertur NAo hat, die wesentlich größer als die des ersten Objektivs ist; daß das zweite Objektiv eine kreisförmige mittlere Feldblende in seiner sekundären Brennpunktsebene oder in deren Nähe enthält, wobei die Feldblende einen Durchmesser hat, der einer numerischen Apertur NAdf entspricht, die etwas größer als NAi ist, während sie wesentlich kleiner als NAo ist, so daß das Beleuchtungsfeld des ersten Objektivs vollständig in die Feldblende fällt und so daß folglich das durch das zweite Objektiv erzeugte Bild des Zellenstrom nur Fluoreszenz und Streulicht vom Zellenstrom enthält; daß die Fluoreszenz und das Streulicht vom Zellenstrom durch einen dichroitischen Spiegel auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Wellenlänge getrennt werden, so daß das Streu- und Fluoreszenzlicht zu getrennten Bildern des Zellenstroms in einer getrennten ersten bzw. zweiten Bildebene des zweiten Objektivs führen; und daß ein unmittelbar hinter der ersten Bildebene befindliches Teleskop ein Bild der Feldblende in einer dritten Bildebene erzeugt, an der zwei konzentrische Spiegel mit unterschiedlichem Durchmesser angeordnet sind, wobei die konzentrischen Spiegel vom Zellenstrom in unterschiedlichen Streuwinkeln gestreutes Licht trennen und das Streulicht mit unterschiedlichen Streuwinkeln zu getrennten Lichtdetektoren richten, und daß die Spiegel in der dritten Bildebene flache Ebenen mit polierten Enden sind, die aus zwei konzentrischen Rohren in einem Winkel von 45º relativ zu ihrer gemeinsamen Achse, aber von 90º relativ zueinander abgeschnitten sind, wobei ihre gemeinsame Achse mit der optischen Achse des Teleskops zusammenfällt.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung fällt der Zellenstrom mit der Objektebene des ersten und zweiten Objektivs zusammen, und der Zellenstrom wird durch das erste Objektiv in einem oder zwei benachbarten Brennpunkten mit unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet, die durch zwei getrennte Lichtquellen emittiert werden.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung können ein erster und zweiter Schlitz das Bild jedes der benachbarten Brennpunkte von den Lichtquellen in der Objektebene abdecken, so daß hinter dem ersten Schlitz gemessene Fluoreszenz nur von einem der Brennpunkte ausgeht, während hinter dem zweiten Schlitz gemessene Fluoreszenz nur vom anderen der Brennpunkte ausgeht.
  • Im folgenden soll die Erfindung anhand einer bevorzugten, nicht einschränkenden Ausführungsform der Erfindung beschrieben werden.
  • Fig. 1 zeigt die optische Anordnung für Durchflußzytometer gemäß der Erfindung.
  • Fig. 2 zeigt ein näheres, durch ein Teleskop erzeugtes Bild gemäß der Erfindung.
  • Fig. 3 zeigt eine konzentrische Spiegelausführungsform gemäß der Erfindung.
  • Bei der schematisch in Fig. 1, 2 und 3 gezeigten Erfindung handelt es sich um eine Vorrichtung, die eine Lichtquelle 1 enthält, die durch eine Linse 2 einen Anregungsschlitz 3 beleuchtet, der sich in der Bildebene 4 eines Mikroskopobjektivs oder einer ähnlichen Linse 5 befindet, die das Anregungslicht von der Lichtquelle 1 in einem Anregungsbrennpunkt 6 in der Objektebene 7 des Objektivs 5 konzentriert. Ein Interferenzbandfilter 8 befindet sich im Lichtweg hinter dem Objektiv 5, um die geeignete Anregungswellenlänge zu isolieren.
  • Außerdem kann die Vorrichtung eine sekundäre Lichtquelle 9 aufweisen, die durch eine Linse 10 einen Anregungsschlitz 11 beleuchtet. Ein Bild dieses Schlitzes 11 wird durch die Linse 5 in der Bildebene 7 über einen dichroitischen Spiegel 12 erzeugt. Ein Interferenzfilter 13 isoliert ein Anregungswellenlängenband, das vorzugsweise nicht das des Bandfilters 8 überlappt. Die Anregungsschlitze 3 und 11 sind so angeordnet, daß sich ihre Bilder in der Objektebene 7 nicht überlappen, aber auf jeder Seite der optischen Achse 14 der Linse 5 eng benachbart sind.
  • Der zumessende Zellen oder andere mikroskopische Teilchen enthaltende Probenstrom wird durch die Meßkammer 15 in der Objektebene 7 durch die optische Achse 14 der Linse 5 geleitet.
  • Ein weiteres Mikroskopobjektiv 16, vorzugsweise vom Ölkapseltyp mit einer numerischen Apertur von etwa NA = 1,3, befindet sich gegenüber der Linse 5, so daß bei den beiden Objektiven 5 und 16 ihre jeweilige optische Achse 14 und jeweilige Objektebene 7 zusammenfallen.
  • Innerhalb des Objektivs 16 befindet sich eine mittlere, kreisförmige Feldblende 17, deren Mitte in der optischen Achse 14 und in einer Ebene liegt, die nahe der hinteren Brennebene des Objektivs 16 liegt. Die Feldblende 17 bedeckt den Mittelteil der Apertur des Objektivs 16, wodurch sie Licht unterbricht, das in einen Raumwinkels fällt, der einer numerischen Apertur NAdf entspricht, die nur etwas größer als die numerische Apertur NAi der Linse 5 ist. Dadurch wird auf die Objektebene 7 durch die Linse 5 fokussiertes Anregungslicht nicht durch das Objektiv 16 durchgelassen. Somit enthält das durch das Objektiv 16 empfangene Licht nur Fluoreszenz und Streulicht vom Probenstrom durch die Meßkammer 15. Hinter dem Objektiv 16 befindet sich ein dichroitischer Spiegel 18 mit einer charakteristischen Wellenlänge, so daß das Streulicht reflektiert wird, um ein Bild des Probenstroms in einer ersten Bildebene 19 des Objektivs 16 zu erzeugen, während die Fluoreszenz durchgelassen wird, um ein entsprechendes Bild in einer zweiten Bildebene 20 des Objektivs 16 zu erzeugen.
  • Hinter der ersten Bildebene 19 befindet sich ein Teleskop 21, das gemäß Fig. 2 ein Bild der die Feldblende 17 enthaltenden Ebene in einer dritten Bildebene 23 erzeugt. Außerhalb des Dunkelfelds 22, das das Bild der Feldblende 17 ist, befindet sich von Zellen im Probenstrom gestreutes Licht. Verständlich ist, daß Licht, das in einen bestimmten Abstand r von der Mitte des Bilds in der dritten Bildebene 23 fällt, mit Streuwinkeln emittiert wird, die einen bestimmten Grenzwert α&sub1; (Gleichung 1) übersteigen und unter einem oberen Grenzwert α&sub2; (Gleichung 2) liegen.
  • α&sub1; arcsin [(r/ro) (NAdf/n)] - arcsin (NAi/n) (1),
  • α&sub2; arcsin [(NAo + NAi)/n] (2),
  • worin n die Brechzahl des Probenstroms, gewöhnlich Wasser, und ro der Radius des Bilds 22 der Feldblende 17 in der Bestimmung durch die Vergrößerung des Teleskops 21 sind.
  • Deutlich ist, daß der kleinste Streuwinkel, der in der dritten Bildebene 23 detektiert werden kann, d. h. am Umfang des Bilds 22 der Feldblende 17, wo r = ro ist, gegeben ist durch:
  • α&sub1;(min) arcsin (NAdf/n) - arcsin (NAi/n) (3).
  • Der größte Streuwinkel, der detektiert werden kann, d. h. am Außenumfang des Bilds (Fig. 2) in der dritten Bildebene 23, wo:
  • r = r(max) = ro(NAo/NAdf) (4)
  • gilt, ist gegeben durch:
  • α&sub1;(max) = arcsin(NAo/n) - arcsin(NAi/n) (5).
  • Aus der Theorie der Lichtstreuung von mikroskopischen Teilchen sowie aus experimentellen Daten zu dieser Erscheinung geht hervor, daß die Intensität des Streulichts mit zunehmendem Streuwinkel über den gesamten Bereich von 0 bis etwa 60º schnell abfällt. Somit wird ein Lichtstreusignal, das über einen bestimmten Bereich von Streuwinkeln empfangen wird, stark von Streuung aus Winkeln nahe der Untergrenze dieses Bereichs dominiert. Folglich stellt ein Lichtstreusignal, das knapp außerhalb des Umfangs des Bilds 22 der Feld blende 17 empfangen wird, kleine Streuwinkel in guter Näherung dar, d. h. Winkel knapp über α&sub1;(min); während nahe dem Außenumfang empfangenes Licht nur Licht aus großen Streuwinkeln enthält, d. h. von etwa α&sub1;(max) aufwärts.
  • Ein geeigneter Wert für NAi beträgt 0, 60, während, NAdf = 0,62 und NAo = 1,3 sind. Gemäß Gleichung (3) und (5) ergeben diese Werte: α&sub1;(min) = 0,97º sowie α&sub1;(max) 51º.
  • Die beiden Lichtstreukomponenten, die kleine bzw. große Streuwinkel darstellen, werden zu getrennten Lichtdetektoren mittels zweier konzentrischer Spiegel 24 und 25 (Fig. 3) geführt, die durch die ebenen, polierten Vorderflächen zweier zylindrischer Rohre gebildet sind, die 45º zu ihrer Achse abgeschnitten und die mit der optischen Achse des Teleskops 21 gleichachsig sind. Gemäß Fig. 3 weisen die Spiegel 24 und 25 in entgegengesetzte Richtungen. Das Innenrohr 26 hat einen Innendurchmesser, der gleich ro ist, während der Innendurchmesser des Außenrohrs 27 etwas kleiner als rmax ist. Bei beiden Spiegeln 24 und 25 liegt ihre Mitte in der dritten Bildebene 23. Das Außenrohr 27 hat eine Öffnung 28 in der Seite, die zum Spiegel 24 weist, so daß das durch den Spiegel 24 reflektierte Licht die Öffnung 28 und eine Linse 29 durchlaufen kann, um den Detektor 30 zu erreichen. Das vom Spiegel 25 reflektierte Licht wird durch eine Linse 31 zu einem Detektor 32 gerichtet.
  • Zwischen dem dichroitischen Spiegel 18 und der Bildebene 20 befindet sich ein weiterer dichroitischer Spiegel 33, der bestimmte Fluoreszenzwellenlängen, gewöhnlich kürzere Wellenlängen, so leitet, daß ein Bild vom Objektiv 16 in der Ebene 34 erzeugt wird, während Fluoreszenz anderer Wellenlängen, gewöhnlich längerer, durchgelassen wird, um ein Bild in der zweiten Bildebene 20 zu erzeugen. Somit hat die Vorrichtung drei getrennte Bildebenen 19, 20 und 24 für das Objektiv 16, wobei das gleiche Bild in drei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erzeugt wird. In jeder der Bildebenen 19, 20 und 24 befindet sich ein rechteckiger Schlitz, dessen Größe so variiert werden kann, daß sie der Bildgröße des beleuchteten Teils des Zellenstroms in der Durchflußkammer 15 entspricht, um Licht von anderen Teilen der Objektebene 7 zu eliminieren und dadurch Hintergrundlicht zu unterdrücken, das ansonsten das Signal-Rausch-Verhältnis der Lichtdetektion und damit die Empfindlichkeit reduziert.
  • Dichroitische Spiegel 38 und 39 sowie optische Bandfilter 40, 41, 42 und 43 befinden sich hinter den Schlitzen 36 und 37, um unterschiedliche Spektralkomponenten der Fluoreszenz zu trennen und diese Spektralkomponenten zu getrennten Detektoren 44, 45, 46 und 47 zu leiten.
  • Der dichroitische Spiegel 18 ist so ausgewählt, daß er das Streulicht, das reflektiert wird, von der Fluoreszenz trennt, die aufgrund ihrer längeren Wellenlänge durchgelassen wird. Der dichroitische Spiegel 33 trennt die Fluoreszenz in zwei unterschiedliche Spektralkomponenten, die jeweils durch die dichroitischen Spiegel 38 und 39 weiter getrennt werden. Somit kann die Vorrichtung vier unterschiedliche Fluoreszenzkomponenten messen. Dieses Verfahren zur Trennung unterschiedlicher Spektralkomponenten von Fluoreszenz ist aus der Literatur gut bekannt, z. B. aus "Flow cytometry and sorting", Melamed et al., Wiley-Liss, New York 1990. Selbstverständlich läßt sich die Anzahl von Fluoreszenzspektralkomponenten durch Zugabe weiterer dichroitischer Spiegel und Bandfilter weiter erhöhen.
  • Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist, daß sie sogenannte "Zwei-Brennpunkt-Anregung" erleichtert. Licht aus zwei getrennten Lichtquellen 1 und 9 wird durch unterschiedliche Bandpaßfilter 8 und 13 geführt, die zwei unterschiedliche Spektralbänder von Anregungslicht durchlassen. Die optischen Achsen dieser beiden Spektralbänder sind relativ zueinander etwas verschoben, so daß das Objektiv 5 zwei benachbarte Anregungsbrennpunkte in der Objektebene 7 erzeugt. Somit durchlaufen die Zellen nacheinander die beiden Anregungsbrennpunkte. Die Schlitze 36 und 37 sind so angeordnet, daß sie das Bild jedes der beiden Anregungsbrennpunkte abdecken. Dadurch wird die von jedem der Anregungsbrennpunkte emittierte Fluoreszenz jeweils von der anderen getrennt und kann somit durch getrennte Detektoren gemessen werden.
  • Bei Verwendung einer solchen "Zwei-Brennpunkt-Anregung" kann einer der Fluoreszenzdetektoren, z. B. 44 oder 47, dazu dienen, das Streulicht von Zellen zu messen, die in jenem der Anregungsbrennpunkte angeregt werden, der die größte Anregungswellenlänge hat. Somit erleichtert die Erfindung die Messung von Streulicht mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen und kann dadurch weitere Informationen über die gemessenen Zellen liefern.

Claims (3)

1. Optische Anordnung für ein Durchflußzytometer, wobei intensives Licht durch ein erstes Mikroskopobjektiv oder eine ähnliche Linse (5) mit einer numerischen Apertur NAi auf einen Zellenstrom fokussiert wird, der durch eine laminare Wasserströmung durch die Brennpunktsebene (7) des ersten Objektivs (5) geführt wird; und wobei sich ein zweites Mikroskopobjektiv (16) gegenüber dem ersten Objektiv (5) befindet, wobei seine optische Achse (14) und Objektebene (7) mit denen des ersten Objektivs (5) zusammenfallen, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mikroskopobjektiv (16) eine numerische Apertur NAo hat, die wesentlich größer als die des ersten Objektivs (5) ist; daß das zweite Objektiv (16) eine kreisförmige mittlere Feldblende (17) in seiner sekundären Brennpunktsebene oder in deren Nähe aufweist, wobei die Feldblende (17) einen Durchmesser hat, der einer numerischen Apertur NAdf entspricht, die etwas größer als NAi ist, während sie wesentlich kleiner als NAo ist, so daß das Beleuchtungsfeld des ersten Objektivs (5) vollständig in die Feldblende (17) fällt und so daß folglich das durch das zweite Objektiv (16) erzeugte Bild des Zellenstrom nur Fluoreszenz und Streulicht vom Zellenstrom aufweist; daß die Fluoreszenz und das Streulicht vom Zellenstrom durch einen dichroitischen Spiegel (18) auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Wellenlänge getrennt werden, so daß das Streu- und Fluoreszenzlicht jeweils zu getrennten Bildern des Zellenstroms in einer getrennten ersten und zweiten Bildebene (19, 20) des zweiten Ob< ektivs (16) führen; und daß ein unmittelbar hinter der ersten Bildebene (19) befindliches Teleskop (21) ein Bild der Feldblende (17) in einer dritten Bil debene (23) erzeugt, an der zwei konzentrische Spiegel (24, 25) mit unterschiedlichem Durchmesser angeordnet sind, wobei die konzentrischen Spiegel vom Zellenstrom in unterschiedlichen Streuwinkeln gestreutes Licht trennen und das Streulicht mit unterschiedlichen Streuwinkeln zu getrennten Lichtdetektoren (30, 32) richten, und daß die Spiegel (24, 25) in der dritten Bildebene (23) flache Ebenen mit polierten Enden sind, die aus zwei konzentrischen Rohren (26, 27) in einem Winkel von 45º relativ zu ihrer gemeinsamen Achse, aber von 90º relativ zueinander abgeschnitten sind, wobei ihre gemeinsame Achse mit der optischen Achse (48) des Teleskops (21) zusammenfällt.
2. Anordnung nach Anspruch 1, wobei der Zellenstrom mit der Objektebene (7) des ersten und zweiten Objektivs (5; 16) zusammenfällt und wobei der Zellenstrom durch das erste Objektiv (5) in einem oder zwei benachbarten Brennpunkten mit unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet wird, die durch zwei getrennte Lichtquellen (1, 9) emittiert werden.
3. Anordnung nach Anspruch 1, wobei ein erster und zweiter Schlitz (36, 37) das Bild jedes der benachbarten Brennpunkte von den Lichtquellen (1, 9) in der Objektebene (7) so abdecken können, daß hinter dem ersten Schlitz (36) gemessene Fluoreszenz nur von einem der Brennpunkte ausgeht, während hinter dem zweiten Schlitz (37) gemessene Fluoreszenz nur vom anderen der Brennpunkte ausgeht.
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