DE3915421C2 - Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen - Google Patents

Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen

Info

Publication number
DE3915421C2
DE3915421C2 DE19893915421 DE3915421A DE3915421C2 DE 3915421 C2 DE3915421 C2 DE 3915421C2 DE 19893915421 DE19893915421 DE 19893915421 DE 3915421 A DE3915421 A DE 3915421A DE 3915421 C2 DE3915421 C2 DE 3915421C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
measuring
wavelengths
partial beams
wavelength
beam splitter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19893915421
Other languages
English (en)
Other versions
DE3915421A1 (de
Inventor
Wolfgang Dipl Phys Paffhausen
Martin Dipl Biol Dr Bechem
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Priority to DE19893915421 priority Critical patent/DE3915421C2/de
Publication of DE3915421A1 publication Critical patent/DE3915421A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3915421C2 publication Critical patent/DE3915421C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/12—Generating the spectrum; Monochromators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/02—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the intensity of light
    • G02B26/04—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the intensity of light by periodically varying the intensity of light, e.g. using choppers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/10—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void
    • G01J1/20—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void intensity of the measured or reference value being varied to equalise their effects at the detectors, e.g. by varying incidence angle
    • G01J1/34—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void intensity of the measured or reference value being varied to equalise their effects at the detectors, e.g. by varying incidence angle using separate light paths used alternately or sequentially, e.g. flicker
    • G01J1/36—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void intensity of the measured or reference value being varied to equalise their effects at the detectors, e.g. by varying incidence angle using separate light paths used alternately or sequentially, e.g. flicker using electric radiation detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/10—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void
    • G01J1/16—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void using electric radiation detectors
    • G01J1/18—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void using electric radiation detectors using comparison with a reference electric value
    • G01J2001/182—Photometry, e.g. photographic exposure meter by comparison with reference light or electric value provisionally void using electric radiation detectors using comparison with a reference electric value with SH sample and hold circuits
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/12—Generating the spectrum; Monochromators
    • G01J2003/1226—Interference filters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N2021/1789—Time resolved
    • G01N2021/1791—Time resolved stroboscopic; pulse gated; time range gated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N2021/3129—Determining multicomponents by multiwavelength light
    • G01N2021/3133—Determining multicomponents by multiwavelength light with selection of wavelengths before the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G01N2021/641—Phosphorimetry, gated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen, bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, die eine Lichtquelle, einen ersten Strahlteiler zur Erzeugung von zwei Teilstrahlen, einen zweiten Strahlteiler zur Wiedervereinigung der beiden Teilstrahlen und den beiden Teilstrahlen zugeordnete Filter zur Aussonderung der beiden Wellenlängen, sowie ein Lochblendenrad zur zeitlichen Modulation der beiden Teilstrahlen aufweist und einer elektronischen Auswerteeinheit zur Messung der von den biologischen Zellen ausgehenden Fluoreszenzlichtsignale, wie aus der DE 36 04 815 C2 bekannt.
Anordnungen zur periodischen Monochromatisierung sind grundsätzlich bekannt und finden Anwendung bei der dynamischen Untersuchung von schnell ablaufenden, photometrisch erfaßbaren Vorgängen bei verschiedenen diskreten Wellenlängen, insbesondere bei der alternierenden Fluoreszenzanregung von farbstoffmarkierten, biologischen Zellen, aber auch bei der zeitlichen Untersuchung von chemischen Reaktionsvorgängen, um Aussagen über reaktionskinetische Daten zu erhalten.
Die eingangs genannte DE 36 04 815 C2 beschreibt ein Mikroskopphotometer zur Messung der Fluoreszenz einer Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen. Hierbei wird in zwei Teilstrahlen aufgeteiltes Licht gefiltert, mit zwei unterschiedlichen Frequenzen moduliert und auf der Probe vereinigt. Der Nachweis z. B. der Fluoreszenz, erfolgt mit Hilfe zweier phasenempfindlicher Detektoren. Nachteilig ist bei dieser Meßanordnung, daß die Wärmestrahlung der Lichtquelle voll von Interferenzfiltern aufgenommen wird. Des weiteren fallen die verschieden frequenten Teilstrahlen im wesentlichen gleichzeitig auf die Probe. Die Verwendung zweier Modulationsfrequenzen gestaltet die Meßanordnung technisch aufwendig.
In der US-PS 4 795 256 ist ein Spektrophotometer beschrieben, in dem polychromatisches Licht über ein Chopperrad mit alternierenden Spiegel-Lochblendenabschnitten auf zwei Monochromatoren gelenkt und anschließend in einem Strahlengang vereinigt wird. Besondere Einrichtungen zur Abtrennung von Wärmestrahlung vor den Monochromatoren sind nicht vorgesehen.
Die US-PS 3 725 204 beschreibt eine Vorrichtung zur Messung von Reaktionsgeschwindigkeiten chemischer Reaktionen, insbesondere Enzymreaktionen, bei der monochromatisiertes Licht über einen Drehspiegel alternierend durch eine Proben- und eine Vergleichsküvette geführt und hinter dem Reaktionsraum über eine weitere Spiegel- und Drehspiegelanordnung auf einem Detektor nachgewiesen wird. Die Anordnung arbeitet also mit Licht einer Wellenlänge, das lediglich zum Durchstrahlen zweier Proben aufgeteilt wird, wobei die Absorption beider Proben verglichen werden soll. Die Anordnung ist zur Fluoreszenzmessung nicht geeignet.
Dielektrische Strahlteiler und ihre Eigenschaften sind nach H. K. Pulker "Coatings on Glass" Elsevier Verlag, 1984, S. 414-418 grundsätzlich bekannt. Als Anwendung wellenlängenselektiver Strahlteiler wird dort nur die Verwendung solcher Spiegel zur Aufteilung des sichtbaren Lichtes für Rot-, Grün-, Blau- Signale bei Farbkameras und Druckern erwähnt.
Zur Fluoreszenzanregung von biologischen Zellen wird häufig die Methode der Auflichtfluoreszenzmikroskopie verwendet. Damit können bestimmte Funktionen und Aktivitäten der biologischen Zellen, wie z. B. die Kalzium- oder pH- Regulation, meßtechnisch erfaßt werden. Dabei werden die Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften bestimmter Farbstoffe bei einer Interaktion mit zellulären Bestandteilen untersucht. Einige Farbstoffe, z. B. der Fluoreszenzfarbstoff Fura 2® zur Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration, erlauben dabei aufgrund einer spezifischen Verschiebung des Anregungswellenlängenmaximums bei Interaktion mit den Zellbestandteilen eine absolute Kalibrierung der Messung. So kann mit Hilfe von Fura 2® die intrazelluläre Kalziumkonzentration weitgehend unabhängig von der verwendeten Farbstoffkonzentration in der Zelle von möglichen Zellbewegungen und von der Zellgröße absolut bestimmt werden. Die Voraussetzung hierfür ist die kontinuierliche Erfassung der Lichtemission des Farbstoffs bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen (vgl. Tsien et al., Cell Calcium 6, 1985, Seiten 145 bis 157).
Die Untersuchung sehr schneller Veränderungen der Kalziumkonzentration, wie sie beispielsweise bei Herzzellen mit einer mittleren Zyklusdauer von weniger als 300 ms vorkommen, erfordert eine hohe zeitliche Auflösung der Meßtechnik und damit einen sehr schnellen Wechsel der Anregungswellenlängen. Die bisher hierfür verwendeten Systeme zum Wechsel der Anregungswellenlängen, wie Filterwechsler, Filterräder und Schwing- bzw. Drehspiegel sind entweder von der zeitlichen Auflösung her stark begrenzt oder sehr störungsempfindlich und mit hohen Intensitätsschwankungen behaftet. Die geringe zeitliche Auflösung bei einem Filterrad resultiert aus dem relativ großen Trägheitsmoment aufgrund der großen bewegten Massen. Die maximal erreichbare Umdrehungsfrequenz liegt bei Verwendung mehrerer Filterpaare nur in der Größenordnung von 10 s⁻¹. Eine weitere Schwierigkeit bei Filterrädern mit mehreren Filterpaaren liegt darin, daß die Filterpaare in ihren optischen Eigenschaften (spektrale Durchlässigkeit) genau übereinstimmen müssen. Bei einem Austausch bzw. einer Erneuerung einzelner Filter kann in der Regel diese Bedingung nicht mehr eingehalten werden, so daß unter Umständen Fremdlicht mit anderen Wellenlängenkomponenten erzeugt wird (Unsymmetrien bei der Aufteilung der Strahlung auf die beiden vorgegebenen alternierenden Wellenlängen).
Die oben erwähnten Schwing- und Drehspiegelanordnungen haben den Nachteil, daß zur alternierenden Beleuchtung des Meßobjektes mit zwei Wellenlängen aufgrund der Strahlaufteilung an der Lichtquelle zwei verschiedene Volumenelemente der Lichtquelle erfaßt werden. Dies führt bei Xenon- oder Quecksilberdampflampen aufgrund von Instabilitäten des Lichtbogens in den beiden Teilstrahlen zu unterschiedlichen Intensitätsschwankungen und Veränderungen der spektralen Zusammensetzungen, die zu einer Verfälschung des Meßergebnisses führen. Außerdem sind bei Schwingspiegeln hinreichend große Schwingungsamplituden bei hohen Frequenzen nur schwierig zu realisieren.
Hier setzt die Erfindung an. Es liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zur periodischen Monochromatisierung eines Primärlichtstrahls bei alternierenden Wellenlängen für die Zwecke der Auflichtfluoreszenzmikroskopie an biologischen Zellen mit einer hohen Zeitauflösung zu entwickeln, wobei systematische Meßfehler aufgrund mangelnder räumlicher Kohärenz der Lichtquelle und Asymmetrien bei der Aufteilung und der Wiederzusammenführung der Teilstrahlen vermieden werden sollen. Außerdem sollen Energieverluste bei der Strahlaufteilung minimiert werden, um eine möglichst hohe Empfindlichkeit zu erreichen. Der langwellige Strahlungsanteil des Lichtes, welcher nicht zur Fluoreszenzanregung beiträgt, soll zudem ausgesondert werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einer Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen, bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, die eine Lichtquelle, einen ersten Strahlteiler zur Erzeugung von zwei Teilstrahlen, einen zweiten Strahlteiler zur Wiedervereinigung der beiden Teilstrahlen und den beiden Teilstrahlen zugeordnete Filter zur Aussonderung der beiden Wellenlängen, sowie ein Lochblendenrad zur zeitlichen Modulation der beiden Teilstrahlen aufweist und einer elektronischen Auswerteeinheit zur Messung der von den biologischen Zellen ausgehenden Fluoreszenzlichtsignale, dadurch gelöst, daß die zwei Strahlteiler dichroitische, wellenlängen-selektive Strahlteiler sind, ein weiterer dichroitischer wellenlängen-selektiver Strahlteiler im Verlauf desjenigen Teilstrahls, der den langwelligen Strahlungsanteil der Lichtquelle umfaßt, zur Aussonderung des nicht zur Fluoreszenzanregung beitragenden langwelligen Spektralanteils der Lichtquelle nach dem ersten dichroitischen wellenlängen- selektiven Strahlteiler angeordnet ist, die zeitliche Modulation der zwei Teilstrahlen derart erfolgt, daß alternierend nur jeweils einer der zwei Teilstrahlen auf die biologischen Zellen auftrifft und daß die elektronische Auswerteeinheit einen mit dem Wechsel der zwei Wellenlängen synchronisierten Demultiplexer und zwei dem Demultiplexer zugeordnete Meßkanäle (A, B) für die elektrischen Signale der jeweiligen Wellenlänge aufweist.
In einer bevorzugten Ausführung wird innerhalb einer Halbperiode des Fluoreszenzlichtsignals jeweils pro Kanal ein frei definierbares Zeitfenster elektronisch vorgegeben, währenddessen des Fluoreszenzlichtsignal gefiltert, integriert und einem Sample- und Hold-Glied zugeführt wird, so daß an den beiden Ausgängen des Demultiplexers zwei den Anregungswellenlängen entsprechende analoge Meßsignale anstehen.
Mit der Erfindung werden folgende weitere Vorteile erzielt:
  • - Aufgrund des symmetrischen Teilstrahlengangs für die Erzeugung der alternierenden Wellenlängen ist eine hohe räumliche Kohärenz gewährleistet.
  • - Durch den Einsatz von dichroitischen Farbteilern werden Energieverluste gering gehalten.
  • - Es wird eine hohe Zeitauflösung (<1 ms) bei hoher Frequenzstabilität erreicht.
  • - Bei einem Übergang auf andere Nutzwellenlängen können die Interferenzfilter im Strahlengang und gegebenenfalls auch die dichroitischen Farbteiler ohne aufwendige optische Nachjustierungen ausgetauscht werden. Die Apparatur kann also ohne allzu großen Aufwand auf andere Meßwellenlängen umgerüstet werden. Im Gegensatz dazu mußten z. B. bei Verwendung eines Filterrades alle Filterpaare ausgetauscht und optisch aufeinander abgestimmt werden.
  • - Der langwellige, nicht zur Messung herangezogene Spektralanteil der Lichtquelle kann bequem aus dem Strahlengang ausgeblendet werden, so daß eine Erwärmung der kritischen Interferenzfilter vermieden wird. Daraus resultiert eine höhere Wellenlängenkonstanz und Lebensdauer der Interferenzfilter.
Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand von Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigt
Fig. 1 den prinzipiellen Strahlengang für die Monochromatisierungseinrichtung zur Erzeugung von Licht mit zwei alternierenden Wellenlängen,
Fig. 2 die Monochromatisierungseinrichtung gemäß Fig. 1 in Verbindung mit einem Meßplatz zur Bestimmung der Fluoreszenzanregung von biologischen Objekten,
Fig. 3 ein Prinzipschaltbild für eine Demultiplexer-Schaltung zur elektronischen Zuordnung und Auswertung der Fluoreszenzlichtsignale,
Fig. 4 ein Diagramm zur Erläuterung der elektronischen Erzeugung eines Zeitfensters bei der Auswertung der Fluoreszenzlichtsignale,
Fig. 5 den prinzipiellen Aufbau des Probengebers bei dem Meßplatz nach Fig. 2,
Fig. 6 die Vorrichtung zur Applikation einer Testlösung bei dem Probengeber nach Fig. 5 und
Fig. 7 den Zeitverlauf des Fluoreszenzsignals (Response) nach einem Lösungswechsel mit Hilfe des Probengebers gemäß Fig. 5.
Monochromatisierungseinrichtung
Gemäß Fig. 1 wird das von der Lichtquelle 1, z. B. einer Xenon-Hochdrucklampe, kommende Licht durch einen ersten dichroitischen, wellenlängen-selektiven Strahlteiler 2 in zwei Teilstrahlen 3 und 4 aufgespalten. Der Teilstrahl 3 umfaßt einen Wellenlängenbereich <360 nm und der Teilstrahl 4 den Bereich <360 nm. Durch einen weiteren dichroitischen, wellenlängen- selektiven Strahlteiler 5 wird dann aus dem Teilstrahl 4 der Wellenlängenbereich <410 nm als Teilstrahl 6 ausgeblendet, während der kurzwellige Teilstrahl zwischen 360 nm und 410 nm als Teilstrahl 7 umgelenkt wird. Der Teilstrahl 6, der den nicht genutzten sichtbaren Anteil des Spektrums der Lichtquelle umfaßt, wird durch eine Lichtfalle 8 aus dem Strahlengang ausgeblendet. Alternativ kann der Teilstrahl 6 aber auch dazu benutzt werden, um die Lichtquelle 1 genau zu justieren.
Der Teilstrahl 3 fällt auf einen Umlenkspiegel 9 und wird durch die Linse 10 auf einen Lochspalt 11 (Lochblenden) eines mit einer Frequenz von 1000 Hz umlaufenden Lochblendenrades 12 fokussiert (Chopper-Motor 13). Die Chopper- Anordnung ist so gewählt, daß das Lochblendenrad 12 abwechselnd die Teilstrahlen 3 und 7 freigibt bzw. abdunkelt. Der Teilstrahl 7 wird in analoger Weise durch die Linse 14 auf den Lochspalt 11 fokussiert. Anschließend werden die beiden Teilstrahlen 7 und 3 durch die Linsen 15 und 16 parallel ausgerichtet. Das parallele Licht des Teilstrahls 3 durchsetzt dann ein Interferenzfilter 17 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 340 nm, während das durch die Linse 16 erzeugte Parallelstrahlenbündel des Teilstrahls 7 durch das Interferenzfilter 18 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 380 nm gefiltert wird. Nach Umlenkung durch einen Spiegel 19 trifft der bei 380 nm monochromatisierte Teilstrahl 7 nach Umlenkung durch den Spiegel 19 auf die Rückseite eines zweiten dichroitischen, wellenlängen-selektiven Strahlteilers 20, der für die Wellenlänge 380 nm durchlässig ist. Auf der anderen Seite wird der Teilstrahl 3 mit der Wellenlänge 340 nm durch den Spiegel 21 umgelenkt und trifft auf die Vorderseite des Strahlteilers 20, an der er deckungsgleich mit dem Teilstrahl 7 reflektiert wird. Der Strahlteiler 20 wird also hier dazu benutzt, um die beiden Teilstrahlen 3, 7 wieder in ein einziges Strahlenbündel 22 zusammenzuführen. Das austretende Strahlenbündel 22, dessen Wellenlänge mit einer durch die Chopper-Umdrehungszahl vorgegebenen Frequenz zwischen 340 nm und 380 nm hin und her wechselt, kann nun zur Beleuchtung eines Meßobjektes benutzt werden, dessen physikalische Eigenschaften, z. B. Remission oder Fluoreszenz, bei verschiedenen diskreten Wellenlängen untersucht werden sollen. Bei dieser Anordnung können ohne Schwierigkeiten Lichtwechselfrequenzen von 1000 s⁻¹ erreicht werden, so daß die Beleuchtungseinrichtung für Meßvorgänge geeignet ist, bei denen eine Zeitauflösung von 1 ms und weniger gefordert wird.
Meßplatz für Auflichtfluoreszenzmikroskopie
Gemäß Fig. 2 wird die beschriebene Monochromatisierungs-Einrichtung 23 als Beleuchtungseinrichtung in einer Apparatur für die Auflichtfluoreszenzmikroskopie zur Fluoreszenzanregung eines kalzium-sensitiven Farbstoffes bei 340 nm und 380 nm verwendet. Zu diesem Zweck wird der von der Beleuchtungseinrichtung 23 kommende Lichtstrahl 22 mit alternierenden Wellenlängen über einen weiteren dichroitischen, wellenlängen-selektiven Strahlteiler 24 in den Objektivstrahlengang eines inversen Mikroskops 25 geführt. Der Strahlteiler 24 ist für Wellenlängen <410 nm durchlässig, während die beiden UV-Komponenten des Lichtstrahls 22 an der Vorderseite reflektiert werden. Das vom biologischen Objekt 26 (Objekttisch 27) emittierte Fluoreszenzlicht wird vom Mikroskopobjektiv 28 nach dem Durchtritt durch ein Sperrfilter 29 mit einem Durchlässigkeitsmaximum bei 510 nm mittels eines halbdurchlässigen Spiegels 30 einerseits zu einem Okular 31 und andererseits zu einem Photomultiplier 32 als lichtemfindlichen Detektor geführt. Das Fluoreszenzlichtsignal des Photomultipliers 32 wird durch einen mit der Chopper-Anordnung (12, 13) synchronisierten Demultiplexer 33 synchron zur Frequenz des Wellenlängewechsels auf zwei Meßkanäle aufgeteilt und zur Auswertung an einen Rechner 34 weitergeleitet. Der Rechner 34 übernimmt auch die Steuerung des Objekttisches 27 mittels eines Schrittmotors und eines automatisierten Probengebers 35.
Die Monochromatisierungs-Einrichtung 23 kann prinzipiell auch in den Detektorstrahlengang (s. Fig. 2) eingesetzt werden. In diesem Fall wird das Meßobjekt im Normalfall polychromatisch beleuchtet, während der in die Monochromatisierungs- Einrichtung eintretende Primärestrahl mit dem Meßlicht identisch ist.
Elektronische Meßsignalverarbeitung
Im folgenden soll anhand der Fig. 3 und 4 die Funktion des Demultiplexers 33 näher beschrieben werden.
Aufgabe des Demultiplexers ist die Trennung der sequentiellen alternierend anstehenden Meßsignale für 340 nm und 380 nm und deren elektronische Aufarbeitung sowie die zur Verfügungstellung zweier analoger Meßkanäle A, B der beiden Fluoreszenzsignale für die weitere rechnerische Verarbeitung.
Dem Eingang 36 wird das zu den beiden UV-Wellenlängen gehörende, vom Photomultiplier 32 kommende Fluoreszenzlichtwechselsignal zugeführt, während der andere Eingang 37 mit einer am Lochblendenrad 12 angordneten Lichtschranke verbunden ist. Die von der Lichtschranke kommenden Triggerimpulse werden zur Synchronisation und Aufteilung der zu den beiden Meßwellenlängen gehörenden Fluoreszenzlichtsignale auf die Meßkanäle A und B benötigt. Diese Zuordnung erfolgt im Kanaltrennungsbaustein 38. Die nachfolgende Signalverarbeitung ist für beide Kanäle identisch und soll daher nur für den Meßkanal A (obere Hälfte in Fig. 3) erläutert werden. Im Steuerbaustein 39 werden die Zeitpunkte für ein frei programmierbares Meßfenster festgelegt. Infolge der Beugung und Brechung an den optischen Komponenten, durch kleine Dejustierungen bzw. Unsymmetrien in den beiden Teilstrahlen, vor allem aber durch die Abschattungseigenschaft des Lochblendenrades 12 in bezug auf die Teilstrahlen, d. h. infolge der optischen Übertragungsfunktion des Gesamtsystems wechselt das alternierende photometrische Meßsignal für die beiden Meßkanäle nicht rechteckig, sondern im allgemeinen trapezförmig. Dieses reale Verhalten kann durch den Steuerbaustein 39 dadurch kompensiert werden, daß nach erfolgtem Kanaltrigger für eine einstellbare Verzögerungszeit Δtv=t₁-t₀ der noch nicht stabilisierte Meßwert verworfen wird. Nach Ablauf dieser Zeit (ca. 100 sec) wird der erste Meßwert in einen Sample- und Hold-Baustein 40 geschrieben und daß Meßfenster mit einer einstellbaren Breite von ΔtM=t₂-t₁ geöffnet. Während der Dauer des Meßfensters (ca. 300 sec) wird das analog anstehende Meßsignal in einem Filterbaustein 41 mit frei einstellbaren Filterkanten integriert und gefiltert, so daß nach Ablauf der Meßzeit in einem weiteren Sample- und Hold-Baustein 42 der gemittelte Meßwert für die Halbperiode des Meßkanals gebildet und für die nächste Halbperiode festgehalten wird. Ein nachfolgendes einstellbares Bandpaßfilter 43 mit einem Frequenzbereich von 2 s⁻¹f2000 s⁻¹ eliminiert niederfrequente Störungen. An den Ausgängen der Meßkanäle A und B stehen dann die aufgetrennten analogen Meßsignale für λ=340 nm und λ=380 nm an. Der Vorteil dieser Meßwerterfassung und Verarbeitung liegt darin, daß "falsche" d. h. noch nicht stabilisierte Meßwerte ausgeblendet und durch die Doppel-Filterung Störungen aus dem photometrischen System (z. B. Dunkelstrom, Pulsationen der Zelle) weitestgehend unterdrückt werden. Hierdurch wird die Meß- bzw. Nachweisempfindlichkeit erheblich gesteigert udn die quantitative Auswertung der stark verrauschten Fluoreszenzsignale erheblich verbessert.
Zur Erläuterung der Erzeugung des elektronischen Zeitfensters ist in Fig. 4 das Fluoreszenzlichtwechselsignal und darunter das Triggersignal als Funktion der Zeit aufgetragen. Im Idealfall wäre das Meßsignal eine Rechteckspannung; aufgrund der optischen Übertragungsverluste ergibt sich jedoch ein trapez- bzw. annähernd sinusförmiger Verlauf (gestrichelte Kurve in Fig. 4).
Zu den Zeitpunkten t₀ bzw. t₃ wird jeweils mit Hilfe des Triggersignals der Startpunkt des Meßfensters für die beiden Meßkanäle festgelegt. Nach einer frei einstellbaren Verzögerungszeit t₁-t₀ wird für die Dauer t₂-t₁ das Meßfenster für den Meßkanal A (340 nm) aktiviert. Die Meßzeit ΔtM=t₂-t₁, während derer das Meßsignal im Filterbaustein 41 geglättet und gefiltert wird, ist ebenfalls frei einstellbar.
Ausgehend vom Zeitpunkt t₃ wird nach einer einstellbaren Verzögerungsszeit t₄-t₃ zum Zeitpunkt t₄ das Meßfenster für den Meßkanal B geöffnet. Die Meßfensterbreite t₅-t₄ (Meßzeit für den Meßkanal B für die Integration und Filterung) ist analog zur Signalverarbeitung im Meßkanal A ebenfalls einstellbar. Am Meßkanal A steht dann, wie oben schon beschrieben, das analoge Ausgangssignal für die Fluoreszenzanregung mit λ=340 nm und am Meßkanal B das Signal für die Anregung mit λ=380 nm an. Durch die beschriebene elektronische Ausblendung von Zeitfenstern im Meßsignal kann das Signal-Rausch-Verhältnis und damit die Empfindlichkeit der Meßanordnung erheblich verbessert werden.
Probengeber
Nachfolgend werden Aufbau und Funktion des Probengebers 35 anhand der Fig. 5 und 6 näher erläutert. Der Probengeber 35 besteht einerseits aus einem in vertikaler Richtung verfahrbaren Mikromanipulator 44, der an seiner Spitze eine Halterung zur Aufnahme von herkömmlichen Pipettenspitzen 45 und zum Befestigen einer Glaskapillare 46 besitzt und andererseits aus einer Dosiereinrichtung 47 zur Aufnahme von gebräuchlichen Spritzen 48, z. B. Einmalspritzen. Die Pipettenspitze 45 und die Glaskapillare 46 an der Spitze des Mikromanipulators 44 können mit Hilfe eines Schrittmotors 49 und einer daran angeordneten Spindel 50 in vertikaler Richtung präzise und reproduzierbar gehoben bzw. abgesenkt werden.
Die ebenfalls zum Probengeber 35 gehörende Dosiereinrichtung 47 besteht aus der schon erwähnten konventionellen medizinischen Spritze 48, deren Kolben mittels einer von einem zweiten Schrittmotor 51 angetriebenen Spindel 52 betätigt wird. Die Spritze 48 und die Pipettenspitze 45 bzw. die Glaskapillare 46 am Mikromanipulator 44 sind über eine bewegliche Schlauchverbindung 53 miteinander verbunden. Beim Zudosieren einer Testlösung aus der Spritze 48 wird die Spindel 52 durch den Schrittmotor 51 in definierter und reproduzierbarer Weise nach unten abgesenkt, wodurch ein vorgegebenes Volumen der Testlösung aus der Spritze 48 herausgedrückt wird. Umgekehrt kann durch ein Anheben der Spindel 52 und des mit ihm verbundenen Spritzenkolben die Lösung wieder abgesaugt werden. Der Schrittmotor 49 des Mikromanipulators 44 und der Schrittmotor 51 der Dosiereinrichtung 47 werden von dem Rechner 34 gesteuert.
Über die Schlauchverbindung 53 können die Pipettenspitzen 45 gezielt gefüllt oder entleert werden. Die vertikale Bewegung des Mikromanipulators 44 erlaubt dabei in Verbindung mit dem motorisierten Objekttisch 27 (Fig. 2) das Anfahren von beliebigen Positionen des Tisches oder der Meßkammer 54, auf deren Boden das zu untersuchende biologische Objekt 26 angeordnet ist. Die Meßkammer 54 ist i. a. mit einer Kontrollösung 55 gefüllt. Der Mikromanipulator 44 erlaubt in Kombination mit der Dosiereinrichtung 47 sowohl die genaue Abgabe einer Testlösung in unmittelbarer Nähe des biologischen Objektes 26 als auch die automatische Aufnahme einer neuen Lösung. Auf diese Weise können Substanztestungen in Verbindung mit der Rechnersteuerung vollautomatisch durchgeführt werden.
Im Rahmen der pharmakologischen und physiologischen Messungen an isolierten Zellen besteht häufig die Anforderung, die Nährlösung, die die Zellen umgibt, sehr schnell gegen eine Testlösung auszutauschen, der in geeigneter Dosierung die zu untersuchenden Substanzen zugegeben wurden. Der Austausch der Lösungen an der Oberfläche der Zellen sollte dabei möglichst in weniger als einer Sekunde zu mehr als 90% vollzogen sein, ohne die kontinuierliche Messung zu beeinträchtigen oder die Zellen durch hohe Strömungsgeschwindigkeiten zu schädigen. Für einen solch schnellen Lösungswechsel scheidet ein Austausch des Gesamtvolumens der Meßkammer 54 von mehreren 100 µl im allgemeinen aus, da die benötigten, hohen Volumenströme zu einer sofortigen Schädigung und Zerstörung der Zellen führen würden. Bei diesem Verfahren bestehen weiterhin besonders die Probleme einer gleichmäßigen Durchmischung und konstanten Thermostatisierung der Meßkammer 54. In den bisher verwendeten Meßanordnungen können diese Probleme nur durch eine drastische Verlängerung der Austauschzeiten (auf viele Sekunden oder gar Minuten) gelöst werden.
Durch die Verwendung einer Glaskapillare 46 gemäß Fig. 6 mit einem Innendurchmesser von ca. 100 bis 1500 µm und einer Wandstärke von ca. 1000 µm, die senkrecht zum Boden der Meßkammer 54 in einem Abstand von ca. 10 µm über dem Boden konzentrisch zu den die Probe 26 bildenden untersuchten Zellen gehalten wird, entsteht im Bereich der gemessenen Zellen ein von der übrigen Meßkammer völlig abgegrenzter Lösungsraum 56 mit einem Volumen von nur wenigen µl. Ein Lösungswechsel in der Meßkammer 54 hat unter diesen Bedingungen keinen Einfluß auf die zu messenden Zellen. Durch Anlegen eines Überdruckes kann aus der Öffnung der Glaskapillare 46 eine geringe Volumenmenge (ca. 10 µ) herausgedrückt und damit auf die in der Glaskapillare 46 weiter oben befindliche Testlösung 57 gewechselt werden. Bei einer gut zentrierten Glaskapillare mit einem exakt bodenparallelen Öffnungsrand können dabei überraschenderweise sehr hohe Strömungsgeschwindigkeiten (bis zu 40 µl/sec) benutzt werden, ohne die Zellen zu schädigen. Die Ursache hierfür liegt in der günstigen Verteilung der Strömung an der Öffnung der Glaskapillare 46, da unter dem Rand der Glaskapillare Bereiche mit einer sehr hohen Strömungsgeschwindigkeit entstehen, während sich in der Mitte der Öffnung in der Umgebung der Zellen ein Gebiet mit sehr geringen Strömungsgeschwindigkeiten ausbildet. Es lassen sich auf diese Weise kurze Austauschzeiten von kleiner 300 msec erzielen. Desgleichen wird die Messung auch während des Austausches der Lösungen nicht gestört.
Ein typischer Zeitverlauf bei einem Lösungswechsel mit Hilfe des Probengebers 35 und speziell der Glaskapillare 46 ist in Fig. 7 dargestellt. In dem Diagramm ist das relative Fluoreszenzsignal als Funktion der Zeit bei Zugabe und anschließendem Absaugen einer Fluoreszenzfarbstofflösung aufgezeichnet. Der Kurvenverlauf zeigt den Anstieg der Lichtemission bis zum Erreichen der für die Farbstofflösung typischen Fluoreszenzintensität während der Zugabe (markiert durch den linken Balken unterhalb der Meßspur) und den anschließenden Abfall auf das Kontrollniveau nach dem Absaugen der Farbstofflösung (rechter Balken). Die Wechselzeiten betrugen in diesem Experiment ca. 500 ms.
Ein unkontrolliertes Vermischen von Kontroll- und Testlösung innerhalb der Glaskapillare vor dem Lösungswechsel wird durch eine Einschnürung 58 der Glaskapillare 46 auf ca. 10% ihres Querschnittes an der Grenze beider Lösungen verhindert.
Zum Befüllen der Glaskapillare 46 wird zunächst die Testlösung (ca. 10 bis 100 µl) aufgesaugt und anschließend wird soviel Kontrollösung aufgesaugt, daß die Grenzfläche zwischen Kontroll- und Testlösung im Bereich der Einschnürung liegt. Befüllen und Freisetzen der Lösungen wird über die mit dem Schlauch 53 angeschlossene, rechnergesteuerte Dosiereinrichtung 47 vorgenommen. Die einzelnen Schritte zum Befüllen der Glaskapillare 46 und Zugeben der Testlösung können so programmgesteuert automatisch ausgeführt werden.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Vorrichtung zum Lösungswechsel liegt in der Möglichkeit des einfachen Auswaschens der Testlösung. Dadurch sind Versuche mit einer nur kurz anhaltenden Exposition (von ca. 1 sec) der Testlösung möglich. Dies wird durch Absaugen eines geringfügig größeren als des zugegebenen Volumens erreicht. Die Testlösung wird zurück in die Glaskapillare 46 gesaugt und die nachströmende Kontrollösung 55 aus der umgebenden Meßkammer 54 wäscht die Umgebung der Zellen von der Testlösung frei und stellt die Kontrollbedingung wieder her. Auch beim Absaugen bildet sich das für die Zellen günstige Strömungsprofil mit geringen Strömungsgeschwindigkeiten im Zentrum der Öffnung aus. Beim vorherigen Austausch der Lösung in der gesamten Meßkammer 54, der auch langsamer erfolgen kann, könnte während des Absaugens der Testlösung auch auf eine weitere, von der vorgenannten unterschiedliche, Testlösung gewechselt werden.
Für pharmakologische Untersuchungen besteht ein weiterer Vorteil der beschriebenen Vorrichtung in dem äußerst geringen Volumen der Testlösung (von minimal 10-20 µl), die zu Applikation und Testung einer Substanz benötigt werden. Die automatisierte Zugabe erlaub darüber hinaus leicht die Testung von vielen verschiedenen Substanzen, wie dies im pharmakologischen Screening erforderlich ist.
Der Rechner mit der dazugehörigen Software ermöglicht eine einfache Bedienung und Steuerung des Meßvorganges sowie die Erfassung, Kalibrierung, Auswertung und graphische Darstellung der Meßergebnisse. Auch die Identifizierung und anschließende sequentielle Positionierung und Messung verschiedener biologischer Proben (Zellen) sowie eine statistische Auswertung der durchgemessenen Zellpopulationen ist mit den erstellten Programmen möglich.
Der beschriebene Meßplatz (Fig. 2) kann zur Untersuchung von ganz verschiedenartigen Zellen verwendet und für den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe durch einfaches Austauschen der dichroitischen, wellenlängen-selektiven Strahlteiler und Filter umgerüstet werden. Auch eine Erweiterung zur synchronen Erfassung verschiedener Farbstoffe in einer Zelle kann damit verhältnismäßig leicht realisiert werden. Das beschriebene Meßsystem ist insbesondere durch die Kombination einer Meßtechnik mit hoher zeitlicher Auflösung und der Möglichkeit des schnellen Lösungswechsels im Bereich der Zellphysiologie und -pharmakologie für eine breite und generelle Anwendung geeignet.

Claims (2)

1. Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen, bestehend aus einer Beleuchtungseinrichtung, die eine Lichtquelle, einen ersten Strahlteiler zur Erzeugung von zwei Teilstrahlen, einen zweiten Strahlteiler zur Wiedervereinigung der beiden Teilstrahlen und den beiden Teilstrahlen zugeordnete Filter zur Aussonderung der beiden Wellenlängen, sowie ein Lochblendenrad zur zeitlichen Modulation der beiden Teilstrahlen aufweist und einer elektronischen Auswerteeinheit zur Messung der von den biologischen Zellen ausgehenden Fluoreszenzlichtsignale, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Strahlteiler dichroitische, wellenlängen-selektive Strahlteiler (2, 20) sind, ein weiterer dichroitischer wellenlängen-selektiver Strahlteiler (5) im Verlauf desjenigen Teilstrahls (4), der den langwelligen Strahlungsanteil der Lichtquelle (1) umfaßt, zur Aussonderung des nicht zur Fluoreszenzanregung beitragenden langwelligen Spektralanteils der Lichtquelle (1) nach dem ersten dichroitischen, wellenlängen-selektiven Strahlteiler (2) angeordnet ist, die zeitliche Modulation der beiden Teilstrahlen (3, 4) derart erfolgt, daß alternierend nur jeweils einer der beiden Teilstrahlen (3 oder 4) auf die biologischen Zellen auftrifft und daß die elektronische Auswerteeinheit einen mit dem Wechsel der zwei Wellenlängen synchronisierten Demultiplexer (33) und zwei dem Demultiplexer (33) zugeordnete Meßkanäle (A, B) für die elektrischen Signale der jeweiligen Wellenlänge aufweist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektronische Auswerteeinheit einen Steuerbaustein (39, 39*) aufweist, durch den innerhalb einer Halbperiode der Fluoreszenzlichtsignale frei definierbare Zeitfenster vorgegeben werden, während derer das Fluoreszenzlichtsignal gefiltert, integriert Filterbausteine (41, 41*) und einem Sample- und Hold-Baustein (42, 42*) zugeführt wird, so daß an den beiden Ausgängen der Meßkanäle (A, B) des Demultiplexers (33) zwei den Anregungswellenlängen entsprechende analoge Meßsignale anstehen.
DE19893915421 1989-05-11 1989-05-11 Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen Expired - Fee Related DE3915421C2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19893915421 DE3915421C2 (de) 1989-05-11 1989-05-11 Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19893915421 DE3915421C2 (de) 1989-05-11 1989-05-11 Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3915421A1 DE3915421A1 (de) 1990-11-15
DE3915421C2 true DE3915421C2 (de) 1995-03-02

Family

ID=6380463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19893915421 Expired - Fee Related DE3915421C2 (de) 1989-05-11 1989-05-11 Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE3915421C2 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19916748A1 (de) * 1999-04-14 2000-10-19 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung und Auswertung von fluoreszenzbasierten Nachweisreaktionen
DE19930532A1 (de) * 1999-06-30 2001-01-11 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-Mikroskop
DE19950692A1 (de) * 1999-10-15 2001-04-19 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung zur wellenlängenabhängigen Einstellung von Lichtstrahlung
DE10040988A1 (de) * 2000-08-22 2002-03-21 Evotec Biosystems Ag Verfahren und Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben
DE10065784A1 (de) * 2000-12-30 2002-07-11 Leica Microsystems Verfahren und Vorrichtung zum Auffinden von Probenbereichen
DE102011083847A1 (de) * 2011-09-30 2013-04-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4221063C2 (de) * 1992-06-26 1994-06-01 Thomas Dr Heiden Optisches System für Auflicht-Fluoreszenzmikroskop zur Beobachtung mehrer Fluoreszenzvorgänge
DE19829954A1 (de) * 1998-07-04 2000-01-05 Zeiss Carl Jena Gmbh Strahlteiler in einem Laser-Scanning-Mikroskop
DE10038185C2 (de) * 2000-08-04 2003-05-28 Siemens Ag Einrichtung zum Erfassen von unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen eines mit verschiedenen Anregungswellenlängen ganzflächig beleuchteten Probenträgers
DE10311286A1 (de) * 2003-03-14 2004-09-23 Leica Microsystems Semiconductor Gmbh Beleuchtungsvorrichtung für ein optisches System
US9279722B2 (en) 2012-04-30 2016-03-08 Agilent Technologies, Inc. Optical emission system including dichroic beam combiner

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1096059B (de) * 1956-04-24 1960-12-29 Continental Elektro Ind Ag Einrichtung zur Herstellung von Strahlungsstroemen bestimmter spektraler Energieverteilung
FR2106754A5 (de) * 1970-09-23 1972-05-05 Commissariat Energie Atomique
US3725204A (en) * 1971-08-02 1973-04-03 Perkin Elmer Corp Reaction detector
US4168910A (en) * 1978-04-27 1979-09-25 The Perkin-Elmer Corporation Optical beam-switching chopper
DD216323A1 (de) * 1983-05-18 1984-12-05 Magdeburg Medizinische Akad Elektromechanischer licht-chopper fuer vier verschiedene wellenlaengen
JPS61116627A (ja) * 1984-11-12 1986-06-04 Hitachi Ltd 分光蛍光光度計
DD242089A1 (de) * 1985-11-01 1987-01-14 Zeiss Jena Veb Carl Verfahren zur optischen modulation mit umschaltung der strahlengaenge
DE3604815A1 (de) * 1986-02-15 1987-08-20 Zeiss Carl Fa Mikroskopphotometer
US4795256A (en) * 1987-03-09 1989-01-03 Photon Technology International, Inc. Dual-wavelength spectrophotometry system

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19916748A1 (de) * 1999-04-14 2000-10-19 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung und Auswertung von fluoreszenzbasierten Nachweisreaktionen
DE19930532A1 (de) * 1999-06-30 2001-01-11 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-Mikroskop
DE19930532C2 (de) * 1999-06-30 2002-03-28 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-Mikroskop
DE19950692A1 (de) * 1999-10-15 2001-04-19 Zeiss Carl Jena Gmbh Anordnung zur wellenlängenabhängigen Einstellung von Lichtstrahlung
DE10040988A1 (de) * 2000-08-22 2002-03-21 Evotec Biosystems Ag Verfahren und Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben
DE10065784A1 (de) * 2000-12-30 2002-07-11 Leica Microsystems Verfahren und Vorrichtung zum Auffinden von Probenbereichen
DE10065784C2 (de) * 2000-12-30 2003-12-04 Leica Microsystems Verfahren zum Auffinden von Kontaktstellen zwischen Zellen in einer stimulierbaren mikroskopischen Probe bei einer Kalziummigration und Scanmikroskop zur Durchführung des Verfahrens
DE102011083847A1 (de) * 2011-09-30 2013-04-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie

Also Published As

Publication number Publication date
DE3915421A1 (de) 1990-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1856509B1 (de) Fluoreszenzmessgerät
EP0941466B1 (de) Verfahren und anordnung zum bestimmen vorgegebener eigenschaften von zielpartikeln eines probenmediums
EP1584918B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie
DE69530323T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur eichung eines optischen abtasters
DE102008018476B4 (de) Mikroskopievorrichtung
DE19916749B4 (de) Verfahren zur Untersuchung von Proben
WO2010060515A1 (de) Kombinationsmikroskopie
EP0056426A2 (de) Vorrichtung zur Darstellung von Probenparametern
EP1091205A2 (de) Spektralphotometrische und nephelometrische Detektionseinheit
DE3915421C2 (de) Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzanregung biologischer Zellen bei zwei verschiedenen Wellenlängen
EP0979402B1 (de) Verfahren zur optischen detektion von analytmolekülen in einem natürlichen biologischen medium
DE10038526A1 (de) Verfahren und Anordnung zur Erfassung des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe
DE4228366C2 (de) Fluoreszenz-Meßvorrichtung
EP1384104A2 (de) Vorrichtung und verfahren zur optischen messung von chemischen und/oder biologischen proben
EP1381900B1 (de) Mikroskopanordnung zur fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
DE102011055639B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur simultanen Multikanal- und Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in systemübergreifenden Fluoreszenzlebensdaueranwendungen
WO2005043213A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur messung optischer eigenschaften eines objekts
DE2944019C2 (de) Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten
DE2742957C2 (de) Mikroskop-Photometer
EP0902272A2 (de) Atomabsorptionsspektrometer
DE19702914A1 (de) Verfahren und Anordnung zum Bestimmen vorgegebener Eigenschaften von Zielpartikeln eines Probenmediums
EP3649501A1 (de) Verfahren zum untersuchen einer flüssigkeit, die wenigstens eine zelle und/oder wenigstens ein partikel enthält
EP1504251A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur untersuchung chemischer und/oder biologischer proben
EP1311829B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum messen chemischer und/oder biologischer proben
DE1673348A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur spektroskopischen Analyse von Festkoerpern,Loesungen und Gasen

Legal Events

Date Code Title Description
OM8 Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law
8110 Request for examination paragraph 44
8125 Change of the main classification

Ipc: G01N 21/64

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee