DE2944019C2

DE2944019C2 - Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten

Info

Publication number: DE2944019C2
Application number: DE19792944019
Authority: DE
Inventors: Vladimir V. Puschtschino Moskovskoj oblasti Dudarjev; Valerij A. Jaschin; Valerij N. Karnauchov; Vladimir I. Kulakov; Vassilij M. Verschinin
Original assignee: INSTITUT BIOLOGICESKOJ FIZIKI AKADEMII NAUK SSSR PUSCINO MOSKOVSKAJA OBLAST' SU
Current assignee: INSTITUT BIOLOGICESKOJ FIZIKI AKADEMII NAUK SSSR PUSCINO MOSKOVSKAJA OBLAST' SU
Priority date: 1978-11-01
Filing date: 1979-10-31
Publication date: 1985-08-29
Also published as: SU938936A1; DE2944019A1; FR2441190A1; GB2039031A; DD147002A1; FR2441190B1; GB2039031B; JPS5574448A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Die Erfindung kann bei wissenschaftlichen und angewandten Untersuchungen in der Biologie, Chemie, Physik und Medizin, insbesondere auf den Gebieten der Onkologie, der Hämatologie, der Immunologie, der Toxikologie, der Epidemiologie sowie bei Kontrolluntersuchungen der Wirksamkeit von Arzneimitteln, in der Mikrobiologie und der mikrobiologischen Industrie, beim Umweltschutz, bei Analysen und Pulvern von Mikrokristallen benutzt werden.

Es ist bekannt, Mikrospektrofluorimeter zur Registrierung und Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten zu verwenden. (VergL-iche

z. B. Olson R. A. »Rapid Scanning microspektrofluorimeter«, Rev. Sei. Instrum, v. 31, p. 844, 1960.) Diese Mikrospektrofluorimeter enthalten ein Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Mikroobjekt angeordnet ist, sowie einen Monochromator, auf dessen Eingargsspalt eine vom Lumineszenzmikroskop vergrößerte Lumineszenzabbildung des Mikroobjekts projiziert wird. Hinter dem Ausgangsspalt des Monochromator befindet sich im Wege der Mikroobjekt-Lunineszenzstrahlung ein als Fotovervielfacher ausgeführter Lichtempfänger, der das Lichtsignal in elektrischen Strom umwandelt, welcher dem Eingang eines Linienschreibers zugeführt wird. Bei Einschaltung der Ablenkvorrichtung des Monochromators wird mit Hilfe des Linienschreibers das Lumineszenzspektrum des im Gesichtsfelds des Mikroskops liegenden Mikroobjekts registriert Das Lumineszenzspektrum jedes Mikroobjekts weist in der Reg/J ausreichend kennzeichnende Merkmale auf. Dieses Spektrum kann man dazu benutzen, unter einer Vielzahl von Mikroobjekten solche zu finden, die sich durch ihre Spektralkennwerte, und folglich durch ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften von allen übrigen Mikroobjekten unterscheiden. Bei Beginn eines bestimmten Vorganges, dessen frühes Entwicklungsstadium man erkennen will, ist die Zahl von veränderten Mirkoobjekten gegenüber der Gesamtzahl von Mikroobjekten im Präparat sehr gering und verhält sich zu dieser Gesamtzahl etwa 1 :1000 oder 1 :10 000. Die verhältnismäßig lange Dauer der Registrierung und der Analyse von Li"T>ineszenzspektren jedes Mikroobjekts im Präparat und die sich ergebende Notwendigkeit, die Lumineszenzspektren von Hunderten und Tausenden von Mikroobjekten zu registrieren und zu analysieren, ehe ein verändertes Mikroobjekt gefunden wird, erfordern für diese Suche eines veränderten Mikroobjekts bei Benutzung des vorstehend beschriebenen Mikrospektrofluorimeters einen hohen Zeitaufwand.

Ferner sind zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten Einrichtungen bekannt, bei denen Mikroobjekte durch geeignete Bestrahlung zur Lumineszenz angeregt, die Lumineszenzstrahlung in Abhängigkeit ihrer Wellenlänge in getrennten Kanälen erfaßt und aus der Verteilung dieser Lumineszenzstrahlung auf gewisse Eigenschaften der untersuchten Mikroobjekte geschlossen wird (vgl. DE-OS 27 09 399). Eine ähnliche bekannte Einrichtung (Papajan G. W., Joffe W. A., Winogradowa W. N., Barski I. J. »Zweistrahl-Impuls-Mikrospektrofluorimeter mit Ziffernablesung«, Zytologie, Band 16, Nr. 3, Seiten 355 bis 357,

1974) umfaßt ein Lumineszenzmikroskop, auf dessen Objekttisch ein Mikroobjekt angeordnet ist, das unter der Einwirkung der Strahlung einer Anregungsstrahlungsquelle luminesziert. Im Wege der Lumineszenzstrahlung ist eine Lichtzerlegungsplatte mit einem Interferenzbelag angeordnet. Diese mit dem Intcrlcrcnzbelag überzogene Lichtzerlegungsplattc reflektiert die kurzwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumincszenzstrahlung zu einem Kanal für die Registrierung der

kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und läßt die langwellige Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung zu einem anderen, zur Registrierung dieser Komponente vorgesehenen Kanal hindurch. Jeder dieser Kanäle enthält im Wege der Lumineszenzstrahlung ein entsprechendes Lichtfilter, das die Strahlung in einem schmalen Spektralbereich durchläßt, sowie einen Fotovervielfacher, an dessen Ausgang tin elektronischer Verstärker angeschlossen ist. Die Ausgänge der elektronischen Verstärker der Kanäle sind an ein Digitalvoltmeter angeschlossen, mit dessen Hilfe das Verhältnis der Intensität der Mikroobjekt-Lumineszenz in zwei vorher gewählten charakteristischen Wellenlängenintervallen des Lumineszenzspektrums gemessen wird. Als charakteristische Intervalle der Längenweilen des Lumineszenzspektrums gelten solche Intervalle, in denen eine Änderung der Lumineszenzintensität auf eine Änderung biologischer oder physikalisch-chemischer Eigenschaften des Mikroobjekts hinweist. Die für die Mikroobjektanalyse mit dieser Einrichtung erforderliche Zeit beträgt einige Stunden, da die Lumineszenzkennwerte von Hunderten und Tausenden von Mikroobjekten des zu untersuchenden Präparates registriert und miteinander verglichen werden müssen, ehe ein Mikroobjekt gefunden wird, das sich durch seine Lumineszenzkennwerte von den anderen unterscheidet und visuell sowie mit Hilfe von Geräten näher untersucht werden soll.

Aus der US-PS 41 22 348 ist schließlich eine Einrichtung zur Klassifizierung biologischer Zellen bekannt, bei der die von den Zellen nach einer Bestrahlung mit polarisiertem Licht emittierte Lumineszenzstrahlung hinsichtlich ihres Polarisationszustandes in zwei getrennten Kanälen mit Fotovervielfacher gemessen und registriert wird. Das Ausgangssigna! des Registriersystems wird dabei zur Steuerung zweier den Objekttisch antreibenden Elektromotoren rückgekoppelt Diese Rückkopplung beinhaltet eine Summenschaltung für die Signale der beiden Registrierkanäle und bewirkt eine Selektionsverschiebung des Objekttisches. Dabei wird jede Zelle bezüglich des Objektivs zentriert und Messungen der Parameter der Zellen durchgefünrt. Die Bedienungsperson gewinnt die Kenntnis von der Pathologie einer bestimmten Zelle allein dadurch, daß diese die Parameterwerte jeder im Präparat vorhandenen mit bestimmten Parameterwerten vergleicht. Hierzu ist jedoch ein hoher Zeitaufwand erforderlich.

Es ist somit Aufgabe der Erfindung, eine Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikrcobjekten zu schaffen, die zu einer wesentlichen Verringerung des Zeitaufwandes für die Erkennung eines veränderten Mikroobjekts beiträgt, das näher untersucht werden soll.

Diese Aufgabe wird bei einer Einrichtung der oben genannten Gattung durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Einrichtung sind Gegenstand der Patentansprüche 2 bis 4.

Durch die Erfindung ist die Möglichkeit gegeben, einzelnes verändertes und näher zu untersuchendes Mikroobjekt unter Hunderten und Tausenden von anderen nicht veränderten Mikroobjekten des Präparates bedeutend schneller zu erkennen, da die Bewegung des Objekttisches nur dünn stillgesetzt wird, wenn eine paihalogische Zelle mit e'nem Parameter erscheint, der über einen vorgegebenen Grenzwert hinausgeht. Die vorgeschlagene Einrichtung weist außerdem verhältnismäßig kleine Abmessungen und ein geringes Gewicht auf. Außerdem zeichnet sie sich durch niedrige Herst;llungs- und Betriebskosten aus.

Die Ausgestaltung gemäß Anspruch 2 ermöglicht eine tragbare Einrichtung zu schaffen.

Die Ausgestaltung gemäß Anspruch 3 dient der leichteren Umstellung der Einrichtung zur Untersuchung verschiedenartiger Mikroobjekte in einem weiten Bereich. Durch die Ausgestaltung gemäß Anspruch 4 kann die Bedienung der Einrichtung vereinfacht werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert Es zeigt

F i g. 1 die Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten im Blockschaltbild;

F i g. 2 ein Funktionsschaltbild der Einheit zur Erfassung des Verhältnisses der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und des Diskriminators für die Größe des gebildeten Verhältnisses;

F i g. 3 ein Funktionsschaltbild ei,:, r anderen Ausführungsform der Einheit zur Erfassung des Verhältnisses der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und des Diskriminators für die Größe diesem gebildeten Verhältnisses;

Fig \ ein anderes Ausführungsbeispiel der Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten;

Fig.5 Bewegungsbahnen des auf dem Schirm der Elektronenstrahlröhre abgebildeten Leuchtflecks bei einer normalen veränderten Zelle (ausgezogene Linie) und einer Krebszelle (Strichlinie).

Die vorgeschlagene Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten ist mit einem Lumineszenzmikroskop 1 (Fi g. 1) ausgcstattet. Das Lumineszenzmikroskop 1 besteht aus einer Anregungsstrahiungsqueiie 2, in dessen Strahiungsgang nacheinander eine Kollektorlinse 3 zur Sammlung der Strahlung der Anregungsquelle 2, einen schmälet. Strahlungsbereich bestimmendes Lichtfilter 4, eine Feldblende 5 zur Begrenzung des Gesichtsfeldes des Mikroskops 1 sowie eine Lichtzerlegungsplatte 6 mit einem Interferenzbelag angeordnet sind. Im Wege der an der Oberfläche der Lichtzerlegungsplatte 6 reflektieren Strahlung befinden sich ein Mikroskopobjek»'v 7 und ein Mikroobjekt 8, das in dem auf dem Objekttisch 9 des Mikroskops 1 befestigten Präparat enthalten ist. Das Mikroskopobjektiv 7 dient zur Konzentration der die Lumineszenz anregenden Strahlung auf dem Mikroobjekt 8 und zur Sammlung der Lumineszenzstrahlung dieses Mikroobjekts 8. Im Strahlengang der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8, die unter Einwirkung cVr Strahlung der Anregungsspule 2 entsteht, befindet sich h'nte. der Lichtzerlegungsplatte 6 in Richtung der Lumineszenzstrahlung ein Spiegel 10. Im Strahlengang der an der Oberfläche aes Spiegels 10 reflektieren Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung liegt ein Okular 11, das eine vergrößerte Lumineszenzabbildung des Mikroobjekts 8 erzeugt, v/obei die Maße dieser Abbildung durch die Abmessungen der Feldblende 5 bestimmt werden.

Im Strahlengang ist zwischen dem Okular U und dem Auge des Forschers ein Lichtfilter 12 angeordnet, das die vom Lichtfilter 4 durchgelassene und am Mikroobjekt reflektierte Strahlung der Anregungsquelle 2 zurückhält. Bei Herarsführung des Spiegels 10 aus dem Strahlengang der Lumineszenzstrahlung liegt im Wege der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 eine mit Interferenzbelag versehene Lichtzerlegungsplatie 13, die die kurzwellige Komponente der Mikroobjekt-Lu-

mineszenzstrahlung zum einein als Detektoreinheit ausgebildeten Kanal 14 für die Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszcnzstrahlung reflektiert und die langwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 zu einem als Detektoreinheit ausgebildeten Kanal 15 für die Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung hindurchläßt. Der für die_ Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmte Kanal 14 enthält im Strahlengang der von der Oberfläche der Lichtzerlegungsplatte 13 reflektierten Lumineszenzstrahiunfj des Mikroobjekts 8 hintereinander ein schmalbandiges Lichtfilter 16 und einen Fotovervielfacher 17. dessen Ausgang mit dem Eingang eines Regelverstärkers 18 verbunden ist. In dem zur Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmten Kanal 15 liegen im Strahiciigaiigcuei LumineszenzM! ahiurigues fviikroobjektsS ebenfalls ein schmalbandiges Lichtfilter 19 und dahinter ein Fotovervielfacher 20, dessen Ausgang mit dem Eingang eines Regelverstärkers 21 verbunden ist.

Die Ausgänge der Verstärker 18 und 21, die zu den für die Registrierung der entsprechenden Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Kanälen 14 und 15 gehören, sind mit den Eingängen einer Divisionseinheit 22 zur Erfassung des Verhältnisses der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung verbunden. Der Ausgang dieser Divisionseinheit 22 liegt am Eingang eines Diskriminators 23 für die Größe dieses gebildeten Verhältnisses an. Das Ausgangssignal dieses Diskriminators 23 trägt die Information über das Vorhandensein eines veränderten Mikroobjekts in dem von der Feldblende 5 begrenzten Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1. Der Ausgang des Diskriminators 23 ist mit dem Eingang einer Steuereinheit 24 verbunden. Am Aus^sp.*¹ dieser Steuereinheit 24 liegt ein Elektromotor 25, der mit dem Objekttisch 9 des Lumineszenzmikroskops 1 mechanisch verbunden ist.

Die Divisionseinheit 22 zur Erfassung des Verhältnisses der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung stellt eine Elektronenstrahlröhre 26 (Fig. 2) dar, bei der die Horizo'iUlablenkplatten 27 mit dem Ausgang des Verstärkers 18 im Kanal 14 zur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung und die Vertikalablenkplatten 28 mit dem Ausgang des Verstärkers 21 im Kanal 15 zur Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung verbunden sind. Der Diskriminator 23 isi als Fotodetektor 29 ausgeführt, der am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 mit Hilfe einer schmalen Platte 31 befestigt ist, wobei die letztere einen Längsschlitz 32 zur Verschiebung des Fotodetektors 29 entlang dieser Platte 31 aufweist. Die Platte 31 ist an einer Achse 33 befestigt und kann um diese Achse 33 mitsamt dem Fotodetektor 29 parallel zum Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 geschwenkt werden. Die auf diese Weise mit Hilfe der Bauelemente 29,30,31,32, 33 ausgeführte Polarkoordinaten-Vorrichtung ermöglicht, daß der Fotodetektor 29 an einem beliebigen vorher gewählten Punkt des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26 festgelegt werden kann. Die Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 (Fig. 1) ist amplitudenmoduliert, da die Anregungsstrahiungsqueile 2 eine Quelle mit amplitudenmodulierter Strahlung darstellt, wobei die Modulation mittels entsprechender Speisung der Anregungsstrahlungsquelle 2 mit Wechselstrom erfolgt.

Die Modulation der die Lumineszenzerregung bewirkenden Strahlung kann auch mit Hilfe einer mechanischen Verschlußblende erfolgen, die im Strahlengang der Lumineszenzerregungsstrahlung zwischen der Anregungsquelle 2 und der Lichtzerlegungsp'atte 6 eingebaut wird, wobei die Anregungsstrahlungsquelle 2 mit

_ Gleichstrom gespeist wird.

Infolge der Amplitudenmodulation der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 wird jedes Mikroobjekt am Schirm 30 (F i g. 2) der Elektronenstrahlröhre 26 als leuchtende Linie 34 dargestellt, deren auf die Horizontalachse bezogener Neigungswir keltangens der Größe des Verhältnisses der langwellige η Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikrocbjekts 8 zur kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszen/strahlung proportional ist. Die Mikroobjektc 8. die sich voneinander durch die Größe des Verhältnisses der langweiligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente unterscheiden, werden als leuchtende Linien 34, 34', 34" mit verschiedenen Neigungswinkeln zur Horizontalachsc dargestellt. Deswegen bestimmt der Befestigungspunkt des Fotodetektor 29 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 die Grenze der Lokalisation eines veränderten Mikroobjekts 8 beim Queren dieses Punktes durch die leuchtende Linie 34.

Das M.xroobjekt kann auf dem Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre durch eine leuchtende Linie 34 auch in dem Falle dargestellt werden, wenn die Lumineszenzstrahlung des Mikrcobjekts 8 nicht in der Amplitude moduliert wird. In diesem Falle, d. h. wenn zur Erzeugung der Lumineszenz des Mikroobjekts 8 eine nichtmodulierte Strahlung benutzt wird, kann die leuchtende Linie 34 auf dem Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 mittels der Modulation von Verstärkungsfaktoren der Verstärker IS und 2! oder der Fotovervielfacher 17 und 20 erzeugt werden.

Eine Vereinfachung der Bedienung der Einrichtung kann bei einer anderen Ausführungsvariante des Diskriminators 23 erreicht werden. Bei dieser Variante enthält der Diskriminator 23 einen Fotodetektor 35 (Fig. 3). der im Strahlengang des vom Schirm 30 der Elektronenröhre 26 emittierten Lichtstromes angeordnet wird, sowie eine am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 angeordnete Maske 36, die aus einem im Bereich der Spektralempfindlichkeit des Fotodetektors 35 undurchlässigen Werkstoff gefertigt wird. Bei einer derartigen Ausführung des Diskriminators 23 wird die Anregungsstrahlungsquelle2(Fig. l)des LumineszenzmikroslOps 1 mit Gleichstrom gespeist (die Gleichstromquelle ist in der Zeichnung nicht gezeigt). Dabei wird jeder Mikroobjekt 8 am Schirm 30 (F i g. 3) der Elektronenstrahlröhre 26 als Leuchtfleck 37 dargestellt, dessen Koordinaten durch das Verhältnis der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmt werden. Die sich durch dieses Verhältnis unterscheidenden Mikroobjekte 8 werden als Leuchtflecke 37,37', 37" abgebildet, die an verschiedenen Stellen des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26 liegen. Die Grenzen der Maske 36 bestimmten dabei die Lokalisationsgrenze der veränderten Mikroobjekte.

Die Steuereinheit 24 (F i g. 4), die bei der Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjckten benutzt wird, enthält einen für elektrische Signale bestimmten Regelverstärker 38 mit einem einstellbaren Verstärkungsfaktor, dessen Eingang an den Ausgang des Diskriminators 23 angeschlossen ist

Der Ausgang des elektrischen Signalverstärkers 38 ist mit dem invertierenden Eingang eines Schmitt-Triggers 39 verbunden.

In der Einrichtung wird eine allgemein bekannte Schaltungsvariante des Schmitt-Triggers 39 benutzt (vgl. z. B. Analog integrated circuits. Devices circuits. Systems and Applications. S. A. Corielley (Ed.) John Wiley and Sons Publ., New-York — London — Sydney — Toronto, 1975).

Der nichtinvertierende Eingang des Schmitt-Triggers 39 ist über einen Widerstand 40 mit seinem Ausgang und über einen anderen Widerstand 41 mit dem Schleifer 42 eines Potentiometers 43 verbunden, das an den Minuspol 44 und an den Pluspol 45 einer nicht gezeigten Speisequelle des Schmitt-Triggers 39 angeschlossen ist. Der Schleifer 42 wird mit dem Minuspol 44 der nicht gezeigten Speisequelle über einen normal geöffneten Stopknopf 46 und mit dem Pluspo! 45 dieser Speisequel-Ie über einen normal offenen Startknopf 47 verbunden. Parallel zum Knopf 47 liegt ein Ausschalter 48.

Der Ausgang des Schmitt-Triggers 39 ist über eine Diode 49 an parallel zusammengeschaltete elektronische Schalter 50 und 51 angeschlossen, deren miteinander verbundene Ausgänge an den Elektromotor 25 geschaltet sind. Parallel zur Diode 49 ist ein Kondensator

52 angeschlossen. Der Ausgang der Diode 49 ist mit der gemeinsamen Schiene einer nicht gezeigten Speisequelle des Schmitt-Triggers 39 über einen Regelwiderstand

53 verbunden. Der Ausgang der Schalter 50 und 51 steht über eine Diude 54 mit einem Tongenerator 55 und einem Kondensator 56 in Verbindung, über den die Speisung des Tongenerators 55 erfolgt.

Zur Ermittlung des Verhältnisses der veränderten Mikroobjekte zur Gesamtzahl der Mikroobjekte im untersuchten Präparat enthält die Einrichtung einen Impulszähler 57, der über einen Ausschalter 58 an den Ausgang des Verstärkers 2i des Kanais i5 zur Registrierung der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung angeschlossen ist, sowie einen Impulszähler 59, der über einen Ausschalter 60 an den Ausgang des Verstärkers 18 des Kanals 14 zur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung geschaltet ist, und einen Impulszähler 61, der über einen Ausschalter 62 mit dem Ausgang des Diskriminators 23 verbunden ist. Zur Ermittlung einer allgemeinen statistischen Charakteristik aller Mikroobjekte des Präparats enthält die Einrichtung einen Impulsamplitudenanalysator 63 und einen mit diesem in Reihe liegenden elektronischen Signalteiler 64, deren Eingänge über einen zweipoligen Ausschalter 65 an die Ausgänge der Verstärker 18 und 21 der zur Registrierung der entsprechenden kurzwelligen bzw. langwelligen Komponenten der Lumineszenzstrahlung von Mikroobjekten bestimmten Kanäle 14 und 15 angeschlossen sind. Der elektronische Signalteiler 64 ist nach der bekannten Schaltungsvariante ausgeführt, die im Buch »Analoge und digitale integrierte Schaltungen«, red. von S.W. Jakubowski, S.239, 240, Verlag »Sowetskoje Radio«, Moskau, 1979, angeführt ist.

Die Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten funktioniert folgendermaßen:

Ein das Mikroobjekt 8 (F i g. 1) enthaltendes Präparat wird auf dem Objekttisch 9 des Lumineszenzmikroskops ί angeordnet Die von der Koüektoriinse 3 gesammelte und vom Lichtfilter 4 durchgelassene Strahlung der Anregungsquelle 2 gelangt auf die mit einem Interferenzbelag versehene Lichtzerlegungsplatte 6, die diese Anregungsstrahlung unter einem Winkel von 90° zum Mikroskopobjektiv 7 ref'kiiert, das die Anregungsstrahlung auf die Ebene des Präparats mit den Mikroobjekten 8 fokussiert, bei welchen unter Einwirkung der Anregungsstrahlung der Quelle 2 die Lumineszenz hervorgerufen wird. Die Lumineszenzstrahlung der Mikroobjekte 8 wird vom Mikroobjektiv 7 gesammelt, von der mit einem Interferenzbelag überzogenen Lichtzerlegungsplatte 6 durchgelassen, vom Spiegel 10

ίο reflektiert und erzeugt so ein Bild der Mikroobjekte 8 in ihrem Lumineszenzlicht. Dieses Lumineszenzbild der Mikroobjekte 8 wird von der Bedienungsperson mit Hilfe des Okulars 11 und des Lichtfilters 12 betrachtet, welches die Strahlung der Quelle 2 absorbiert. Bei der Betrachtung der Lumineszenzabbildung der im Präparat enthaltenen Mikroobjekte 8 durch das Okular 11 verändert die Bedienungsperson die Abmessungen der Feldblende 5 des Mikroskops 1 in der Weise, daß das Gesichtsfeld des Mikroskops 1 gleich einem einzelnen lumineszierenden Mikroobjekt 8 im Präparat oder um einige Male größer wird. Darauf verschiebt die Bedienungsperson den Spiegel 10 aus dem Strahlengang der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8, wobei diese Strahlung auf die Lichtzerlegungsplatte 13 mit Interferenzbelag fällt, die die Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 in zwei Komponenten zerlegt. Die kurzwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 wird von der Lichtzerlegungsplatte 13 reflektiert, durchdringt das Lichtfilter 16 und gelangt zur Fotokatode des Fotovervielfachers 17, der diese kurzwellige Komponente der Mikroobjektstrahlung in ein zur Intensität der Komponente proportionales elektrisches Signal umwandelt. Das Ausgangssignal des Fotovervielfachers 17 wird vom Verstärker 18 verstärkt und einem der Eingänge der zur Erfassung der Komponenten der Lumineszenzstrahlung vorgesehenen Divisionseinheit 22 zugeführt. Die langwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 durchdringt ungehindert die mit einem Interferenzbelag überzogene Lichtzerlegungsplatte 13, passiert das Lichtfilter 19 und fällt auf die Fotokatode des Fotovervielfachers 20, der diese langwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 in ein zur Intensität der Komponente proportionales elektrisches Signal umformt.

Das Ausgangssignal des Fotovervielfachers 20 wird vom Verstärker 21 verstärkt und gelangt zum zweiten Eingang der zur Erfassung der Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmten Divisionseinheit 22, die als Elektronenstrahlröhre 26 (F i g. 2,

3) ausgeführt ist.

Den Horizontalablenkplatten 27 der Divisionseinheit 22 wird das Signal vom Ausgang des zum Kanal 14 für die Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung gehörenden Verstärkers 18 zugeführt Auf die Vertikalablenkplatten der Divisionseinheit 22 wird das Signal vom Ausgang des Verstärkers 21 vom Kanal 15 zugeführt der für die Registrierung der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung vorgesehen ist. Infolgedessen wird der Elektronenstrahl von seiner Anfangslage am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 zu einem Punkt abgelenkt, bei dem das Verhältnis seiner Vertikalkoordinate zu seiner Horizontalkoordinate dem Verhältnis der Intensität der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrah-

iung des Mikroobjekts 8 zur Intensität der kurzweiligen Komponente der Lumineszenzstrahlung dieses Mikroobjekts 8 proportional ist

Bei einer der Ausführungsvarianten der Einrichtung

zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten wird im Lumineszenzmikroskop 1 eine amplitudenmodulierte Anregungsstrahlungsquelle 2 benutzt, die mit Wechselstrom gespeist wird. Infolgedessen bewegt sich der Elektronenstrahl (F i g. 2) mit der Modulationsfrequenz zwischen seinem Anfangspunkt (Nullpunkt) und einem Punkt, bei dem die Horizontalkoordinate der L jrzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung und die Vertikalkoordinate der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 proportional sind, wobei am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 eine leuchtende Linie 34 entsteht, deren Neigungswinkeltangens dem Verhältnis der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 proportional ist. Bei Einschaltung des Elektromotors 25 (F i g. 1), der die horizontale Verschiebung des Objekttisches 9 im Lumineszenzmikroskop 1 bewirkt, erscheinen im GpsirhKfek! des Lumineszenzmikroskops 1 abwechselnd die Mikroobjekte 8, wobei jedem dieser Mikroobjekte am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 eine leuchtende Linie 34, 34', 34" (F i g. 2) entspricht. Wenn im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 ein Mikroobjekt 8 erscheint, bei dem der Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung größer als der durch den Anordnungspunkt des Fotodetektors 29 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 festgelegte Wert ist, schneidet die diesem Mikroobjekt 8 entsprechende leuchtende Linie 34 die Anordnungsstelle des Fotodetektors 29, wobei an seinem Ausgang ein elektrisches Signal entsteht, welches das Ansprechen der Steuereinheit 24 (Fig. 1) bewirkt. Die letztere bringt den Elektromotor 25 zum Stehen, so daß das erkannte Mikroobjekt 8 im Mittelpunkt des Gesichtsfeldes des Lumineszenzmikroskops 1 bleibt. Gleichzeitig gibt die Steuereinheit 24 der Bedienungsperson ein Tonsignal, welches die Erkennung des veränderten Mikroobjekts 8 signalisiert, dessen Lumineszenzkenndaten näher zu untersuchen sind. Nach durchgeführter Untersuchung der Lumineszenzkennwerie de« erkannten Mikroobjekts 8 schaltet die Bedienungsperson den Elektromotor 25 wieder ein und setzt den Suchvorgang fort.

Durch VeiSchiebung des Fotodetektors 29 (Fig. 2) entlang des in der Platte 31 vorgesehenen Schlitzes 32 und durch Drehung dieser Platte 31 um die Achse 33 stellt die Bedienungsperson den Fotodetektor 29 in einem beliebigen vorher gewählten Punkt des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26 ein und gibt dadurch die Grenze der Lokalisation veränderter Mikroobjekte vor.

In einer anderen Ausführungsvariante der Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten wird im Lumineszenzmikroskop 1 eine Anregungsstrahlungsquelle 2 (Fig. 1) benutzt, die mit Gleichstrom gespeist wird. Somit entspricht jedem im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 erscheinenden Mikroobjekt 8 bei eingeschaltetem Elektromotor 25 des Objekttisches 9 ein am Schirm 30 (F i g. 3) der Elektronenstrahlröhre 26 entstehender Leuchtfleck 37, bei dem seine Horizontalkoordinate der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts 8 und seine Vertikalkomponente der langwelligen Komponente seiner Lumineszenzstrahlung proportional sind.

Bei dieser Variante der Einrichtung funktioniert der Diskriminator 23 folgendermaßen:

Bei eingeschaltetem Elektromotor 25 (Fig. I) des Objekitisches 9 üischeinen im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 nacheinander die Mikroobjekte 8, wobei jedem dieber Mikroobjekte 8 ein am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 entstehender Leuchtfleck 37, 37' bzw. 37" (Fig. 3) entspricht. Wenn im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 ein Mikroobjekt 3 erscheint, bei dem der Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur

ίο kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung größer als der durch die Konfiguration der Maske 36 gegebene Wert ist, erscheint der Leuchtflcck 37 in dem Teil des Schirmes 30 der Elektronenstrahlröhre 26, der durch die Maske 36 nicht verdeckt ist, wobei der Leuchtfleck 37 vom fotoelektrischen Geber 35 registriert wird, an dessen Ausgang ein elektrisches Signal entsteht, welches dem Eingang der Steuereinheit 24 (Fig. 1) zugeführt wird. Durch Änderung der Konfiguration r\r*r 2^y; Schirm 30 *i~r Elektronenstrahlröhre 2fc angeordneten Maske 36 gibt die Bedienungsperson eine beliebige Grenze der Lokalisation veränderter Mikroobjekte 8 vor.

Die Steuereinheit 24 funktioniert wie folgt:

Beim Schließen des Kontaktes des Startknopfes 47 (Fig.4) wird dem nichtinvertierenden Eingang des Schmitt-Triggers 39 über einen Widerstand 41 eine positive Spannung zugeführt, wobei am Ausgang des Schmitt-Triggers 39 eine positive Spannung erscheint, die über die Diode 49 zum Eingang der parallel zusammengeschalteten elektronischen Schalter 50 und 51 gelangt. Hierbei wird der elektronische Schalter 50 leitend und schließt den vom positiven Pol der Speisequellc führenden Speisestromkreis des Elektromotors 25. Der Elektromotor 25 verschiebt den Objekttisch des Lumineszenzmikroskops 1. Beim Erscheinen eines veränderten Mikroobjekts 8 im Gesichtsfeld des Lumineszenzmikroskops 1 entsteht am Ausgang des Diskriminators 23 ein elektrisches Signal, das nach seiner Verstärkung im Verstärker 38 dem invertierenden Eingang des Schmitt-Triggers 39 zugeführt wird und in diesem einen Zustand herstellt, bei dem am Ausgang de? Schmitt-Triggers 39 eine negative Spannung erscheint. Im Laufe eines Zeitabschnitts, der durch die Zeitkonstante des aus dem Kondensator 52 und dem Regelwiderstand 53 bestehenden /?C-Gliedes bestimmt wird, liegt diese Spannung am Eingang der parallel verbundenen elektronischen Schalter 50 und 51. Infolgedessen wird der elektronische Schalter 50 gesperrt und unterbricht den vom Pluspol der Speisequelle kommenden Speisestromzweig des Elektromotors 25. In der Zeitspanne, die von den Werten des Kondensators 52 und des Regelwiderstandes 53 abhängt, ist der elektronische Schalter 51 leitend und schließt den negativen Speisestromzweig des Elektromotors 25, wobei der Objekttisch 9 zurückgeschoben und die trägheitsbedingte Verschiebung des Mikroobjekts 3 in bezug auf den Mittelpunkt des Gesichtsfeldes des Lumineszenzmikroskops 1 kompensiert wird. Durch die vom Ausgang des elektronischen Schalters 51 über die Diode 54 zugeführte negative Spannung wird der Kondensator 56 aufgeladen, von dem der Tongenerator 55 gespeist wird. Der Tongenerator gibt der Bedienungsperson ein Tonsignal bei der Erkennung eines Mikroobjekts 8, bei dem die Größe des Verhältnisses der langwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung zur kurzwelligen Komponente seiner Lumineszenzstrahlung über dem vom Diskriminator 23 vorgegebenen Pegel liegt

Beim Auftreten dieses Tonsignals führt die Bedie-

nungsperson den Spiegel 10 in den Strahlengang ein und beginnt mit Hilfe des mit dem Lichtfilter 12 ausgestatteten Okulars 11 die morphologische Untersuchung des erkannten Mikroobjekts 8. Danach schiebt die Bedienungsperson den Spiegel 10 aus dem Strahlengang des Luminesrenzmikroskops 1 heraus und untersucht die unter Einwirkung von physikalisch-chemischen Faktoren, z. B. einer Ultraviolettstrahlung, erfolgte Änderung des Verhältnisses der kurzwelligen und der langwelligen Komponenten der Strahlung des erkannten Mikroobjekts.

Nach Beendigung der Untersuchung des erkannten Mikroobjekts leitet die Bedienungsperson durch Drükken des Stprtknopfes. 47 die Suche der Mikroobjekte 8 mit vorgegebenen Lumineszenzkennwerten ein. Durch Drücken des Stopfknopfes 46 kann die Bedienungsperson in jedem beliebigen Moment die negative Spannung auf den nichtinvertierenden Eingang des Schmitt-Trigger·« 39 geben u'iu die Arbeit des Elektromotors 25 stoppen. Mit Hilfe des Schleifers 42 des Potentiometers 43 wird die erfo.iderliche Betriebsart des Schmitt-Triggers 39 vorgegeben. Der Schalter 48 blockiert den Startknopf 47 für die Zeit der Einstellung der Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften der Mikroobjekte 8. Indem die Bedienungsperson mit Hilfe des Ausschalters 58 den Impulszähler 57 an den Ausgang des Kanals 15 zur Registrierung der langwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung anschließt oder mit Hilfe des Ausschalters 60 den Impulszähler 59 an den Ausgang des Kanals 14 zur Registrierung der kurzwelligen Komponente der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung anschließt, erhält sie die Information über die Gesamtzahl von lumineszierenden Mikroobjekten 8 im untersuchten Präparat. Beim Anschluß des Impulszählers 61 an den Ausgang des Diskriminators 23 mit Hilfe des Ausschalters 62 erhält die Bedienungsperson Angaber, über die Anzahl von veränderten Mikroobjekten 8 im Präparat, und auf Grund der angezeigten Werte des Impulszählers 57 oder 59 und des Impulszählers 61 bestimmt sie die relative Anzahl von veränderten Mikroobjekten 8 im Präparat.

Beim mit Hilfe des zweipoligen Ausschalters 65 erfolgenden Anschließen der Eingänge des elektronischen Signalteilers 64 an die Ausgänge der zur Registrierung der kurzwelligen und der langwelligen Komponenten der Mikroobjekt-Lumineszenzstrahlung bestimmten Kanäle 14 und 15 erhält man am Ausgang des elektronischen Signalteilers 64 ein Ausgangssignal, welches dem Wert des Verhältnisses der langwelligen Komponente zur kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts entspricht. Vom Ausgang des elektronischen Signalteilers 64 werden die Signale dem Eingang des ImpulsamDlitudenanalysators 63 zugeführt, der ein Staffelbild der Amplitudenverteilung der Werte der Verhältnisse der langwelligen zu den kurzwelligen Komponenten der Lumineszenzstrahlung aller zum Untersuchungsmuster gehörenden lumineszierenden Mikroobjekte konstruiert

Die Benutzung der Einrichtung in verschiedenen Anwendungsgebieten wird durch nachstehende Beispiele veranschaulicht

Beispiel 1
Medizinische Diagnostik

Abstriche von Blut, Knochenmark, Aszitesflüssigkeit, abgeschabte Schleimhaut, Abdrücke von Biopsiematerial, Gewebeschnitte werden im Laufe von 4 bis 10 Minuten auf dem Objektglas mit Carnoi-Flüssigkeit oder einer Äthanol-Azeton-Lösung (1:) fixiert, in einer Zitrat-Phosphat-Pufferlösung mit pH =4,0 ... 4,6 im Laufe von 4 bis 6 Minuten gehalten und mittels einer Akridin-

5 orange-Lösung mit einer Konzentration voi. 5 IC^-5... 10-⁴ M sowie einer Zitrat-Phosphai-Pufferlösung mit pH = 4,0... 4,2 bei einer Temperatur von 18. ..20" C im Laufe von 8—12 Min. gefärbt. Die gefärbten Präparate werden mit derselben Pufferlösung oder mit destilliertem Wasser gespült, mit einem Deckglas abgedeckt und auf dem Objekttisch 9 der Einrichtung zur Untersuchung der Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekten angeordnet.

Man benutzt die Interferenzplatte 13 (F ig. 1), die die Strahlung im grünen Spektralbereich (500—580 nm) reflektiert 'ind im roten Spektralbereich (600—700 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4,16,19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 436 nm (4), 530 nm (16) und 640 nm (19). Die Impulszähler59 und61 sind angeschlossen.

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Intensität /_M0 der roten Komponente (640 nm) der Lumineszenzstrahlur.g einer Zelle zur Intensität /530 der grünen Komponente (530 nm) der Zellenlumineszenz, das dem Verhältnis der Menge von Einspiral-Nukleinsäuren (NS]) zur Menge von Zweispiral-Nukleinsäuren (NS2) in der Zelle proportional ist:

λ = W/530 = A ■

(1)

wobei A ein Proportionalitätsfaktor ist. Nach Einstellung einer bestimmten Ansprechschwelle des Diskriminators 23 schaltet die Bedienungsperson durch Betätigung des Startknopfes 47 den Elektromotor 25 des Objekttisches 9 im Lumineszenzmikroskop 1 ein und findet schnell eine veränderte Zelle, deren Kennwert λ über der von ihr eingestellten Ansprechschwelle des Diskrirninators 23 liegt, Nach Eriöiien eines Tonsignais rückt die Bedienungsperson den Spiegel 10 in den Strahlengang und untersucht die erkannte veränderte Zelle nach ihren morphologischen Daten.

Nach Beendigung der morphologischen Untersuchung der Zelle führt die Bedienungsperson den Spiegel 10 wieder aus dem Strahlengang heraus und un< --sucht den Vorgang der Farbstoff-Fotodestruktion in der erkannten Zelle. Verläuft die Fotodestruktion des Farbstoffes unter Einwirkung der Strahlung der Quelle 2 so, daß die Bewegungsbahn 66 (F i g. 5) des Leuchtfiecks 37 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 längs der Linie gerichtet ist, die den Koordinatenanfangspunkt und den die betreffende Zelle kennzeichnenden Ausgangspunkt verbindet, so gehört die erkannte Zelle zur normalen differenzierten Zellenart, und der hohe a-Wert dieser Zelle ist die Folge ihrer erhöhten synthetischen Aktivität.

Wenn in einem der oben aufgeführten zytologischen Präparate, mit Ausnahme vom Knochenmark, bei dem das Vorhandensein von Blastomzellen als normal gilt, unter den gefundenen Zellen mit erhöhtem «-Wert eine Zelle erkannt wird, in der die Fotodestruktion des Farbstoffes unter Einwirkung der Anregungsstrahlungsquel-Ie 2 so erfolgt, daß die Intensitätsabnahme bei der roten Komponente (640 nm) von einer Erhöhung der Intensität der grünen Komponente (530 nm) begleitet wird und die Bewegungsbahn 67 des Leuchtflecks 37 am Schirm 30 der Elektronenstrahlröhre 26 einen bedeutenden Anteil aufweist, der senkrecht zu der den Koordinatenanfangspunkt mit dem Ausgangspunkt 37 verbindenden Linie steht, so ist diese Zelle nichtdifferenziert (oder

eine dedifferenzierte Krebszelle) und zeugt von einer gefährlichen Pathologie des Organismus. Wenn die Fotodestruktion der erwähnten Art für den segmentkernigen Granulozyt charakteristisch ist, der anhand seiner morphologischen Merkmale mit Hilfe des Okulars 11 leicht erkannt wird, .veist dies auf eine Art von Lupus systemicus beim betreffenden Organismus hin.

Nach Beendigung der visuellen und apparativen Untersuchung der erkannten veränderten Zelle drückt die Bedienungsperson auf den Startknopf 47 und setzt das Suchen fort. Nach der Präparatanalyse erhält die Bedienungsperson mit Hilfe des Impulszähiers 59 die Information über die Gesamtzahl von kernhaltigen Zellen im Präparat, mit Hilfe des Impulszähiers 61 die Angaben über die Anzahl «on veränderten Zellen im betreffenden Präparat sowie Hinweise auf den Veränderungsgrad von vorhandenen Zeilen auf der morphologischen und molekularen Ebene.

Beispiel 2
'rnrnünoiugie

Die Zellen eines Organismus läßt man mit den durch Lumineszenzfarbstoffe, z. B. 4-Azetamid, 4'-IsothiozyanostiIben-2,2'-Disulfonsäure markierten Antikörpern nach einem für diese immune Reaktion geeigneten Verfahren ausbrüten, setzt zusätzlich die Bromid-Etydium-Lösung (2,7-Diamino-10-ÄthyI-9-Phenylphenantrydium-Rromid) mit einer Konzentration von 10—· — 10~⁵ g/ml hinzu, deckt das Präparat mit einem Deckglas ab und legt es nach I bis 8 Min. auf den Objekttisch 9.

Man benutzt die Interferenzplatte 13 (Fig. 1), die die Strahlung im blauen Spektralbereich (400—500 nm) reflektiprt -jnd im roten Spektralbereich (580—700 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4,16,19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 365 ηm (4), 460 nm (16) und 610 nm (19) und schalter die Impulszähler 57 und 61 ein.

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Intensität Aw der Lumineszenz im blauen Spektralbereich zur Intensität /öionm im roten Spektralbereich, welches das Verhältnis der Immunfluoreszenz-Markierung (M) zur Gesamtmenge von Nukleinsäuren (NS)m der betreffenden Zelle wiedergibt:

« = W/610 = A ■ M/NS

ANS (l-Anilin-Naphthalen-8-Sulfonat) in einer Konzentration von 10~⁴g/ml sowie von Bromidetydium (10-⁵g/ml) hinzu. Das erhaltene Gemisch wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf dem Objekttisch 9 angeordnet

Man benutzt die mit Interferenzbelag versehene Lichtzerlegungsplatte 13, die die Strahlung im blauen Spektralbereich (400—520 nm) reflektiert und im roten Spektralbereich (580—700 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4,16,19, deren Durchlaßbereichsmaxima bei 365 nm (4), 490 nm (16) und 610 nm (19) liegen.

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzintensität k\a um im roten Spektralbereich zur Intensität Asonm im blauen Spektralbereich:

wobei A einen Proportionalitätsfaktor darstellt.

Nach Einstellung der entsprechenden Ansprechschwelle des Diskriminators 23 schaltet die Bedienungsperson den Elektromotor 25 durch einen Druck auf den Startknopf 47 ein und findet schnell die Zellen mit hoher immuner Aktivität, falls solche im Präparat vorhanden sind. Die erkannten Zellen werden mit Hilfe des Okulars 11 morphologisch untersucht. Nach der durchgeführten Analyse der Probe erhält die Bedienungsperson mit Hilfe des Impulszählers 57 die Information über die Gesamtzahl von kernhaltigen Zellen in der Probe, mit Hilfe des Impulszählers 61 die Angaben über die Anzahl von Zellen mit hoher immuner Aktivität und mit Hilfe des Okulars 11 die morphologischen Daten von Zellen mit hoher immuner Aktivität.

Beispiel 3
Mikrobiologie

Zur Suspension von gramnegativen Mikroorganismen (Produzenten) setzt man wäßrige Lösungen von x =

welches den Grad der Zellschadigung charakterisiert.

Nach Einstellung der Ansprechschwelle des Diskriminator* 23 und nach Betätigung des Siartknupfes 47 erkennt die Bedienungsperson schnell die im Präparat enthaltenen Zellen mit dem vorgegebenen oder größeren Beschädigungsgrad und unterzieht sie der morphologischen Analyse mit Hilfe des Okulars 11.

Beispiel 4

Zellenenergetik

Eine Suspension von lebenden Zellen oder ein Abdruck von Biopsiematerial wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf dem Objekttisch 9 angeordnet.

Man benutzt eine Lichtzerlegungsplatte 13, die die Strahlung im blauen Spektralbereich (400—490 r.m) reflektiert und im grünen Spektralbereich (500—600 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4, 16 und 19 mit Durchlaßbereichsmaxima bei 365 ηm (4), 470 nm (16) und 530nm(19).

Als charakteristisches Merkmal benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzstrahlungs-Intensität von oxidierten Flavoproteinen auf der Wellenlänge von 530 nm zur Lumineszenzintensität der reduzierten Pyridinnukleotide auf der Wellenlänge von 470 nm:

= /530//470,

welches die energetische Aktivität der Zelle charaktcrisiert.

Nach Einstellung der Ansprechschwelle des Diskriminators 23 und nach Betätigung des Startknopfes 47 erkennt die Bedienungsperson schnell die Zellen mit erhöhter energetischer Aktivität und untersucht sie mit Hilfe des Okulars II.

Beispiel 5

Biomonitoring des Mikrophytoplanktons

Ein Wassertropfen aus einem zu untersuchenden Wasserbecken wird auf das Objektglas aufgetragen, mit einem Deckglas bedeckt und auf den Objekttisch 9 gelegt.

Man benutzt eine Interferenzplatte 13. die die Strahlung im gelb-orangenen Spektralbereich (560—660 nm) reflektiert und im roten Spektralbcrcich (670—750 nm) durchläßt, sowie die Lichtfilter 4, 16,19 mit DurchlaUbc-

15

reichmaxima bei 436 nm (4), 660 nm (16), 680 nm (19) und schaltet die Impulszähler 57 und 61 an.

Als charakteristisches Merkmal einer Zelle benutzt man das Verhältnis der Lumineszenzintensität des AlIophykozyanins bei 660 nm zur Lumineszenzintensität des Chlorophylls bei 680 nm:

λ = /tW/bso, (5)

welches das Aiter der Zellen von Blaugrünalgen kennzeichnet

Nach der Einstellung der Ansprechschwelle des Diskriminators 23 erkennt die Bedienungsperson im Präparat die Zellen der Blaugrünalgen, die sich im stationären Entwicklungsstadium befinden. Dabei erhält die Bedienungsperson mit Hilfe des Impulszählers 61 die Information über das Verhältnis der Anzahl von Zellen der Blaugrünalgen, die sich im Wasserbecken im stationären Entwicklungsstadium befinden, zur Gesamtzahl von Zellen des Mikrophytoplanktons. die mittels des Impuls-Zählers 57 ermittelt wird.

Dasselbe Präparat wird 5 bis 10 Minuten einer totalen Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlung von 365 nm Wellenlänge unterzogen, worauf es wiederholt analysiert wird. Nach dieser Analyse erhält man das Verhältnis der Gesamtzahl von Zellen der Blaugrünalgen, die mittels des Impulszählers 61 bestimmt wird, zur Gesamtzahl von Zellen des Mikrophytoplanktons, die mit Hilfe des Impulszählers 57 ermittelt wird.

Die beschriebene Einrichtung weist bei allen aufgeführten Anwendungsbeispielen gegenüber den bekannten zu ähnlichen Zwecken angewandten Einrichtungen ent:chiklertde Vorteile auf. Bei Benutzung der vorgeschlagenen Einrichtung in der medizinischen Diagnostik ähnlich dem Beispiel 1 kann während eines Arbeitstages die Analyse von 100 bis 200 Präparaten des menschlichen Gewebes zwecks Erkennung von dedifferenzierten Krebszellen beim Vorhandensein von einer bis zwei ja pathologischen Zellen in 1000 bis 10 000 normalen ZeI- " lcn durchgeführt werden. Dabei erhöht sich die Genauigkeit der Diagnose des dedifferenzierten Zustands einer Krebszelle stark infolge der Auswertung ihrer besonderen physikalisch-chemischen Kennwerte (Farbstoff-Fotodestruktion) zusätzlich zur üblichen morphologischen visuellen Analyse einer derartigen Zelle. Der verhältnismäßig einfache Aufbau der Einrichtung bedingt eine wesentliche (um das 7- bis lOfache) Senkung der Hcrstellungs- und Betriebskosten gegenüber den bekannten automatischen Einrichtungen, bei denen zur Erkennung der pathologieverdächtigen Zellen morphologische Merkmale benutzt werden.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

55

b0

65

Claims

Patentansprüche:

1. Einrichtung zur Untersuchung von Lumineszenzeigenschaften von Mikroobjekien, die auf einem mittels eines Elektromotors (25) bewegbaren Objekttisch (9) eines Lumineszenzmikroskops liegen, mit einer im Weg der durch die Strahlung einer Anregungsstrahlungsquelle (2) hervorgerufenen Lumineszenzstrahlung des zu überprüfenden Mikroobjekts (8) liegenden Lichtzerlegungsplatte (13), die die kurzwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung auf eine erste Detektoreinheit (16, 17, 18) für die Erfassung der entsprechenden Komponente der Lumineszenzstrahlung reflektiert und die langwellige Komponente der Lumineszenzstrahlung zu einer zweiten Detektoreinheit (19, 20, 21) für die Registrierung der entsprechenden Komponente der Lumineszenzstrahlung durchläßt, mit einer Auswertseinheit (22, 23) für die von den jeweiligen Detektoren erfaßte Lusnineszenzstrahlung und einer dieser nachgeordneten Steuereinheit (24) für den Objekttisch, wobei in die Auswerteeinheit Kriterien für die Unterscheidbarkeit der Mikroobjekte aufgrund der einzelnen Komponenten der Lumineszenzstrahlung eingebbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswerteeinheit (22, 23) eine Divisionseinheit (22) zur Bildung des Verhältnisses zwischen der langwelligen Komponente und der kurzwelligen Komponente der Lumineszenzstrahlung des Mikroobjekts sowie einen Diskriminator (23) für die Größe dieses gebildeten Verhältnisses aufweist und daß die Steuereinheit (24) aufgrund jes von der Auswerteeinheit (22,23) kommenden Signals zur Bewegung oder Stillsetzung des mit dei.. Objekttisch (9) verbundenen Motors (25) ausgelegt ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Divisionseinheit (22) als Elektronenstrahlröhre (26) ausgebildet ist, deren Horizontalablenkplatten (27) mit dem Ausgang der ersten Detektoreinheit (16, 17, 18) und deren Vertikalablenkplatten (28) mit dem Ausgang der zweiten Detektoreinheit (19,20,21) verbunden sind.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Diskriminator (23) als Fotodetektor (29) ausgeführt ist, der an einer Stelle am Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) festlegbar ist, die die Grenze für die Erfassung der veränderten Mikroobjekte (8) bestimmt.

4. Einrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Diskriminator (23) eine am Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) angeordnete Maske (36) enthält, die die Grenze für die Erfassung der veränderten Mikroobjekte (8) bestimmt, und daß ein Fotodetektor (35) vorgesehen ist, der im Wege des vom Schirm (30) der Elektronenstrahlröhre (26) emittierten Lichtstromes angeordnet ist.