DE69722800T2

DE69722800T2 - Probenanalyseverfahren mittels bestimmung einer funktion der spezifischen helligkeit

Info

Publication number: DE69722800T2
Application number: DE69722800T
Authority: DE
Inventors: Peet Kask
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1996-10-12
Filing date: 1997-10-11
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2017-10-12
Also published as: WO1998016814A1; EP0931254B1; US20030013086A1; ATE242879T1; US20100230612A1; US20070020645A1; US7019310B2; EP0836090A1; US8269965B2; JP4023523B2; EP0931254A1; DE69722800D1; JP2001502062A; AU5118398A; DK0931254T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die Teilchen enthalten, welche Strahlung emittieren, streuen und/oder reflektieren, durch Messen der Anzahl der Photonenzählereignisse in einem repetitiven Modus pro Zeitintervall einer definierten Länge und Bestimmung einer Funktion für die Anzahl der Photonenzählereignisse.
Die ersten erfolgreichen Studien über Fluktuationen der Fluoreszenzintensität wurden von Magde, Elson und Webb durchgeführt (Biopolymers, Vol. 13, 29–61, 1974), die die Möglichkeit aufzeigten, Zahlenfluktuationen von fluoreszenten Molekülen nachzuweisen, und ein Forschungsgebiet begründeten, das Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) genannt wird. FCS wurde primär als Verfahren zur Bestimmung von chemischen Geschwindigkeitskonstanten und Diffusionskoeffizienten entwickelt. Das Experiment besteht im Wesentlichen darin, die zeitliche Variation der Anzahl von Molekülen spezifischer Reaktanten in einem definierten offenen Volumen der Lösung zu messen. Die Konzentration eines Reaktanten wird anhand seiner Fluoreszenz aus einem kleinen Messvolumen gemessen. Das Messvolumen wird durch einen fokussierten Laserstrahl, der die Fluoreszenz anregt, und eine Lochblende in der Bildebene des Mikroskops, das die Fluoreszenz auffängt, definiert. Die Intensität der Fluoreszenzemission fluktuiert proportional zu den Änderungen in der Anzahl der fluoreszenten Moleküle, während sie in das Messvolumen hinein und aus dem Messvolumen heraus diffundieren und während sie durch die chemischen Reaktionen gebildet oder eliminiert werden. Technisch gesehen ist das direkte Ergebnis eines FCS-Experiments die berechnete Autokorrelationsfunktion der gemessenen Fluoreszenzintensität.
Eine wichtige Anwendung von FCS ist die Bestimmung von Konzentrationen fluoreszenter Spezies mit verschiedenen Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Gemisch. Um die beiden Terme, die der Translationsdiffusion von zwei Arten von Teilchen entsprechen, in der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität zu trennen, benötigt man wenigstens etwa einen Unterschied in der Diffusionszeit gemäß einem Faktor zwei, was im Allgemeinen einem Unterschied in der Masse der Teilchen gemäß einem Faktor von acht entspricht. Wenn es gelingt, die beiden Terme in der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität zu trennen, ist dies weiterhin noch nicht ausreichend, um die entsprechenden Konzentrationen zu bestimmen, außer wenn man die relative Helligkeit der beiden verschiedenen Arten von Teilchen kennt.
Während herkömmliche FCS aus einer einfachen Autokorrelationsfunktion von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität eher begrenzte Informationen über Aggregatgrößen liefert, verlangen mögliche biophysikalische Anwendungen die Fähigkeit, komplexe Gemische von verschiedenen Spezies zu analysieren. Zu diesem Zweck untersuchten Palmer und Thompson Korrelationsfunktionen höherer Ordnung von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität und haben Verfahren skizziert, um die Zahlendichten und die relative molekulare Helligkeit der Fluoreszenz von verschiedenen fluoreszenten Spezies zu bestimmen (Biophys. J., Vol. 52, 257–270, August 1987). Ihre Technik kann sich im Prinzip als nützlich beim Nachweis und bei der Charakterisierung von Aggregaten von fluoreszenzmarkierten biologischen Molekülen, wie Zelloberflächenrezeptoren, erweisen, hat jedoch den großen Nachteil, ziemlich komplex zu sein, so dass die Datenverarbeitung eines Experiments einschließlich der Berechnung von Korrelationsfunktionen hoher Ordnung Stunden dauert.
Ein Verfahren, das beträchtlich weniger kompliziert ist als die Berechnung von Autokorrelationsfunktionen hoher Ordnung zum Charakterisieren von Gemischen fluoreszenter Spezies mit unterschiedlicher spezifischer Helligkeit ist die Berechnung von Momenten höherer Ordnung der Fluoreszenzintensität aus der experimentell bestimmten Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse. Dieses Verfahren wurde von Qian und Elson vorgestellt (Biophys. J., Vol. 57, 375–380, Februar 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, 5479–5483, Juli 1990). Bei ihren Demonstrationsexperimenten wurden Signalerfassungszeiten von etwa 7 Minuten für ein relativ günstiges experimentelles System von zwei Arten von fluoreszenten Teilchen, deren spezifische Helligkeit sich um den Faktor 30 unterschied, dem Gemisch von Monomeren und 30-meren, verwendet. Das Verfahren der Momente ist bei Berechnungen relativ einfach und schnell, ermöglicht aber nur die Bestimmung einer begrenzten Zahl von unbekannten Parametern, die die Probe charakterisieren, da aus dem Experiment gewöhnlich nur etwa drei oder vier erste Momente der Fluoreszenzintensität mit einer für die weitere Analyse ausreichenden Präzision berechnet werden können.
Aus diesem Grund ist das Verfahren der Momente kaum geeignet, um komplexe Proben zu charakterisieren oder zwischen konkurrierenden Modellen der Probe auszuwählen oder zu überprüfen, ob das gegebene Modell geeignet ist.
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, zuverlässige Informationen über eine Probe zu erhalten, die Teilchen enthält, welche Photonen emittieren, streuen und/oder reflektieren, was eine Analyse der Probe in Bezug auf bestimmte Bestandteile oder in Bezug auf bestimmte Zustände der Probe ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die nützlichen Informationen, die aus der experimentell bestimmten Funktion, vorzugsweise der Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, erhalten werden können, erheblich zu erweitern.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden mit dem Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 erreicht.
Der Ausdruck "Teilchen" bezieht sich im Allgemeinen auf Teile einer Probe, die in der Lage sind, Strahlung zu emittieren, zu streuen und/oder zu reflektieren. Eine Probe könnte mehrere identische Teilchen oder verschiedene Teilchen, die vorzugsweise zu Spezies gruppiert werden können, enthalten. Der Ausdruck "verschiedene Spezies" bezieht sich auch auf verschiedene Zustände, insbeson dere verschiedene Konformationszustände, eines Teilchens, wie eines Moleküls. Fluoreszenzmarkierte oder natürlicherweise fluoreszente Moleküle, Molekülkomplexe, Vesikel, Zellen, Kügelchen und andere Teilchen in Wasser oder anderen Flüssigkeiten sind Beispiele für fluoreszente Teilchen in flüssigen Proben, während Beispiele für fluoreszente Teilchen einer festen Probe Verunreinigungsmoleküle, -atome oder -ionen oder andere Fluoreszenzzentren sind.
Der Ausdruck "spezifische Helligkeit" von Teilchen im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine physikalische Eigenschaft, welche ausdrückt, in welchem Ausmaß ein Teilchen einer gegebenen Spezies in der Lage ist, Strahlung, vorzugsweise Licht, zu emittieren, zu streuen und/oder zu reflektieren. Sie soll einzelne Teilchen charakterisieren, und daher hängt der Wert der spezifischen Helligkeit weder von der Konzentration der Teilchen noch von der Anwesenheit anderer Teilchen ab. Wenn eine Änderung der Gesamtzählrate der aus dem Messvolumen emittierten, gestreuten und/oder reflektierten Photonen nur auf eine Änderung der Konzentration der gesamten Anzahl der Teilchen zurückzuführen ist, beeinflusst sie also nicht den Messwert der spezifischen Helligkeit oder den Wert des Verhältnisses der Anzahlen von Teilchen verschiedener Spezies, der durch die vorliegende Erfindung bestimmt wird. Die spezifische Helligkeit wird gewöhnlich als mittlere Zählrate pro Teilchen ausgedrückt und ist ein gewogenes Mittel der Zählrate über Koordinaten des Teilchens im Messvolumen. In einigen Fällen könnte man bevorzugen, die spezifische Helligkeit in Zählraten auszudrücken, die einem Teilchen entsprechen, das sich an einer Stelle befindet, wo die Zählrate ihre Spitzenwerte hat. Dies könnte zum Beispiel die Mitte des Brennpunkts eines einfallenden Strahls sein.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung für die Analyse von Proben kann durch das folgende, nicht einschränkende Beispiel veranschaulicht werden: Angenommen, eine Lösung enthält eine Menge (a) einer Art von Teilchen (A) mit einer entsprechenden spezifischen Helligkeit (Ia) und eine Menge (b) einer anderen Art von Teilchen (B) mit einer entsprechenden spezifischen Helligkeit (Ib), dann hängt die Gesamtzählrate der von der Lösung emittierten Photonen von dem Ausdruck Ia*a + Ib*b ab. Lediglich durch Bestimmung der Gesamtzähl rate ist es also nicht möglich, den Wert für a und/oder b aufzulösen. Im Allgemeinen wird die Gesamtzählrate wenigstens einer Art von Teilchen bei fluorimetrischen Messungen in einem unabhängigen Experiment bestimmt. Wenn sich die Gesamtzahl a + b der Teilchen in Bezug auf diese Messung nicht ändert, kann das Verhältnis a/b oder sein Kehrwert bestimmt werden, indem man in einer zweiten Messung lediglich die Gesamtzählrate des Gemischs bestimmt. Die Annahme, dass sich die Gesamtzahl a + b zwischen den beiden Messungen nicht ändert, ist häufig falsch. Zum Beispiel können Adsorptionseffekte von Teilchen auf Oberflächen auftreten. Fluorimetrische Messungen können die Gesamtzahl von Teilchen a + b nicht unabhängig nachprüfen. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Einschränkungen. Aus einer Messung können die Anzahlen von Teilchen a und b ohne irgendeine a-priori-Information über ihre spezifischen Helligkeiten bestimmt werden.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die folgende Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend sein soll. Viele Ausführungsformen werden dem Fachmann einfallen, wenn er die folgende Beschreibung durchliest. Die Erfindung wird in erster Linie am Beispiel der Messzahlen von Photonenzählereignissen von Licht, das von Fluoreszenz-markierten Teilchen in einer Probe emittiert wird, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Berechnung der erwarteten Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse bereit, die einem gegebenen realen Experiment und Proben einer gegebenen Zusammensetzung entspricht. Die Fähigkeit, die Verteilung der Anzahl von Zählereignissen, die Proben einer gegebenen Zusammensetzung entspricht, vorherzusagen, ermöglicht es bei der Untersuchung von Proben mit unbekannter Zusammensetzung, das Modell der Probe herauszufinden, das die beste Anpassung zwischen der berechneten und der experimentell bestimmten Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse ergibt. Die "Zusammensetzung der Probe" bedeutet hier die spezifische Helligkeit und Konzentration der in der Probe vorhandenen Teilchen. Zum Beispiel ist eine Lösung eines einzigen Fluoreszenzfarbstoffs durch zwei Parameter charakterisiert: die Konzentration und die spezifische Helligkeit der Farbstoffmoleküle. Ein Gemisch von zwei Fluoreszenzfarbstoffen ist durch vier Parameter charakterisiert: die Konzentrationen und die spezifischen Helligkeiten der beiden Arten von Molekülen. Ein komplexes Gemisch kann durch die Verteilungsfunktion der Konzentration in Abhängigkeit von der spezifischen Helligkeit der Moleküle charakterisiert werden. Zweckmäßigerweise wird die Konzentration als mittlere Anzahl von Teilchen pro Messvolumen ausgedrückt, und die spezifische Helligkeit wird als mittlere Zählrate pro Teilchen ausgedrückt.
Andererseits hängt die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse nicht nur von der Zusammensetzung der Probe, sondern auch von den Geräten ab: zuallererst von der räumlichen Helligkeitsfunktion, die für den optischen Aufbau charakteristisch ist, und von einigen Merkmalen des Detektors, wie seiner Dunkelzählrate, seiner Totzeit und der Wahrscheinlichkeit des Nachpulsens. Im Interesse einer hohen Qualität der Analyse, die durch das Erreichen einer genauen Anpassung zwischen den experimentell bestimmten und den berechneten Kurven angezeigt wird, werden die Geräte vorzugsweise ausreichend charakterisiert.
Gemäß der Erfindung wird eine neue Qualität der Analyse von Proben möglich, die Teilchen enthalten, welche Strahlung, vorzugsweise Licht, emittieren, streuen und/oder reflektieren. In einem ersten Schritt wird die Anzahl der Photonenzählereignisse aus Strahlung, die von den Teilchen in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, in einem repetitiven Modus pro Zeitintervall einer definierten Länge gemessen. Für eine komplexere Analyse kann auch eine Reihe von unterschiedlichen Zeitintervallen verwendet werden. In Schritt 1 wird die Anzahl der Photonenzählereignisse in einem repetitiven Modus gemessen, d. h. die Anzahl der nachgewiesenen Photonen wird vorzugsweise viele Male bestimmt, wobei das Verfahren in einer Reihe von vorzugsweise aufeinanderfolgenden Zeitintervallen wiederholt wird, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Die Länge des Zeitintervalls ist die Dauer des Zeitintervalls, während derer die Anzahl der Photonenzählereignisse bestimmt wird. Die Länge des Zeitintervalls wird gewöhnlich in Mikrosekunden oder Millisekunden oder anderen Zeiteinheiten ausgedrückt.
In einem zweiten Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung wird eine Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse pro Zeitintervall bestimmt, was bedeutet, dass bestimmt wird, wie oft man eine bestimmte Anzahl von Photonenzählereignissen erhalten hat. Die Verteilung ist eine Funktion der Anzahl der Photonenzählereignisse, die entweder die relative oder die absolute Anzahl von beobachteten (oder erwarteten) Ereignissen ausdrückt, wenn eine bestimmte Anzahl von Photonenzählereignissen erhalten wurde (oder wird).
In einem dritten Schritt wird die experimentell bestimmte Verteilung der Photonenzählereignisse direkt ohne Zwischenschritte analysiert, so dass man eine Verteilung der spezifischen Helligkeiten der Teilchen in der Probe erhält.
Vorzugsweise überwacht wenigstens eine Nachweiseinrichtung die Anzahl der Photonenzählereignisse. Jeder Detektor, der von Teilchen der Probe emittierte, gestreute und/oder reflektierte Strahlung nachweisen kann, kann verwendet werden, wobei die Strahlung vorzugsweise aus wenigstens einem Messvolumen stammt. Geeignete Nachweiseinrichtungen, wie eine Lawinenphotodiode, ein Photomultiplier (Sekundärelektronenvervielfacher) oder herkömmliche Photodioden, sind dem Fachmann wohlbekannt. Es könnte auch bevorzugt sein, einen Multidetektor zu verwenden, der aus einer monolithischen Konfiguration einer Vielzahl von Detektoren besteht, insbesondere wenn man eine Menge von Proben parallel messen will, wie es beim miniaturisierten Hochdurchsatz-Screening der Fall ist. Es könnte weiterhin bevorzugt sein, einen zweidimensionalen Multiarray-Detektor zu verwenden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Teilchen vorzugsweise lumineszenzmarkierte oder unmarkierte, vorzugsweise natürlich lumineszente, Moleküle oder Makromoleküle oder Farbstoffmoleküle, molekulare Aggregate, Komplexe, Vesikel, Zellen, Viren, Bakterien, Kügelchen oder Gemische davon.
Die Lumineszenzeigenschaften der Teilchen können variiert werden, indem man sie über verschiedene Linkermoleküle mit einem spezifischen Luminophor konjugiert. Es kann bevorzugt sein, polymere Linkermoleküle zu verwenden, die aus einer variablen Anzahl von gleichen oder verschiedenen Monomeren bestehen.
Es kann vorteilhaft sein, wenigstens eines der Teilchen mit einer speziellen Stelle zu versehen, an die eine Affinitätssubstanz mit nachweisbaren Eigenschaften bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat wenigstens eines der Teilchen eine Markierung mit Histidinresten, an die eine Affinitätssubstanz, wie ein Chelatkomplex, binden kann. Es kann bevorzugt sein, Komplexe von Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) und eines Lumineszenzmarkers als Affinitätssubstanz zu verwenden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Komplex zwei oder mehr chelatisierende Gruppen und wenigstens einen Lumineszenzmarker.
Die Lumineszenzeigenschaften der Teilchen können auch variiert werden, indem man sie mit einem ersten Molekül, wie z. B. Biotin, konjugiert, das ein lumineszenzmarkiertes zweites Molekül, wie z. B. lumineszenzmarkiertes Avidin oder Streptavidin, bindet, oder umgekehrt, wie es im Einzelnen in Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Lumineszenzeigenschaften eines Teilchens können also durch Energieübertragung geändert werden. Von einem Donor absorbierte Energie wird bei nahem Kontakt zum Luminophor einer Akzeptoreinheit übertragen und anschließend emittiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform tragen die Teilchen jeweils mehrere Bindungsstellen für lumineszente Teilchen. Lumineszente Teilchen können direkt oder über sekundäre Moleküle an diese Bindungsstellen binden. Da hochgradig lumineszente Teilchen erzeugt werden, wenn viele lumineszente Teilchen an die Bindungsstellen der ersten Teilchen binden, ist das Verfahren gemäß der Erfindung in der Lage, zwischen Teilchen mit einem großen Unterschied in der Lumineszenzintensität leicht zu unterscheiden, so dass selbst eine kleine Menge an gebundenen lumineszenten Teilchen in Gegenwart einer überschüssigen Konzentration freier lumineszenter Teilchen gemessen werden kann. Diese Ausführungsform ergibt eine neue Analyse von Teilchen, die keinen Lumineszenzmarker tragen, durch Bindung an ein zweites Teilchen, das lumineszenzmarkiert ist, dessen Helligkeit sich jedoch bei der Bindung nicht ändert. Eine kommerziell sehr wichtige Anwendung dieses Verfahrens ist die Messung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die an ein Antigen binden, während das Antigen an wenigstens eine der mehreren Bindungsstellen des Teilchens, das vorzugsweise ein Kügelchen ist, bindet oder umgekehrt. Das Verfahren kann auch auf andere Arten von Wechselwirkungen angewendet werden, wie Nucleinsäure-Hybridisierung oder Protein/Nucleinsäure-Wechselwirkung. Die Erfindung lässt sich auch auf die Analyse der Verteilungseigenschaften der Teilchen anwenden, wie für die Qualitätskontrolle und Verfahrenskontrolle von Polymeren oder oligomeren Suspensionen von Teilchen. Außerdem können Oberflächen von Teilchen sowie Verteilungen von Oberflächen von Teilchen analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform trägt eine Art von Teilchen, im folgenden als "A" bezeichnet, mehr als eine Bindungsstelle. Eine andere, lumineszente Art von Teilchen, im folgenden als "C" bezeichnet, kann (i) entweder direkt an wenigstens eine der Bindungsstellen des Teilchens A binden oder (ii) bindet an wenigstens eine Bindungsstelle eines Moleküls B, das wiederum an wenigstens eine der Bindungsstellen des Teilchens A bindet. Diese Bindungen können entweder durch natürlich vorkommende Bindungsstellen an den Teilchen oder durch die Einführung spezieller Bindungsstellen an die Teilchen A, B und/oder C vermittelt werden. Da in beiden Fällen mehr als eines der Teilchen der Art C an das Teilchen A binden kann, emittiert der Komplex mehr Photonen als freie Teilchen der Art C. Diese Ausführungsform liefert einen bequemen Weg zur Messung der Bindung von Teilchen der Art B an ein Teilchen der Art C oder A, obwohl das Teilchen der Art B nicht lumineszenzmarkiert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Messvolumen nur ein Teil des Gesamtvolumens der Probe, wobei die Teilchen in das Messvolumen und wieder heraus diffundieren und/oder aktiv transportiert werden und/oder die Probe aktiv transportiert und/oder optisch abgetastet wird. Wenn die Teilchen, z. B. fluoreszente Teilchen, ausreichend klein sind, ist die Diffusion schnell genug für eine Datenerfassung aus einer großen Zahl von unabhängigen Messvolumina, und die Datenerfassung unter Verwendung von zeitlicher Mittelung ist fast identisch mit Mittelung über ein Ensemble. Wenn die charakteristische Diffusionszeit wesentlich länger ist als das für die Messung der Fluoreszenzintensität notwendige Zeitintervall (das gewöhnlich 10 bis 50 μs beträgt), kann der aktive Transport (Fließen oder Abtasten) bei der Datenerfassung erheblich Zeit sparen.
Die Messvolumina können vorzugsweise auf zweidimensionalen Trägern, wie Membranen oder Platten mit Näpfen, angeordnet sein. Geeignete Trägersysteme sind z. B. in WO 94/16313 (Evotec BioSystems GmbH) beschrieben. Die Messvolumina könnten auch linear, wie z. B. in einem Kapillarsystem, angeordnet sein.
Bei Fluoreszenzstudien kann es vorteilhaft sein, Messungen vorzunehmen, um die Hintergrundzählrate zu reduzieren, die sich durch die Raman-Streuung im gelösten Material und die Dunkelzählrate des Detektors in Bezug auf die Zählrate pro Teilchen ergibt. Insbesondere ist es in manchen Fällen bevorzugt, Messvolumina zu verwenden, die kleiner als 100 μm³, besonders bevorzugt etwa 1 μm³, sind. Vorteilhafterweise können das hohe Verhältnis von Signal zu Hintergrundzählrate und das kleine optische Messvolumen erreicht werden, indem man wenigstens ein Mikroskopobjektiv, vorzugsweise mit einer numerischen Apertur von ≥ 0,9, in konfokaler Weise sowohl zum Fokussieren eines einfallenden Laserstrahls als auch zum Auffangen der Strahlung, vorzugsweise Licht, die von Teilchen in den Proben emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, verwendet. Vorzugsweise wird ein konfokaler Mikroskopaufbau verwendet, der wenigstens ein Mikroskopobjektiv, einen dichroitischen Spiegel, eine Lochblende in der Bildebene des Mikroskopobjektivs, eine Nachweiseinrichtung, eine Datenerfassungseinrichtung und gegebenenfalls Einrichtungen zum Abtasten und/oder aktiven Transportieren der Probe umfasst. Eine geeignete Vorrichtung ist in WO 94/16313 (Evotec BioSystems GmbH) offenbart. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Lochblende durch einen geeigneten Detektor ersetzt sein, wie er auch in WO 94/16313 beschrieben ist. Es könnte weiterhin bevorzugt sein, den Arbeitsabstand zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem Messvolumen so zu wählen, dass Hintergrundbeiträge minimiert werden. Vorzugsweise sollte der Arbeitsabstand kleiner als 1000 μm sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird Mehrfachphotonenanregung verwendet, um ein Teilchen anzuregen. Mehrfachphotonenanregung bedeutet, dass die Summe, Differenz oder eine beliebige Kombination von Wellenfrequenzen von zwei, drei oder mehr Photonen für die Anregung der Sekundäremission der Probe verwendet wird, bei der es sich z. B. um Lumineszenz oder Raman-Streuung zweiter Ordnung handeln kann. Ein solches Anregungsschema hat den Vorteil, dass die Anregungswahrscheinlichkeit nicht linear, sondern von der zweiten oder einer höheren Potenz der Anregungsintensität abhängt. Die Mehrfachphotonenanregung ist also meistens auf das Volumen des Laserbrennpunkts beschränkt, während außerhalb des Laserbrennpunkts keine falsche Anregung erzeugt wird. Geeignete Laserquellen für Picosekunden- oder Subpicosekunden-Pulse sind dem Fachmann wohlbekannt. Die vorliegende Erfindung profitiert insofern von einem solchen Anregungsschema, als weniger Hintergrund erzeugt wird als bei Einzelphotonenanregung und dass keine Lochblende notwendig ist, um das Messvolumen einzuschränken. Der Lochblendendurchmesser und seine Abbildung auf den Detektor gehen also nicht mehr als Modellierungsparameter in die räumliche Helligkeitsfunktion ein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Messvolumen durch die Verwendung von Elementen der Nahfeldmikroskopie eingeschränkt. Diese können verwendet werden, um die Anregungsstrahlung der Teilchen zu fokussieren und/oder um die von den Teilchen emittierte, gestreute und/oder reflektierte Strahlung aufzufangen. Optische Nahfeldmikroskopie bedeutet hier, dass das Licht durch eine Öffnung tritt, bei der wenigstens eine ihrer Abmessungen kleiner ist als die Wellenlänge des verwendeten Lichts und die in direktem Kontakt mit dem Messvolumen steht. Die Öffnung kann aus einer undurchsichtigen Schicht mit wenigstens einem Loch mit dem Durchmesser oder wenigstens einem Spalt mit geeigneter Breite und/oder aus einer sich verjüngenden Glasfaser oder einem Wellenleiter mit einem Spitzendurchmesser der Breite, der gegebenenfalls auf der Außenseite mit einer undurchsichtigen Schicht beschichtet ist, bestehen. Eine geeignete Vorrichtung ist in WO 96/13744 und im Deutschen Patent 44 38 391 (Evotec BioSystems GmbH) offenbart.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform kombiniert die optische Nahfeldmikroskopie für den Anregungslichtweg mit herkömmlicher optischer Mikroskopie für den Emissionslichtweg oder umgekehrt. Die vorliegende Erfindung profitiert von einer solchen Realisierung in dem Sinne, dass die Größe des Messvolumens im Vergleich zur herkömmlichen konfokalen Mikroskopie reduziert ist. Die vorliegende Erfindung kann also verwendet werden, um eine höhere Konzentration an Teilchen zu messen als bei anderen optischen Konfigurationen.
Eine Probe ist gewöhnlich durch Werte der Konzentration und der spezifischen Helligkeit von einer oder mehreren Spezies von Arten von fluoreszenten Teilchen charakterisiert. In Fällen, wenn einer oder mehrere dieser Werte im voraus bekannt sind, besteht das Ziel der Analyse darin, unbekannte Werte, entweder solche der Konzentration oder der spezifischen Helligkeit oder beide, zu bestimmen.
Zwei alternative Verfahren zum Auswählen des Modells, das eine Anpassung zwischen der experimentell bestimmten und der berechneten Funktion ergibt, vorzugsweise Verteilungen der Anzahl der Photonenzählereignisse, können verwendet werden. In einer Ausführungsform, kann das wohlbekannte Anpassungsverfahren der kleinsten Quadrate eingesetzt werden, wobei die Probe durch eine endliche (gewöhnlich kleine) Zahl von Parametern beschrieben wird. Der Zweck ist, Werte für die Parameter zu finden, die die beste Anpassung zwischen der experimentellen und der berechneten Kurve ergeben. Gemäß der Erfindung können Werte für die Konzentrationen und/oder spezifischen Helligkeiten mehrerer Spezies von Teilchen, z. B. Arten von fluoreszenten Teilchen, geschätzt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann ein anderes allgemeinen Verfahren eingesetzt werden, das inverse Transformation mit linearer Regularisierung (ITR) genannt wird. ITR beschreibt die Probe unter Verwendung einer halbkontinuierlichen Verteilungsfunktion von Teilchen in Abhängigkeit von ihrer spezifischen Helligkeit und sucht nach der besten Anpassung, wobei gefordert wird, dass die Lösung eine glatte Funktion ist. (Wegen des Verfahrens der ITR, siehe z. B. W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, B. P. Flannery, Numerical recipes in C: the art of scientific computing, second edition, Cambridge University Press, 1992, S. 808). Es könnte weiterhin bevorzugt sein, eine inverse Transformation mit Nebenbedingungen (ITC) oder eine inverse Transformation mit Regularisierung und Nebenbedingungen (ITRC) zu verwenden. Wegen statistischer Fehler und begrenzter Größen gemessener Daten ist die inverse Transformation häufig ein schlecht gestelltes mathematisches Problem, das im Ergebnis durch heftige Oszillationen charakterisiert ist. ITR, ITC und ITRC stabilisieren das mathematische Problem, indem sie nach einer "regulären" (z. B. einer glatten) oder durch Nebenbedingungen eingeschränkten Lösung suchen, indem sie zum Beispiel die Summe der quadrierten Abweichungen von statistischen Daten und einer Funktion der Lösung selbst minimieren, wobei "irreguläre", gewöhnlich nicht reproduzierbare Strukturen im Ergebnis oder Werte ohne physikalische Bedeutung unterdrückt werden. Ein Beispiel für eine Nebenbedingung ist der Ausschluss von negativen Werten für die Konzentration.
Im folgenden wird die Erfindung weiterhin in nichteinschränkender Weise erläutert. Insbesondere wird beschrieben, wie die erwartete Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse bestimmt wird.
Ein vorzugsweise viele Male wiederholter Schritt bei der Berechnung der Wahrscheinlichkeitsverteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse ist die Berechnung der Wahrscheinlichkeitsverteilung der Anzahl der Zählereignisse für Photonen, die von einer einzigen Spezies aus einem räumlichen Abschnitt des Messvolumens mit einem konstanten Wert des räumlichen Helligkeit emittiert, gestreut und/oder reflektiert wurden. Es ist wohlbekannt, dass die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Anzahl der Teilchen in einem offenen Volumen eine Poisson-Verteilung ist. Wenn die Zahl der Teilchen innerhalb des räumlichen Abschnitts gegeben ist, ist außerdem auch die Zahl der nachgewiesenen Photonen pro Tastzeitintervall Poisson-verteilt. Folglich ist die Gesamtverteilung der Anzahl der Zählereignisse für Photonen, die von einer einzigen Spezies aus einem räumlichen Abschnitt mit konstanter Helligkeit emittiert, gestreut und/oder reflektiert und von einem idealen Detektor nachgewiesen werden, eine überlagerte Poisson-Verteilung.
Als nächster Schritt kann man den Fall untersuchen, bei dem das Messvolumen in mehrere räumliche Abschnitte mit konstanter Helligkeit unterteilt wird. Wenn die Werte von Volumina und räumlichen Helligkeiten in jedem der Abschnitte bekannt sind, kann die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, die jedem Abschnitt entsprechen, getrennt bestimmt werden. Alle diese Verteilungen sind überlagerte Poisson-Verteilungen. Wenn weiterhin Verteilungen der Zahl der Photonenzählereignisse für alle Abschnitte bekannt wären, könnte die Gesamtverteilung durch Faltungen bestimmt werden, wobei man die Tatsache verwendet, dass die Gesamtzahl der Zählereignisse die Summe der Zahl der Zählereignisse ist, die aus verschiedenen Abschnitten des Messvolumens stammen.
Als folgenden Schritt kann man ein Gemisch von Spezies untersuchen, z. B. Gemische von fluoreszenten Teilchen mit verschiedenen Werten der spezifischen Helligkeit. Jeder räumliche Abschnitt des Messvolumens kann in eine Anzahl von abstrakten Teilabschnitten unterteilt werden, von denen jeder nur Teilchen einer einzigen Spezies enthält. Es kann jetzt ein ähnliches Verfahren angewendet werden, wie es oben für räumliche Abschnitte des Messvolumens beschrieben ist, um die Gesamtverteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse zu bestimmen.
Eine experimentell bestimmte Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse wird nicht nur von den Eigenschaften des Lichtstrahls beherrscht, sondern wird auch von nichtidealen Eigenschaften des Photonendetektors beeinflusst. Stochastisch verhalten sich die Dunkelzählereignisse des Detektors in derselben Weise wie Photonenzählereignisse von Hintergrundlicht mit konstanter Intensität. Ihr Beitrag sind Photonenzählereignisse mit Poisson-Verteilung. Außerdem sind die Art und Weise, wie die Totzeit des Detektors und sein Nachpulsen die Verteilung von Photonenzählereignissen verzerren, aus der Literatur über Pho tonenstatistik bekannt (siehe z. B. B. Saleh, Photoelectron Statistics, Springer, Berlin, 1978).
Um es zusammenzufassen, die erwartete Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse wird einerseits anhand von Merkmalen der Probe (Konzentrationen und spezifische Helligkeiten von fluoreszenten Teilchen verschiedener Art) und andererseits anhand von Merkmalen der Geräte (das Tastzeitintervall, die räumliche Helligkeitsfunktion, die Hintergrundzählrate, die Totzeit und die Nachpulswahrscheinlichkeit des Detektors) bestimmt.
In einer Ausführungsform werden sowohl die Totzeit als auch die Nachpulswahrscheinlichkeit des Detektors aus Experimenten bestimmt, bei denen die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, die Licht konstanter Intensität entspricht, bestimmt wird. Eine Korrektur wegen der Totzeit des Detektors kann auf der Grundlage einer von Cantor und Teich abgeleiteten Formel durchgeführt werden (J. Opt. Soc. Am. 65, 786, 1975; siehe auch B. Saleh, 5. 272–277). Die Mathematik des Nachpulsens ist einfach: Jedem Photonenpuls kann ein anderer (künstlicher) Puls folgen; dies geschieht gewöhnlich mit einer konstanten Wahrscheinlichkeit.
Gemäß der Erfindung wird die räumliche Helligkeitsfunktion vorzugsweise unter Verwendung von Experimenten an einer einzigen Teilchenspezies charakterisiert. Wenn zum Beispiel die Laserwellenlänge 514,5 nm verwendet wird, ist eine Lösung von Rhodamin 6G eine zweckmäßige Probe, die verwendet werden kann, um die räumliche Helligkeitsfunktion zu charakterisieren.
Die Merkmale der räumlichen Helligkeitsfunktion, die eingesetzt werden können, wenn man die erwartete Verteilung der Anzahl der Zählereignisse bestimmt, sind Werte für Volumina der Abschnitte des Messvolumens, die einer ausgewählten Menge von Werten der räumlichen Helligkeit entsprechen. Typischerweise wird eine Menge von zwanzig oder dreißig Werten der räumlichen Helligkeit, die sich auf der logarithmischen Skala in einem konstanten Abstand voneinander befinden, ausgewählt, so dass zwei oder drei Größenordnungen abgedeckt werden.
Der Beitrag von den unteren Helligkeitsbereichen kann durch einen einzigen Parameter, ihr relativer Beitrag zur Fluoreszenzintensität, berücksichtigt werden. Intensitätsfluktuationen dieses Lichts können vernachlässigt werden. Wegen der großen Zahl der Abschnitte des Messvolumens wäre es weniger bevorzugt, Volumina, die jedem der Abschnitte entsprechen, als unabhängige Variablen anzusehen. Es ist zweckmäßig, sie als Variablen anzusehen, die von wenigen anderen Parametern abhängen, und die Werte dieser Parameter zu bestimmen, die die beste Anpassung zwischen der experimentell bestimmten und der berechneten Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse ergeben. Zweckmäßigerweise wird ein relativ einfaches Modell des optischen Aufbaus angewendet, das keine Aberrationen der verwendeten Optik berücksichtigt und das Volumina der Abschnitte des Messvolumens bestimmt. Zum Beispiel hängen die Volumina der Abschnitte von Werten des Konvergenzwinkels des Laserstrahls und des Durchmessers der Lochblende ab. Es könnte daher bevorzugt sein, die Abmessungen der Lochblende und den Konvergenzwinkel des einfallenden Laserstrahls als Modellierungsparameter für die räumliche Helligkeitsfunktion zu verwenden.
Alternativ dazu können auch einfache mathematische Ausdrücke mit formalen Parametern anstelle von physikalischen Modellen verwendet werden, um die Volumina der räumlichen Abschnitte zu bestimmen. Die Werte der formalen Parameter sollten vorzugsweise so ausgewählt werden, dass die beste Anpassung zwischen experimenteller und berechneter Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse erreicht wird. Formale flexible Ausdrücke sind vorteilhaft, da sie eine gute Anpassung zwischen experimenteller und theoretischer Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse ergeben. Zweitens sind Berechnungen auf der Basis von einfachen mathematischen Ausdrücken sehr schnell im Vergleich zu solchen auf der Basis von physikalischen Modellen.
Gemäß der Erfindung kann es in manchen Fällen bevorzugt sein, die Länge des Tastzeitintervalls so auszuwählen, dass im Mittel mehr als ein, vorzugsweise eins bis zehn, Zählereignisse pro Teilchen erzielt werden.
Es kann weiterhin bevorzugt sein, dass die Länge des Zeitintervalls im Mittel kleiner ist als die charakteristische Korrelationszeit von Fluktuationen der Strahlungsintensität.
Wenn mehr als zwei unbekannte Parameter der Probe abgeschätzt werden müssen, gibt es vorzugsweise nicht mehr als ein paar, vorzugsweise etwa ein, Teilchen pro Messvolumen. Vorzugsweise gibt es weniger als 10 Teilchen pro Messvolumen, um gute Signal-Rausch-Verhältnisse zu erhalten.
In einer Ausführungsform wird wenigstens ein einzelnes Teilchen in Bezug auf seine spezifische Helligkeit, die nichtstochastisch fluktuieren oder sich ändern kann, statistisch analysiert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft, da Informationsverluste und Verzerrungen minimal gehalten werden. Weiterhin besteht eine neue Qualität, die durch die vorliegende Erfindung erreichbar ist, darin, dass die Datenverarbeitung weniger von einem bestimmten mathematischen Modell der Probe abhängt als die anderen Techniken, die Stand der Technik sind. Dies bedeutet, dass das Verfahren zuverlässiger ist im Sinne einer Langzeitstabilität einer instrumentellen Realisierung und dass jede Störung des Messvolumens durch z. B. trübe Proben oder Teilchen innerhalb des Laserstrahls die experimentellen Ergebnisse nicht signifikant beeinflusst.
Eine weitere neue Qualität, die durch die vorliegende Erfindung erreichbar ist, besteht darin, dass das Signal-Rausch-Verhältnis viel besser ist als bei den Techniken des Standes der Technik. Dies bedeutet, dass Experimente innerhalb einer erheblich kürzeren Zeit (bis zu 100mal kürzer) als früher durchgeführt werden können und dasselbe Signal-Rausch-Verhältnis zeigen wie frühere Langzeitexperimente. Da die Photobleichung von fluoreszenten Molekülen oder fluoreszent markierten Molekülen bisher bei jeder auf diesem Gebiet angewendeten Messtechnik ein ungelöstes Problem ist, insbesondere bei Anwendung auf Zellen, ist man auf kurze Messzeiten eingeschränkt. Im Vergleich zum Stand der Technik ist die vorliegende Erfindung also für Messungen innerhalb von Zellsystemen vorteilhaft.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet der Untersuchungen von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität realisiert. Das optische Gerät ist ein herkömmliches konfokales FCS-Mikroskop, das mit einem kontinuierlichen Laser im sichtbaren Licht ausgerüstet ist. Der Anregungslaserstrahl wird in eine Probe fokussiert, bei der es sich um eine homogene wässrige Lösung mit einer geringen Konzentration, typischerweise im nanomolaren Bereich, von fluoreszentem Material handelt. Die Fluoreszenzemission aus einem mikroskopischen konfokalen Volumen von etwa 1 μm³ wird mit einem Photonendetektor aufgefangen. Die Messzeit, die typischerweise 1 bis 60 Sekunden beträgt, wird in Hunderte oder Tausende von Zählintervallen mit einer typischen Weite von 10 bis 50 μs aufgeteilt. Die höchste Zahl von Photonenzählereignissen, die bei dieser experimentellen Realisierung der hier beschriebenen Erfindung typischerweise erhalten werden, liegt zwischen 10 und 100.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonders gut zur Verwendung beim Hochdurchsatz-Screening, Diagnostik, Überwachung von Polymerisations-, Aggregations- und Zersetzungsverfahren oder Analytik von Nucleinsäuren geeignet.
Bei Screeningverfahren können Substanzen, die möglicherweise pharmakologisch aktiv sind, über ihre Wechselwirkung mit spezifischen Rezeptoren analysiert werden, indem man die Wechselwirkung mit der Bindung eines lumineszent markierten Liganden an Rezeptoren untersucht, wobei natürliche Rezeptoren an ihren Trägerzellen sowie Rezeptoren an rezeptorüberexprimierenden Trägerzellen oder Rezeptoren an Vesikeln oder Rezeptoren in Form von exprimierten Molekülen oder Molekülkomplexen verwendet werden können. Überdies kann die Wechselwirkung von Substanzen mit Enzymen in Lösung oder in ihrer echten zellulären Umgebung nachgewiesen werden, indem man eine Änderung des Substrats des Enzyms, z. B. eine Änderung der Helligkeit, überwacht. Weitere Anwendungen, insbesondere bezüglich der Leistungsfähigkeit von Assays, sind in WO 94/16313 (Evotec BioSystems GmbH) offenbart.
Für den Nachweis spezifischer Erkennungsreaktionen können in komplexen natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Gemischen, die vor der Analyse einer Trennung unterzogen werden, potentielle Wirkstoffe vorhanden sein. Diese Gemische können zuerst z. B. durch Chromatographie aufgetrennt werden, um die einzelnen Fraktionen auf die Anwesenheit von funktionellen Verbindungen zu testen, vorzugsweise mitlaufend in einer Kapillare am Ende einer Trennmatrix. Die Kopplung von Fraktionierungsverfahren mit FCS-Nachweis wird im Einzelnen in WO 94/16313 (Evotec BioSystems GmbH) beschrieben. Ein ähnlicher Aufbau kann in Bezug auf die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Häufig sind Aggregation und Zersetzung zu überwachende Phänomene. Aggregate weisen Helligkeiten auf, die sich von denen der Monomere unterscheiden, und können gemäß der vorliegenden Erfindung überwacht werden.
Bei der Sequenzierung gemäß dem Verfahren von Sangen werden Oligomere unterschiedlicher Länge, deren endständige Nucleinsäure mit einem Farbstoff markiert ist, identifiziert. Fortgeschrittene Techniken, wie z. B. die in DE 38 07 975 A1 beschriebene, verwenden Farbstoffe, die je nach der Art der Base, an die sie gebunden sind, verschiedene Eigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer, aufweisen. Die Bestimmung einer Base ist viel sicherer, wenn mehrere Eigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer und Helligkeit oder irgendeine andere spezifische physikalische Eigenschaft, bestimmt und auf wechselseitige Konsistenz geprüft werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu sequenzierende Probe durch Gel- oder Kapillarelektrophorese aufgetrennt, oder ein Trennschritt wird durch Kapillarelektrochromatographie, elektrohydrodynamische Migration oder verwandte elektrokinetische Verfahren durchgeführt.
Beispiel 1
Die Natur und die Vorteile der Erfindung werden auf der Grundlage des folgenden Beispiels, in dem ein Gemisch von Rhodaminfarbstoffen analysiert wird, besser verständlich. Die 1 bis 7 zeigen aufeinanderfolgende Schritte der Analyse und ihrer Ergebnisse.
1. Verteilungen der Anzahl der Photonenzählereignisse, experimentell bestimmt bei konstanten Lichtintensitäten, einem Zeitintervall von 10 μs und einer Datensammelzeit von 50 s. Aus der Kurvenanpassung wurde die Totzeit des Detektors auf 28 ± 4 ns geschätzt; die Nachpulswahrscheinlichkeit betrug 0,0032 ± 0,0008. In der unteren Graphik werden gewichtete Restwerte der Kurvenanpassung dargestellt.
2. Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, experimentell bestimmt für eine Lösung von Rhodamin 6G mit einem Zeitintervall von 40 μs und einer Datensammelzeit von 50 s.
3. Normalisierte Größen von Volumina der zwanzig räumlichen Abschnitte des Messvolumens mit der höchsten Helligkeit. Abschnitt 0 entspricht dem maximalen Wert der räumlichen Helligkeit, während Abschnitt 19 einer etwa 100mal geringeren Helligkeit entspricht. Größen von Volumina werden aus Experimenten an einzelnen fluoreszenten Spezies bestimmt.
4. Restwerte der Kurvenanpassung, die einem Experiment an einer Rhodamin-6G-Lösung (dem in 2 graphisch dargestellten Experiment) entsprechen.
5. Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, experimentell bestimmt für drei Proben mit einem Zeitintervall von 40 μs und einer Datensammelzeit von 50 s. Die Verteilung, die Rhodamin 6G entspricht, ist dieselbe wie in 2.
6. Die Ergebnisse der inversen Transformation mit linearer Regularisierung, die auf die Daten von 5 angewendet wurde.
7. Restwerte, die der Analyse eines Experiments an der gemischten Lösung von Rhodamin 6G und Tetramethylrhodamin (gemessene Daten in 5) entsprechen. Graphik a: Die erwartete Kurve wurde durch inverse Transformation mit linearer Regularisierung erhalten. Graphik b: Die erwartete Kurve wurde durch die Kleinste-Quadrate-Anpassung der experimentellen Daten erhalten. Graphik c: Die Restwerte der Kleinste-Quadrate-Kurvenanpassung unter der falschen Annahme einer einzigen Spezies.
Als erster vorbereitender Analyseschritt werden die Totzeit und die Nachpulswahrscheinlichkeit des Photonendetektors abgeschätzt. Dies erfolgte durch Bestimmung der Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse unter Beleuchtung des Detektors durch Licht mit konstanter Intensität. Da sich die Totzeitverzerrungen bei hohen Zählraten am stärksten bemerkbar machen, während die Nachpulsverzerrungen bei niedrigen Zählraten besser aufgelöst sind, wurden die Werte für die Totzeit und für die Wahrscheinlichkeit des Nachpulsens bestimmt, indem man Verteilungen der Anzahl von Photonenzählereignissen, die bei einer relativ hohen und bei einer relativ niedrigen Beleuchtungsintensität bestimmt wurden, gemeinsam anpasste. Die experimentell bestimmten Verteilungen der Zahl der Zählereignisse sind in 1 zusammen mit Restwerten der Kurvenanpassung gezeigt. Werte der geschätzten Parameter für den Photonendetektor, die verwendet wurden, sind: Totzeit 28 ns, Nachpulswahrscheinlichkeit 0,003.
Die Hintergrundzählrate des Geräts wird bestimmt, indem man die Zählrate misst, wenn der Probenhalter mit reinem Wasser gefüllt ist.
Als zweiter vorbereitender Schritt wurde die räumliche Helligkeitsverteilung charakterisiert, die einem gegebenen optischen Aufbau entspricht. Zu diesem Zweck wurde die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, die einer Lösung von Rhodamin 6G entspricht, experimentell bestimmt (2). Wenn die räumliche Helligkeitsverteilung in geeigneter Weise charakterisiert wird, passt die berechnete Kurve zu der experimentellen Kurve. Um die erwartete Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse numerisch zu berechnen, werden in unserem Programm Werte von einundzwanzig Parametern benötigt, die das räumliche Profil charakterisieren: zwanzig Größen von Volumina, die zwanzig räumlichen Abschnitten mit den höchsten Werten der räumlichen Helligkeit entsprechen, und der relative Beitrag zum Fluoreszenzlicht, der aus Bereichen mit niedrigerer räumlicher Helligkeit stammt. Um Werte dieser unbekannten Parameter zu berechnen, wurde ein einfaches Modell der optischen Geräte, das keine Aberrationen berücksichtigte, verwendet. Wie in 3 gezeigt ist, sind die bestimmten Größen der zwanzig Volumina reproduzierbar, auch wenn andere Spezies als Rhodamin 6G verwendet werden.
Mit den bestimmten Werten der einundzwanzig Parameter, die die räumliche Helligkeitsverteilung in der soeben beschriebenen Weise charakterisieren, passt die berechnete Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse tatsächlich zu der experimentellen Kurve, siehe 4.
Nach den oben beschriebenen vorbereitenden Schritten ist das Gerät bereit für eine Analyse. In 5 sind Verteilungen der Anzahl der Photonenzählereignisse dargestellt, die drei verschiedenen Proben entsprechen. In 6 sind die Ergebnisse der inversen Transformation mit linearer Regularisierung graphisch dargestellt. Beide Spektren, die einzelnen Spezies entsprechen (Rhodamin 6G oder Tetramethylrhodamin) haben einen einzelnen Peak, aber die Peaks sind auf verschiedenen Werten der spezifischen Helligkeit zentriert. Der Peak von Rhodamin 6G liegt bei etwa 108 kHz/Molekül, während der Peak von Tetramethylrhodamin bei etwa 37 kHz/Molekül zentriert ist. Dies deutet darauf hin, dass ein Rhodamin-6G-Molekül etwa dreimal heller ist als ein Tetramethylrhodamin-Molekül. Das Spektrum, das dem Gemisch der beiden Spezies entspricht, hat zwei Peaks, die tatsächlich in der Nähe der Werte zentriert sind, die man für die beiden Spezies getrennt erhalten hat.
7 zeigt die Restwerte, die den Messungen des Gemischs von Rhodamin 6G und Tetramethylrhodamin entsprechen. Verschiedene Verfahren der Datenverarbeitung ergeben leicht unterschiedliche Anpassungskurven (und verschiedene Restwerte). Die obere Graphik entspricht dem Spektrum der spezifischen Helligkeit, das man durch inverse Transformation mit linearer Regularisierung erhält. Die mittlere Graphik entspricht der Anpassungskurve, die man bei Annahme von zwei Spezies erhält. Diese beiden Graphiken sind fast identisch. Die experimentell bestimmte Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse kann formal unter der falschen Annahme von einzelnen Spezies angepasst werden, was in der unteren Graphik gezeigt ist, aber die Anpassungskurve weicht offensichtlich von der experimentellen ab.
Beispiel 2
Um weiterhin die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, wurde ein Hybridisierungsvorgang unter Verwendung eines herkömmlichen konfokalen FCS-Mikroskops untersucht. Ein Modellsystem auf der Basis der Wechselwirkung von zwei 32-Basen-Oligonucleotiden, die beide mit dem Fluoreszenzfarbstoff TAMRA (5-(und 6-)Carboxytetramethylrhodamin) markiert sind, wurde untersucht. Die Sequenz dieser Oligonucleotide beinhaltete eine Stelle für das Restriktionsenzym EcoRI, die die Spaltung des Primerdimers ermöglicht. Diese Restriktionsanalyse wurde als Kontrolle verwendet, um die Spezifität der mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse zu überprüfen.
Die Hybridisierung wurde in einem 10 mM Tris-Puffer (pH 7,4), der 1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, durchgeführt, und die Restriktionsanalyse wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 0,2% Triton X-100 durchgeführt. Die Messzeit für jede Analyse betrug 30 Sekunden.
B. Zahl der Teilchen pro Volumenelement als Funktion ihrer spezifischen Helligkeiten.
Die Analyse der TAMRA-markierten einzelsträngigen Oligonucleotide ergab bei Anregung bei 543 nm einen einzigen charakteristischen Peak der Fluoreszenzintensität von 45 kHz für Oligonucleotid A (8a) und von 20 kHz für Oligonucleotid B (8b).
Die Hybridisierung der Oligonucleotide A und B führte zu einem einzigen Intensitätspeak von 35 kHz (8c), was darauf hinweist, dass die Hybridisierung vollständig war. Aufgrund der Intensitätswerte für die einzelnen Oligonucleotide würde man einen Intensitätspeak von 65 kHz für dieses Primerdimer erwarten. Diese Diskrepanz in der Intensität kann durch das Auftreten von Farbstoff-Nucleotid-Wechselwirkungen und durch Elektronenübertragung-induziertes Löschen erklärt werden.
Einen weiteren Beweis dafür, dass der Intensitätspeak von 35 kHz das Primerdimer darstellt, erhält man durch ein Spaltungsexperiment unter Verwendung von EcoRI (8d). Die Restriktionsspaltung der assoziierten Primer führt zu einem Intensitätspeak von 20 kHz. Die Verbreiterung der Intensitätsverteilung weist darauf hin, dass die Reaktion nicht vollständig war.
Diese Experimente zeigen, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gut geeignet ist, um Hybridisierungsvorgänge zu untersuchen, die für den Nachweis und die Charakterisierung von Pathogenen eine wichtige Rolle spielen. Die Fähigkeit des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Messung der Aktivität einer Restriktionsendonuclease wurde durch diese Reihe von Experimenten ebenfalls demonstriert.
Beispiel 3
Biotin, mit den folgenden verschiedenen Farbstoffen markiert

a) 5-(und 6-)Carboxy-X-rhodamin (Abk. ROX)
b) 5-(und 6-)Carboxytetramethylrhodamin (Abk. TAMRA)
c) Rhodolgrün^TM
d) Rhodamingrün^TM
e) Resorufin
f) Texasrot^® und
g) Rhodamin B mit und ohne Spacermolekül (Abk. Sp.) sowie ihre Gemische mit Streptavidin wurden gemäß dem Verfahren der vorliegenden Endung analysiert, um Löscheffekte von unterschiedlich markiertem Biotin auf die Streptavidin-Bindung zu überwachen.

9 zeigt die spezifischen Helligkeiten der unterschiedlichen Moleküle. Die Anwesenheit von Streptavidin wird durch "+" angezeigt, während seine Abwesenheit durch "-" angezeigt wird.
Beispiel 4
Das folgende Beispiel beweist, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Messung von Liganden, die an Rezeptorpopulationen an Membranvesikeln gebunden sind, wertvoll ist.
Die Verwendung von rohem biologischem Material, wie von Gewebe oder Zellen abgeleitete Biomembranen, in Assays zur Analyse durch Einzelteilchen-Fluoreszenznachweisanalyse führt zu Fragen, die sich mit der Natur und Heterogenität dieses Materials befassen. Wenn Membranpräparate aus rezeptorüberexprimierenden Zellen erzeugt werden, ist die wahrscheinlichste Situation, dass es viele Rezeptormoleküle auf einem einzigen Membranvesikel gibt. Für eine Analyse der Bindung von Fluoreszenzliganden an diese Rezeptoren ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ideal geeignet, da es zwischen Teilchen, die unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten aufweisen, diskriminiert. Membranvesikel sind sich langsam bewegende Teilchen (mittlere Diffusionszeit τ_diff > 10 ms) in einer niedrigen Konzentration. Um ein vernünftiges Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, müssen die Messzeiten für diese seltenen Ereignisse also im Vergleich zu denen für nanomolare Fluorophorlösungen verlängert werden. Um die Mess zeit zu verkürzen und die statistische Genauigkeit zu verbessern, musste das zu analysierende effektive Volumen wesentlich erhöht werden, ohne den Vorteil des Nachweises einzelner Moleküle zu verlieren. Dies wurde durch Einführung einer Strahlabtastvorrichtung erreicht. Bei Verwendung eines Strahlabtasters werden auch Bleichwirkungen umgangen, da die mittlere Anregungszeit eines einzelnen Vesikels durch die Bewegung des Laserstrahls minimiert wird.
Die Möglichkeit der Quantifizierung einer biologischen Wechselwirkung durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird demonstriert, wobei man epidermalen Wachstumsfaktor (Abk. EGF) verwendet, der an Membranvesikel von humanen Carcinomzellen A431 bindet. Diese Zellen exprimieren 10⁵ bis 10⁶ Rezeptoren des epidermalen Wachstumsfaktors pro Zelle.
Membranvesikelpräparate
Membranpräparate wurden durch Zellaufschluss in einem hypotonischen Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂), der Protease-Inhibitoren (Leupeptin, Aprotinin und PMSF) enthielt, unter Verwendung eines Glashomogenisators und einer Hochleistungszentrifugation nach der Entfernung von Zellkernen bei geringer Zentrifugalbeschleunigung angefertigt. Während des ersten Zentrifugationsschritts wurde 10% Saccharose hinzugefügt. Die Membranen wurden vor dem Experiment in EGF-Bindungspuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 4,2 mM NaHCO₃ und 5,5 mM Glucose) homogenisiert, wobei man ein Branson-Ultraschallgerät verwendete. Der Proteingehalt wurde mit Bichinchoninsäure (Pierce) zu 0,504 mg/ml (A431) bestimmt.
EGF-Bindungsstudien
Bindungsexperimente unter Verwendung von mit Tetramethylrhodamin (Abk. TMR) markiertem EGF und A431-Membranen wurden nach Carraway et al. (J. Biol. Chem. 264: 8699, 1989) durchgeführt. Kurz gesagt, sie wurden mit EGF-Bindungspuffer verdünnt und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur mit markiertem Ligand in 20-μl-Proben inkubiert. In Konkurrenzexperimenten wurden Membranen mit unmarkiertem EGF inkubiert. Messungen von 30 Sekunden Dauer wurden durchgeführt, wobei man eindimensionale Strahlabtastung mit 25 Hz und einer Amplitude von 700 μm verwendete.
10 zeigt eine Auftragung der Menge an Ligand-Rezeptor-Komplexen gegen die Gesamtligandkonzentration.
11 zeigt Beispiele für Intensitätsverteilungen, die bei bestimmten Konzentrationen von A431-Vesikeln gemessen wurden.
Die y-Achse der Intensitätsverteilungen in 11 wird konstruiert, indem man die für jede Intensität in dem Gitter der Intensitäten erhaltene Teilchenzahl mit der Intensität dieses Gitterpunkts multipliziert, was den Beitrag von Teilchen bei dieser Intensität zur Gesamtintensität darstellt. Vorzugsweise wird diese Transformation gewählt, da sie Teilchen mit hoher Intensität, aber geringer Konzentration hervorhebt, was bei Vesikeln mit gebundenem Liganden der Fall ist. In Bezug auf Teilchenzahlen (Konzentration) würden Vesikel nur einen vernachlässigbaren Beitrag leisten.
11a zeigt die Intensitätsverteilung des Liganden allein. Der Ligand hat eine Intensität von etwa 40 kHz/Teilchen. In den 11b–d sind Intensitätsverteilungen mit steigenden Konzentrationen von Vesikeln aufgetragen. Die Erhöhung der Fluoreszenz von hellen Teilchen, d. h. Vesikeln mit vielen Ligand-Rezeptor-Komplexen auf diesen, ist eindeutig sichtbar.
Um den Grad der Bindung zu quantifizieren, muss man zwischen ungebundenem Liganden und Ligand-Rezeptor-Komplexen unterscheiden. Vesikel mit mehreren gebundenen Liganden sind heller als der Ligand allein. Es wird also eine bestimmte Diskriminierungsintensität I_d gewählt. Bei unterhalb dieser Intensität nachgewiesenen Teilchen wird angenommen, dass es sich um Ligandmoleküle handelt, während oberhalb dieser Intensität nachgewiesene Teilchen als Vesikel mit Rezeptor-Ligand-Komplexen gezählt werden.
Die Konzentration c_L des freien Liganden wird bestimmt, indem man über alle Konzentrationen unterhalb der Diskriminierungsintensität summiert:
Die Konzentration c_RL an Ligand-Rezeptor-Komplexen ist durch die Annahme gegeben, dass ein Vesikel mit n gebundenen Liganden eine Intensität vom n-fachen der Ligandenintensität hat. Eine Intensitätskomponente bei einer Intensität I stammt also von einem Vesikel mit n = I/I_Ligand Ligand-Rezeptor-Komplexen, und die Konzentration dieser Komplexe ist gegeben durch:
Der Grad der Komplexbildung ist jetzt gegeben durch
Dies ist in 10 für die Bindung von markiertem EGF an A431-Vesikeln aufgetragen.

Claims

Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die Teilchen enthalten, durch Messen von fluktuierenden Strahlungsintensitäten, die von den Teilchen in wenigstens einem Messvolumen emittiert, gestreut und/oder reflektiert werden, wobei die Messung durch wenigstens eine Nachweiseinrichtung erfolgt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Messen der Anzahl der Photonenzählereignisse in einem repetitiven Modus pro Zeitintervall einer definierten Länge; b) Bestimmung einer Verteilungsfunktion der Anzahl der Photonenzählereignisse pro Zeitintervall; c) Bestimmen einer Verteilungsfunktion der spezifischen Helligkeit der Teilchen auf der Basis der Verteilungsfunktion der Anzahl der Photonenzählereignisse durch Herausfinden des Modells der Probe, die die genaueste Übereinstimmung zwischen der experimentell bestimmten und einer erwarteten Verteilungsfunktion der Anzahl der Photonenzählereignisse ergibt; wobei die erwartete Verteilungsfunktion der Anzahl der Photonenzählereignisse unter Verwendung von Merkmalen der räumlichen Helligkeitsfunktion der Ausrüstung bestimmt wird; – Einsetzen von Werten von Volumina von Abschnitten des Messvolumens, die einer ausgewählten Menge von Werten der räumlichen Helligkeit entsprechen und Betrachten der Volumina als Variablen, die von den Modellierungsparametern der räumlichen Helligkeitsfunktion abhängen; und – Bestimmen derjenigen Werte dieser Parameter, die die genaueste Übereinstimmung zwischen einer experimentell bestimmten und einer berechneten Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse ergibt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die räumliche Helligkeitsfunktion in einem Vorbereitungsschritt charakterisiert wird, wobei man Experimente mit einer einzigen Spezies von Teilchen verwendet.
Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse von Photonen, die von einzelnen Spezies aus einem Raumabschnitt mit konstanter Helligkeit emittiert, gestreut und/oder reflektiert und von einem idealen Detektor nachgewiesen werden, eine überlagerte Poisson-Verteilung ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Gesamtverteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse für alle Abschnitte durch Faltungen bestimmt wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Gesamtverteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse für ein Gemisch von Spezies durch Faltungen bestimmt wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Teilchen Moleküle, Makromoleküle, Farbstoffe, Molekülaggregate, Komplexe, Vesikel, Zellen, Viren, Bakterien, Kügelchen oder Gemische davon in Flüssigkeiten oder Gasen sind.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Teilchen zu Spezies gruppiert werden können, die anhand ihrer spezifischen Helligkeit unterschieden werden können.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei wenigstens eine Spezies lumineszent, vorzugsweise fluoreszent, und/oder lumineszent markiert ist.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Lumineszenzeigenschaften der Teilchen variiert werden, indem man sie mit einem ersten Molekül, insbesondere Biotin, konjugiert, das ein lumineszent markiertes zweites Molekül, insbesondere lumineszent markiertes Avidin oder Streptavidin, bindet, oder umgekehrt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das erste Moleküle ein (6 × His)-Tag ist und das zweite Molekül ein lumineszent markiertes Ni-NTA-Derivat ist.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Lumineszenzeigenschaften eines Teilchens durch Energieübertragung geändert werden, wobei von dem Teilchen absorbierte Energie bei engem Kontakt mit einem Luminophor eines Akzeptors übertragen und anschließend emittiert wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Teilchen jeweils mehrere Bindestellen für lumineszente Teilchen tragen.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Messvolumen nur ein Teil des Gesamtvolumens der Probe ist und ein Volumen von ≤ 10^–12 l, vorzugsweise ≤ 10^–14 l, hat.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Teilchen in das Messvolumen und wieder heraus diffundieren und/oder aktiv transportiert werden und/oder die Probe aktiv transportiert und/oder optisch abgetastet wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Messvolumina auf einem zweidimensionalen Träger, insbesondere auf einer Membran oder in Platten mit Näpfen, oder in linearer Weise, vorzugsweise in einem Kapillarsystem, angeordnet sind.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei ein konfokaler Mikroskopaufbau verwendet wird, umfassend: wenigstens ein Mikroskopobjektiv, vorzugsweise mit einer numerischen Apertur von ≥ 0,9, sowohl zum Fokussieren eines einfallenden Laserstrahls als auch zum Auffangen der Strahlung, die von den Teilchen in der Probe emittiert; gestreut und/oder reflektiert wird, ein dichroitischer Spiegel, eine Lochblende in der Bildebene des Mikroskopobjektivs, eine Nachweiseinrichtung, eine Datenerfassungseinrichtung und gegebenenfalls Einrichtungen zum Abtasten und/oder aktiven Transportieren der Probe.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Messvolumen durch die Verwendung von Elementen der optischen Nahfeldmikroskopie oder deren Kombination mit einer herkömmlichen Mikroskopoptik eingeschränkt ist.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Fluoreszenz mit Hilfe von Mehrfachphotonenanregung induziert wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Größe und zweidimensionale Form der Lochblende, die sich in der Brennebene des Mikroskops befindet, als Modellierungsparameter der räumlichen Helligkeitsfunktion verwendet wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Konvergenzwinkel des einfallenden Laserstrahls als Modellierungsparameter der räumlichen Helligkeitsfunktion verwendet wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Konzentration und/oder spezifische Helligkeit wenigstens einer Spezies der Teilchen bestimmt wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse unter Verwendung von a-priori-Informationen über die Probe angepasst wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse unter Anwendung einer inversen Transformation mit linearer Regularisierung und/oder linearen Nebenbedingungen verarbeitet wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die experimentellen Parameter der Nachweiseinrichtung, insbesondere die Totzeit und die Nachpulswahrscheinlichkeit der Nachweiseinrichtung, bestimmt werden, indem man die Anzahl der Photonenzählereignisse pro definiertem Zeitintervall in einem repetitiven Modus misst, während die Nachweiseinrichtung Licht mit konstanter Intensität oder hochfrequenten Laserpulsen ausgesetzt wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Hintergrundzählrate des Geräts bestimmt wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Länge des Zeitintervalls im Durchschnitt kleiner ist als die charakteristische Korrelationszeit von Fluktuationen der Strahlungsintensität.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Länge des Zeitintervalls so gewählt wird, dass man im Durchschnitt mehr als ein, vorzugsweise eins bis zehn, Photonenzählereignisse pro Teilchen erhält.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Konzentration der Probe oder die Größe des Messvolumens so gewählt wird, dass sich im Durchschnitt nicht mehr als einige, vorzugsweise etwa ein, Teilchen im Messvolumen befinden.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei wenigstens ein individuelles Teilchen in Bezug auf seine spezifische Helligkeit, die fluktuieren oder sich nichtstochastisch ändern kann, statistisch analysiert wird.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 29 zur Verwendung im Hochdurchsatz-Screening, in der Diagnostik, zur Überwachung von Polymerisations-, Aggregations- und Abbauvorgängen oder zur Analyse von Nucleinsäuren.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei einfache mathematische Ausdrücke mit formalen Parametern verwendet werden, um die Volumina von räumlichen Abschnitten zu bestimmen.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei physikalische Modelle verwendet werden, um die Volumina von räumlichen Abschnitten zu bestimmen.