WO2013157283A1 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents

Abstract

標的粒子の検出方法は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、（ａ）標的粒子と、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の１５％未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の１５％以上である発光しない複合体を形成する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を反転型走査分子計数法により算出する工程と、を有する。

Description

標的粒子の検出方法

　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、標的粒子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１２年４月１８日に、日本に出願された特願２０１２－０９５１０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出及び測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合－解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。特に、蛍光相関分光分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）、蛍光強度分布分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく、一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度である。また、測定時間も大幅に短縮され、一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。なお、前記微小領域とは、顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。さらに、ＦＣＳの態様の一つとして、多量の発光物質が溶解された溶液中において分散された発光しない粒子がコンフォーカル・ボリューム内に進入した際に検出される光強度が低下する系において、蛍光強度の自己相関関数の値を算出し、発光しない粒子のコンフォーカル・ボリューム内における並進拡散時間及び滞留粒子数の平均値を算出する方法（ｉｎｖｅｒｓｅ－ＦＣＳ（ｉＦＣＳ））がある（例えば、特許文献１参照。）

　最近、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系等の溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液内において光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、前記微小領域内を横切る発光粒子（蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子）を個別に検出する新規な方式の光分析技術（走査分子計数法）が提案されている（例えば、特許文献２～４参照）。走査分子計数法は、具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。

　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているため、ＦＩＤＡ等と同様に試料溶液の量は微量（例えば、数十μＬ程度）であってよく、また測定時間が短い。一方で、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理を要するＦＩＤＡ等と異なり、このような統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。つまり、発光プローブによって標識された試料溶液中の標的粒子（観測対象粒子）を、走査分子計数法を利用して検出することにより、試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度が非常に低い場合であっても、標的粒子の状態又は特性を検出し解析することができる（例えば、特許文献５参照。）。

国際公開第２０１０／１１９０９８号 国際公開第２０１１／１０８３６９号 国際公開第２０１１／１０８３７０号 国際公開第２０１１／１０８３７１号 国際公開第２０１２／０１４７７８号

　発光する単一粒子の光を個別に検出する走査分子計数法においては、単一粒子からの光は、微弱であるので、迷光や水のラマン散乱による影響を受けやすい。即ち、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大を発光粒子の信号として識別する分析手法の場合、迷光や水のラマン散乱による光を誤って発光粒子の信号として識別してしまうことがある。また、単一粒子の光を検出する走査分子計数法の場合には、観測対象となる粒子（観測対象粒子）は、発光粒子に限られる。従って、発光しない粒子を観測したい場合には、観測対象となる粒子に発光標識（蛍光標識、りん光標識など）を付与する必要があるところ、観測対象粒子に常に適当な発光標識が付与可能であるとは限らない。発光標識の付与により、観測対象粒子が変性することもあり得る。

　本発明の態様は、走査分子計数法を利用して、試料溶液中の発光しない標的粒子（検出対象の粒子）を、迷光や水のラマン散乱による影響を抑制しつつ、かつ発光標識せずに検出する方法を提供することを目的としている。

　上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法において、前記光学系の光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出すると、光検出領域よりも充分に小さい粒子が通過した際には、検出される光強度はほとんど変化しないが、比較的大きな粒子が通過すると、前記粒子により光が遮蔽され、検出される光強度が低下することが見出された。さらに、一分子当たりの大きさが光検出領域よりも充分に小さい発光しない粒子を標識用粒子として用い、一分子当たり複数個の標識用粒子を用いて標的粒子を標識することにより、背景光の低減（光検出領域から検出される光強度の低下）を標的粒子の存在を表す信号として検出することにより、標的粒子と結合した標識用粒子を、遊離の標識用粒子と区別して検出し得ることを見出された。

　すなわち、本発明の一態様における標的粒子の検出方法は、下記（１）～（１２）である。
（１）本発明の一態様における標的粒子の検出方法は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、
　（ａ）標的粒子と、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の１５％未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の１５％以上である発光しない複合体を形成する工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
　前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
　前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
により算出する工程と、
を有する。
（２）　前記（１）の標的粒子の検出方法において、前記複合体の外径が、前記光検出領域の直径の３５％以上であってもよい。
（３）　前記（１）又は（２）の標的粒子の検出方法において、前記標的粒子と前記標識用粒子が特異的に結合してもよい。
（４）　前記（１）～（３）のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記標的粒子が核酸であってもよい。
（５）　前記（１）～（４）のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってもよい。
（６）　前記（１）～（４）のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記背景光が照明光であってもよい。
（７）　前記（１）～（６）のいずれかの標的粒子の検出方法における前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されてもよい。
（８）　前記（１）～（７）のいずれかの標的粒子の検出方法における前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内における前記光検出領域の位置を移動してもよい。
（９）　前記（１）～（８）のいずれかの標的粒子の検出方法における前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの複合体が前記光検出領域に入ったと判定してもよい。
（１０）　前記（１）～（９）のいずれかの標的粒子の検出方法における前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記複合体の存在を表す信号として検出してもよい。
（１１）　前記（１）～（１０）のいずれかの標的粒子の検出方法は、さらに、前記工程（ｂ）において検出された計数された前記複合体の数に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の数密度又は濃度を決定する工程を有してもよい。
（１２）　前記（１）～（１０）のいずれかの標的粒子の検出方法の前記工程（ｂ）において、前記複合体の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記複合体の存在を表す信号の検出とを繰り返し、
　前記複合体の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を決定してもよい。

　本発明の態様における標的粒子の検出方法は、走査分子計数法の原理を利用しているため、試料溶液中の標的粒子の数密度又は濃度が非常に低い場合であっても、標的粒子を検出することができる。また、本発明の態様における標的粒子の検出方法は、標的粒子を発光標識する必要がなく、このため、光標識を付与すると変性する粒子であっても、標的粒子として検出できる。さらに、或る程度の背景光の存在下で、背景光の低減を標的粒子の存在を表す信号として検出する態様によれば、迷光やラマン散乱光を標的粒子の信号として誤検出することを防止することができる。

反転型走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。 ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内における光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 反転型走査分子計数法における発光しない単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 反転型走査分子計数法における発光しない単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 発光しない単一粒子が光検出領域に進入した際の検出光量の低下の原理を説明する図である。 光検出領域と単一粒子との径の比と検出光量の低下の割合との関係を示す図である。 反転型走査分子計数法の処理手順の一態様をフローチャートの形式で表した図である。 単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。 単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。 反転型走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順における検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 反転型走査分子計数法の処理手順の別の一態様をフローチャートの形式で表した図である。 反転型走査分子計数法の処理手順のさらに別の一態様をフローチャートの形式で表した図である。 反転型走査分子計数法の処理手順のさらに別の一態様をフローチャートの形式で表した図である。 参考例１において、各試料溶液のピーク検出率（％）を算出した結果を示した図である。 実施例１において、各試料溶液から得られたピーク数とデキストランビオチンの濃度を示した図である。

　本実施形態の標的粒子の検出方法（以下、単に「本実施形態の検出方法」ということがある。）は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、反転型走査分子計数法を利用する。反転型走査分子計数法とは、前記光学系の光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出し、前記光検出領域から検出される光強度の低下を指標として、前記光検出領域を通過する粒子の存在を検出する走査分子計数法である。

　特許文献２～５に記載されている通常の走査分子計数法では、観測対象となる粒子は、発光粒子であり、発光しない粒子を検出することができない。従って、本来的には発光しない粒子を観測対象とする場合には、かかる粒子に蛍光標識等の発光標識を付与する必要がある。しかしながら、粒子によっては、発光標識の付与が困難であり、発光標識の付与に起因して粒子の変性が起き得る。また、粒子の放出する光をその粒子の存在を表す信号として識別する形式の場合、迷光や散乱光或いは光検出器の電気的ノイズにより、光強度データ上の値の増大が生じたときに、その値の増大を誤って発光粒子の信号として識別してしまう場合が在り得る。

　一方で、一般に、顕微鏡の光学系により光計測を行う場合、背景光が高いときには、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくい。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いため、発光しない粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される。つまり、充分な背景光の存在下で反転型走査分子計数法による計測を行うことにより、迷光や水のラマン散乱による影響が低減された環境下で、標的粒子を検出することができる。また、標的粒子を発光プローブ等で標識する必要もない。

　本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。

　本実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。

　反転型走査分子計数法では、走査分子計数法と同様に、試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成において、光検出領域からの光に実質的に一定の背景光が含まれている場合には、「光検出領域に対してある程度の大きさを有する発光しない粒子」が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が前記発光しない粒子を包含したときに、前記粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する背景光の光強度又は光量が低下することとなる。かくして、反転型走査分子計数法では、逐次的に検出された光において、かかる背景光の光強度又は光量の低下を前記発光しない粒子の信号として個別に検出する。これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。なお、本実施形態において、「粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、前記粒子の存在を表す信号を指すものとする。

　以下、まず反転型走査分子計数法について説明する。
＜反転型走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　反転型走査分子計数法は、基本的な構成において、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａを参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。光分析装置１の光学系において、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端において固有のＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ａｐｅｒｔｕｒｅ）にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１μＬ～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中に、観測対象である発光しない粒子（本実施形態の方法においては、標的粒子）等の発光しない粒子のほかに、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されていてもよい。この場合、発光しない粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、発光しない粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。

　かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子（一の粒子としての挙動を示す粒子。本実施形態の検出方法においては、遊離の状態の標的粒子や遊離の状態の標識用粒子に加えて、標的粒子と標識用粒子の複合体も含まれる。）検出のための処理が為される。なお、当業者において知られている如く、上記の構成において、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１ｆＬ～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ^２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本実施形態では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光における単一粒子の存在による光量の低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

　更に、上記の光分析装置の光学系においては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１Ｄに例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内における光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。

　背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、装置１においては、図１Ａに示す如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光物質の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、背景光の波長に応じて別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。

＜反転型走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　反転型走査分子計数法は、端的に述べれば、単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法にて、即ち、背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、発光しない単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出され、その計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。

　具体的には、通常の走査分子計数法と同様に、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。既に触れたように、試料溶液中には発光物質が分散され、光検出領域ＣＶ内には、多数の発光物質が存在しているので、光検出領域ＣＶの移動中（図２Ａ中、時間ｔ０～ｔ２）、基本的には、それらの発光物質からの光が略一様に検出される。しかしながら、光検出領域ＣＶが移動する間において１つの発光しない粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光物質の存在領域の体積が低減するので、発光物質の放出する光の総量が低減し、図２Ｂに描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度（Ｅｍ）の低下が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如きパルス状の有意な光強度の低下、即ち、単一粒子の存在を表す信号を一つずつ検出する。これによって、単一粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する単一粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。

　上記の光強度の低下の度合は、発光しない単一粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。図２Ｃを参照して、典型的には、光検出領域内の光強度分布は、図２Ｃ中、実線にて示されている如く、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に発光しない粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、式（１）で与えられる。
　α＝４π∫ｒ^２ ｆ（ｒ）ｄｒ ［積分区間は、０～ａ］ 　…（１）
　一方、光検出領域内に、半径ｂの発光しない単一粒子が進入し、図２Ｃの下段の如く光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなる。よって、図２Ｃの上段の斜線領域に相当する光量が低減することとなる。その排除される発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、式（２）で与えられる。
β＝４π∫ｒ^２ ｆ（ｒ）ｄｒ ［積分区間は、０～ｂ］ 　…（２）
　かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。

　ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、ｆ（ｒ）は式（３）で表される。
　ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（－２ｒ^２ ）　 …（３）
　図２Ｄは、式（３）を用いて、半径比ｂ／ａに対する光強度の低下の割合β／αをプロットした図である。図２Ｄを参照して、典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。

　なお、観測されるべき単一粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、単一粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な単一粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。

＜反転型走査分子計数法の処理工程＞
　反転型走査分子計数法では、観測対象となる粒子を含む試料溶液の光強度が測定された後、分析される。図３に、反転型走査分子計数法における処理手順の一態様を、フローチャートの形式で表す。

（試料溶液の光強度の測定：図３のステップＳ１００）
　反転型走査分子計数法による光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。反転型走査分子計数法の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４Ｂに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｃの最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

　また、反転型走査分子計数法においては、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による背景光の低減を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。

　具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式（４）から、式（５）で表される。
　（２Ｗｏ）^２ ＝６Ｄ・Δｔ　　 …（４）
　Δｔ＝（２Ｗｏ）^２ ／６Ｄ 　　　…（５）
　従って、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、式（６）で表される。
　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（６）
　そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に速い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^－１０ｍ^２ ／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^－３ ｍ／ｓとなる。よって、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（光強度の分析）
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。

　１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、上記の処理により時系列光強度データの形状に基づいて為されてよい。典型的には、まず背景光の強度を計って、所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データにおいて、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の高い信号として現れる。そこで、時系列光強度データ上において、まず背景光の強度を計って、所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。

　更に、反転型走査分子計数法に用いられる光分析装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データにおいて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出してもよい。

　反転型走査分子計数法においては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　以下、より詳細に説明する。

（ｉ）単一粒子信号の個別検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ｂに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号における光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する（図４Ｃ最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸のガウス分布である式（７）であると仮定できるとする。
Ｉ＝Ｉｂｇ－Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ^２ ／ａ^２ ） 　　…（７）
　有意な光強度の低下のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。
　強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等において無視されてよい。

　時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４Ｃの最上段「検出結果（未処理）」で示されるデータ）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３－ステップＳ１１０、図４Ｃの中上段「スムージング」で示される。）。発光物質の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数などは、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データにおいて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップＳ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４Ｃ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

　しかる後、時系列光強度データ上において、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップＳ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域におけるスムージングされた時系列光強度データに対して、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４Ｃ下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップＳ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、が判定される（ステップＳ１５０）。例えば、下記の条件を満たすか否か等が判定される。
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］ 　　…（Ａ）
相関係数＞０．９５かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号において想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

　上記のステップＳ１３０～Ｓ１５０の処理におけるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップＳ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）粒子濃度の決定
　更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップＳ１７０）。

　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよい。また、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、式（８）により与えられる。
　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ 　　…（８）
　また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、式（９）により与えられる。
　ｃ＝ｎ／Ｖｔ 　　…（９）
　なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子の検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

　かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法において、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。

　一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
　上記の単一粒子検出処理においては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。つまり、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。このように、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。

　そこで、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。すなわち、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。つまり、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。
　そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。つまり、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果におけるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。

（ｉ）基本原理
　粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中において、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、式（１０）で表される。
　Ｘ＝ＣＳｕτＮ_Ａ 　　…（１０）
　ここで、Ｎ_Ａ は、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、式（１１）により時間Ｔの関数として与えられる。
　Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮ_Ａ ） 　　…（１１）
　なお、式（１１）において、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて、式（１２）により与えられる。
　Ｖ＝ＸＥ／Ｔ　　 …（１２）
　よって粒子濃度Ｃは、式（１３）で表される。
　Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮ_Ａ ）　　…（１３）
　この式（１３）においては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験においては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。

（ii）処理操作手順
　一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図５のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。図５の例においては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（発光粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。

（ａ）初期設定
　図５を参照して、操作処理について、具体的に説明する。まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して、顕微鏡のステージ上に載置する。その後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１における処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１において記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。

（ｂ）粒子数の検出
　上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップＳ３０）と、ステップＳ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔ_ｎ）を算定する処理（ステップＳ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔ_ｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップＳ５０）、反復して実行される。なお、ステップＳ３０～Ｓ５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップＳ２５）。

　ステップＳ３０における光検出並びに粒子数検出の処理は、図３に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為される。しかる後、得られた解析時間間隔ｔにおける時系列光強度データにおいて、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。

　かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データにおける粒子数ｘが検出されると、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ ）が式（１４）により算出される（図５－ステップＳ４０）。
　Ｘ（ｔ_ｎ ）＝Ｘ（ｔ_ｎ－１ ）＋ｘ 　　…（１４）
　なお、Ｘ（ｔ_ｎ－１ ）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップＳ３０～Ｓ４０は、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、式（１５）が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。
　Ｘ（ｔ_ｎ ）≧ＸＥ 　　…（１５）
　そして、ステップＳ３０～Ｓ５０を反復しているうちに、式（１５）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップＳ３０～Ｓ５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップＳ６０）。

（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
　ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップＳ３０～Ｓ５０の反復実行期間において（式（１５）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。

　上記の如き表示を実行する場合には、図５のステップＳ５０の判定において、式（１５）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップＳ４０において算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）が表示器上に表示される（ステップＳ５２）。なお、既にステップＳ３０～Ｓ５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップＳ３０～Ｓ５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップＳ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、式（１６）により与えられてよい。
　ｖ＝Ｘ（ｔ_ｎ ）／（Ｔ_ｐ－Ｔ_ｓ） 　　…（１６）
　ここで、Ｔ_ｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップＳ３０～Ｓ５０の処理終了までの時間）が、式（１７）により推定される。
　Ｔｒ＝（ＸＥ－Ｘ（ｔ_ｎ ））／ｖ 　　…（１７）
　また、測定終了時間ＴＥ（ステップＳ３０～Ｓ５０の処理が終了する時間）が、式（１８）により推定される（ステップＳ５６）。
　ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ 　　…（１８）
　そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップＳ５８）。なお、既にステップＳ３０～Ｓ５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔ_ｎ ）＝０のときは、式（１７）又は（１８）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。

　上記の図５のステップＳ３０～Ｓ５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３のステップＳ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップＳ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出並びに粒子数検出の処理においては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８において、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出並びに計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出並びに計数が達成されることとなる。

（ｄ）濃度算出等の分析
　かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ－Ｔ_ｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップＳ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。

　なお、式（１０）～（１３）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出並びに計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定における粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、式（１９）により与えられる。
　Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ ・ｕｏ・τｏ） 　　…（１９）
　また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。

（ｅ）試料溶液の光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理の修正例
　上記の試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出並びに計数の処理において、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、発光粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図６Ａは、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップＳ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理をフローチャートの形式で表したものである。図６Ｂは、ステップＳ２０’における解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図６Ａにおいて、図５と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。

　図６Ａの処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップＳ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定において、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップＳ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップＳ２５）の後、最初に光強度の測定と粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図６ＢのステップＳ２００、Ｓ２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップＳ２７０）、図５に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び粒子の検出並びに計数の処理が実行される（ステップＳ３０～Ｓ５０）。かくして、最初のサイクルの粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ_１ ））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップＳ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップＳ５６）が順に算定される。なお、図５の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔ_ｎ ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップＳ５２、Ｓ５８）。また、最初の処理サイクルで粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理が終了する（ステップＳ５０）。

　最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図５の場合と同様の光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理サイクル（ステップＳ２０’、Ｓ３０～Ｓ５８）が、粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップＳ２０’においては、まず、そのときまでに検出されている粒子数Ｘ（ｔ_ｎ）が０であるか否かが判定される（ステップＳ２２０）。Ｘ（ｔ_ｎ）＝０のときは、直前のサイクルにおける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔ_ｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、式（２０）により算定される（ステップＳ２４０）。
　ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ－ｋ） 　　…（２０）
　なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップＳ２５０、Ｓ２６０）。上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。

＜標的粒子の検出方法＞
　本実施形態の検出方法では、反転型走査分子計数法を利用して、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する。前述のように、反転型走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、標識用粒子と結合した標的粒子を高感度に計数することができる。

　さらに、本実施形態の検出方法では、一分子当たりの大きさが光学系の光検出領域の体積に対して充分に小さい（すなわち、前記光検出領域を前記粒子が通過する際に、前記光検出領域から検出される光強度がほとんど低下しない）標識用粒子を２個以上標的粒子に結合させることにより、前記光検出領域の体積に対して或る程度の大きさの複合体を形成する。そして、前記複合体が光検出領域を通過する際に、前記光検出領域から検出される光強度が低下することに基づいて、前記複合体を検出する。つまり、本実施形態の検出方法において用いる反転型走査分子計数法では、標的粒子と結合して複合体を形成した標識用粒子を、標的粒子と結合していない遊離の標識用粒子から区別して検出することができるため、反転型走査分子計数法による計測の前に、試料溶液中から遊離の標識用粒子を除去する必要がない。

　具体的には、本実施形態の方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有する。
（ａ）標的粒子と、外径が前記光学系の光検出領域の直径の１５％未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の１５％以上である発光しない複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
により算出する工程である。

　本実施形態の検出方法の検出の対象である標的粒子は、試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、特に限定されるものではない。例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウィルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイド等など）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。

　本実施形態の検出方法における標的粒子としては、核酸分子又は核酸類似物質であることが好ましい。核酸分子又は核酸類似物質としては、２本鎖核酸分子であってもよく、１本鎖核酸分子であってもよい。具体的には、例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子が挙げられる。中でも、標的粒子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等が好ましい。

　本実施形態の検出方法において用いられる標識用粒子は、一分子当たりの大きさが、光検出領域を前記粒子が通過する際に、前記光検出領域から検出される光強度がほとんど低下しないほど充分に小さく、かつ標的粒子１分子当たり２分子以上が結合することによって、前記光検出領域を通過する際に、一分子の状態よりも、前記光検出領域から検出される背景光の光強度の低下の度合が有意に大きくなる程度の大きさの発光しない複合体を形成する。このため、反転型走査分子計数法により、標的粒子と結合していない遊離の標識用粒子と、標的粒子と結合して複合体を形成している標識用粒子とを、区別して計数することができる。

　標識用粒子の大きさは、光検出領域を当該粒子が通過する際に、前記光検出領域から検出される光強度がほとんど低下しない程度であればよく、反転型走査分子計数法の測定に使用する光分析装置の光検出領域や、検出される背景光の波長や光強度等を考慮して適宜決定することができる。本実施形態においては、一分子の状態では、背景光の光強度の低下が殆ど観察されないことから、標識用粒子の平均外径は、前記光学系の光検出領域の直径の１５％未満であることが好ましく、１０％未満であることがより好ましい。

　標的粒子と２分子以上の標識用粒子が結合した複合体の大きさは、光検出領域を前記粒子が通過する際に、前記光検出領域から検出される光強度の低下の度合が、標識用粒子一分子の場合よりも有意に大きければよく、反転型走査分子計数法の測定に使用する光分析装置の光検出領域や、検出される背景光の波長や光強度等を考慮して適宜決定することができる。本実施形態においては、複合体の外径は、前記光学系の光検出領域の直径の１５％以上であることが好ましく、３５％以上であることがより好ましい。

　一分子当たりの標的粒子に結合する標識用粒子の数は、２分子以上であればよく、標的粒子や標識用粒子の一分子当たりの大きさ、複合体の大きさ等を考慮して、適宜決定することができる。本実施形態においては、標識用粒子一分子の大きさと、標的粒子と結合した複合体の大きさの差が充分に大きくできるため、一分子当たりの標的粒子に結合する標識用粒子の数は、多いほうが好ましい。

　本実施形態の検出方法においては、複合体が発光しない粒子であればよい。例えば、標的粒子と標識用粒子の両方が発光しない粒子であってもよく、標的粒子が蛍光粒子であり、標識用粒子が、前記蛍光物質から発される蛍光を吸収する消光物質であってもよい。

　標識用粒子は、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する部位を有する物質である。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標識用粒子としては、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、核酸結合性タンパク質（例えば、核酸結合性抗体等）、核酸に結合する発光しない色素分子等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
　また、標的粒子がタンパク質である場合には、標識用粒子としては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを用いることができる。

　本実施形態において用いられる標識用粒子は、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出並びに定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する標識用粒子としては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸分子である場合には、標識用粒子として用いるオリゴヌクレオチドは、前記標的粒子の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、前記標的粒子の部分塩基配列と１～数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。

　標識用粒子としては、例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質（以下、「標的粒子と結合する物質」ということがある。）を表面に備えた粒子を用いることができる。前記粒子としては、例えば、磁気粒子、シリカ粒子、アガロースゲル粒子、ポリアクリルアミド樹脂粒子、ラテックス粒子、ポリスチレン粒子等のプラスチック粒子、セラミックス粒子、ジルコニア粒子等が挙げられる。

　標識用粒子として、標的粒子と結合する物質を表面に備えた粒子を用いる場合、通常は、粒子表面には、標的粒子と結合する物質が複数結合している。このため、このような粒子を用いることにより、標的粒子と標識用粒子が凝集し、より大きな複合体を形成し得る。なお、１の粒子の表面には、１種類の標的粒子と結合等する物質が結合されていてもよく、２種類以上の標的粒子と結合等する物質が結合されていてもよい。

　標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質と、これらの粒子表面とを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、粒子表面の官能基に化学的に結合させてもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により結合させることができる。例えば、ＥＤＡＣ反応、ＥＤＣとＮＨＳとを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質中の官能基を結合する反応等が挙げられる。粒子表面に官能基を有さない磁性粒子の場合には、粒子表面を官能基で被覆してもよい。

　本実施形態においては、１分子の標的粒子に、同時に複数の標識用粒子が結合できればよく、１種類の標識用粒子を用いてもよく、２種類以上の標識用粒子を用いてもよい。例えば、標的粒子に、同じ構造の部位が複数箇所存在する場合には、前記部位と特異的又は非特異的に結合又は吸着する１種類の物質を標識用粒子として用いてもよい。また、標的粒子に対して、それぞれ異なる部位と独立して結合し得る複数の物質を、共に標識用粒子として用いてもよい。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合、前記標的粒子のそれぞれ異なる部分領域とハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを、標識用粒子として用いることができる。

　具体的には、工程（ａ）は、まず、標的粒子と標識用粒子を適当な溶媒に添加して、両者を含む溶液を調製する。前記溶媒は、標的粒子及び標識用粒子を損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではない。典型的には水溶液であるが、ホルムアミド等の有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。具体的には、前記溶媒は、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

　溶液に添加する標識用粒子の濃度は特に限定されるものではないが、標的粒子の検出感度を高められるため、標識用粒子の濃度は、期待される標的粒子の濃度に、一分子の標的粒子当たりに結合し得る標識用粒子の数を乗じた濃度より高くなるように、両者を含む溶液を調製することが好ましい。

　次いで、当該試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記標識用粒子を結合させ、複合体を形成する。標的粒子と標識用粒子を同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、両者を含む溶液を調製した後、必要に応じて所定時間前記溶液をインキュベートするだけで、前記溶液中で、標的粒子と標識用粒子とを含む複合体を形成することができる。

　一方で、標的粒子や標識用粒子が２本鎖構造の核酸分子又は核酸類似物質である場合には、溶液中の核酸分子等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸分子又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、標識用粒子がＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が２本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、前記標識用粒子と標的粒子とを含む複合体を形成することができる場合がある。

　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記溶液を高温処理することにより、前記溶液中の核酸分子等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。

　必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的粒子と標識用粒子を会合させて、両者を含む複合体を形成する。熱変性を行った場合には、高温処理後、前記溶液の温度を、標的粒子と標識用粒子とが特異的にハイブリダイズできる温度（特異的会合条件）にまで低下させることにより、前記溶液中の両者を適宜会合させることができる。好ましくは、両者を含む溶液の温度を、標識用粒子中の標的粒子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記溶液の塩濃度を、標的粒子と標識用粒子とが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、前記溶液中の両者を適宜会合させることができる。

　なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。

　このように、特異的会合条件は、標的粒子や標識用粒子の種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標識用粒子の塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。

　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、複合体を形成させる際に、前記溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、前記溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。

　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め前記溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。

　その後、工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、反転型走査分子計数法により算出する。具体的には、まず試料溶液を前記の反転型走査分子計数法のための光分析装置に設置する。前記の手法により、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する。得られた時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する。個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する。

　反転型走査分子計数法による計測では、光検出領域からの光に含まれているべき実質的に一定の背景光としては、透過照明等による照明光であってもよく、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってもよい。この場合、試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。

　背景光のために試料溶液内に光を放出又は散乱する物質を溶解又は分散させる場合、前記物質は、反転型走査分子計数法による計測の前に試料溶液に添加されればよく、工程（ａ）において、複合体の形成前に、標識用粒子等と共に添加されてもよく、工程（ａ）の後に添加されてもよい。前記物質としては、典型的には蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。

　さらに、工程（ｂ）において検出された計数された前記複合体の数に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の数密度又は濃度を決定することもできる。検出された複合体の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された複合体の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、複合体の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。

　次に実施例等を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。

［参考例１］
　光検出領域の直径が約２．８μｍの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、直径の異なる発光しない粒子を、反転型走査分子計数法により計測した。
　まず、平均粒子径（平均外径）が０．３２μｍ、０．４１μｍ、又は０．９２μｍであるポリスチレン粒子（Ｓｐｈｅｒｏ　Ｔｅｃｈ社製）を、２０容量％　ＰＥＧ溶液を用いて、各２０ｆＭに調製し、ポリスチレン粒子溶液を調製した。これとは別に、蛍光物質ＡＴＴＯ（登録商標）４８８（ＡＴＴＯ社製）を、１０ｍＭ　トリスバッファー（ｐＨ８）を用いて６ｎＭに調製し、蛍光物質溶液を調製した。その後、前記ポリスチレン粒子溶液と前記蛍光物質溶液を等量ずつ混合し、測定用の試料溶液を調製した。これらの試料溶液を、反転型走査分子計数法により測定した。

　具体的には、計測においては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。励起光は、５０μＷの４８８ｎｍのレーザ光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５１０ｎｍ～５６０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中における光検出領域は、６０００ｒｐｍの移動速度にて回転させ、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は３０秒間とした。各試料溶液について、３回ずつ測定を行った。測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。

　測定の結果得られた実際のピーク数を、走査体積から計算されるピーク数で除することにより、ピーク検出率（％）を算出した。算出結果を図７に示す。平均粒子径が０．３２μｍ及び０．４１μｍのポリスチレン粒子では、ピークが検出されず、ピーク検出率はそれぞれ５．６％及び４．７％であり、いずれも１０％未満であったのに対して、平均粒子径が０．９２μｍであるポリスチレン粒子では、ピーク検出率は８５．７％と高かった。これらの結果から、光検出領域の直径に対して外径が小さい粒子は、反転型走査分子計数法では検出されないことが確認された。

［実施例１］
　光検出領域の直径が約２．８μｍの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、１分子当たり多数のビオチン化部位を有するデキストラン（デキストランビオチン）を標的粒子とし、ストレプトアビジン粒子を標識用粒子として用い、試料溶液中の標的粒子を反転型走査分子計数法により検出した。
　まず、粒子表面にストレプトアビジンがコートされたストレプトアビジン粒子（平均粒子径：０．３２μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を、２０容量％　ＰＥＧ溶液を用いて、各４ｐＭに調製した（ストレプトアビジン粒子溶液）。また、デキストランビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、１０ｍＭ　トリスバッファー（ｐＨ８）を用いて、０ｐＭ、２０ｐＭ、２００ｐＭ、２ｎＭに調製した（デキストランビオチン溶液）。さらにこれらとは別に、蛍光物質ＡＴＴＯ（登録商標）４８８（ＡＴＴＯ社製）を、１０ｍＭ　トリスバッファー（ｐＨ８）を用いて、６ｎＭに調製した（蛍光物質溶液）。
　ストレプトアビジン粒子溶液及びデキストランビオチン溶液を、等量で混合し、得られた混合液を３０分間室温で静置した。その後、前記混合液に、等量の蛍光物質溶液を加え、測定用の試料溶液を調製した。

　これらの試料溶液について、測定時間を６０秒間とした以外は参考例１と同様にして、反転型走査分子計数法により測定した。図８は、得られたピーク数とデキストランビオチンの濃度を示した図である。この結果、デキストランビオチン濃度依存的に、検出されるピーク数は増大していた。つまり、デキストランビオチンとストレプトアビジン粒子の凝集体により、ピークが検出された。

［実施例２］
　光検出領域の直径が約２．８μｍの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、１分子当たり０、１又は２箇所のビオチン化部位を有する核酸を標的粒子とし、ストレプトアビジン粒子を標識用粒子として用い、試料溶液中の標的粒子を反転型走査分子計数法により検出した。
　まず、以下に示す核酸をそれぞれ含有する水溶液（核酸試料１～４）を調製した。なお、各塩基配列を表１に示す。
　核酸試料１は、１０ｎｇ／μＬのＨＳＲＲＢ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）により提供されたゲノム試料：Ｎｏ．１９４（以下、「ゲノムＮｏ．１９４」）である。
　核酸試料２は、１０ｎｇ／μＬのゲノムＮｏ．１９４と、一方の核酸鎖が配列番号１で表される塩基配列からなるＰＣＲ産物（以下、「ＰＣＲ産物」）である。
　核酸試料３は、１０ｎｇ／μＬのゲノムＮｏ．１９４と、配列番号２で表される塩基配列からなり、５’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸（以下、「ビオチン－ｓｓＤＮＡ」）である。
　核酸試料４：１０ｎｇ／μＬのゲノムＮｏ．１９４と、配列番号３で表される塩基配列からなり、５’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸及び配列番号４で表される塩基配列からなり、５’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸が会合したニ本鎖核酸（以下、「ビオチン－ｄｓＤＮＡ」）である。

　さらに、粒子表面にストレプトアビジンがコートされたストレプトアビジン粒子（平均粒子径：０．３２μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社製）を、２０容量％　ＰＥＧ溶液を用いて、各１００ｐＭに調製した（ストレプトアビジン粒子溶液）。また、蛍光物質ＡＴＴＯ（登録商標）４８８（ＡＴＴＯ社製）を、１０ｍＭ　トリスバッファー（ｐＨ８）を用いて、６ｎＭに調製した（蛍光物質溶液）。

　核酸試料１とストレプトアビジン粒子溶液を、等量で混合し、得られた混合液を３０分間室温で静置した。その後、前記混合液に、等量の蛍光物質溶液を加え、測定用の試料溶液１を調製した。核酸試料１に代えて、核酸試料２～４をそれぞれ用い、同様にして、測定用の試料溶液２～４を調製した。これらの試料溶液について、回転速度を６０００ｒｐｍ、測定時間を３０秒間とした以外は参考例１と同様にして、反転型走査分子計数法により測定した。

　各試料溶液で得られたピーク数（平均値）及び標準偏差（ＳＤ）を表２に示す。この結果、核酸１分子当たり１個のビオチンのみを含み、ストレプトアビジン粒子が１分子当たり１分子しか結合しない試料溶液３では、ビオチンで標識された核酸を含まない試料１及び２と同程度のピーク数（４０未満）しか得られなかった。これに対して、核酸１分子当たり２個のビオチンのみを含み、ストレプトアビジン粒子が１分子当たり２分子結合する試料溶液４では、１４８ものピーク数が検出された。これは、多数のビオチン－ｄｓＤＮＡとストレプトアビジン粒子が凝集することにより、大きな複合体が形成されたため、反転型走査分子計数法により高感度に検出されたためと推察される。また、これらの試料溶液中には、ゲノムＮｏ．１９４が含まれていたことから、試料溶液中に、標的粒子以外の類似の物質が多数存在していた場合であっても、標的粒子と特異的に結合する標識用粒子を用いることによって、反転型走査分子計数法により標的粒子を検出し得ることが確認された。

　本発明の態様における検出方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子を、反転型走査分子計数法により検出することができるため、本発明の態様における検出方法は、臨床検体等の解析対象物質の濃度が微量である試料の解析や検査等の分野で利用が可能である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

Claims (12)

1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、
   　（ａ）標的粒子と、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の１５％未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子１分子当たり、２分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の１５％以上である発光しない複合体を形成する工程と、
   　（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
   　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
   　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
   　前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
   　前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
   　により算出する工程と、
   　を有する標的粒子の検出方法。
2. 　前記複合体の外径が、前記光検出領域の直径の３５％以上である請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
3. 　前記標的粒子と前記標識用粒子が特異的に結合する請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
4. 　前記標的粒子が核酸である請求項１～３のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
5. 　前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光である請求項１～４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
6. 　前記背景光が照明光である請求項１～４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
7. 　前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１～６のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
8. 　前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内における前記光検出領域の位置を移動する請求項１～７のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
9. 　前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの複合体が前記光検出領域に入ったと判定する請求項１～８のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
10. 　前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記複合体の存在を表す信号として検出する請求項１～９のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
11. 　さらに、前記工程（ｂ）において検出された計数された前記複合体の数に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の数密度又は濃度を決定する工程を有する請求項１～１０のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
12. 　前記工程（ｂ）において、前記複合体の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記複合体の存在を表す信号の検出とを繰り返し、
    　前記複合体の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を決定する請求項１～１０のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。

Images