JPWO2008099778A1 - スリット走査共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

スリット走査共焦点顕微鏡は、スリット状の光源１と、光源１の像を試料３の上に結像させる照明光学系２と、試料３からの反射光、透過光又は蛍光を、光源１と光学的に共役な位置に配置された１次元撮像素子５上に結像させる結像光学系４とを有する。スリット状の光源１は、１次元撮像素子５の画素と光学的に共役な大きさの単位光源に分割されている。

Description

本発明は、スリット走査共焦点顕微鏡に関するものである。

一般的に使用されているスリット走査共焦点顕微鏡は、光源からの光を第１のスリットを通過させ、第１のスリットの像を、走査光学系を介して走査光として、対物レンズにより試料上に結像させ、試料からの反射光又は蛍光を、前記対物レンズと前記走査光学系を逆に通過させて非走査光に変え、第１のスリットと光学的に共役な位置に置かれた第２のスリットを通し、第２のスリットを通った光の強度を検出器（１次元撮像素子）により測定し、画像データを構成するものである。走査光学系には、ガルバノミラー等が使用され、スリットの長さ方向と直角な方向に一次元走査を行う。なお、走査光学系は必ずしも必要ではなく、例えば、光源、照明光学系、結像光学系、スリット等を一体に移動させることにより走査を行ってもよい。

なお、レーザー共焦点走査顕微鏡に関しては「第５・光の鉛筆 / 鶴田匡夫 /新技術コミュニケーションズ p177〜p205」（非特許文献１）に詳しく記載されている。スリット走査共焦点顕微鏡は、レーザー共焦点走査顕微鏡が使用しているピンホールをスリットに変えたものである。
第５・光の鉛筆 / 鶴田匡夫 /新技術コミュニケーションズ p177〜p205

共焦点顕微鏡においては、ピンホール状の光源を用いて試料を走査し、光源と共役な位置に置かれたピンホールを透過した光のみを検出しているため、試料の深さ方向において高い分解能を有する。しかし、２次元走査であるため計測時間がかかる。

スリット走査共焦点顕微鏡は、通常の点光源を使用したレーザー共焦点走査顕微鏡に対して、スリットを使用しているため、測定時間は短いが、試料の深さ方向の分解能（解像度）が低いという問題があった。本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、試料の深さ方向の分解能を高めることができるスリット走査共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、スリット状の光源と、前記光源の像を試料の上に結像させる照明光学系と、前記試料からの反射光、透過光又は蛍光を、前記光源と光学的に共役な位置に配置された１次元撮像素子上に結像させる結像光学系とを有し、前記光源は、前記１次元撮像素子の画素と光学的に共役な大きさの単位光源に分割されていることを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記光源は、前記単位光源を離散的に点灯するよう制御されていることを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第２の手段であって、前記光源は、点灯している前記単位光源の両隣にある単位光源を消灯状態にするよう制御されていることを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第２の手段又は第３の手段であって、前記光源は、前記単位光源を１つおきに点灯するよう制御されていることを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第５の手段は、前記第２の手段乃至第４の手段のいずれか一つの手段であって、点灯している前記単位光源と共役な位置にある前記１次元撮像素子の画素の出力信号をＳａとし、その両隣にある、前記単位光源が点灯したときの前記共役位置に配置された１次元撮像素子の画素の出力信号をＳｂとするとき、差分出力信号（Ｓａ−Ｓｂ）を、前記１次元撮像素子の画素の出力信号Ｓａの修正出力信号とする処理部を有することを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡である。

本発明の実施の形態の１例であるスリット走査共焦点顕微鏡の原理を示す概要図と、光源及びラインセンサの配列を示す図である。 スリット状光源の点灯の実施の形態を示す図である。 試料において、単位光源が照射する領域を示す図である。 ラインセンサの画素と共役な位置にある単位光源の隣の単位光源を点灯させた場合に、出力信号に含まれている試料情報の領域を示す図である。 ラインセンサの１つの画素の出力信号に含まれている試料情報の領域と、演算結果に含まれている試料情報の領域を示す図である。

符号の説明

１…スリット状光源、２…照明光学系、３…試料、４…結像光学系、５…ラインセンサ、ＳＡ，ＳＢ１，ＳＢ２、ＳＢ３、ＳＢ４…単位光源、Ｄ０，Ｄ１，Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４…画素

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１（ａ）は、本発明の実施の形態の１例であるスリット走査共焦点顕微鏡の原理を示す概要図である。図１（ａ）においては、光軸方向をｚ軸、スリット状光源１のスリット長さ方向をｙ軸、スリット幅方向をｘ軸にとる。

スリット状光源１（２次光源である場合もある）が位置する光源面は、試料３上の結像面と共役な関係にある。よって、スリット状光源１から放出された光は、照明光学系２により、試料３上の結像面（ｘｓ−ｙｓ平面）に、スリット状光源１の像を結像する。これにより、試料３において照射される領域から蛍光、反射光、又は透過光（図においては透過光の例を示している）が発生される。試料３から発生する蛍光、反射光、又は透過光（図においては透過光の例を示している）は、結像光学系４により、試料３から発生する蛍光、反射光、又は透過光の像を、１次元撮像素子であるラインセンサ５（ｘｄ−ｙｄ平面）上に結像する。ラインセンサ５からの出力信号は、処理部６により処理される。

ラインセンサ５の位置は、スリット状光源１と共役にされている。また、ラインセンサ５が位置する検出面は、結像面と共役な関係にある。よって、試料３上の結像面（ｘｓ−ｙｓ平面）から発する光が、ラインセンサ５（ｘｄ−ｙｄ平面）上に焦点を結ぶことになる。そして、注目する試料領域すべての信号を得ることができるように、試料３を光軸方向とｘｓ方向に走査する。なお、スリット状光源１とラインセンサ５が常に共役の関係にあるように位置を保ちながら、スリット状光源１をｘ軸方向に、ラインセンサ５をｘｄ軸方向に走査してもよい。

図１（ｂ）は、スリット状光源１の詳細とラインセンサ５の各画素との関係を示す図である。スリット状光源１は、ラインセンサ５の各画素と照明光学系２及び結像光学系４を介して光学的に共役な大きさの単位光源に分割されている。図１（ｂ）は、スリット状光源１の単位光源ＳＡが、ラインセンサ５の画素Ｄ０と共役な関係にあることを示している。同様、単位光源ＳＢ１が画素Ｄ１と、単位光源ＳＢ２が画素Ｄ２と、単位光源ＳＢ３が画素Ｄ３と、単位光源ＳＢ４が画素Ｄ４と共役な関係にある。このように、スリット状光源１は、ラインセンサ５の各画素と共役な位置関係となるような単位光源で構成されている。

このような、スリット状光源１の点灯の実施の形態を図２に示す。表示方法は図１と同じである。図２においてはハッチングをしてある単位光源が点灯している。則ち、図２（ａ）においては、一つおきの単位光源ＳＡ、ＳＢ３、ＳＢ４が点灯している。そして、点灯している単位光源ＳＡの両隣にある単位光源ＳＢ１、ＳＢ２を消灯状態にする。なお、単位光源の点灯および消灯は制御部（不図示）により制御されている。図に示されているハッチングを施された楕円は、点灯している単位光源と共役な画素が検出しうる試料上の領域を示している。また、破線で示された楕円は、点灯していない単位光源と共役な画素が検出しうる試料上の領域を示している。

図２（ｂ）においては、一つおきの単位光源ＳＢ１、ＳＢ２が点灯している。そして、点灯している単位光源ＳＢ１の両隣にある単位光源ＳＡ、ＳＢ３を消灯状態にし、また点灯している単位光源ＳＢ２の両隣にある単位光源ＳＡ、ＳＢ４を消灯状態にする。このように、スリット光源１は、図２（ａ）に示す点灯状態と、図２（ｂ）に示す点灯状態とを有するように制御されている。そして、図２（ａ）に示す点灯状態と図２（ｂ）に示す点灯状態とのそれぞれで、試料３を走査して出力信号を得る。なお、スリット状光源１をｘ軸方向に走査して出力信号を得てもよい。

以下、単位光源ＳＡと画素Ｄ０を例として、光の進み方を説明する。単位光源ＳＡが点灯している図２（ａ）の点灯状態のとき、対応するハッチングをした楕円の照明領域からの光は画素Ｄ０に入射するが、その一部は、画素Ｄ０の隣の画素Ｄ１、Ｄ２に入射する。則ち、ハッチングをした楕円と破線で示した楕円の重なり合う部分の光が、それぞれ、画素Ｄ１、Ｄ２に入射する。

同様にして、図２（ｂ）の点灯状態のとき、画素Ｄ０には、単位光源ＳＢ１、ＳＢ２からの光の一部（ハッチングをした楕円と破線で示した楕円の重なり合う部分の光）が入射する。これは、単位光源からの光は試料上で広がりを持ち、また画素Ｄ０が検出しうる試料上の領域も広がりを持つためである。則ち、画素Ｄ０で受光される光は、単位光源ＳＢ１の照明により結像面近傍以外の領域から発する光の一部と、単位光源ＳＢ２の照明により結像面近傍以外の領域からの発する光の一部である。

以下、図２（ａ）の点灯状態のとき、則ち、単位光源ＳＡが点灯しているとき画素Ｄ０からの出力信号をＳａとする。次に、この出力信号Ｓａが示す試料の情報について説明する。

図３は、試料において、単位光源ＳＡが照射する領域Ａを示す図である。この領域からの光が主として画素Ｄ０で受光されると共に、一部が画素Ｄ１、Ｄ２で受光される。

なお、図３の領域ＡのＸｓ軸上の部分が結像面近傍に相当する。領域Ａは、試料３上の結像面（ｘｓ−ｙｓ平面）上において一番絞られているが、ｚ軸方向にも広がっている。前述のように、スリット走査共焦点顕微鏡においては、ピンホールを用いていないので、試料深さ方向の分解能が低く、出力信号Ｓａに含まれる試料情報の領域は、照射されている試料の領域Ａと重なった領域となる。出力信号Ｓａには、単位光源ＳＡの試料における結像面近傍以外の領域（光軸方向に離れた位置）から発する光の一部も含まれる。

次に、図２（ｂ）のように、単位光源ＳＡの両隣の単位光源ＳＢ１、ＳＢ２を点灯させる。その際、画素Ｄ０で受光される光による出力信号をＳｂとする。この出力信号Ｓｂが示す試料情報の領域について図４を用いて説明する。

図４（ａ）において、実線で示した領域Ａ（ｚ軸方向中心軸はＺ_Ａ）は図３で示した領域Ａであり、破線で示した領域Ｂ（ｚ軸方向中心軸はＺ_Ｂ）は、単位光源ＳＢ１によって照明されている領域である。図４（ａ）に示すように領域Ａと領域Ｂとは、ハッチングを施した領域Ｄで重なり合っている。

同様にして、図４（ｂ）において、実線で示した領域Ａは図３で示した領域であり、破線で示した領域Ｅ（ｚ軸方向中心軸はＺ_Ｅ）は、単位光源ＳＢ２によって照明されている領域である。図４（ｂ）に示すように領域Ａと領域Ｅとは、ハッチングを施した領域Ｆで重なり合っている。

以上のように、図２（ｂ）の点灯状態の場合に、これらの重なり合った試料上の領域Ｄ及び領域Ｅからの光が、画素Ｄ０で検出され、出力信号Ｓｂが得られる。つまり、出力信号Ｓｂに含まれる試料情報の領域は、図５（ｂ）に示すように、図４の領域Ｄと領域Ｆとを合成したものとなり、これらから得られる出力信号Ｓｂは、出力信号Ｓａに含まれる、単位光源ＳＡの照明により結像面近傍以外の領域から発する光の一部とほぼ等価とみなせる。

よって、差分出力信号（Ｓａ−Ｓｂ）を演算すれば、この差分に含まれている試料情報の領域は図５（ｃ）に領域Ｇで示す領域となり、図５（ａ）に領域Ａで示すような、単位光源ＳＡを点灯させた場合の試料情報の領域に比して、ｚ方向の領域が狭くなっている。これは、すなわち、試料深さ方向の分解能（解像度）が高くなっていることを意味する。よって、この差分出力信号を画素Ｄ０の修正出力信号として用いて画像を形成すれば、試料深さ方向に高い分解能を有する画像が得られる。

このようにして、まず、図２（ａ）のように、スリット状光源１の単位光源を１つおきに点灯させて上述の処理を行う。続いて、図２（ｂ）のように、スリット状光源１の単位光源のうち点灯していた単位光源を消灯し、消灯していた単位光源を点灯させて、前述の処理を行う。そして、両者を合成した出力信号により画像を構成すれば、試料深さ方向に高い分解能を有する画像が得られる。

なお、以上の説明においては、単位光源を一つおきに交互に点灯させたが、必ずしもこのようにする必要はない。例えば、単位光源を任意の順で離散的に点灯させ、点灯している単位光源と共役な位置にある１次元撮像素子の画素の出力信号をＳａとし、その両隣にある単位光源が点灯したときの前記の同じ画素の出力信号をＳｂとするとき、差分出力信号（Ｓａ−Ｓｂ）を、前記の１次元撮像素子の画素の出力信号Ｓａの修正出力信号とすれば、同じ効果が得られる。

なお、図１においては走査機構の説明を省略しているが、走査機構は従来のスリット走査共焦点顕微鏡と変わるところが無く、従来のものをそのまま使用できる。

Claims (5)

1. スリット状の光源と、
   前記光源の像を試料の上に結像させる照明光学系と、
   前記試料からの反射光、透過光又は蛍光を、前記光源と光学的に共役な位置に配置された１次元撮像素子上に結像させる結像光学系とを有し、
   前記光源は、前記１次元撮像素子の画素と光学的に共役な大きさの単位光源に分割されていることを特徴とするスリット走査共焦点顕微鏡。
2. 前記光源は、前記単位光源を離散的に点灯するよう制御されていることを特徴とする請求項１に記載のスリット走査共焦点顕微鏡。
3. 前記光源は、点灯している前記単位光源の両隣にある単位光源を消灯状態にするよう制御されていることを特徴とする請求項２に記載のスリット走査共焦点顕微鏡。
4. 前記光源は、前記単位光源を１つおきに点灯するよう制御されていることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載のスリット走査共焦点顕微鏡。
5. 点灯している前記単位光源と共役な位置にある前記１次元撮像素子の画素の出力信号をＳａとし、その両隣にある、前記単位光源が点灯したときの前記共役位置に配置された１次元撮像素子の画素の出力信号をＳｂとするとき、差分出力信号（Ｓａ−Ｓｂ）を、前記１次元撮像素子の画素の出力信号Ｓａの修正出力信号とする処理部を有することを特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか一項に記載のスリット走査共焦点顕微鏡。

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