WO2013031439A1 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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田邊哲也
山口光城
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Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- It relates to optical analysis technology that can detect light from biological particles and obtain useful information in the analysis or analysis of those states (interaction, binding / dissociation state, etc.).
  • the present invention relates to an optical analysis device, an optical analysis method, and an optical analysis computer program that enable various optical analyzes by individually detecting light from a single light emitting particle using the optical system as described above.
  • a particle that emits light (hereinafter referred to as “luminescent particle”) is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA.
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 4 and Photon Counting Histogram (PCH.
  • Patent Document 5 are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume generated is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules etc.
  • the average value of the value and the number of molecules staying in the confocal volume is calculated, and based on this information, changes in the structure or size of the molecule, binding / dissociation state, dispersion / aggregation state, etc. are estimated. It will be.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles distributed in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the light to be measured is light emitted from one or several fluorescent molecules.
  • statistical processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to histogram is executed, and light signals from individual fluorescent molecules etc. are processed. It is not individually referenced or analyzed. That is, in these photoanalysis techniques, light signals from a plurality of fluorescent molecules and the like are statistically processed, and statistical average characteristics of the fluorescent molecules and the like are detected.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is equal to one second in the equilibrium state.
  • the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time of the order length enters and exits the micro area, and preferably there is always about one fluorescent molecule in the micro area.
  • the concentration of fluorescent molecules or the like in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more. When it is significantly lower than 1 nM, a time when the fluorescent molecule or the like is not present in the confocal volume occurs, and a statistically significant analysis result cannot be obtained.
  • the detection methods for fluorescent molecules and the like described in Patent Documents 6 to 8 do not include statistical calculation processing of fluctuations in fluorescence intensity, and even if the fluorescent molecules in the sample solution are less than 1 nM, the fluorescent molecules However, it has not been achieved to quantitatively calculate the concentration or number density of fluorescent molecules that are moving randomly in the solution.
  • the applicant of the present application deals with the optical analysis technique including the statistical processing such as FCS, FIDA, etc. in the concentration or number density of the luminescent particles to be observed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481.
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution below a certain level is proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, like FCS, FIDA and the like.
  • the photodetection area When used, while moving the position of a minute region (hereinafter referred to as “light detection region”) that is a light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region,
  • the photodetection area includes luminescent particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the luminescent particles is detected, and each of the luminescent particles in the sample solution is detected individually.
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS and FIDA, and the concentration, number density or Other characteristics can be detected quantitatively.
  • the light intensity value (or photon count value) sequentially measured is recorded as time-series light intensity data as the position of the light detection region in the sample solution moves.
  • an increase in the light intensity value representing the light emitted from the light emitting particles (a signal representing the light of the light emitting particles) is detected.
  • the light intensity value is used to analyze various characteristics such as wavelength characteristics and polarization characteristics of the light, it is possible to detect the characteristics of the individual light-emitting particles and specify the type.
  • the light measured by the above scanning molecule counting method is weak light at the level of one fluorescent molecule or several molecules, and the light measuring time of one light emitting particle is the light detection of the light emitting particle. It is a short time while passing through the area. Accordingly, since the light intensity value obtained from the detection light is low, or the amount of light or the number of photons is small, the information on the wavelength characteristics of the light emitted by the light emitting particles becomes large, and only low-precision detection results can be obtained. There is a case.
  • the main object of the present invention is to reduce the variation in the detection results such as the wavelength characteristics of the light emitted from the luminescent particles obtained based on the light measured by the scanning molecule counting method. It is to provide a novel optical analysis technique capable of improving accuracy.
  • the light detection region passes through a predetermined path a plurality of times, and repeatedly measures the light emitted by the same luminescent particles.
  • the above problem is to detect light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and move randomly using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection region moving part that moves the position of the light detection region of the optical system along a predetermined path in the sample solution by changing the light path of the optical system of the microscope, and a light detection region
  • a signal processing unit that individually detects a signal representing light from each of the light emitting particles in time-series light intensity data, and the light detection region moving unit detects light over at least two rounds along a predetermined path.
  • a light-emitting particle dispersed in a sample solution and moving randomly is a particle that emits light, such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in a sample solution. Any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the “signal” of the luminescent particles refers to a signal representing light from the luminescent particles unless otherwise specified.
  • the scanning molecule counting method which is the basic configuration of the present invention
  • the position of the light detection region in the sample solution is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope.
  • the light is sequentially detected while moving, that is, while scanning the sample solution with the light detection region.
  • the light detection region that moves in the sample solution includes light emitting particles that are moving randomly, the light from the light emitting particles is detected, thereby detecting the presence of one light emitting particle.
  • the light signals from the luminescent particles are detected individually in the sequentially detected light, thereby detecting the presence of the particles individually one by one, and in the solution of particles.
  • Various information regarding the state is acquired.
  • the light of the luminescent particles is weak, and the light of the luminescent particles can be detected only in a short time from when the luminescent particles enter the moving light detection region until it deviates.
  • the amount of light or the number of photons detected is relatively small if the light detection region passes through the region where the luminescent particles are present only once. Therefore, the information obtained from the amount of light or the number of photons varies widely and has low accuracy. obtain. Therefore, in the present invention, as described above, the light detection area moving unit moves the position of the light detection area along at least two rounds along the predetermined path, and rotates the light detection area along the predetermined path.
  • the light from each light emitting particle existing in the predetermined path is detected multiple times, and more light amount or photon is obtained from each light emitting particle, thereby detecting the presence of the light emitting particle (signal Detection of the presence of luminescent particles) and variation in information obtained from the signal can be reduced and accuracy can be improved.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution by changing the optical path of the optical system of the microscope may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvano mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the predetermined path may be a circulation path (closed path) having an arbitrary shape, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, and a rectangle.
  • the movement of the light detection region is quick, and mechanical vibration or hydrodynamic action is applied to the sample solution. Therefore, it is advantageous in that light can be measured in a stable state without the influence of the mechanical action of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region is preferably moved at a cycle shorter than the diffusion time until the luminescent particles deviate from the predetermined path by diffusion.
  • the movement cycle of the position of the light detection region depends not only on the movement speed of the light detection region, but also on the path length of the predetermined route.
  • the length of the predetermined path and the moving speed of the light detection area are appropriately set so that the light detection area can circulate on the predetermined path with a period shorter than the diffusion time until the luminescent particles to be observed deviate from the predetermined path. May be adjusted.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion). If the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is lower than the diffusion movement speed of the luminescent particles, the position moves randomly by Brownian motion even while the luminescent particles are included in the light detection region.
  • the viscosity of the sample solution may be increased and the translational diffusion rate of the particles may be reduced.
  • the viscosity of the sample solution can be adjusted by adding thickeners and gelling agents (polymer compounds, polysaccharides, silicones, glycerin, PEG, dextran, sucrose, sodium alginate, polysilicon, water-soluble cellulose, etc.) It is.
  • the sample solution is moved by moving the microscope stage, etc.
  • the process from light detection to generation of time-series light intensity data is executed in the above manner at another location in the sample solution so that signals for a larger number of luminescent particles can be detected. It is preferable that As already mentioned, in order to make the period of the circular movement of the light detection region shorter than the diffusion time until the luminous particles deviate from the predetermined path due to diffusion, when the predetermined path length is shortened, The number of luminescent particles present will be reduced.
  • the light detection as described above is performed at a plurality of different positions of the sample solution, and the number of detected luminescent particles is increased, thereby obtaining the signal from the luminescent particle signal.
  • the accuracy of information is improved.
  • the apparatus of the present invention further moves the position of the sample solution at the end of the movement of the position of the light detection region along the predetermined path for a predetermined number of laps.
  • Individual detection of signals representative of light from each of the particles may be performed.
  • by combining the circular movement of the light detection region by changing the optical path of the optical system and the intermittent movement of the sample solution it is possible to detect the presence of luminescent particles with higher accuracy and Acquisition of information obtained from the signal is executed.
  • the movement of the sample solution may preferably be moved together with the sample solution container by moving the stage of the microscope, as already mentioned. In this case, since no flow is generated in the solution, it is considered that the influence of the sample solution on the luminescent particles is reduced.
  • the detection of the signal of the luminescent particles and the extraction of the signal characteristics from the generated time-series light intensity data may be roughly performed in one of two modes.
  • the light intensity data (time-series light intensity data) measured while the light detection region goes around the predetermined path is used to measure the light intensity in one predetermined path a plurality of times.
  • the executed data is concatenated data
  • in the time-series light intensity data, for each position on the predetermined path refer to a plurality of light intensity values corresponding to each position, and A representative value of the intensity value, for example, an average value, a median value, a minimum value, a maximum value, or a mode value is determined, and time-series light intensity representative value data including the representative value of the light intensity value is generated.
  • the movement speed of the light detection area is usually constant, or the movement speed when passing through the same position on the predetermined path in each round of the light detection area is set to be equal to each other.
  • the position on the predetermined path corresponds to the time from the start time of each round in the time-series light intensity data. Therefore, specifically, a representative value of the light intensity value is determined for each time from the start of each turn in the time-series light intensity data, and the representative values of the light intensity values are arranged in time series. Time-series light intensity representative value data may be generated. Then, in the time-series light intensity representative value data, signals representing light from each of the luminescent particles are individually detected, and the feature amount of the signal (that is, signal characteristics) is detected.
  • the time-series light intensity data in the time-series light intensity data, first, signals representing the light from each of the luminescent particles are individually detected, Each feature amount of the signal is detected.
  • the signal of the luminescent particles existing in the predetermined path is included for the number of rounds, so the detected signal is referred to for each luminescent particle.
  • the representative value of the feature amount of the signal is calculated.
  • the signal processing unit individually detects a signal representing light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data, detects a feature amount of the signal, In addition, a representative value of the feature amount of the signal, for example, an average value, a median value, a minimum value, a maximum value, or a mode value is calculated.
  • the feature amount of the signal may typically be the light intensity or the number of photons.
  • the feature amount of the signal is a plurality of components. It may be an index value representing the characteristics of any luminescent particle such as the degree of polarization, rotational diffusion constant, emission spectrum, etc. obtained from the ratio of the light intensity or the number of photons.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention determines whether or not one luminescent particle has entered the light detection region from the detection value signal from the sequential light detection unit. This may be done based on the shape of the signal in the data. In the embodiment, typically, when a signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region. More specifically, as will be described later in the section of the embodiment, the signal representing the light from the luminescent particles is usually the time-series detection value of the light detection unit, that is, the light intensity data.
  • the signal appears as a bell-shaped pulse signal having a certain level of intensity or more, and the noise appears as a signal that is not a bell-shaped pulse signal or has a low intensity. Therefore, the signal processing unit of the apparatus of the present invention, on the time-series light intensity data (or time-series light intensity representative value data), a pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold is output from a single luminescent particle. It may be configured to detect as a signal representing light.
  • the “predetermined threshold value” can be set to an appropriate value experimentally.
  • the detection target of the apparatus of the present invention is light from a single luminescent particle, the light intensity is very weak, and when one luminescent particle is a single fluorescent molecule or several molecules, The light emitted from the luminescent particles is probabilistically emitted, and there is a possibility that a signal value may be lost in a very short time. When such a lack occurs, it becomes difficult to specify a signal corresponding to the presence of one luminescent particle. Therefore, the signal processing unit smoothes the time-series light intensity data, processes the data so that missing signal values at a minute time can be ignored, and then performs predetermined processing on the smoothed time-series light intensity data. A bell-shaped pulsed signal having an intensity exceeding a threshold value may be detected as a signal representing light from a single luminescent particle.
  • the number of light-emitting particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region position is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles can be reduced. It can be calculated specifically.
  • a light analysis technique for performing light detection while moving the position of a light detection region in a sample solution and individually detecting a signal from each luminescent particle, the predetermined path
  • the light detection area is moved around along the path to detect light from the light emitting particles in the predetermined path multiple times, thereby detecting the presence of the light emitting particles and reducing the variation in information obtained from the signal and improving the accuracy.
  • the processing of the optical analysis technique that can be achieved can also be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, for optical analysis for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • Computer program is provided that.
  • the computer program is stored in a computer-readable storage medium and provided.
  • the computer implements the above-described procedure by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / arithmetic processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-described program may be distributed to a computer via a communication line, and the computer that has received this distribution may execute the program.
  • the position of the light detection region is preferably moved along the predetermined path in a cycle shorter than the diffusion time until the luminescent particles deviate from the predetermined path due to diffusion.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution by changing the optical path of the optical system is performed by using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope, for example.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system, and the predetermined path can be selected from circular paths of arbitrary shapes such as a circle, an ellipse, and a rectangle, for example. It may be.
  • the movement speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion movement speed of the luminescent particles to be detected in order to prevent random changes in the light intensity of the luminescent particles. Is done.
  • the procedure for moving the position of the sample solution by moving the microscope stage or the like at the end of the movement of the position of the light detection region along the predetermined path of the predetermined circuit.
  • the light detection region circling movement procedure and the time-series light intensity data generation procedure are repeated at the position of the sample solution after the movement, and the luminescent particle signal detection procedure is executed for each position after the movement of the sample solution. It is preferable that signals for a larger number of luminescent particles can be detected.
  • the signal processing in the above computer program from the representative value of the light intensity value determined for each position on the predetermined path in the time-series light intensity data.
  • a procedure for generating representative data of time series light intensity is executed, and in the light emission particle signal detection procedure, signals representing light from each of the light emission particles are individually detected in the time series light intensity representative value data.
  • a signal representing light from each of the luminescent particles is individually detected in the time-series light intensity data.
  • the feature amount of the signal may be detected, and a representative value of the feature amount of the signal may be calculated for each luminescent particle (second aspect).
  • the signal feature amount may be at least one selected from the group consisting of light intensity, number of photons, degree of polarization, rotational diffusion constant, and emission spectrum.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • a procedure for counting the number of light-emitting particles detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of signals from the individually detected light-emitting particles and / or A procedure for determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles may be included.
  • an optical analysis method for detecting light of individual luminescent particles while moving the position of the photodetection region in the sample solution, which is along a predetermined path.
  • an optical analysis method for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, comprising: By changing the optical path of the optical system, the optical detection area of the optical system moves in the sample solution at least two rounds along the predetermined path, and at least two rounds.
  • Time-series light intensity data generation process for detecting light from the light detection area and generating time-series light intensity data during the movement of the position of the light detection area along a predetermined path, and time-series light intensity data
  • a luminescent particle signal detection process for individually detecting signals representing light from each of the luminescent particles present in the predetermined path.
  • the predetermined path may be selected from circulation paths having an arbitrary shape such as a circle, an ellipse, and a rectangle, and typically, for example, in a laser scanning optical microscope.
  • the position of the light detection region is moved along the predetermined path in a cycle shorter than the diffusion time until the luminescent particles deviate from the predetermined path due to diffusion, such as by using a galvanometer mirror adopted in
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the luminescent particle signal detection process is executed for each position after the movement of the sample solution, so that signals for a larger number of luminescent particles can be detected. It's okay.
  • time-series light intensity representative values composed of representative values of light intensity values determined for each position on a predetermined path in time-series light intensity data.
  • a process of generating data is included, and in the luminous particle signal detection process, a signal representing light from each of the luminous particles is individually detected in the time-series representative light intensity value data, and a feature amount of the signal is detected.
  • signals representing light from each of the light emission particles are individually detected in the time-series light intensity data, and the feature amount of the signal is detected.
  • the representative value of the feature amount of the signal may be calculated for each luminescent particle (second aspect).
  • the signal feature amount may be at least one selected from the group consisting of light intensity, number of photons, degree of polarization, rotational diffusion constant, and emission spectrum.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • a step of determining the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles formed may be included.
  • the optical analysis technique of the present invention described above is typically a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. Used to analyze or analyze the state of matter in solution, but analyze or analyze the state in solution of non-biological particles (eg, atoms, molecules, complexes, micelles, metal colloids, plastic beads, etc.) It should be understood that such cases are also within the scope of the present invention.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, complexes, micelles, metal colloids, plastic beads, etc.
  • the presence of luminescent particles is obtained by capturing light from the luminescent particles when the light detection region moving in the sample solution includes the luminescent particles. And / or detection of its characteristics. Accordingly, it is difficult to keep track of one light-emitting particle and continue to detect the light.Since the observation time of one light-emitting particle is short, the amount of light or the number of photons from the light-emitting particle is small, and the information obtained therefrom The variation tended to be large.
  • the present invention it is possible to measure the light from one luminescent particle a plurality of times by circling the same predetermined path, so that the amount of light or the number of photons from the luminescent particle is detected. It is expected to improve accuracy and reduce variation in information obtained from it. Further, as will be shown in the examples described later, according to one aspect of the present invention, the background noise relative to the signal of the luminescent particles is relatively reduced, and the S / N ratio is improved. It is done.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in the scanning molecule counting method to which the present invention is applied, and a schematic diagram of time variation of the measured light intensity, respectively.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope
  • FIG. 2C is a diagram for explaining a mode of movement of the position of the light detection region along one scanning trajectory (predetermined path) in the present invention.
  • FIG. 2D is a diagram for explaining a mode of movement of the position of the sample solution.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a mode of signal processing of time-series light intensity data in the present invention.
  • (A) is a schematic diagram of time-series light intensity data when the photodetection region is moved around on one scanning trajectory (predetermined path) as shown in (B).
  • FIG. 4 is a flowchart showing the processing procedure of the scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention in the form of a flowchart.
  • (A) is a processing procedure in the case of detecting a signal after generating time-series light intensity representative value data
  • (B) is a representative value of a signal for each luminescent particle after detecting the signal. It is a processing procedure in the case of calculating.
  • (C) is a processing procedure for detecting a luminescent particle signal in time-series light intensity data or time-series light intensity representative value data.
  • 5A and 5B show the case where the luminescent particles traverse the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a model figure showing the mode of movement of particles when luminous particles cross a photodetection region by moving.
  • FIG. 5C shows the signal processing process of the detection signal in the processing procedure for detecting the presence of the luminescent particles from the measured time-series light intensity data (time change of the photon count) according to the scanning molecule counting method. It is a figure explaining an example.
  • FIG. 6 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region. In the figure, a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 6 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region. In the figure, a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 6 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a
  • FIG. 7 shows the average value (bar graph) and CV value (error bar) of the peak intensity of the luminescent particle signal obtained by the scanning molecule counting method performed according to the present invention using a fluorescently labeled plasmid as the luminescent particle.
  • FIG. 8 shows a change in the amount of noise on the time-series light intensity data with respect to the number of rounds on the scanning orbit of the light detection region in the scanning molecule counting method executed according to the present invention.
  • FIG. 9 shows changes in the average value (bar graph) and standard deviation (error bar) of the degree of polarization of the luminescent particles obtained by the scanning molecule counting method performed according to the present invention with respect to the number of revolutions on the scanning orbit of the light detection region.
  • FIG. 10 shows the number of luminescent particle signals obtained by the scanning molecule counting method using sample solutions having various luminescent particle concentrations.
  • ⁇ is the number of particles detected on the time series light intensity representative value data, which is the average value of the time series light intensity data for three rounds, and ⁇ is detected on the time series light intensity data for one round The number of particles.
  • FIG. 11 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • FIG. 11A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • luminescent particles that are the object of observation typically particles to which luminescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes have been added are dispersed or dissolved, and these luminescent particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting.
  • a sensitive photodetector is used.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • a mechanism for scanning the sample solution with the light detection region that is, for moving the position of the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. Change and move the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved, and the relative position of the light detection region in the sample solution is shifted.
  • the stage position changing device 17a is actuated to move the target position (method of moving the position of the sample solution).
  • the optical detection area is moved around the scanning trajectory (predetermined path) by changing the optical path and moving the absolute position of the optical detection area.
  • the place where the light detection region in the sample solution is moved is changed by the method of moving the position of the sample solution.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region. Driven.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.) Although not shown, the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a dichroic mirror 14a may be inserted in the detection light path so that the detection light is divided into a plurality of wavelength bands and separately detected by a plurality of photodetectors 16. According to such a configuration, it is possible to detect information relating to the emission wavelength characteristics (emission spectrum) of the luminescent particles, and when multiple types of luminescent particles are included, separately detect the light from them depending on the wavelength. It becomes possible.
  • light polarized in a predetermined direction is used as excitation light, and the components of the detection light in the direction perpendicular to the polarization direction of the excitation light are detected separately, and the polarization characteristics of the light of the luminescent particles May be detected.
  • a polarizer (not shown) is inserted in the excitation light optical path, and the polarization beam splitter 14a is inserted in the detection light optical path. (See Example 3).
  • the computer 18 includes a CPU and a memory, and the CPU executes various arithmetic processes to execute the procedure of the present invention. Each procedure may be configured by hardware. All or a part of the processing described in the present embodiment may be executed by the computer 18 using a computer-readable storage medium storing a program for realizing the processing. That is, the computer 18 may realize the processing procedure of the present invention by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / calculation processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-mentioned program is distributed to a computer via a communication line. The computer that has received the distribution may execute the program.
  • the photodetection region is defined.
  • variation in detection of the characteristics can be suppressed and detection accuracy can be improved.
  • the principle of the scanning molecule counting method of the present invention the aspect of the circular movement of the light detection region, and the outline of the signal processing of the measured light intensity data will be described.
  • the spectroscopic analysis technology such as FCS and FIDA is superior to the conventional biochemical analysis technology in that it requires a very small amount of sample and can perform inspection quickly. ing.
  • the concentration and characteristics of the luminescent particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. As shown schematically in FIG. 11A, the concentration or number density of the luminescent particles is a level at which about one luminescent particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. As shown on the right side of the figure, it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the luminescent particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 11B, the luminescent particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a significant light intensity signal (photon count) appears only during a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity. Also, if the concentration of the luminescent particles is much lower than the level at which about one luminescent particle is always present in the light detection area during measurement, the light intensity fluctuation is affected by the background. The measurement time is long to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • FIG. 2 As a process executed in the scanning molecule counting method, in short, a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, and FIG. As schematically depicted in FIG. 2, light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV. . Then, for example, when the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure) and passes through the region where one light emitting particle exists (t1), light is emitted from the light emitting particle, A pulse-like signal having a significant light intensity (Em) appears on the time-series light intensity data as depicted in FIG.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and pulse-like signals (significant light intensity) appearing in the meantime illustrated in FIG. 2B are detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and the number of the luminescent particles is counted to obtain information on the number, concentration, or number density of the luminescent particles present in the measured region.
  • the light characteristics of various luminescent particles and the characteristics of the luminescent particles themselves can be detected for each luminescent particle from the intensity of the signal.
  • FCS, FIDA, etc. have sufficient accuracy. Information on the concentration, number density, and characteristics of particles can be obtained even in a sample solution in which the concentration of particles to be observed is so low that analysis is impossible.
  • the amount of light emitted by the luminescent particles is typically at the level of the amount of light emitted by one to several molecules of fluorescent dye.
  • the light of the luminescent particles is detected only when the light detection region moving within the sample solution includes the luminescent particles, one luminescent particle is included only once by the light detection region.
  • the amount of light or the number of photons obtained from the luminescent particles is very low, so the light detection accuracy of the luminescent particles is low, or there is a large variation in information on the wavelength characteristics obtained from the light of the luminescent particles. Can be.
  • the light detection region is moved around the predetermined path a plurality of times, and the above-mentioned light is measured. Detecting the light from the same luminescent particle existing in the path of multiple times, increasing the amount of light from one luminescent particle, detecting the presence of the luminescent particle and the characteristics of the luminescent particle light or the luminescent particle itself An attempt is made to improve the accuracy of detection.
  • FIG. 2C is a diagram schematically showing a mode in which the light detection region is moved around along the scanning trajectory (predetermined path) a plurality of times.
  • the mirror deflector 17 of FIG. 1 is driven to change the optical path, and the absolute position of the light detection region is changed along a predetermined path (scanning trajectory). The position is moved around. If the light emitting particles in the scanning trajectory hardly change their position during the circular movement of the light detection region, the light of the light emission particles is measured each time the light detection region passes through the region where the light emission particles exist, and accordingly More light can be obtained from the luminescent particles. And if the light quantity from one luminescent particle increases, the improvement of the precision of detection of the presence of a luminescent particle and the detection of the light of a luminescent particle or the characteristic of luminescent particle itself is anticipated.
  • the light-detecting region in order to detect light from the same light-emitting particle over a plurality of circular movements, can be moved around the photodetection region a desired number of times before the light-emitting particles deviate from the scanning orbit by diffusion movement. Needs to be achieved. Therefore, in the present invention, the moving period of the light detection region is preferably set shorter than the diffusion time until the light emitting particles deviate from the scanning orbit by diffusion.
  • the moving period ⁇ is It should be shorter than 6s.
  • the moving period ⁇ needs to be less than 10 ms. .
  • the moving speed of the light detection region does not exceed the upper limit of the moving period of the light detection region determined from the diffusion coefficient D of the luminescent particles and the radius r of the light detection region or the radius R of the scanning trajectory. V and the path length of the scanning trajectory (or the radius R of the scanning trajectory) are selected.
  • the detected luminescent particles are limited to the luminescent particles in the scanning orbit. It will be. Accordingly, the shorter the path length of the scanning trajectory, the smaller the number of detected luminescent particles, and the smaller the number of luminescent particles, the greater the variation in detection values for various characteristics obtained from the luminescent particle signal, Accuracy is also reduced. Therefore, in order to increase the number of detected luminescent particles, every time the light detection region circulates along the scanning trajectory reaches a predetermined number of times, for example, as schematically shown in FIG.
  • the stage position changing device 17a may be driven to move the position of the sample solution, and the circular movement of the light detection region may be repeated at the moved position. Since the movement distance in that case should just be moved longer than the diameter of a photon detection area
  • the path of the position of the sample solution may also be a circulation path, in which case the period may be set longer than the diffusion time until the luminescent particles deviate from the scanning trajectory due to diffusion (this is This is to make it possible to detect light of a light emitting particle different from the light emitting particle whose light has already been measured.
  • time-series light intensity data is generated. Then, in a manner described in detail later, signals representing the light of the luminescent particles are individually detected on the time-series light intensity data.
  • the time-series light intensity data is shown in FIG. As shown in A), it represents the light intensity or the number of photons detected when the light detection region periodically passes the scanning trajectory. That is, in the case of the example of FIG.
  • the sections I, II, and III are respectively the light intensity at the time of circular movement along the scanning trajectory of the first, second, and third light detection regions. The number of photons.
  • the time of the time series light intensity data is periodically on the scanning orbit. Corresponds to the position of.
  • the times t0, t3, t6, and t9 in the time-series light intensity data correspond to the position s0 of the scanning trajectory in FIG. 3B, and the times in the time-series light intensity data.
  • t1, t4, and t5 correspond to the scanning trajectory position s1, and times t2, t5, and t8 in the time-series light intensity data correspond to the scanning trajectory position s2. Therefore, it can be assumed that the light of the luminescent particles on the scanning trajectory appears in the time-series light intensity data approximately at times corresponding to the same position on the scanning trajectory. In consideration of this, the detection of the luminescent particle signal from the time-series light intensity data obtained by orbiting the light detection region on the scanning trajectory is executed according to one of the following two modes. It's okay.
  • time-series light intensity data as shown in FIG. 3A is divided for each movement period of the light detection region, For each time from the starting point, refer to the light intensity or the number of photons at the corresponding time in each section, and calculate their representative values, for example, average value, median value, minimum value, maximum value, or mode value
  • time-series light intensity representative value data in which representative values of the light intensity or the number of photons are arranged in time series is generated.
  • the time-series light intensity representative value data is time-series data including a representative value of the light intensity or the number of photons for each position on the scanning orbit when the light detection region goes around the scanning orbit.
  • the signal of the luminescent particles is detected by processing such as bell-shaped function fitting (FC) in the time-series light intensity representative value data in the manner described later.
  • FC bell-shaped function fitting
  • the light characteristics of the light emitting particles or the characteristics of the light emitting particles themselves are calculated or determined using the signal of the light emitting particles obtained from the time series light intensity representative value data.
  • the effect that a noise level reduces relatively with respect to the signal of a luminescent particle is acquired.
  • noise is randomly generated regardless of the position on the scanning trajectory, whereas the signal of the luminescent particles is always generated at a time corresponding to the position on the same scanning trajectory.
  • the intensity of the noise is reduced relative to the intensity of the signal of the luminescent particles.
  • each luminescent particle on the scanning trajectory appears approximately periodically at times corresponding to positions on the same scanning trajectory.
  • the representative value of each luminescent particle signal for example, the average value, the median value, the minimum value, the maximum value, or the mode value is calculated, and the light value of the luminescent particle is calculated based on the representative value. Alternatively, the characteristics of the luminescent particles themselves are calculated or determined.
  • FIG. 4 shows processing in the present embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • A is a process in the case of detecting the signal of the luminescent particles after generating the time-series light intensity representative value data
  • B is the determination of the representative value of the signal after the detection of the signal of the luminescent particles. The process when performing is shown.
  • C shows an example of detection processing of a signal of luminescent particles.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are arbitrary as long as they are dispersed particles in the sample solution and move randomly in the solution, such as dissolved molecules.
  • biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells, metal colloids, other non-biological molecules, etc. It's okay.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the light intensity in the optical analysis by the scanning molecule counting method of the present embodiment is measured by driving the mirror deflector 17 and the stage position changing device 17a during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • it may be executed in the same manner as the light intensity measurement process in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanomirror), and the light detection area along the scanning trajectory in the well 10.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18, where the computer 18 transmits the signal in an arbitrary manner.
  • Time series light intensity data is generated from the obtained signals and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and therefore when the light detection is based on photon counting, the time-series light intensity data is a time-series data. It may be photon count data.
  • the moving speed in the circular movement of the position of the light detection area along the scanning trajectory during the measurement of the light intensity is arbitrarily a predetermined speed set, for example, experimentally or to suit the purpose of the analysis. It's okay.
  • a predetermined speed set, for example, experimentally or to suit the purpose of the analysis. It's okay.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the movement distance can be grasped.
  • the movement of the position of the light detection area is executed at.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the movement speed of the position of the light detection region satisfies the condition of the movement period ⁇ of the light detection region of the above equation (3), and individually detects the luminescent particles from the measured time-series light intensity data.
  • the observation target particle of the optical analysis technique of the present invention is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion.
  • the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the light intensity changes randomly (as already mentioned, the excitation light intensity of the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), and it corresponds to the individual luminescent particles. It is difficult to specify a change in light intensity. Therefore, preferably, as shown in FIG. 5 (B), the particles cross the light detection region in a substantially straight line, so that in the time-series light intensity data, the uppermost stage of FIG. 5 (C).
  • the light intensity change profile corresponding to each light emitting particle becomes substantially uniform (when the light emitting particle passes through the light detection region substantially linearly, the light intensity change profile is excited).
  • the bell shape is almost the same as the light intensity distribution.
  • the movement speed of the position of the light detection region is the average movement due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between each light emitting particle and the light intensity can be easily identified. It is set faster than the speed (diffusion movement speed).
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s or more, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 detects the signal of the luminescent particles and detects the luminescent particles by processing according to the program stored in the storage device. Various analyzes such as counting and concentration calculation are executed.
  • the first embodiment in which the representative value of the light intensity is determined in the time-series light intensity data before the detection of the signal of the luminescent particle, or the luminescent particle
  • the signal processing is performed in any one of the second modes in which the representative value of the detected signal is determined after the detection of this signal.
  • FIG. 4A time-series light intensity representative value data is generated before detection of the signal of the luminescent particles
  • FIG. 4B representative of the detection signal after detection of the signal of the luminescent particles.
  • the time-series light intensity data is divided for each movement period ⁇ of the light detection region, Starting from the time tsi (i is the number of the section) [ti-i ⁇ tsi] from the data of each section, based on the time tsi (i is the number of the section) of the starting point of each section
  • the light intensity value (number of photons) is read out every time, and the representative values of the light intensity at the time [ti ⁇ i ⁇ tsi] of all the read out parts, that is, the average value, the median value, and the minimum value
  • the maximum value or mode value is calculated or determined.
  • the time-series light intensity configured by arranging the representative values of the light intensity from the time ts at the start point of the section to the time te at the end point in time series. Representative value data is generated.
  • the signal it has corresponds to the passage of one particle through the light detection region and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose light intensity does not exceed the threshold value Ith or whose time width ⁇ is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • smoothing is performed on the light intensity data (FIG. 5C, “detection result (unprocessed)” at the uppermost stage).
  • Processing is performed (FIG. 4 (C) -step 110, upper part “smoothing” in FIG. 5 (C)).
  • the light emitted by the luminescent particles is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time. Therefore, such a data value loss can be ignored by the smoothing process.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data Speed) and BIN TIME may be set as appropriate.
  • a primary differential value with respect to time of the light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the light intensity data as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 5C, the change in the value at the time of change of the signal value becomes large, so the time differential value is referred to.
  • the significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • step 130 significant pulse signals are sequentially detected on the light intensity data. Specifically, first, the start and end points of one pulse signal are searched and determined sequentially on the time differential value data of the light intensity data to identify the pulse existence region. (Step 130). When one pulse existence area is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed light intensity data in the pulse existence area (FIG. 5 (C) lower stage “bell-shaped function fitting”). Parameters such as the intensity Ipeak of the peak (maximum value) of the pulse of the bell-shaped function, the pulse width (full width at half maximum) Wpeak, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether or not the peak intensity, pulse width, and correlation coefficient of the pulse are within predetermined ranges (step 150). Thus, as shown in the left of FIG. 6, the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle. Thus, one luminescent particle is detected. On the other hand, as shown in the right side of FIG. 6, a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise. Note that the counting of the number of signals, that is, the counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with the detection of the signal of the luminescent particles.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the light intensity data (step 160).
  • the process which detects the signal of a luminescent particle separately from light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • step 20 When the representative value of the detection signal is determined after the detection of the light emitting particle signal As shown in FIG. 4B, the light emission detected after the light emitting particle signal detection process (step 20).
  • step 30 the representative value of the particle signal
  • the detection of the signal of the luminescent particles is executed in the same manner as described above. At that time, counting of the number of signals, that is, counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with detection of the signal of the luminescent particles. Thereafter, as schematically illustrated in FIG.
  • the time-series light intensity data is divided for each period, and the intensity value of the signal (for example, peak value) is determined from the data of each classification for each luminous particle. (Intensity) is picked up, and their representative values, that is, average value, median value, minimum value, maximum value or mode value are calculated or determined.
  • the total volume of the region through which the light detection region passes may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (9)) regarding the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • the detection light when the light intensity data is generated for each wavelength band by separately measuring the components of the multiple wavelength bands, the detection light was obtained from each of the light intensity data.
  • Information on the emission wavelength spectrum of the luminescent particles (for example, the intensity ratio at a plurality of wavelengths) can be obtained from the intensity value of the signal. It should be understood that in the scanning molecule counting method which is the object of the present invention, information on the light characteristics of the luminescent particles and the characteristics of the luminescent particles themselves are determined for each luminescent particle. It is.
  • light intensity values obtained by a plurality of measurements per light emitting particle are obtained, and representative values thereof are determined, so that (one time measurement per light emitting particle is executed) Variations in information regarding the light characteristics of the luminescent particles and the characteristics of the luminescent particles themselves are reduced, and detection accuracy is expected to be improved.
  • the light detection region passes through a predetermined path a plurality of times, and repeatedly measures the light emitted by the same luminescent particles during that time. Accordingly, it is possible to suppress variation in detection of the presence of individual luminous particles and / or their characteristics using the measured light intensity data, and to improve detection accuracy.
  • the signal of the luminescent particles is detected from the time-series light intensity data obtained by the light measurement during the circular movement along the predetermined path of the light detection region, and the peak intensity variation of the luminescent particle signal And the relationship between the number of laps of the light detection region was evaluated.
  • SYTOX Orange is a DNA intercalator dye, and when bound to DNA, the fluorescence intensity increases about 500 times.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution
  • time-series light intensity data photon count data
  • a laser beam having a wavelength of 633 nm was used as the excitation light, and light having a wavelength band of 660 to 710 nm was measured using a bandpass filter.
  • the time-series light intensity data is generated in accordance with the mode of generating the time-series light intensity representative value data before the detection of the signal of the luminescent particles described with reference to FIG. Were divided every 10 milliseconds as the movement period, and the average value of the photon count values was calculated every time (every BIN TIME) from the starting point of each division, and representative value data of the time-series photon count values was generated.
  • the representative value data the signal of the luminescent particles was individually detected. The detection of the luminescent particle signal is performed by subjecting the time-series photon count representative value data to smoothing according to the procedure described in “(b) Individual detection of luminescent particle signal” and steps 110 to 160 in FIG.
  • FIG. 7 shows a case where the number of data divisions at the time of generating time-series photon count representative value data (time-series average value data), that is, the number of rounds of the photodetection area in one scanning trajectory is changed.
  • time-series average value data time-series average value data
  • the average value of the peak intensity itself does not change so much in the number of laps 1 to 9, but the CV value, which is an index value of the dispersion of values, increases the number of laps. And reduced.
  • the CV value when the number of laps was 1 was 110%, whereas the CV value when the number of laps was 17 was reduced to 55%, and variation in values was suppressed.
  • the average value of peak intensity decreases as the number of rounds increases, which is thought to be because the position of the luminescent particles gradually moves and the photon count value is dispersed before or after.
  • a reference value (noise level) was calculated by adding three times the standard deviation to the average value of the number of photons in the entire representative value data.
  • FIG. 8 shows the change in the noise level when the number of data divisions when generating time-series photon count representative value data, that is, the number of times the photodetection area is rotated in one scanning orbit, is changed. Represents. As understood with reference to the figure, the noise level decreased as the number of laps increased.
  • background noise occurs randomly regardless of the position of the light detection region on the scanning trajectory. That is, the background noise is very unlikely to occur repeatedly at the time corresponding to the same position on the scanning trajectory, so the more the number of sections referenced when generating the time series photon count representative value data, It is considered that the intensity of the background noise is relatively reduced as compared with the intensity of the signal of the luminescent particles generated at the time corresponding to substantially the same position on the scanning trajectory. This was confirmed by the results of FIG.
  • a polarizer is inserted in the excitation light path to polarize the excitation light in one direction
  • a polarization beam splitter is inserted in the detection light path
  • the detection light has a direction perpendicular to the polarization direction of the excitation light.
  • Component I V and component I H in the direction parallel to each other were detected, and the others were subjected to optical measurement and data processing under the same conditions as in Example 1 to detect signals of luminescent particles. Then, using the signal of the obtained luminescent particles, the degree of polarization (I V ⁇ I H ) / (I V + I H ) was calculated for each luminescent particle, and the average value and the CV value were calculated.
  • FIG. 9 shows the degree of polarization of the luminescent particle signal when the number of data divisions when generating the time-series photon count representative value data, that is, the number of rounds of the photodetection region in one scanning orbit is changed. It represents the change between the average value and the CV value.
  • the average value of the polarization degree itself does not change so much in the number of laps 1 to 17, but the CV value that is an index value of the variation in the value increases the number of laps. And reduced.
  • the CV value when the number of laps was 1 was 35%, whereas the CV value when the number of laps was 17 was reduced to 16%, and variation in values was suppressed. This result indicates that according to the method of the present invention, the variation in the feature amount of the luminescent particle signal is further reduced, and the detection accuracy is improved.
  • the detection of the luminescent particle signal was performed by the scanning molecule counting method according to the present invention using fluorescent dye solutions of various concentrations as sample solutions, and the lower limit of the luminescent particle concentration that could be determined by the scanning molecule counting method according to the present invention was confirmed.
  • a solution containing 1 aM to 10 pM of fluorescent dye ATTO647N (Sigma-Aldrich) in a phosphate buffer (containing 0.05% Tween 20) was prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution
  • time-series light intensity data photon count data
  • laser light of 633 nm was used as excitation light, and light in a wavelength band of 660 to 700 nm was measured using a bandpass filter, and time-series photon count data was generated.
  • the time-series light intensity data is generated in accordance with the mode of generating the time-series light intensity representative value data before the detection of the signal of the luminescent particles described with reference to FIG. Is divided every 5 milliseconds, which is the movement cycle, and the average value of the photon count value of the data for three rounds is calculated for each time (BIN TIME) from the start point of each division, and representative of the time series photon count value Generated value data.
  • the luminescent particle signals were individually detected in the same manner as in Example 1, and the number of detected luminescent particle signals was counted.
  • FIG. 10 shows the number of detected luminescent particle signals (vertical axis) when a dye solution of each concentration (horizontal axis) is used.
  • the number of particles detected in the average value data of three rounds of data measured over three 600 seconds (with superimposition ⁇ ) and the number of particles detected in one round of data ( Each of them is plotted with no superposition processing ⁇ ).
  • the linearity between the number of detected particles and the dye concentration is lost at 1 fM or less, whereas in the case of superimposition processing, the number of detected particles is up to 100 aM. Linearity with the dye concentration was obtained.
  • the luminescent particle signal and the noise signal can be easily distinguished, and the measurement sensitivity is improved.
  • the light detection region is circulated along the same predetermined path and the light from one luminescent particle is measured a plurality of times in accordance with the teaching of the present invention.
  • variation in the feature amount of the luminescent particle signal is reduced, thereby improving detection accuracy.
  • background noise is relatively reduced, and an improvement in the S / N ratio is expected.

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Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、発光粒子の光の信号の検出結果のばらつきがより小さく抑え、精度向上が図られる試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術が提供される。本発明による光分析技術は、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って移動し、複数回に亘る所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の間に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成し、複数回の光検出領域の所定経路に沿った周回移動に於いて得られた時系列の光強度データを用いて所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする。

Description

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
　上記の走査分子計数法では、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動と共に、逐次的に計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）が時系列の光強度データとして記録され、そのデータ上に於いて、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大（発光粒子の光を表す信号）が検出される。その際、その光強度値を用いて、かかる光の波長特性や偏光特性などの種々の特性を分析すれば、個々の発光粒子の特性の検出、種類の特定が可能となる。例えば、検出光を複数の波長帯域に分割して波長帯域毎に検出された光強度値の比を参照することで、発光粒子の放出する光の波長特性の検出が可能となる（特願2010-202995、特願2010-262267参照）。また、検出光を偏光成分に分割して偏光成分毎に検出された光強度値の比を参照することで、発光粒子の放出する光の偏光特性の検出及び発光粒子の運動特性の検出が可能となる（特願2010-234769参照）。
　しかしながら、上記の走査分子計数法に於いて計測される光は、蛍光一分子又は数分子のレベルの微弱光であり、且つ、一つの発光粒子の光の計測時間は、その発光粒子が光検出領域内を通過する間の短い時間である。従って、検出光から得られる光強度値が低く、或いは、光量若しくは光子数が少ないので、発光粒子の放出する光の波長特性等に関する情報にばらつきが大きくなり、低精度の検出結果しか得られない場合がある。
　そこで、本発明の主な目的は、上記の走査分子計数法により計測される光に基づいて得られる発光粒子の放出する光の波長特性等の検出結果に於けるばらつきを小さくし、検出結果の精度向上が図られる新規な光分析技術を提供することである。
　本発明では、端的に述べれば、上記の如き走査分子計数法に於いて、光検出領域が所定の経路を複数回に亘って通過して、その間に同一の発光粒子の放出する光を繰り返し計測することにより、計測された光強度のデータを用いた個々の発光粒子の存在及び／又はその特性の検出に於ける結果のばらつきの抑制、検出精度の向上が図られる。
　かくして、本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、光検出領域移動部が所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って光検出領域の位置を移動し、信号処理部が少なくとも２周回に亘る所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の間に得られた時系列の光強度データを用いて所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする装置によって達成される。
　かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、発光粒子の「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、既に述べた如く、発光粒子の光は微弱であり、移動する光検出領域に発光粒子が進入してから逸脱するまでの短い間でしか発光粒子の光を検出することができないので、光検出領域が発光粒子の存在領域を一回通過しただけでは、検出される光量又は光子数は、比較的少なく、従って、その光量又は光子数から得られる情報は、ばらつきが大きく低精度であり得る。そこで、本発明に於いては、上記の如く、光検出領域移動部が所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って光検出領域の位置を移動し、光検出領域を所定経路に沿って周回させて、所定経路内に存在する各発光粒子からの光を複数回に亘って検出して、各発光粒子から、より多くの光量又は光子を取得し、これにより、発光粒子の存在の検出（信号の検出が発光粒子の存在の検出となる。）及びその信号から得られる情報のばらつきの縮小と精度の向上が図られる。
　上記の顕微鏡の光学系の光路を変更することによる試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。上記の所定経路は、任意の形状の循環経路（閉じた経路）であってよく、例えば、円形、楕円形、矩形のうちから選択可能であってよい。顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置を変更する態様によれば、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点でも有利である。
　また、上記の本発明の装置の構成に於いて、光検出領域の所定経路に沿った周回の間にランダムに運動している発光粒子が拡散運動により所定経路から逸脱してしまうと、発光粒子からの光を複数回に亘って検出することができなくなる。従って、本発明の装置に於いて、光検出領域の位置は、好適には、発光粒子が拡散により所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて移動される。この点に関し、かかる光検出領域の位置の移動周期は、光検出領域の移動速度だけでなく、所定経路の経路長にも依存することは理解されるべきである。従って、観測されるべき発光粒子の所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて所定経路上を光検出領域が循環できるように、所定経路の長さと光検出領域の移動速度が適宜調整されてよい。更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。もし試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度が発光粒子の拡散移動速度よりも低いと、発光粒子が光検出領域に包含されている間にもブラウン運動することによりランダムに位置が移動する場合があり、そうなると、発光粒子の光の強度がランダムに変化し、光の検出精度が低下してしまうためである（検出される発光粒子の光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって変化する。）。なお、測定対象となる発光粒子の拡散速度が速く、そのままでは、各粒子を２回以上観察できないときには、試料溶液の粘性を高めて、粒子の並進拡散速度が低下されてよい。試料溶液の粘性は、増粘剤やゲル化剤(高分子化合物、多糖類、シリコーン類、グリセリン、PEG、デキストラン、スクロース、アルギン酸ナトリウム、ポリシリコン、水溶性セルロースなど)を添加することにより調整可能である。
　更に、上記の本発明の装置の構成に於いて、所定経路に沿った光検出領域の位置の周回移動を所定の回数終了した場合には、顕微鏡のステージを移動するなどして、試料溶液を移動し、試料溶液内の別の場所にて、上記の態様にて光検出から時系列光強度データの生成までの処理が実行され、より多くの数の発光粒子についての信号が検出できるようになっていることが好ましい。既に触れた如く、光検出領域の周回移動の周期を発光粒子が拡散により所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短くするために、所定経路長が短くなると、一か所の所定経路内に存在する発光粒子の数が低減することとなる。そして、検出される発光粒子の数が少ないほど、発光粒子の信号から得られる情報の精度も低下してしまう。そこで、本発明の一つの態様に於いては、試料溶液の異なる複数の位置にて上記の如き光検出が為され、発光粒子の検出数を多くし、これにより、発光粒子の信号から得られる情報の精度の改善が図られる。かくして、本発明の装置は、更に、所定周回数の所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の終了毎に、試料溶液の位置が移動され、移動後の試料溶液の位置にて、光検出領域移動部による光学系の光路を変更することによる試料溶液内に於ける光学系の光検出領域の位置の所定の経路に沿った少なくとも２周回に亘る移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による時系列の光強度データの生成とが繰り返され、試料溶液の移動後の位置毎に、時系列の光強度データに於いて所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出を実行するようになっていてよい。換言すれば、この態様によれば、光学系の光路を変更することによる光検出領域の周回運動と試料溶液の間歇的な移動とを組み合わせることにより、より高精度の発光粒子の存在の検出及びその信号から得られる情報の取得が実行されることとなる。なお、試料溶液の移動は、好適には、既に触れたように、顕微鏡のステージを移動するなどして試料溶液の容器ごと移動するようになっていてよい。その場合、溶液内に流れが発生しないので、試料溶液の発光粒子への影響が低減されると考えられる。
　上記の本発明の装置に於いて、生成された時系列光強度データからの発光粒子の信号の検出及び信号の特性の抽出は、大別して二つの態様のいずれかにて為されてよい。
　第一の態様に於いては、光検出領域が所定経路を周回する間に計測した光の強度データ（時系列光強度データ）が、一つの所定経路に於ける光強度の計測を、複数回、実行したデータが連結されたデータであると考えて、時系列光強度データに於いて、所定経路上の位置毎に、各位置に対応する複数の光強度値を参照して、それらの光強度値の代表値、例えば、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値を決定し、光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データが生成される。ここで、通常、光検出領域の移動速度は一定であるか、光検出領域の各周回に於いて所定経路上の同一の位置を通過するときの移動速度が互いに等しくなるよう設定されるので、所定経路上の位置は、時系列光強度データに於ける各周回の開始時点からの時間に対応する。従って、具体的には、時系列光強度データに於ける各周回の開始時点からの時間毎に光強度値の代表値が決定され、かかる光強度値の代表値を時系列に整列して成る時系列光強度代表値データが生成されるようになっていてよい。そして、時系列光強度代表値データに於いて、発光粒子の各々からの光を表す信号が個別に検出され該信号の特徴量（即ち、信号の特性）が検出される。
　発光粒子の信号の検出及び信号の特性の抽出の第二の態様に於いては、時系列光強度データに於いて、まず、発光粒子の各々からの光を表す信号が個別に検出し、該信号の特徴量がそれぞれ検出される。それらの検出された発光粒子の信号の群に於いては、所定経路内に存在する発光粒子の信号が周回数分含まれていることになるので、検出された信号を発光粒子毎に参照して、信号の特徴量の代表値が算出される。即ち、第二の態様としては、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し該信号の特徴量を検出し、発光粒子毎に信号の特徴量の代表値、例えば、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値が算出される。
　上記の信号の特徴量としては、典型的には、光強度又は光子数であってよく、検出光として複数の成分が検出される場合には、信号の特徴量は、複数の成分に於ける光強度又は光子数の比から得られる偏光度、回転拡散定数、発光スペクトルなどの任意の発光粒子の特性を表す指標値であってよい。
　上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列光強度データに於ける信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、発光粒子からの光を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の小さい信号として現れる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ（又は時系列光強度代表値データ）上に於いて、所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
　更に、本発明の装置の検出対象は、単一の発光粒子からの光であるため、光強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、所定経路に沿って光検出領域を周回移動させて、所定経路内の発光粒子からの光を複数回検出することにより、発光粒子の存在の検出及びその信号から得られる情報のばらつきの縮小と精度の向上が図られる光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於ける光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って移動する光検出領域周回移動手順と、少なくとも２周回に亘る所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の間に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成手順と、前記の時系列光強度データを用いて所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
　かかるコンピュータプログラムに於いても、好適には、発光粒子が拡散により所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて、光検出領域の位置が所定経路に沿って移動される。その場合、光学系の光路を変更することによる試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、所定経路は、例えば、円形、楕円形、矩形などの任意の形状の循環経路のうちから選択可能であってよい。また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の光の強度のランダムな変化を防止すべく、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、所定周回の所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の終了毎に、顕微鏡のステージを移動するなどして、試料溶液の位置を移動する手順を含み、移動後の試料溶液の位置にて、光検出領域周回移動手順と、時系列光強度データ生成手順とが繰り返され、試料溶液の移動後の位置毎に発光粒子信号検出手順が実行されて、より多くの数の発光粒子についての信号が検出できるようになっていることが好ましい。
　上記のコンピュータプログラムに於ける信号処理に於いては、本発明の装置の場合と同様に、時系列の光強度データに於いて所定経路上の位置毎に決定される光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データを生成する手順が実行され、発光粒子信号検出手順に於いて、該時系列光強度代表値データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し信号の特徴量を検出するか（第一の態様）、発光粒子信号検出手順に於いて、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し該信号の特徴量が検出され、発光粒子毎に信号の特徴量の代表値が算出されてよい（第二の態様）。信号の特徴量としては、光強度、光子数、偏光度、回転拡散定数及び発光スペクトルから成る群から選択された少なくとも一つであってよい。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、所定経路に沿って光検出領域を周回移動させて、所定経路内の発光粒子からの光を複数回検出することにより、発光粒子の存在の検出及びその信号から得られる情報のばらつきの縮小と精度の向上が図られる新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って移動する光検出領域周回移動過程と、少なくとも２周回に亘る所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の間に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成過程と、時系列の光強度データを用いて所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。
　かかる方法に於いても、所定経路は、例えば、円形、楕円形、矩形などの任意の形状の循環経路のうちから選択可能であってよく、典型的には、例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、発光粒子が拡散により所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて、光検出領域の位置が所定経路に沿って移動され、特に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。また、所定周回数の所定経路に沿った光検出領域の位置の移動の終了毎に、試料溶液の位置を移動する過程を含み、移動後の試料溶液の位置にて、光検出領域周回移動過程と、時系列光強度データ生成過程とが繰り返され、試料溶液の移動後の位置毎に発光粒子信号検出過程が実行されて、より多くの数の発光粒子についての信号が検出できるようになっていてよい。
　更に、信号処理に関しても、本発明の装置の場合と同様に、時系列の光強度データに於いて所定経路上の位置毎に決定される光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データを生成する過程が含まれ、発光粒子信号検出過程に於いて、該時系列光強度代表値データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号が個別に検出され信号の特徴量が検出されるか（第一の態様）、発光粒子信号検出過程に於いて、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号が個別に検出され該信号の特徴量が検出され、発光粒子毎に信号の特徴量の代表値が算出されてよい（第二の態様）。そして、信号の特徴量は、光強度、光子数、偏光度、回転拡散定数及び発光スペクトルから成る群から選択された少なくとも一つであってよい。
　更に、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
　上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、錯体、ミセル、金属コロイド、プラスチックビーズなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　本発明の対象となっている走査分子計数法では、基本的には、試料溶液中を移動する光検出領域が発光粒子を包含した際の発光粒子からの光を捉えることにより、発光粒子の存在及び／又はその特性の検出が為される。従って、一つの発光粒子を追尾してその光を検出し続けることは困難であり、一つの発光粒子の観測時間が短いため、発光粒子からの光量又は光子数が少なく、そこから得られる情報のばらつきが大きい傾向にあった。しかしながら、本発明によれば、同一の所定経路を周回することによって、一つの発光粒子からの光を複数回に亘って計測することが可能となるので、発光粒子からの光量又は光子数の検出精度の向上と、そこから得られる情報のばらつきの低減が期待される。また、後述の実施例に於いて示される如く、本発明の態様の一つによれば、発光粒子の信号に対するバックグランドノイズの大きさが相対的に低減され、Ｓ／Ｎ比の改善が図られる。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、本発明に於ける一つの走査軌道（所定経路）に沿った光検出領域の位置の移動の態様を説明する図である。図２（Ｄ）は、試料溶液の位置の移動の態様を説明する図である。 図３は、本発明に於ける時系列光強度データの信号処理の態様を説明する図である。（Ａ）は、（Ｂ）の如く一つの走査軌道（所定経路）上にて光検出領域を周回移動させた場合の時系列光強度データの模式図である。（Ｃ）は、（Ａ）の時系列光強度データに於いて、各周回に於いて得られた時系列光強度データを、光検出領域の周回の起点ｓ０を通過した時点（ｔ０、ｔ３、ｔ６）からの時間毎に参照して、（Ｄ）の如く参照された全周回のデータに於ける代表値を決定する態様を説明している。（Ｅ）は、（Ａ）の時系列光強度データ全体に於いて、まず、発光粒子信号を検出し、しかる後、発光粒子（α，β）毎に信号の代表値を決定する態様を説明している。 図４は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。（Ａ）は、時系列光強度代表値データを生成してから信号の検出を行う場合の処理手順であり、（Ｂ）は、信号の検出を行ってから、発光粒子毎の信号の代表値の算出を行う場合の処理手順である。（Ｃ）は、時系列光強度データ又は時系列光強度代表値データに於いて発光粒子信号の検出を行う処理手順である。 図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図７は、発光粒子として、蛍光標識されたプラスミドを用いて本発明に従って実行される走査分子計数法により得られる発光粒子信号のピーク強度の平均値（棒グラフ）とＣＶ値（エラーバー）の、光検出領域の走査軌道上の周回数に対する変化を示している。 図８は、本発明に従って実行される走査分子計数法に於いて、光検出領域の走査軌道上の周回数に対する時系列光強度データ上のノイズの量の変化を示している。 図９は、本発明に従って実行される走査分子計数法により得られる発光粒子の偏光度の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）の、光検出領域の走査軌道上の周回数に対する変化を示している。 図１０は、種々の発光粒子濃度の試料溶液を用いて走査分子計数法により得られた発光粒子の信号の数を示している。●は、３周回分の時系列光強度データの平均値である時系列光強度代表値データ上で検出された粒子数であり、△は、１周回の時系列光強度データ上で検出された粒子数である。 図１１は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、更に、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動される（試料溶液の位置を移動する方式）。後に詳細に説明される如く、本発明に於いては、上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道（所定経路）に沿って周回移動させるとともに、かかる周回数が所定の回数に達すると、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液中の光検出領域を周回移動させる場所が変更される。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、検出光光路にダイクロイックミラー１４ａを挿入して、検出光を複数の波長帯域に分割して別々に複数個の光検出器１６により検出するようになっていてよい。かかる構成によれば、発光粒子の発光波長特性（発光スペクトル）に関する情報の検出や、複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光をその波長によって別々に検出するといったことも可能となる。更にまた、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光の、励起光の偏光方向と垂直な方向の成分を別々に検出して発光粒子の光の偏光特性が検出できるようになっていてもよい。その場合、励起光光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。（実施例３参照）。
　コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
本発明の光分析技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、光検出領域を所定の経路に沿って複数回に亘って周回移動させ、その間に同一の発光粒子の放出する光を繰り返し計測することにより、計測された光強度のデータを用いた個々の発光粒子の存在及び／又はその特性の検出に於けるばらつきの抑制、検出精度の向上が図られる。以下、本発明の走査分子計数法の原理、光検出領域の周回移動の態様及び計測された光強度データの信号処理の概要について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図１１（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１１（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
　走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。又、信号の強度から種々の発光粒子の光の特性や発光粒子自体の特性が発光粒子毎に検出可能となる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度、特性に関する情報が取得可能である。
２．光検出領域の周回移動
　上記の走査分子計数法に於いては、発光粒子の放出する光量は、典型的には、１分子～数分子程度の蛍光色素の放出する光量のレベルであるので、非常に微弱であり、また、試料溶液内を移動する光検出領域が発光粒子を包含したときのみ、発光粒子の光が検出されるので、一つの発光粒子が光検出領域によって一回のみ包含される場合には、その発光粒子から得られる光量又は光子数は非常に低く、従って、発光粒子の光の検出精度が低く、或いは、発光粒子の光から得られる波長特性に関する情報に於けるばらつきが大きくなり得る。そこで、本発明に於いては、既に述べた如く、試料溶液内に於いて、光検出領域を所定の経路に沿って複数回に亘って周回移動させながら、上記の光の計測を行い、所定の経路内に存在する同一の発光粒子から複数回に亘って光を検出し、一つの発光粒子からの光量を増大して、発光粒子の存在の検出と発光粒子の光又は発光粒子自体の特性の検出の精度の向上が試みられる。
　図２（Ｃ）は、複数回に亘って光検出領域を走査軌道（所定の経路）に沿って周回移動させる態様を模式的に表した図である。同図を参照して、まず、本発明に於いては、図１のミラー偏向器１７を駆動して光路を変更し、所定の経路（走査軌道）に沿って、光検出領域の絶対的な位置が周回移動される。かかる光検出領域の周回移動する間、走査軌道内の発光粒子がその位置を殆ど変えなければ、光検出領域がその発光粒子の存在領域を通過する度にその発光粒子の光が計測され、従って、その発光粒子からより多くの光量を得ることが可能となる。そして、一つの発光粒子からの光量が多くなれば、発光粒子の存在の検出と発光粒子の光又は発光粒子自体の特性の検出の精度の向上が期待される。
　この点に関し、複数の周回移動に亘って同一の発光粒子からの光を検出するためには、その発光粒子が拡散移動により走査軌道から逸脱する前に、所望の回数の光検出領域の周回移動が達成される必要がある。従って、本発明に於いて、好適には、光検出領域の移動周期は、発光粒子が拡散により走査軌道から逸脱するまでの拡散時間よりも短く設定される。具体的には、時間ｔに於ける拡散係数Ｄの発光粒子の並進拡散による平均自乗変位＜ｘ２＞は、
　　＜ｘ２＞＝６Ｄｔ　　　…（１）
により与えられるので、この発光粒子が半径ｒの光検出領域を逸脱するまでの時間は、概ね、
　　ｔ～４ｒ２／６Ｄ　　　…（２）
となる。従って、光検出領域の移動周期τは、
　　τ＜ｔ～４ｒ２／６Ｄ　　　…（３）
が十分に成立するよう設定されるべきである。即ち、例えば、走査軌道が半径Ｒの円であるとすると、移動速度Ｖは、
　　Ｖ＝２πＲ／τ＞２πＲ／（４ｒ２／６Ｄ）　　　…（４）
となるよう決定される。光検出領域の半径は、通常、０．２～３０μｍであるので、拡散係数Ｄが２×１０－１０～１０×１０－１１［ｍ２／ｓ］の発光粒子の場合、移動周期τは、６ｓより短ければよい。また、光検出領域の直径が１．６μｍであり、発光粒子の拡散係数が１．７×１０－１０［ｍ２／ｓ］の場合には、移動周期τは、１０ｍｓ未満である必要がある。かくして、実際には、発光粒子の拡散係数Ｄと光検出領域の半径ｒ又は走査軌道の半径Ｒとから決定される光検出領域の移動周期の上限を超えないように、光検出領域の移動速度Ｖと走査軌道の経路長（又は走査軌道の半径Ｒ）が選択される。
　なお、上記の如く、一つの走査軌道に於いて発光粒子が走査軌道から逸脱する前に光検出領域を周回させる態様に於いては、検出される発光粒子は、走査軌道内の発光粒子に限られてしまう。従って、走査軌道の経路長が短いほど、検出される発光粒子の数が少なくなり、発光粒子の数が少ないほど、発光粒子信号から得られる種々の特性に関する検出値に於いてばらつきが大きくなり、精度も低下する。そこで、検出される発光粒子の数を多くするために、走査軌道に沿った光検出領域の周回が所定回数に達する毎に、例えば、図２（Ｄ）に模式的に示されている如く、ステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液の位置を移動して、移動後の位置にて光検出領域の周回移動を繰り返されてよい。その際の移動距離は、光検出領域の直径より長く移動させればよいので、典型的には、１μｍ以上である。また、試料溶液の位置の経路も、循環経路であってもよく、その場合、その周期は、発光粒子が拡散により走査軌道から逸脱するまでの拡散時間よりも長く設定されてよい（これは、既に光を計測した発光粒子とは別の発光粒子の光を検出できるようにするためである。）。
３．光強度データの信号処理
　走査分子計数法に於いて、光検出領域を移動しながらの光計測が為されると、時系列の光強度データが生成される。そして、後で詳細に説明される態様にて、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の光を表す信号が個別に検出される。この点に関し、上記の如く、光検出領域の周回移動の周期を発光粒子が拡散により走査軌道から逸脱するまでの拡散時間よりも短く設定した場合には、時系列光強度データは、図３（Ａ）に示されている如く、光検出領域が走査軌道を周期的に通過した際に検出された光強度又は光子数を表す。即ち、図３（Ａ）の例の場合、区間Ｉ、II、IIIは、それぞれ、一周目、二周目、三周目の光検出領域の走査軌道に沿った周回移動の際の光強度又は光子数である。そして、光検出領域の周回移動に於ける速度が一定であるとき、或いは、走査軌道上の同じ部位に於いて常に同一であるときには、時系列光強度データの時間は、周期的に走査軌道上の位置に対応する。図示の例の場合、時系列光強度データに於ける時間ｔ０、ｔ３、ｔ６、ｔ９は、図３（Ｂ）に於ける走査軌道の位置ｓ０に対応し、時系列光強度データに於ける時間ｔ１、ｔ４、ｔ５は、走査軌道の位置ｓ１に対応し、時系列光強度データに於ける時間ｔ２、ｔ５、ｔ８は、走査軌道の位置ｓ２に対応する。従って、走査軌道上の発光粒子の光は、時系列光強度データに於いて、概ね、周期的に走査軌道の同一の位置に対応する時間に出現すると仮定することができる。このことを考慮して、光検出領域を走査軌道上にて周回移動させて得られた時系列光強度データからの発光粒子の信号の検出は、以下の二通りの態様のいずれかに従って実行されてよい。
　第一の態様としては、図３（Ｃ）に模式的に描かれている如く、図３（Ａ）の如き時系列光強度データを、光検出領域の移動周期毎に区分し、各区分の起点からの時間毎に、各区分の対応する時間に於ける光強度又は光子数を参照して、それらの代表値、例えば、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値を算出又は決定し、図３（Ｄ）に例示されている如く、光強度又は光子数の代表値を時系列に並べた時系列光強度代表値データが生成される。時系列光強度代表値データは、換言すれば、光検出領域が走査軌道を周回する際の走査軌道上の位置毎の光強度又は光子数の代表値からなる時系列データである。そして、時系列光強度代表値データが生成されると、後述の態様にて、時系列光強度代表値データにて、釣鐘型関数のフィッティング（ＦＣ）等の処理を通じて、発光粒子の信号が検出され、時系列光強度代表値データから得られた発光粒子の信号を用いて、発光粒子の光の特性又は発光粒子自体の特性の算定又は決定が為される。なお、この態様の場合、ノイズレベルが発光粒子の信号に対して相対的な低減するという効果が得られる。一般にノイズは、走査軌道上の位置によらず、ランダムに発生するのに対し、発光粒子の信号は、常に概ね同じ走査軌道上の位置に対応する時間に発生するので、光強度の代表値を決定する過程に於いて、ノイズの強度は、発光粒子の信号の強度に対して相対的に低減することとなる。
　第二の態様としては、図３（Ｅ）に例示されている如く、光検出領域を走査軌道上にて周回移動させて得られた時系列光強度データに於いて、まず、発光粒子の信号の検出が実行される。そうすると、既に述べた如く、走査軌道上の各発光粒子の信号（図中、α、β）は、概ね周期的に、同一の走査軌道上の位置に対応する時間に出現するので、発光粒子毎の信号を参照して、各発光粒子の信号の代表値、例えば、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値の算出が為され、かかる代表値により、発光粒子の光の特性又は発光粒子自体の特性の算定又は決定が為される。
走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。なお、（Ａ）は、時系列光強度代表値データの生成後に発光粒子の信号の検出を行う場合の処理であり、（Ｂ）は、発光粒子の信号の検出の後に信号の代表値の決定を行う場合の処理を示している。また、（Ｃ）は、発光粒子の信号の検出処理の例を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３（Ａ）、（Ｂ）－ステップ１００）
　本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７及びステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）及び試料溶液の移動を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、まず、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて走査軌道に沿った光検出領域の位置の周回移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。そして、所定の回数の光検出領域の位置の周回移動が終了すると、ステージ位置変更装置１７ａが顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９の位置を移動して、再び、走査軌道に沿った光検出領域の位置の周回移動を実行し、同時に時系列の光強度データの生成及び保存が為される。かくして、これらの処理が、任意の回数繰り返され、一回の測定が終了する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の走査軌道に沿った周回移動に於ける移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度は、上記の式（３）の光検出領域の移動周期τの条件を満たすともに、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図５（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様の釣鐘型となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（５）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（６）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（７）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。また、既に述べた如く、特に、本発明に於いては、発光粒子の信号の検出の前に、時系列光強度データに於いて光強度の代表値を決定する第一の態様か、発光粒子の信号の検出の後に検出された信号の代表値を決定する第二の態様のいずれかにて信号処理が為される。以下、（ｉ）発光粒子の信号の検出の前に時系列光強度代表値データを生成する場合（図４（Ａ））、及び、（ii）発光粒子の信号の検出の後に検出信号の代表値の決定を行う場合（図４（Ｂ））のそれぞれについて説明する。
（ｉ）発光粒子の信号の検出の前に時系列光強度代表値データを生成する場合
（ａ）時系列光強度代表値データの生成処理（図４（Ａ）ステップ２０）
　時系列光強度代表値データの生成処理に於いては、図３（Ｃ）に関連した説明に於いて述べた如く、時系列光強度データを、光検出領域の移動周期τ毎に区分し、各区分の起点の時間ｔｓｉ（ｉは、区分の番号）を基準として、各区分のデータより、各区分の起点の時間ｔｓｉ（ｉは、区分の番号）からの時間［ｔｉ－ｉ×ｔｓｉ］毎に光強度値（光子数）が読み出され、それらの読み出された全区分の時間［ｔｉ－ｉ×ｔｓｉ］に於ける光強度の代表値、即ち、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値が算出又は決定される。かくして、区分の終点の時間ｔｅｉまで光強度の代表値が決定されると、区分の起点の時間ｔｓから終点の時間ｔｅまでの光強度の代表値を時系列に並べて構成された時系列光強度代表値データが生成される。
（ｂ）発光粒子の信号の個別検出（図４（Ａ）ステップ３０、図４（Ｃ）参照）
　上記の処理にて時系列光強度代表値データが生成されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（８）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（８）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４（Ｃ）－ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０～１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）発光粒子の信号の検出の後に検出信号の代表値の決定を行う場合
　図４（Ｂ）に示されている如く、発光粒子の信号の検出処理（ステップ２０）の後に検出された発光粒子信号の代表値の算出又は決定（ステップ３０）を実行する場合、まず、ステップ１０にて得られた時系列光強度データに於いて、そのまま、例えば、式（８）のフィッティング又は図４（Ｃ）に示された処理に従って、上記と同様に、発光粒子の信号の検出が実行される。その際、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。しかる後、図３（Ｅ）に模式的に描かれている如く、時系列光強度データに於いて各周期毎に区分し、発光粒子毎に各区分のデータから信号の強度値（例えば、ピーク強度）を拾い出して、それらの代表値、即ち、平均値、中央値、最小値、最大値又は最頻値が算出又は決定される。
（iii）発光粒子濃度の決定
　検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ４０）。
　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（９）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（１０）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（９））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
（iv）種々の特性の決定
　発光粒子信号の検出が為されると、発光粒子濃度の他に、信号の強度値を用いて種々の発光粒子の光の特性、発光粒子自体の特性に関する情報（信号の特徴量）を得ることが可能となる。例えば、検出光の計測に於いて、検出光を偏光方向毎に別々に計測して、偏光方向毎に光強度データを生成している場合、それらの光強度データからそれぞれ得られた信号の強度値から偏光度、偏光異方性等の偏光特性を表す任意指標値が算出され、かかる指標値から更に発光粒子の回転拡散特性の指標値を算出することが可能である。また、検出光の計測に於いて、検出光を複数の波長帯域の成分を別々に計測して、波長帯域毎に光強度データを生成している場合、それらの光強度データからそれぞれ得られた信号の強度値から発光粒子の発光波長スペクトルに関する情報（例えば、複数の波長に於ける強度比）を得ることが可能である。ここで理解されるべきことは、本発明の対象となっている走査分子計数法では、上記の如き発光粒子の光の特性、発光粒子自体の特性に関する情報が発光粒子毎に決定されるという点である。また、本発明に於いては、一つの発光粒子当たりに複数回の計測による光強度値が得られ、それらの代表値が決定されるので、（一つの発光粒子当たり一回限りの計測を実行する場合に比して）発光粒子の光の特性、発光粒子自体の特性に関する情報のばらつきが低減され、検出精度の改善が期待される。
　かくして、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、光検出領域が所定の経路を複数回に亘って通過して、その間に同一の発光粒子の放出する光を繰り返し計測することにより、計測された光強度のデータを用いた個々の発光粒子の存在及び／又はその特性の検出に於けるばらつきの抑制、検出精度の向上が図られる。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　上記の走査分子計数法に従って、光検出領域の所定経路に沿った周回移動の間の光測定により得られた時系列光強度データから発光粒子の信号を検出し、発光粒子信号のピーク強度のばらつきと光検出領域の周回数との関係について評価した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む）に、１０ｎＭの蛍光色素SYTOX　Orange（インビトロジェン社、Cat.No.S-11368）と、１ｐＭのプラスミドpbr322（タカラバイオ株式会社、Cat.No.3035）とを溶解した溶液を調製した。SYTOX　Orangeは、ＤＮＡインタカレーター色素であり、ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が５００倍程度増大する。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０－７１０ｎｍの波長帯域の光を測定した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の走査軌道は、半径約２４μｍの円とし、移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、周回移動の周期は、１０ｍ秒（＝６０００ｒｐｍ）とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を行った。
　光計測後のデータ処理に於いては、図３（Ｃ）に関連して説明された発光粒子の信号の検出の前に時系列光強度代表値データを生成する態様に従って、時系列光強度データを移動周期である１０ｍ秒毎に区分し、各区分の起点からの時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ毎）にフォトンカウント値の平均値を算出し、時系列のフォトンカウント値の代表値データを生成した。そして、かかる代表値データに於いて、発光粒子の信号の個別検出を行った。発光粒子の信号の検出は、「（ｂ）発光粒子の信号の個別検出」及び図４（Ｃ）のステップ１１０～１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウント代表値データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出し、抽出された発光粒子信号のピーク強度（ピーク強度は、信号の特徴量の一つである。）の平均値とＣＶ値を算出した。
　図７は、時系列フォトンカウント代表値データ（時系列の平均値データ）を生成する際のデータの区分数、即ち、一つの走査軌道に於ける光検出領域の周回数を変更した場合に於ける（時系列フォトンカウント代表値データ上で）検出された発光粒子信号のピーク強度の平均値とＣＶ値との変化を表している。図から理解される如く、ピーク強度の平均値自体は、周回数１～９に於いて然程に大きな変化は見られないが、値のばらつきの指標値であるＣＶ値は、周回数が増えると、低減した。特に、周回数が１回のときのＣＶ値が１１０％であったのに対し、周回数が１７回のときのＣＶ値は、５５％まで低減され、値のばらつきが抑制された。［周回数が増えると、ピーク強度の平均値が低減するのは、発光粒子の位置が徐々に移動して、フォトンカウント値が前又は後の時間に分散するためであると考えられる。］この結果は、本発明の手法によれば、発光粒子信号の特徴量のばらつきがより低減され、検出精度が改善されることを示している。
　試料溶液として、実施例１のリン酸緩衝液（発光粒子を含まない）を用いて、実施例１と同様の態様にて、光検出及び時系列フォトンカウント代表値データの調製を行った後、バックグラウンドノイズの大きさの指標値として、代表値データ全域の光子数の平均値にその標準偏差の３倍の値を加算した参照値（ノイズレベル）を算出した。図８は、時系列フォトンカウント代表値データを生成する際のデータの区分数、即ち、一つの走査軌道に於ける光検出領域の周回数を変更した場合に於ける上記のノイズレベルの変化を表している。同図を参照して理解される如く、ノイズレベルは、周回数が多くなるほど、低減した。既に触れたように、バックグラウンドノイズは、走査軌道上の光検出領域の位置によらず、ランダムに発生する。即ち、バックグラウンドノイズは、走査軌道上の同一の位置に対応する時間に於いて繰り返し発生する可能性は極めて低いので、時系列フォトンカウント代表値データの生成時に参照される区分数が多いほど、バックグラウンドノイズの強度は、走査軌道上の略同一の位置に対応する時間に於いて発生する発光粒子の信号の強度に比して、相対的に低減されることとなると考えられる。このことは、図８の結果により確かめられた。
　光分析装置に於いて、励起光光路にポーラライザを挿入して励起光を一方向に偏光し、検出光光路に偏光ビームスプリッタを挿入して、検出光として励起光の偏光方向に垂直な方向の成分ＩＶと平行な方向の成分ＩＨとをそれぞれ検出し、その他は、実施例１と同様の条件にて光計測・データ処理を行い、発光粒子の信号の検出を行った。そして、得られた発光粒子の信号を用いて、発光粒子毎に偏光度（ＩＶ－ＩＨ）／（ＩＶ＋ＩＨ）を算出し、その平均値とＣＶ値とを算出した。
　図９は、時系列フォトンカウント代表値データを生成する際のデータの区分数、即ち、一つの走査軌道に於ける光検出領域の周回数を変更した場合に於ける発光粒子信号の偏光度の平均値とＣＶ値との変化を表している。図から理解される如く、偏光度の平均値自体は、周回数１～１７に於いて然程に大きな変化は見られないが、値のばらつきの指標値であるＣＶ値は、周回数が増えると、低減した。特に、周回数が１回のときのＣＶ値が３５％であったのに対し、周回数が１７回のときのＣＶ値は、１６％まで低減され、値のばらつきが抑制された。この結果は、本発明の手法によれば、発光粒子信号の特徴量のばらつきがより低減され、検出精度が改善されることを示している。
　種々の濃度の蛍光色素溶液を試料溶液として本発明に従って走査分子計数法により発光粒子の信号の検出を実行し、本発明による走査分子計数法で決定可能な発光粒子濃度の下限を確認した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む）に、１ａＭ～１０ｐＭの蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎ(Sigma-Aldrich)を含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の蛍光色素を含む色素溶液と蛍光色素を含まない緩衝液とについて、それぞれ、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０－７００ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の走査軌道は、半径約７２μｍの円とし、移動速度は、９０ｍｍ／秒とし、周回移動の周期は、５ｍ秒（＝１２０００ｒｐｍ）とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、６００秒間の測定を行った。
　光計測後のデータ処理に於いては、図３（Ｃ）に関連して説明された発光粒子の信号の検出の前に時系列光強度代表値データを生成する態様に従って、時系列光強度データを移動周期である５ｍ秒毎に区分し、各区分の起点からの時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ毎）に３周回分のデータのフォトンカウント値の平均値を算出し、時系列のフォトンカウント値の代表値データを生成した。そして、かかる代表値データに於いて、実施例１の場合と同様に発光粒子の信号の個別検出を行い、検出された発光粒子信号の数を計数した。
　図１０は、各濃度（横軸）の色素溶液を用いた場合の発光粒子信号の検出数（縦軸）を示している。図中、３回の６００秒間の測定による３周回分のデータの平均値データに於いて検出された粒子数（重畳処理あり●）と、１周回分のデータに於いて検出された粒子数（重畳処理なし△）とが、それぞれプロットされている。同図を参照して、重畳処理なしの場合は、１ｆＭ以下では、検出粒子数と色素濃度との直線性が失われたのに対し、重畳処理ありの場合は、１００ａＭまで、検出粒子数と色素濃度との直線性が得られた。このことにより、本発明によれば、発光粒子信号とノイズ信号との識別が容易となり、測定感度が改善されることが示された。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、光検出領域を同一の所定経路に沿って周回させて一つの発光粒子からの光を複数回に亘って計測した場合に、発光粒子信号の特徴量のばらつきの低減がされ、これにより、検出精度の向上が為される。また、時系列光強度代表値データを生成する場合には、バックグラウンドノイズが相対的に低減し、Ｓ／Ｎ比の改善が期待される。

Claims (30)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記光検出領域移動部が前記所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って前記光検出領域の位置を移動し、前記信号処理部が前記少なくとも２周回に亘る前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の間に得られた前記時系列の光強度データを用いて前記所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、所定周回の前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の終了毎に、前記試料溶液の位置が移動され、移動後の前記試料溶液の位置にて、前記光検出領域移動部による前記光学系の光路を変更することによる前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置の所定の経路に沿った少なくとも２周回に亘る移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記時系列の光強度データの生成とが繰り返され、前記試料溶液の移動後の位置毎に、前記時系列の光強度データに於いて前記所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出を実行することを特徴とする装置。
  3. 　請求項１又は２の装置であって、前記発光粒子が拡散により前記所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて、前記光検出領域の位置が前記所定経路に沿って移動されることを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて、前記所定経路上の位置毎に決定される光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データを生成し、該時系列光強度代表値データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し信号の特徴量を検出することを特徴とする装置。
  5. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し該信号の特徴量を検出し、発光粒子毎に前記信号の特徴量の代表値を算出することを特徴とする装置。
  6. 　請求項４又は５の装置であって、前記信号の特徴量が、光強度、光子数、偏光度、回転拡散定数及び発光スペクトルから成る群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  9. 　請求項１乃至８のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列の光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することを特徴とする装置。
  10. 　請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  11. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って移動する光検出領域周回移動過程と、
    　前記少なくとも２周回に亘る前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の間に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成過程と、
    　前記時系列の光強度データを用いて前記所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出過程と
    を含むことを特徴とする方法。
  12. 　請求項１１の方法であって、更に、所定周回の前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の終了毎に、前記試料溶液の位置を移動する過程を含み、移動後の前記試料溶液の位置にて、前記光検出領域周回移動過程と、前記時系列光強度データ生成過程とが繰り返され、前記試料溶液の移動後の位置毎に前記発光粒子信号検出過程が実行されることを特徴とする方法。
  13. 　請求項１１又は１２の方法であって、前記発光粒子が拡散により前記所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて、前記光検出領域の位置が前記所定経路に沿って移動されることを特徴とする方法。
  14. 　請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、前記時系列の光強度データに於いて前記所定経路上の位置毎に決定される光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データを生成する過程を含み、前記発光粒子信号検出過程に於いて、該時系列光強度代表値データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し信号の特徴量を検出することを特徴とする方法。
  15. 　請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、前記発光粒子信号検出過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し該信号の特徴量を検出し、発光粒子毎に前記信号の特徴量の代表値を算出することを特徴とする方法。
  16. 　請求項１４又は１５の方法であって、前記信号の特徴量が、光強度、光子数、偏光度、回転拡散定数及び発光スペクトルから成る群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする方法。
  17. 　請求項１１乃至１６のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  18. 　請求項１１乃至１７のいずれかの方法であって、前記発光粒子信号検出過程に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする方法。
  19. 　請求項１１乃至１８のいずれかの方法であって、前記発光粒子信号検出過程に於いて、前記時系列の光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とする方法。
  20. 　請求項１１乃至１９のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  21. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を所定経路に沿って少なくとも２周回に亘って移動する光検出領域周回移動手順と、
    　前記少なくとも２周回に亘る前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の間に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成手順と、
    　前記時系列光強度データを用いて前記所定経路内に存在する発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項２１のコンピュータプログラムであって、更に、所定周回の前記所定経路に沿った前記光検出領域の位置の移動の終了毎に、前記試料溶液の位置を移動する手順を含み、移動後の前記試料溶液の位置にて、前記光検出領域周回移動手順と、前記時系列光強度データ生成手順とが繰り返され、前記試料溶液の移動後の位置毎に前記発光粒子信号検出手順が実行されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 　請求項２１又は２２のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子が拡散により前記所定経路から逸脱するまでの拡散時間よりも短い周期にて、前記光検出領域の位置が前記所定経路に沿って移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  24. 　請求項２１乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於いて前記所定経路上の位置毎に決定される光強度値の代表値から成る時系列光強度代表値データを生成する手順を含み、前記発光粒子信号検出手順に於いて、該時系列光強度代表値データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し信号の特徴量を検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  25. 　請求項２１乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記発光粒子信号検出手順に於いて、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出し該信号の特徴量を検出し、発光粒子毎に前記信号の特徴量の代表値を算出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 　請求項２４又は２５の方法であって、前記信号の特徴量が、光強度、光子数、偏光度、回転拡散定数及び発光スペクトルから成る群から選択された少なくとも一つであることを特徴とするコンピュータプログラム。
  27. 　請求項２１乃至２６のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  28. 　請求項２１乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記発光粒子信号検出手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  29. 　請求項２１乃至２８のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記発光粒子信号検出手順に於いて、前記時系列の光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  30. 　請求項２１乃至２９のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
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JP2013531171A JP6013338B2 (ja) 2011-08-26 2012-07-26 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
US14/188,375 US10371631B2 (en) 2011-08-26 2014-02-24 Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection

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WO (1) WO2013031439A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2615445A1 (en) * 2010-10-13 2013-07-17 Olympus Corporation Method for measuring diffusion characteristic value of particle by detecting single light-emitting particle
US8803106B2 (en) 2010-10-19 2014-08-12 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis for observing polarization characteristics of a single light-emitting particle
WO2015015951A1 (ja) 2013-07-31 2015-02-05 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
JP2015094625A (ja) * 2013-11-11 2015-05-18 オリンパス株式会社 光検出を用いた単一発光粒子検出方法
US9329117B2 (en) 2011-11-10 2016-05-03 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
WO2016071985A1 (ja) * 2014-11-06 2016-05-12 オリンパス株式会社 発光粒子解析方法
JP2019144021A (ja) * 2018-02-16 2019-08-29 横河電機株式会社 分光分析装置

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2635896A1 (en) 2010-11-03 2013-09-11 Reametrix Inc. Method and device for fluorescent measurement of samples
US9671345B2 (en) * 2011-02-24 2017-06-06 Reametrix, Inc. Mapping volumes of interest in selected planes in liquid samples
WO2020158489A1 (ja) * 2019-01-28 2020-08-06 ソニー株式会社 可視光通信装置、可視光通信方法及び可視光通信プログラム
KR102239319B1 (ko) * 2019-02-07 2021-04-09 국민대학교산학협력단 시분해 단일 광자 계수 장치
CN113011549A (zh) * 2021-02-20 2021-06-22 重庆博奥新景医学科技有限公司 一种应用于化学发光分析仪发光值的自适应测量计算方法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009281831A (ja) 2008-05-21 2009-12-03 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光解析装置及び解析方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2010202995A (ja) 2009-03-02 2010-09-16 Toppan Forms Co Ltd リストバンド
JP2010234769A (ja) 2009-03-31 2010-10-21 Dainippon Printing Co Ltd 加飾シート、加飾樹脂成形品の製造方法及び加飾樹脂成形品
JP2010262267A (ja) 2009-04-08 2010-11-18 Yamaha Corp 演奏装置およびプログラム
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
WO2012050011A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
JPS63225145A (ja) * 1987-03-16 1988-09-20 Sasakura Eng Co Ltd 流体中の不純微粒子計測方法及び計測装置
US4885473A (en) * 1988-04-29 1989-12-05 Shofner Engineering Associates, Inc. Method and apparatus for detecting particles in a fluid using a scanning beam
US4979824A (en) 1989-05-26 1990-12-25 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High sensitivity fluorescent single particle and single molecule detection apparatus and method
CA2035703A1 (en) * 1991-01-22 1992-07-23 Pedro Lilienfeld System and method for determining and printing airborne particle concentration
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
DE19723999B4 (de) * 1997-06-06 2008-04-10 Schwartz, Margit Vorrichtung zur Messung von Partikelabmessungen in Fluiden
US6710871B1 (en) 1997-06-09 2004-03-23 Guava Technologies, Inc. Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples
GB2326229A (en) 1997-06-13 1998-12-16 Robert Jeffrey Geddes Carr Detecting and analysing submicron particles
SE9800360D0 (sv) 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
KR100618502B1 (ko) 1998-03-16 2006-09-01 지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 코프. 공초점 마이크로스코피 영상 시스템에서 사용하기 위한 전자기 방출의 집속 시스템 및 방법
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
DE60001731T2 (de) 1999-04-29 2004-02-05 Evotec Oai Ag Verfahren zur erfassung von fluoreszierenden molekülen oder anderen teilchen mittels erzeugenden funktionen
US6376843B1 (en) 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
AU780158B2 (en) 1999-05-04 2005-03-03 Mettler-Toledo Autochem, Inc. Method and apparatus for particle assessment using multiple scanning beam reflectance
WO2000071991A1 (en) 1999-05-25 2000-11-30 Biometric Imaging, Inc. Apparatus and method for optical detection in a limited depth of field
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
DE10035190C5 (de) 2000-07-20 2009-07-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung
DE10038528A1 (de) 2000-08-08 2002-02-21 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
WO2002031467A1 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Amnis Corporation Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects
HU226937B1 (en) 2000-11-17 2010-03-29 Mta Szegedi Biolog Koezpont Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope
WO2002048693A1 (fr) 2000-12-14 2002-06-20 Olympus Optical Co., Ltd. Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique
US6782297B2 (en) 2001-05-24 2004-08-24 Eric Paul Tabor Methods and apparatus for data smoothing
US7668697B2 (en) 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
WO2004042404A1 (en) 2002-11-07 2004-05-21 Erasmus Universiteit Rotterdam Fret probes and methods for detecting interacting molecules
US7038848B2 (en) 2002-12-27 2006-05-02 Olympus Corporation Confocal microscope
JP4315794B2 (ja) 2002-12-27 2009-08-19 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡
US20060078998A1 (en) 2004-09-28 2006-04-13 Singulex, Inc. System and methods for sample analysis
US7528384B2 (en) 2005-01-31 2009-05-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media
EP1906172A4 (en) 2005-07-15 2014-01-08 Olympus Corp LIGHT METER
WO2007118209A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Kim Laboratories Apparatus and method for rapid detection of analytes
US8445655B2 (en) 2006-06-16 2013-05-21 Cornell Research Foundation, Inc. Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins
WO2008007580A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
US20080052009A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
JP4891057B2 (ja) 2006-12-27 2012-03-07 オリンパス株式会社 共焦点レーザー走査型顕微鏡
US7804594B2 (en) * 2006-12-29 2010-09-28 Abbott Laboratories, Inc. Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream
JPWO2008099778A1 (ja) 2007-02-14 2010-05-27 株式会社ニコン スリット走査共焦点顕微鏡
JP2009145242A (ja) 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP2009288161A (ja) 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
CA2740587C (en) * 2008-10-23 2014-08-19 Egil Ronaes Method and apparatus for measuring particle size distribution in drilling fluid
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
JP2010276380A (ja) * 2009-05-26 2010-12-09 Olympus Corp 蛍光相関分光分析装置及び方法並びにそのためのコンピュータプログラム
JP5325679B2 (ja) * 2009-07-03 2013-10-23 富士フイルム株式会社 低コヒーレンス光源を用いた動的光散乱測定装置及び光散乱強度測定方法
WO2011108371A1 (ja) 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
JP5480679B2 (ja) * 2010-03-12 2014-04-23 大阪瓦斯株式会社 エンジン冷却装置
WO2012014778A1 (ja) 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
EP2602613B1 (en) 2010-09-10 2017-02-22 Olympus Corporation Optical analysis method using optical intensity of single light-emitting particle
JP5907882B2 (ja) 2010-10-19 2016-04-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子の偏光特性を観測する光分析装置、光分析方法及びそのための光分析用コンピュータプログラム
CN103229042B (zh) 2010-11-25 2016-06-29 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子的光的波长特性的光分析装置和光分析方法
CN103477210B (zh) 2011-04-13 2015-09-23 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
EP2700935A4 (en) 2011-04-18 2014-10-22 Olympus Corp QUANTITATIVE PROCEDURE FOR TARGET PARTICLES, PHOTOMETRIC ANALYSIS DEVICE AND COMPUTER PROGRAM FOR PHOTOMETRIC ANALYSIS
EP2746748B1 (en) 2011-08-15 2017-12-06 Olympus Corporation Photometric analysis device using single light emitting particle detection, photometric analysis method and computer program for photometric analysis,
JP6010033B2 (ja) 2011-08-26 2016-10-19 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
CN103765194B (zh) 2011-08-30 2016-02-17 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法
CN104246479B (zh) * 2012-04-18 2016-10-19 奥林巴斯株式会社 利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
JP2009281831A (ja) 2008-05-21 2009-12-03 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光解析装置及び解析方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2010202995A (ja) 2009-03-02 2010-09-16 Toppan Forms Co Ltd リストバンド
JP2010234769A (ja) 2009-03-31 2010-10-21 Dainippon Printing Co Ltd 加飾シート、加飾樹脂成形品の製造方法及び加飾樹脂成形品
JP2010262267A (ja) 2009-04-08 2010-11-18 Yamaha Corp 演奏装置およびプログラム
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
WO2012050011A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.J.MEYER-ALMS: "Fluorescence Correlation Spectroscopy", 2000, SPRINGER, pages: 204 - 224
MASATAKA KINJO, PROTEIN, NUCLEIC ACID, ENZYME, vol. 44, no. 9, 1999, pages 1431 - 1438
NORIKO KATO ET AL., GENE MEDICINE, vol. 6, no. 2, pages 271 - 277
P. KASK; K. PALO; D. ULLMANN; K. GALL, PNAS, vol. 96, 1999, pages 13756 - 13761
See also references of EP2749867A4

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2615445A1 (en) * 2010-10-13 2013-07-17 Olympus Corporation Method for measuring diffusion characteristic value of particle by detecting single light-emitting particle
EP2615445A4 (en) * 2010-10-13 2013-07-24 Olympus Corp METHOD FOR MEASURING DIFFUSION SELECTION VALUES OF PARTICLES BY DETECTING INDIVIDUAL LIGHT-EMITTING PARTICLES
US8681332B2 (en) 2010-10-13 2014-03-25 Olympus Corporation Method of measuring a diffusion characteristic value of a particle
US8803106B2 (en) 2010-10-19 2014-08-12 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis for observing polarization characteristics of a single light-emitting particle
US9329117B2 (en) 2011-11-10 2016-05-03 Olympus Corporation Optical analysis device, optical analysis method and computer program for optical analysis using single light-emitting particle detection
WO2015015951A1 (ja) 2013-07-31 2015-02-05 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
CN105431759A (zh) * 2013-07-31 2016-03-23 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测技术的光学显微镜装置、显微镜观察法以及用于显微镜观察的计算机程序
US10310245B2 (en) 2013-07-31 2019-06-04 Olympus Corporation Optical microscope device, microscopic observation method and computer program for microscopic observation using single light-emitting particle detection technique
JP2015094625A (ja) * 2013-11-11 2015-05-18 オリンパス株式会社 光検出を用いた単一発光粒子検出方法
WO2016071985A1 (ja) * 2014-11-06 2016-05-12 オリンパス株式会社 発光粒子解析方法
JP2019144021A (ja) * 2018-02-16 2019-08-29 横河電機株式会社 分光分析装置
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