JP5945506B2 - 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析装置及び方法に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする装置及び方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報

金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要 １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall PNAS 96, 13756-13761 (1999)）

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。

ところで、一般に、発光粒子或いは観測対象となる粒子に付加される発光標識は、それぞれ、固有の発光波長特性（発光スペクトル）を有しているので、発光粒子又は発光標識からの光の検出を、各発光粒子又は発光標識の発光波長特性の特徴が捉えられるように実行すれば、発光粒子又は発光標識の種類の識別が可能となる。従って、上記の走査分子計数法に於いて、発光粒子の発光波長特性の特徴を検知できるように発光粒子からの光の検出を実行すれば、個別に検出される単一発光粒子の各々の種類の識別が可能となり有利であろう。

かくして、本発明の主な課題は、上記の特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１にて提案された新規な光分析技術を更に発展させるべく、特に、検出される単一発光粒子の発光波長特性の特徴を検知して単一発光粒子の種類の識別の可能な新規な光分析装置及び方法を提供することである。

本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光の複数の波長帯域の成分の強度に於いて発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて発光粒子の種類を識別する信号処理部とを含むことを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。

上記の本発明の装置に於いては、走査分子計数法と同様に、基本的な構成に於いて、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光検出領域からの光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。かかる構成に於いて、本発明では、特に、光検出領域からの光のうちの複数の波長帯域の成分の強度が測定される。既に述べた如く、発光粒子或いは観測対象となる粒子に付加される発光標識は、それぞれ、固有の発光波長特性を有しており、かかる発光波長特性に於ける特徴は、発せられる光のうちの複数の波長帯域の成分の強度を参照すれば、把握することが可能であるので、上記の如く測定された複数の波長帯域の成分の強度に基づいて発光粒子の各々の種類を識別し特定することが可能となる。かくして、上記の構成によれば、光検出領域の移動経路に発光粒子が進入すれば、その発光波長特性の特徴から発光粒子又は発光標識の種類を個別に識別でき、しかも、そのような発光粒子の検出及びその種類の識別が、試料溶液中の発光粒子濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術で良好な測定結果を得るに必要なレベルよりも低い場合でも可能である点で有利である。

上記の構成に於いて、発光粒子の種類は、より具体的には、複数の波長帯域の成分の強度の配分の割合若しくは強度の比を参照することにより識別可能である。そこで、実施の形態の一つに於いては、信号処理部は、発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて発光粒子の種類を識別するよう構成されていてよい。なお、光検出に於ける波長選択や信号処理の容易性の点では、検出されるべき波長帯域は、少ない方が有利であるので、上記の本発明の装置は、典型的には、光検出部が光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度を検出し、信号処理部が二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて発光粒子の種類を識別するよう構成されていてよい。検出されるべき波長帯域は、観測対象となる発光粒子又は発光標識の発光波長特性、検出感度等を考慮して、発光波長特性の特徴ができるだけ顕著に把握できるよう適宜選択されてよい。

また、特に、発光粒子が励起光の照射により発光する粒子である場合、装置には励起光を光検出領域に照射するための光照射部が設けられるところ、その場合、光照射部が１つの波長帯域の励起光を照射し、光検出部がかかる１つの波長帯域の励起光の照射により発せられる光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出するようになっていてよい。通常、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系に於いて光の測定を行うとき、装置は、１つの波長帯域の励起光の照射に対して１つの波長帯域の光を検出するよう設定され、複数の種類の発光粒子の光を、その種類を識別しながら測定する場合には、複数の波長帯域の励起光の照射が実行される。その場合、互いに波長帯域の異なる励起光の集光領域を一致させること、及び、複数の波長帯域の励起光の強度のバランスを調整することは、比較的困難であり、従って、複数の波長帯域の成分の強度から発光粒子の発光波長特性の特徴を表す値を決定する処理が煩わしいものとなる（励起光の集光領域の位置のずれを補正するための処理や励起光の強度のバランスを補正するための処理などが必要となろう。）。しかしながら、励起光が１つの波長帯域の光であれば、発光粒子の発光波長特性の特徴を表す値の決定処理は、単純化することが可能となり有利である。また、１つの波長帯域の励起光の照射による場合、発光粒子の励起波長特性に依存して、発光強度が比較的低くなる可能性があるが、本発明の場合、発光粒子の発光波長特性の特徴（より具体的には、発光粒子の光のうちの複数の波長帯域の成分の強度の配分の割合）を参照して発光粒子の種類を識別するので、個々の成分の強度の配分割合の精度が担保されれば、強度の絶対値が低下することは問題とならないことは理解されるべきである。

上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。

更に、上記の光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置では、光検出領域が包含した１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を、１つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の計測が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

また、実施の形態に於いて、本発明による光分析装置は、信号処理部が個別に検出された発光粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい。これにより、発光粒子の種類別に、発光粒子の数密度又は濃度についての情報を取得することが可能となる。

上記の本発明の装置によれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、発光粒子の種類の識別ができる態様にて、個々の発光粒子の光の検出を行う新規な光分析方法が実現される。従って、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する過程と、検出された光の複数の波長帯域の成分の強度に於いて発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて発光粒子の種類を識別する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。

上記の方法に於いても、発光粒子の種類の識別は、発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて為されてよく、特に、光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度が検出され、かかる二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて発光粒子の種類が識別されてよい。また、発光粒子が１つの波長帯域の励起光の照射により発光する粒子である場合には、かかる１つの波長帯域の励起光を光検出領域に照射する過程が実行され、光の検出過程に於いては、励起光の照射により発せられる光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度が検出されてよい。更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また更に、光検出領域の位置を移動するべく光学系の光路を変更する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。

本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

総じて、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡に於いて、その光検出領域により試料溶液中を走査することにより、発光粒子の存在を個別に検出する走査分子計数法に於いて、その発光粒子の発光波長特性の特徴が把握できる態様にて発光粒子の光を検出することにより、個々の発光粒子の種類の識別が可能となる。かかる本発明の構成によれば、試料溶液中に複数種類の発光粒子が混在する場合でも、個々の発光粒子の種類が特定できるので、複数の種類の粒子等が混在する系に於ける各粒子の状態、数密度又は濃度に関する情報が得られると共に、それらの変化から、粒子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出及び分析が可能となる。また、本発明では、発光粒子を個別に検出しその種類の識別が為されるようになっていることから、試料溶液中で相対的に濃度が低い発光粒子であって、その光が従前の方法ではその他の発光粒子からの光に埋没してしまう発光粒子であっても、検出可能であり、その存在が観測可能となる。かかる特徴は、反応率の比較的低い反応の生成物や相対的に数の少ない中間生成物の検出への応用も期待される。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明の光分析技術を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の光分析技術の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、本発明に従って、複数の波長帯域の光成分の強度を検出することにより発光粒子の発光波長特性の違いからその種類が識別できる原理を説明する図である。上図は、種々の互いに異なる発光波長特性を有する発光粒子α、β、γ、δの発光波長特性（発光スペクトル）（実線グラフ）と、別々に検出される複数の波長帯域の範囲（観測窓−横軸の下のｃｈ１〜ｃｈ５と付された四角枠）を示している。下図の棒グラフは、それぞれ、発光粒子α、β、γ、δの信号に於ける各観測窓にて検出された光の強度を模式的に示している。図２（Ｄ）は、二つの波長帯域の光成分を検出する場合に発光粒子の種類が識別できることを説明する図２（Ｃ）と同様の図である。 図３は、本発明に従って実行される光検出・分析の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６（Ａ）は、蛍光色素ＡＴＴＯ５６５を含む溶液と蛍光色素ＡＴＴＯ５９０を含む溶液について、本発明に従って検出された個々の発光粒子の第一の波長帯域の光強度（フォトンカウント）Ｉ_ｃｈ１に対して第二の波長帯域の光強度（フォトンカウント）Ｉ_ｃｈ２をプロットした図である。図中、各点が１つの発光粒子の強度である。図６（Ｂ）は、蛍光色素ＡＴＴＯ５６５及び蛍光色素ＡＴＴＯ５９０の二つの波長帯域の光強度の比Ｉ_ｃｈ１／Ｉ_ｃｈ２の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）を示している。 図７は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４ａ、ｂ…バリアフィルター
１４ｘ…検出光用ダイクロイックミラー
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６ａ、ｂ…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ｘに於いて、複数の波長帯域に分割され（図では、二つの波長帯域に分割されているが、二つ以上であってもよい。）、分割された光の成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター１４ａ、ｂを透過し、そこに於いて特定の波長帯域の光成分のみに選択された後、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６ａ、ｂに到達する（図では、二つの光検出器が装備されているが、光検出器は、検出波長帯域の数だけ装備され、それぞれ、１つの検出波長帯域の成分を受光するようになっていてよい。）。この構成により、図１（Ａ）の装置では、光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分が別々に且つ同時に検出され、発光粒子の発光波長特性の特徴を捉えることが可能となる。光検出器１６ａ、ｂは、逐次到来する光の強度を時系列の電気信号に変換して、コンピュータ１８へ送信し、かくして、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６ａ、ｂとしては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。

また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。

発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。一時に照射される励起光は、好適には、１つの波長帯域の光であるが、実験条件によって、一時に複数の波長帯域の光が励起光として用いられてもよい。

本発明の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術によれば、端的に述べれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を試料溶液内にて移動しながら、試料溶液中にて分散する発光粒子が光検出領域内に包含される際に放出する光を検出して発光粒子の存在を個別に検知する「走査分子計数法」に於いて、発光粒子の光の複数の波長帯域の成分を別々に計測し、発光粒子の発光波長特性の特徴の検出が試みられる。かかる構成によれば、個別に検出される発光粒子の発光波長特性の特徴から発光粒子の種類の識別が可能となるので、複数の種類の発光粒子が混在する系に於いて、個々の種類の発光粒子の存在の検出、各種類の発光粒子の存在比（濃度比）の検出、各種類の発光粒子の数密度又は濃度等の情報の取得が可能となる。以下、走査分子計数法及び本発明による発光波長特性の特徴の検出の原理について説明する。

１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図７（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図７（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。

走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。

２．本発明による発光粒子の発光波長特性の特徴の検出の原理
上記の走査分子計数法に於いて、発光粒子又は発光標識の発光波長特性の特徴を検出するために、本発明では、特に、光検出領域からの光が複数の波長帯域に分けられて検出される。例えば、試料溶液中に図２（Ｃ）上に例示されている如き発光波長特性（発光スペクトル）をそれぞれ有する発光粒子α、β、γ、δが存在している場合に、光検出領域からの光を適当な数の波長帯域に分けて、例えば、５つの観測窓ｃｈ１〜ｃｈ５に分けて、各成分をそれぞれ別々の光検出器により計測すれば、発光波長特性をそれぞれ有する発光粒子α、β、γ、δのそれぞれのｃｈ１〜ｃｈ５の強度の配分は、図２（Ｃ）の下方に模式的に描かれている如く、それぞれの発光波長特性のプロファイルの特徴を反映して互いに異なる配分となる。従って、ｃｈ１〜ｃｈ５の強度の配分を参照すれば、例えば、各観測窓に於ける強度の比Ｉ_ｃｈ１：Ｉ_ｃｈ２：Ｉ_ｃｈ３：Ｉ_ｃｈ４：Ｉ_ｃｈ５を参照すれば、個々の発光粒子がいずれの発光波長特性を有する粒子であるかが分かり、発光粒子の種類の識別が可能となる。例えば、或る発光粒子の信号のｃｈ１〜ｃｈ５の強度の配分が、図２（Ｃ）の下方の「γ」と付されたグラフの配分であったときには、その発光粒子の種類は、γの発光波長特性を有する粒子であると識別できることとなる。

なお、観測窓の数、即ち、別々に検出する波長帯域数が多いほど、各発光粒子の発光波長特性の特徴を詳細に検知することが可能となるが、装置１の検出光を分割する部分の光学系（ダイクロイックミラー１４ｘ、バリアフィルター１４ａ、ｂなど）の構成が複雑になり調整の煩わしさが増大するとともに各観測窓に於ける強度が減少することとなり、個々の測定された強度値の精度が悪化し得る。そこで、好適には、図２（Ｄ）の如く、観測窓の数を二つとし、二つの観測窓の強度の配分に各発光粒子の発光波長特性の特徴が適切に反映されるように各観測窓の検出波長帯域を調節して、それらの二つの観測窓に於ける強度のバランスに基づいて、観測対象となる発光粒子の種類毎の区別が達成されてよい。その場合、発光粒子の種類の識別は、二つの観測窓の強度比Ｉ_ｃｈ１：Ｉ_ｃｈ２、Ｉ_ｃｈ１／Ｉ_ｃｈ２などに基づいて為されてよい。

処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。

（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。

（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図３−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６ａ、ｂは、それぞれ、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６ａ、ｂは、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図４（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ｒ）^２＝６Ｄ・Δτ …（１）
から、
Δτ＝（２ｒ）^２／６Ｄ …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出及び各発光粒子の種類の識別が実行される。

（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図４（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、複数の検出波長帯域の成分の各々の時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。また、本実施形態の場合、一つの発光粒子の光は、複数の検出波長帯域の時系列光強度データに於いて出現するので、各発光粒子の信号は、複数の検出波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の組により構成されることとなる。この点に関し、一つの発光粒子の光は、図２（Ｃ）又は（Ｄ）の下図から理解される如く、複数の検出波長帯域の時系列光強度データのいずれにも出現することもあれば、それらのうちのいずれかのみに出現することもある。従って、複数の検出波長帯域の時系列光強度データのうちの少なくとも１つに発光粒子の信号が出現した場合には、その信号が出現した時間に於いて、その他の検出波長帯域の時系列光強度データに発光粒子の信号が存在するものとして処理されてよい。複数の検出波長帯域の成分の時系列光強度データ上の信号の対応付けは、パルス存在領域の時間値を参照して為されてよい。また、別の態様として、複数の検出波長帯域の成分のうちの一つについて、その時系列光強度データ上にて、発光粒子の信号を検出し、それらの検出された信号の発生時間に、その他の検出波長帯域の成分の時系列光強度データ上に於いても発光粒子の信号が存在するものとして処理されてよい。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）各発光粒子の光強度比算出と種類の識別（図３−ステップ１７０、１８０）
かくして、複数の検出波長帯域の各々の時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号が検出されると、発光粒子毎に、複数の検出波長帯域の光強度を参照して、それらの配分に基づいて、発光粒子の種類が判定される。各成分の光強度としては、ステップ１３０〜１６０に於いて検出された発光粒子の信号のピーク強度、フォトンカウントの積算値、或いは、フィッティングされた釣鐘型関数の時間積分値などが採用されてよい。例えば、図２（Ｃ）の如く、検出波長帯域が３つ以上であるときには、それらの強度比、（Ｉ_ｃｈ１／Ｉｏ）：（Ｉ_ｃｈ２／Ｉｏ）：（Ｉ_ｃｈ３／Ｉｏ）：…を参照して、その比の配分に基づいて発光粒子の種類の識別が為されてよい（Ｉｏは、複数の検出波長帯域の成分の強度の総和である。）。また、図２（Ｄ）の如く、検出波長帯域が２つであるときには、それらの強度比の値Ｉ_ｃｈ１／Ｉ_ｃｈ２が算出され、その算出値によって発光粒子の種類の識別が為されてもよい。そして、予め複数の検出波長帯域の成分の強度の比が既知である発光粒子については、上記にて算出された強度比からその種類の同定が可能となる。

更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい（発光粒子のカウンティング）。その場合、本発明では、発光粒子の種類が識別可能なので、発光粒子の数は、種類毎に決定されてよい。更にまた、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される。

光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。なお、本発明では、発光粒子の種類が識別可能なので、発光粒子の種類毎に数密度又は濃度が決定可能である。

かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、発光粒子の光を複数の検出波長帯域にて別々に検出し、その発光粒子の発光波長特性の特徴が反映された強度の配分又は強度の比を参照することによって、検出された各発光粒子の種類の識別が可能となる。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

本発明により走査分子計数法に於いて発光粒子の種類の識別が可能であることを検証した。

試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）中に、蛍光色素ＡＴＴＯ５６５（蛍光波長ピーク５９２ｎｍ）、ＡＴＴＯ５９０（蛍光波長ピーク６２４ｎｍ）を、濃度が１００ｐＭとなるように、溶解した溶液をそれぞれ調製した（以下、ＡＴＴＯ５６５溶液、ＡＴＴＯ５９０溶液と称する。）。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５００μＷの５４３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５６５−５９５ｎｍの波長帯域（第一の波長帯域−ｃｈ１）と６６０−７１０ｎｍの波長帯域（第二の波長帯域−ｃｈ２）の光を測定し、それぞれの波長帯域について、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。

光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、ｃｈ２に於いて取得された時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］ …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。次いで、ｃｈ２の時系列光強度データ上において発光粒子の信号として判定された信号発生期間（パルス存在領域）に於けるｃｈ１の時系列光強度データ上のフォトンカウントの積算値及びｃｈ２の時系列光強度データ上のフォトンカウントの積算値を、それぞれ、発光粒子の信号のｃｈ１の強度値Ｉｃｈ１、ｃｈ２の強度値Ｉｃｈ２として算定した。

図６（Ａ）は、ＡＴＴＯ５６５溶液及びＡＴＴＯ５９０溶液のそれぞれについて、上記の光測定及び信号検出処理により検出された発光粒子の信号の各々のｃｈ１の強度Ｉｃｈ１に対してｃｈ２の強度Ｉｃｈ２をプロットした図である。図から理解される如く、ＡＴＴＯ５６５のプロット（白丸）とＡＴＴＯ５９０のプロット（黒四角）は、それぞれ、略直線上に分布し、また、二つの分布は、互いに分離した。このことは、強度比Ｉｃｈ１／Ｉｃｈ２は、それぞれの蛍光色素の発光波長特性の特徴を反映した発光粒子の種類に固有の値であり、強度比によって、種類を見分けられることを示している。図６（Ｂ）は、ＡＴＴＯ５６５の強度比Ｉｃｈ１／Ｉｃｈ２及びＡＴＴＯ５９０の強度比Ｉｃｈ１／Ｉｃｈ２のそれぞれの平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）を示しており、同図から理解される如く、ＡＴＴＯ５６５の強度比の平均値とＡＴＴＯ５９０の強度比の平均値とは有意に異なっており、且つ、ＡＴＴＯ５６５の強度比のエラーバーとＡＴＴＯ５９０の強度比のエラーバーとは、重複していないので、ＡＴＴＯ５６５の信号とＡＴＴＯ５９０の信号とは、互いに識別可能であることが示された。

かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、複数の検出波長帯域の成分を別々に計測して、発光粒子の発光波長特性の特徴が反映された複数の検出波長帯域の成分の強度比を参照することによって、検出される発光粒子の種類によって発光粒子の信号を区別することが可能となり、これにより、各発光粒子の種類の識別が可能となる。特に、本発明は、発光粒子の信号を個別に検出して、各発光粒子の種類の識別が可能となるので、試料溶液中の発光粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明により、走査分子計数法に於いて発光粒子の種類の識別が可能となることから、走査分子計数法の応用範囲が拡大されることが期待される。

Claims (12)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、
   前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
   前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する光検出部と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された光の複数の波長帯域の成分の強度に於いて前記発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、前記検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて前記発光粒子の種類を識別する信号処理部とを含み、
   前記信号処理部が、前記発光粒子の各々からの光の信号の検出に於いて、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された光の複数の波長帯域の成分の強度の時系列の光強度データを前記波長帯域毎に生成し、前記波長帯域毎に、前記時系列の光強度データに於けるデータ値の欠落を無視できるようになるまで前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列の光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の光信号として個別に検出することにより、前記発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出することを特徴とする装置。
2. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類を識別することを特徴とする装置。
3. 請求項１の装置であって、前記光検出部が前記光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度を検出し、前記信号処理部が前記二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類を識別することを特徴とする装置。
4. 請求項１の装置であって、更に、１つの波長帯域の励起光を前記光検出領域に照射する光照射部を含み、前記発光粒子が前記１つの波長帯域の励起光の照射により発光する粒子であり、前記光検出部が前記１つの波長帯域の励起光の照射により発せられる前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出することを特徴とする装置。
5. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
6. 請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
7. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、
   前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する過程と、
   前記検出された光の複数の波長帯域の成分の強度の時系列の光強度データを前記波長帯域毎に生成し、前記波長帯域毎に、前記時系列の光強度データに於けるデータ値の欠落を無視できるようになるまで前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列の光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の光信号として個別に検出することにより、前記発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、前記検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて前記発光粒子の種類を識別する過程とを含むことを特徴とする方法。
8. 請求項７の方法であって、前記発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類が識別されることを特徴とする方法。
9. 請求項７の方法であって、前記光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度が検出され、前記二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類が識別されることを特徴とする方法。
10. 請求項７の方法であって、更に、１つの波長帯域の励起光を前記光検出領域に照射する過程を含み、前記発光粒子が前記１つの波長帯域の励起光の照射により発光する粒子であり、前記１つの波長帯域の励起光の照射により発せられる前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度が検出されることを特徴とする方法。
11. 請求項７の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
12. 請求項７乃至１１のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。

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