CN102869982B - 光学分析装置、光学分析方法 - Google Patents

Abstract

提供一种光学分析技术，其能够对以低的浓度或数密度包含于样品溶液中的被观测粒子的状态或特性进行检测。本发明的光学分析技术使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能够对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统，以在使微小区域的位置在样品溶液中移动的同时（在利用微小区域扫描样品溶液的内部的同时）对来自被观测发光粒子的光进行检测；产生时间序列光强度数据，计算光强度的特征值，其中所述特征值表示光强度数据中每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光；并且对横穿微小区域的内部的发光粒子单个地进行检测，由此使得能够对发光粒子计数或能够获取关于发光粒子的浓度或数密度的信息。

Description

光学分析装置、光学分析方法

技术领域

本发明涉及对来自分散或溶解于溶液中的原子、分子或团聚体（在下文中，这些均称作“粒子”）的光进行检测以用于分析溶液中的粒子的状态的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序，更具体地，本发明涉及如下的光学分析装置、光学分析方法和用于光学分析的计算机程序：其能够通过使用诸如共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统等能对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统来获取对分析例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或其团聚体等生物分子以及例如病毒、细胞或非生物粒子等粒状物等等各种粒子的状态（相互作用、结合或离解状态，等等）有用的信息。 

背景技术

根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共聚焦显微镜的光学系统和能够对光子计数（单光子检测）的超高灵敏度光检测技术，使得单光子或单荧光分子水平的微弱光的检测和/或测量成为可能。因此，提出了借助于这种微弱光检测技术对生物分子等的分子间相互作用、结合或离解反应进行检测的各种装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS，参见例如专利文献1和2以及非专利文献1-3）中，借助于激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对进出样品溶液中的微小区域（显微镜的激光会聚的聚焦区域，称作“共聚焦体积”）的荧光分子或荧光标记分子（荧光分子等）的荧光强度进行测量，并且基于由测得的荧光 强度的自相关函数值所确定的荧光分子等在微小区域中的平均驻留时间（平移扩散时间）和驻留分子数的平均值，实现了诸如荧光分子等的运动速度、尺寸或浓度等信息的获取和/或诸如分子的结构或大小的变化、分子的结合或离解反应或者分散和团聚等各种现象的检测。此外，在荧光强度分布分析（Fluorescence Intensity Distribution Analysis：FIDA，例如专利文献3）或者光子计数统计分析（Photon Counting Histogram：PCH，例如专利文献4）中，生成了通过与FCS类似的方式测得的进出共聚焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，并且通过将统计模型公式与直方图的分布拟合来计算荧光分子等的特征亮度的平均值以及共聚焦体积内驻留的分子的平均数，从而，将基于这些信息估算分子的结构或尺寸变化、结合或离解状态或者分散和团聚状态。此外，在专利文献5和6中，提出了基于使用共聚焦显微镜的光学系统测得的样品溶液中荧光信号的时间演进来检测荧光物质的方法。专利文献7提出了一种信号计算处理技术，其利用光子计数技术测量来自流过流式细胞仪的荧光微粒或者来自固定在基板上的荧光微粒的微弱光，以检测荧光微粒是否存在于流体中或者基板上。 

特别地，根据诸如FCS和FIDA等采用了使用共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术来对微小区域进行荧光测量的技术的方法，与现有技术相比，测量所需的样品量可以极少（一次测量所使用的量最多几十μL）且浓度极低，并且测量时间也大幅缩短（在一次测量中，反复进行若干次时间为秒量级的测量）。因此，特别是在对医学或生物学研究和开发领域中常用的稀有或昂贵的样品进行分析时，或者在诸如疾病临床诊断或生物活性物质的筛选等对大量的样本进行试验时，期望这些技术与传统的生化方法相比是使得能够以低成本和/或快速地进行实验 或试验的强力的手段。 

现有技术文献 

专利文献 

专利文献1：日本特开2005-098876 

专利文献2：日本特开2008-292371 

专利文献3：日本特许第4023523号 

专利文献4：国际公开2008-080417 

专利文献5：日本特开2007-20565 

专利文献6：日本特开2008-116440 

专利文献7：日本特开平4-337446号公报 

非专利文献 

非专利文献1：金城政孝，“蛋白质，核酸，酵素”，Vol.44，No.9，1431－1438页，1999年。 

非专利文献2：F.J.梅耶-阿姆兹（F.J.Meyer-Alms），荧光相关光谱学（Fluorescence Correlation Spectroscopy），R.里格尔（R.Rigler）编，施普林格（Springer），柏林，2000年，204－224页。 

非专利文献3：加藤则子外4名，遗传子医学，Vol.6，No.2，271－277页。 

发明内容

发明要解决的问题

在诸如FCS、FIDA和PCH等上述光学分析技术中，简要地说，通过统计处理算出测得的荧光强度的时间波动的大小，然后基于波动的大小确定在样品溶液中的微小区域内进出的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述光学分析技术中获得显著的结果，优选的是，以如下方式准备被用作样品溶液中的观 测对象的荧光分子等的浓度或数密度：使得在平衡状态下，在秒量级长度的一次测量时间内，有使得统计处理能够进行的数量的荧光分子等将进出微小区域，优选地使得在微小区域中将总是存在大约一个荧光分子等（典型地，由于共聚焦体积的体积为大约1fL，所以优选的是荧光分子等的浓度为大约1nM以上）。换言之，当样品溶液中被观测粒子的浓度或数密度远远低于使得统计处理能够进行的水平（例如，远远低于1nM）时，会出现在测量时间内很少有被观测对象进入到微小区域内的状态，因此，荧光强度的测量结果会包括很长一段时间的在微小区域内完全不存在被观测对象的状态，并且显著的荧光强度的观测量也会减小，因此，不能够期望在如上所述基于荧光强度的统计波动的光学分析技术中有显著的或精确的分析结果。 

在专利文献5和6中描述的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，在未对荧光强度波动如上所述地进行统计处理的情况下，能够根据遍及数秒的测量时间内是否产生具有显著强度的荧光信号来确定样品中是否存在被观测荧光分子等，并且公开了，已经获得具有显著强度的荧光信号的频率与样品中荧光分子等的数量之间的相关性。特别地，在专利文献6中启示，搅动样品溶液的内部的随机流动的发生改善检测敏感度。然而，即使在那些方法中，也仅仅检测到是否存在由于扩散或随机流动而随机地进出微小区域的荧光分子等，而不能掌握微小区域内的荧光分子等的粒子的行为，所以，例如没有实现粒子的计数或者粒子的浓度或数密度的定量计算。此外，专利文献7中描述的技术在于检测流式细胞仪中的流体内是否存在单个荧光微粒或者检测是否存在固定于基板上的单个荧光微粒，而不是用于对在样品溶液中在通常状态下被溶解或分散的诸如分子和胶体等粒子、即在样品溶液中随机移动的粒子进行 检测的技术，因此，没有实现定量地算出样品溶液内溶解或分散的粒子的浓度或数密度。此外，由于专利文献7的技术包括诸如流式细胞仪中的测量或将荧光粒子固定于基板的处理等过程，所以与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况相比，大大地增加了试验所需的样品量，并且对于进行试验的人员可能要求复杂且先进的操作技术。 

因此，本发明的一个目的在于提供一种新的光学分析技术，该技术不包括诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术中进行的统计处理，使得能够在包含的被观测粒子的浓度或数密度比诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术所能够处理的水平低的样品溶液中检测被观测粒子的状态或特性。 

另外，本发明的另一目的在于提供一种实现上述新的光学分析技术的光学分析装置、方法或用于光学分析的计算机程序，其中，能够在与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术相似的短的测量时间内利用少量样品（例如，数十μL的水平）完成测量，还能够定量地确定被观测粒子的诸如浓度或数密度等特性。 

用于解决问题的方案

总的来说，在本发明中，提出了一种新型光学分析技术，该技术借助于诸如共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够对来自溶液中的微小区域的光进行检测的光学系统对分散在样品溶液中且在样品溶液中随机地移动的发光的粒子（以下称为“发光粒子”）发出的光进行检测，该技术在使微小区域的位置在样品溶液中移动的同时（即，在利用微小区域扫描样品溶液的内部的同时）对来自微小区域、即光检测区域的光进行检测，由此单个地检测横穿微小区域的内部的发光粒子，并且使得能够对发光粒子计数和能够获取关于样品溶液内的发光粒子的浓度或数密度的信息。 

根据本发明，作为一个方面，提供一种光学分析装置，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述光学分析装置包括：光检测区域移动部，其使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；光检测部，其对来自所述光检测区域的光进行检测；和信号处理部，其生成在所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的过程中利用所述光检测部检测到的来自所述光检测区域的光的时间序列光强度数据，并且在所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号；其中，所述信号处理部计算表示在所述时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值，并且使用所述特征值单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号。在该结构中，“分散在样品溶液中且在样品溶液中随机地移动的发光粒子”是能发光且分散或溶解在样品溶液中的诸如原子、分子或其团聚体等粒子，并且可以是在溶液中自由地进行布朗运动而未固定于基板的任意微粒物质等。该发光粒子典型地为荧光粒子，但是也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等而发光的粒子。共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是那些显微镜中的检测光的微小区域，该区域与当照明光从物镜发出时将照明光会聚到的区域对应（该区域根据共聚焦显微镜中的、特别是物镜和针孔之间的空间关系来确定。对于在没有照明光的情况下发光的发光粒子，例如根据化学发光或生物发光的粒子，在显微镜中不需要照明光。）在这方面，在本说明书中，“光信号”是指“表示光的信号”。 

如从以上可以理解到的，在本发明的装置的基本结构中， 首先，在使光检测区域的位置在样品溶液中移动的同时，即在利用光检测区域扫描样品溶液的内部的同时，顺次地进行光的检测。因此，当移动的光检测区域包括随机地移动的发光粒子时，通过光检测区域来检测来自发光粒子的光，由此，通过捕获该光将检测到存在一个发光粒子。在这方面，更详细地，在从光检测部以时间序列输出的信号、即光强度数据中，在来自单个发光粒子的光到达光检测部的时间区间内的光检测部的输出信号的值以脉冲形式变化，其特性不同于没有来自发光粒子的光到达并且仅产生噪声的时间区间内的值。因此，将本发明的装置的信号处理部设计成：根据光检测部顺次地检测到的信号产生时间序列光强度数据；计算出表示在时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值，并且使用该特征值单个地检测来自各个发光粒子的光信号。 

关于特征值，可以采用如下的任意的值：该值在存在来自单个发光粒子的光的预定宽度的时间区间内的大小比不存在来自单个发光粒子的光的预定宽度的时间区间内的大小变大。在那种情况下，当光强度的特征值大于预定阈值时，判定为该预定宽度的时间区间内存在来自发光粒子的光信号。例如，该特征值可以是预定宽度的时间区间内的光强度的累计值、光强度的中心值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值和根据光强度的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数中的任一个。在这方面，典型地，光检测部通过光子计数来检测来自光检测区域的光，因此，在那种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。因此，光强度的特征值可以是选自以下组的值：该组由预定宽度的时间区间内光子数的总值、光子数的中心值、光子数 的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。 

另外，在如上所述对于每个预定宽度的时间区间使用特征值检测发光粒子的信号的方法的情况下，如果预定宽度比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度短，则将在两个以上时间区间上检测到一个发光粒子的光；然而当预定宽度长以致于包含了多个发光粒子的光的到达时间时，一个时间区间内将包括关于两个以上的发光粒子的信息，因而在任何一种情况下，并未建立一个发光粒子对应于一个时间区间的关系，因此，用于单个地检测来自每个发光粒子的光信号的信号处理将变得复杂。因此，优选地，预定宽度被设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短。换言之，时间区间的预定宽度的下限被设定为实质上比一个发光粒子的光信号的时间宽度长，并且预定宽度的上限被设定为使得各个时间区间内包含的发光粒子数实质上将不多于一个粒子。在这方面，在上述表达中，“实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长”或“实质上比一个发光粒子的光信号的时间宽度长”意味着预定宽度被设定为比大多数发光粒子的光信号的时间宽度长，也就是在误差范围内允许时间宽度比预定宽度长的发光粒子的光信号存在。同样地，“实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短”或“使得各个时间区间内包含的发光粒子数实质上将不多于一个粒子”意味着 预定宽度被设定为使得在大多数时间区间内发现的发光粒子数不多于一个粒子，也就是在误差范围内允许包含两个以上的发光粒子的时间区间存在。根据该结构，当确定了存在来自发光粒子的光的一个时间区间时，在大多数情况下，可以判定时间区间内包括的光信号是来自一个发光粒子的光信号，从而能够确定存在一个发光粒子，因此，单个地检测发光粒子的处理变得有利地简单。 

当样品溶液中随机移动的发光粒子成为能够如上所述地被单个地检测时，将获取关于溶液中的发光粒子的状态的各种信息。具体地，例如，在本发明的装置中，信号处理部可以被设计成通过对发光粒子的单个地检测的光信号的数量计数（发光粒子的计数），来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量计数。在那种情况下，如上所述，当使用各个预定宽度的时间区间内的光强度的特征值来单独检测发光粒子时，具有来自发光粒子的光信号的预定宽度的时间区间数对应于发光粒子数，由此通过对具有来自发光粒子的光信号的预定宽度的时间区间的数量计数，来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量计数。根据该结构，通过将发光粒子数与光检测区域的位置的移动量关联，将获取关于样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度的信息。特别地，通过利用任意方法确定光检测区域的位置的运动轨迹的总体积，例如通过以预定速度使光检测区域的位置移动，能够具体地计算发光粒子的数密度或浓度。当然，代替直接确定数密度或浓度的绝对值，可以计算出数密度或浓度相对于多个样品溶液或者相对于作为浓度或数密度的基准的标准溶液的相对比率。 

此外，在上述本发明的装置中，基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来适当地改变光检测区域的 位置在样品溶液中的移动速度。如本领域普通技术人员所理解的，来自发光粒子的被检测到的光的状态可以根据发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度而改变。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量将减小，所以，优选的是能够适当地改变光检测区域的移动速度，使得能够以精确的或足够的灵敏度测量来自一个发光粒子的光。 

此外，在本发明的装置中，优选地，将光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度设定为高于作为待检测对象的发光粒子的扩散移动速度（粒子由于布朗运动而移动的平均移动速度）。如上所述，当光检测区域通过存在发光粒子的位置时，本发明的装置检测到从发光粒子发出的光，由此单个地检测发光粒子。然而，当发光粒子由于布朗运动而随机地移动以致多次进出光检测区域时，将多次检测到来自一个发光粒子的光信号（表明存在发光粒子），所以，使存在一个发光粒子与检测到的光信号相关联变得困难。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于发光粒子的扩散移动速度，由此，变成能够使一个发光粒子与一个光信号（表明存在发光粒子）相对应。在这方面，由于扩散移动速度取决于发光粒子而不同，所以，优选地，如上所述可以将本发明的装置设计成能够根据发光粒子的特性（特别是扩散常数）来适当地改变光检测区域的移动速度。 

可以以任意方式使得光检测区域的位置移动。例如，可以通过使用激光扫描型光显微镜中采用的电流镜改变光路来改变光检测区域的位置，或者在光检测区域不移动时，可以通过移动样品溶液的位置（移动显微镜的载物台）来使光检测区域的位置在样品溶液中移动。光检测区域的位置移动轨迹可以任意 地设定，例如，该移动轨迹可以从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线中选择。 

在上述本发明的装置中与使光检测区域的位置在样品溶液中移动一起进行光检测、并且对来自每个发光粒子的光信号单个地进行检测的光学分析技术的处理也可以通过通用计算机来实现。因此，根据本发明的另一方面，提供一种用于光学分析的计算机程序，其用于通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述计算机程序使计算机执行如下进程：使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据；计算光强度的特征值，其中，所述特征值表示在所述时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光；和使用每个所述预定宽度的时间区间内的光强度的特征值，单个地检测来自每个发光粒子的光信号。 

另外，该计算机程序可以包括：通过对单个地检测出的来自发光粒子的光信号的数量计数或者通过对具有来自发光粒子的光信号的预定宽度的时间区间的数量计数,来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量进行计数的进程；和/或基于检测到的发光粒子数来确定样品溶液内的发光粒子的数密度或浓度的进程。典型地，在检测来自光检测区域的光以产生时间序列光强度数据的进程中，通过光子计数来检测来自光检测区域的光，并且在那种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。在使光检测区域的位置移动的进程中，可以使光检测区域的位置以预定的速度或者比发光粒子的 扩散移动速度快的速度移动，并且可以基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。光检测区域的位置的移动轨迹可以从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线中选择。 

此外，同样在上述本发明的计算机程序中，预定宽度的时间区间内光强度的特征值可以是如下这样的值：该值在存在来自单个发光粒子的光时比不存在来自单个发光粒子时变大，并且当光强度的特征值大于预定阈值时，可以判定为预定宽度的时间区间内存在来自发光粒子的光信号。具体地，该特征值可以采用预定宽度的时间区间内的光强度的累计值、光强度的中心值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值和根据光强度的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数中的任一个。特别地，当时间序列光强度数据是时间序列光子数数据时，光强度的特征值可以是选自以下组的值：该组由预定宽度的时间区间内光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。此外，优选地，将如上所述的时间区间的预定宽度设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短。 

此外，根据上述本发明的装置或计算机程序，实现了新的光学分析方法，该方法通过与使光检测区域的位置在样品溶液中移动一起对光进行检测，来单个地检测来自每个发光粒子的光信号。因此，本发明的光学分析方法，其通过使用共聚焦显 微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据；计算光强度的特征值，其中，所述特征值表示在所述时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光；和使用每个所述预定宽度的时间区间内的光强度的特征值，单个地检测来自每个发光粒子的光信号。 

该方法也可以包括：通过对单个地检测出的来自发光粒子的光信号的数量计数或通过对具有来自发光粒子的光信号的预定宽度的时间区间的数量计数，来对在光检测区域的位置移动的过程中检测到的发光粒子的数量进行计数的步骤；和/或基于检测到的发光粒子数来确定样品溶液内的发光粒子的数密度或浓度的步骤。典型地，在检测来自光检测区域的光以产生时间序列光强度数据的步骤中，通过光子计数来检测来自光检测区域的光，并且在那种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。此外，在使光检测区域的位置移动的步骤中，可以使光检测区域的位置以预定的速度或者比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，并且可以基于发光粒子的特性或样品溶液内发光粒子的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。光检测区域的位置的移动轨迹可以从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线中选择。 

此外，同样在上述方法中，预定宽度的时间区间内光强度的特征值可以是如下这样的值：该值在存在来自单个发光粒子的光时比不存在来自单个发光粒子时变大，并且当光强度的特 征值大于预定阈值时，可以判定为预定宽度的时间区间内存在来自发光粒子的光信号。具体地，该特征值可以采用预定宽度的时间区间内的光强度的累计值、光强度的中心值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值和根据光强度的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数中的任一个。特别地，当时间序列光强度数据是时间序列光子数数据时，光强度的特征值可以是选自以下组的值：该组由预定宽度的时间区间内光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。此外，优选地，将如上所述的时间区间的预定宽度设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短。 

发明的效果 

通过上述本发明的装置、方法或计算机程序实现的光学分析技术为自身的光检测机构采用了如下结构：与诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况类似，对来自共聚焦显微镜的或多光子显微镜中的光检测区域的光进行检测，因此，样品溶液的量可以同样地少。然而，由于在本发明中未进行计算荧光强度波动的统计处理，所以本发明的光学分析技术适用于发光粒子的数密度或浓度大大地低于诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术所需的水平的样品溶液。 

此外，由于在本发明中对分散或溶解在溶液中的每个发光粒子单个地进行检测，所以通过使用关于粒子的信息能够定量地进行发光粒子的计数、样品溶液中发光粒子的浓度或数密度 的计算或者获取关于浓度或数密度的信息。例如，虽然专利文献5和6能够获取在预定时间内强度超过预定阈值的荧光信号的频率的总数与样品溶液中荧光分子等的粒子数之间的相关性，但是不能掌握通过测量区域的粒子的动态行为（粒子是径直通过测量区域或是驻留在测量区域内），因此，强度比预定阈值高的荧光信号与通过测量区域的粒子之间的对应关系不清楚，从而发光粒子的计数从理论上讲是不可能的，从而难以精确地确定样品溶液内粒子的浓度。然而，根据本发明，由于使得通过光检测区域的发光粒子与发光粒子的光信号到达光检测部的时间以1对1的方式相关联，使得一次将检测到一个发光粒子，对分散在溶液中且在溶液中随机地移动的发光粒子的计数成为可能，并且与传统技术相比能够精确地确定样品溶液中的粒子的浓度或数密度。 

本发明的光学分析技术典型地用于生物微粒对象的溶液的状态分析，其中生物微粒对象为例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者其团聚体等生物分子，以及病毒和细胞等，但是也可以用于溶液中非生物粒子（例如原子、分子、胶束、金属胶体等）的状态分析，并且应当理解的是，这些情况也都包含在本发明的范围内。 

本发明的其他目的和优点将通过对本发明的优选实施方式的以下说明变得清楚。 

附图说明

图1的（A）是根据本发明的光学分析装置的内部结构的示意图。图1的（B）是共聚焦体积的（共聚焦显微镜的观测区域）的示意图。图1的（C）是用于改变镜7的方向以使光检测区域的位置在样品溶液中移动的机构的示意图。图1的（D）是 用于移动显微感光板的水平位置以使光检测区域的位置在样品溶液中移动的机构的示意图。 

图2的（A）和图2的（B）分别是说明根据本发明的光学分析技术来检测光的原理的示意图和测得的光强度随时间变化的示意图。图2的（C）是说明根据光强度数据单个地检测来自发光粒子的光的原理的示意图。图2的（D）示出时间区间的预定宽度与两个以上发光粒子的光同时进入的几率之间的关系（多个发光粒子包含于一个预定宽度ω的时间区间内的比率）。 

图3的（A）和图3的（B）分别是发光粒子由于布朗运动而横穿光检测区域的情况下的模型图和示出在该情况下光子数（光强度）随时间的变化的示例的图。 

图4的（A）和图4的（B）分别是使得光检测区域的位置以比发光粒子的扩散移动速度快的速度在样品溶液内移动时发光粒子横穿光检测区域的情况下的模型图和示出在该情况下光子数（光强度）随时间的变化的示例的图。 

图5的（A）是示出根据本发明的光学分析技术测得的全部时间序列光子数数据的图，以及图5的（B）是时间序列光子数数据的几个区间的放大图，其中也示出对参照区间计算得到的多个特征值。 

图6示出对于含有的发光粒子的浓度为10fM-100pM的各个溶液、使用根据本发明计算的特征值在时间序列光子数数据中单个地检测到的发光粒子数。 

图7是示出根据本发明的光学分析技术的时间序列光子数数据中时间区间的预定宽度与检测到存在发光粒子的区间的数量之间的关系的图。 

图8示出在计算荧光强度波动的传统光学分析技术中 获得的光子数（光强度）的时间变化的示例，其中，（A）示出粒子浓度处于在测量中提供足够精度的水平的情况，（B）示出样品中的粒子浓度显著地低于情况（A）时的情况。 

附图标记说明

1…光学分析装置（共聚焦显微镜） 

2…光源 

3…单模光纤 

4…准直透镜 

5…分色镜 

6、7、11…反射镜 

8…物镜 

9…显微感光板 

10…井（样品溶液容器） 

12…聚光透镜 

13…针孔 

14…阻断滤片 

15…多模光纤 

16…光电检测器 

17…镜偏转器 

17a…载物台位置改变装置 

18…计算机 

具体实施方式

在下文中，详细地描述本发明的优选实施方式。 

光学分析装置的结构

实现本发明的光学分析技术的光学分析装置的基本结构可以是如图1的（A）中示意性地示出的那样通过将能够被用来进 行FSC、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统与光电检测器组合而形成的装置。参照附图，光学分析装置1由光学系统2-17和计算机18构成，该计算机18用于获取和分析数据并且控制光学系统的各部件的操作。光学分析装置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统相同，其中，从光源2发出并通过单模光纤3的内部传输的激光（Ex）在光纤的发射端形成以固有NA所决定的角度放射的发散光；并且在利用准直透镜4形成平行光束之后，光在分色镜5和反射镜6、7上反射，从而进入到物镜8中。典型地，在物镜8的上方放置被分注了一至数十μL的样品溶液的样品容器或者其上配置有井10的显微感光板9，并且从物镜8发出的激光在样品容器或井10中的样品溶液内聚焦，从而形成具有强的光强度的区域（激发区域）。荧光粒子或者附有诸如荧光染料等发光标记的粒子等作为被观测对象的发光粒子在样品溶液中分散或溶解，并且当发光粒子进入到激发区域时，发光粒子在驻留于激发区域中的过程中被激发，从而发出光。在通过物镜8和分色镜5之后，发出的光（Em）在镜11上反射并且被聚光透镜12会聚，然后光通过针孔13、透过阻断滤片14（在这里仅选择处于特定波长带区域的光分量）并被导入多模光纤15中，从而到达光电检测器16，并且在转换为时间序列电信号之后，该信号被输入到计算机18中，在计算机18中以稍后说明的方式执行用于光学分析的处理。在这方面，如本领域技术人员所知道的，在上述结构中，针孔13位于物镜8的聚焦位置的共轭位置处，因此，仅从如图1的（B）中示意性地示出的激光的聚焦区域、即激发区域发出的光通过针孔13，而来自激发区域之外的其他区域的光被阻挡。图1的（B）中示出的激光的聚焦区域是该光学分析装置中的有效体积通常为大约1-10fL的光检测区域（典型地，光强度与在区域的中央具有峰值的高斯分布一 致地展开。有效体积是以光强度减小至峰值强度的1/e²的表面为边界的近似椭球的体积），该有效体积称作“共聚焦体积”。此外，由于在本发明中对从一个发光粒子发出的光、例如从一个荧光染料分子发出的微弱光进行检测，所以，优选地，光电检测器16使用能够用于光子计数的超高灵敏度光电检测器。当通过光子计数来进行光的检测时，以对预定时间内的每个预定单位时间（BIN时间）测量到达光电检测器的光子的数量的方式，连续地进行光强度的测量。因此，在这种情况下，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。 

此外，在上述光学分析装置的光学系统中，设置有用于利用光检测区域、即聚焦区域扫描样品溶液的内部以用于使光检测区域在样品溶液内移动的机构。对于用于使光检测区域的位置移动的该机构，例如，如图1的（C）中示意性地示出的那样，可以采用改变反射镜7的方向的镜偏转器17（使光检测区域的绝对位置移动的类型）。该镜偏转器17可以与配备在通常的激光扫描型显微镜上的电流镜装置中的镜偏转器相同。或者，可替代地，如图1的（D）所示，可以采用载物台位置改变装置17a来移动分注了样品容液的容器10（显微感光板9）的水平位置，以使光检测区域的相对位置在样品溶液中移动（使样品溶液的绝对位置移动的类型）。无论在哪一种类型中，为了得到光检测区域的位置期望的移动图形，在计算机18的控制下与光电检测器16的光检测协调一致地驱动镜偏转器17或者载物台位置改变装置17a。光检测区域的位置的移动轨迹可以从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线中以单个或组合的形式任意地选择（在计算机18中的程序中，可以设计成能够选择多种移动图形。）。在这方面，虽然未示出，但是可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置在上下方向上移动。 

在用作被观测对象的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在那种情况下，由于光仅从激发光的聚焦区域（光检测区域）发出，所以可以移除针孔13。此外，在用作被观测对象的发光粒子不是由于激发光而是由于化学发光或生物发光现象而发光的情况下，可以省略用于产生激发光的光学系统2-5。当发光粒子由于磷光或散射光而发光时，照原样使用上述共聚焦显微镜的光学系统。此外，如图所示，在光学分析装置1中，可以设置两个以上的激发光源2，使得能够根据发光粒子的激发波长适当地选择激发光的波长。类似地，也可以设置两个以上的光电检测器16，使得当样品包含波长彼此不同的两种以上的发光粒子时，能够根据波长对分别从这些发光粒子发出的光分开地进行检测。 

本发明的光学分析技术的原理

诸如FCS和FIDA等光谱分析技术的优点在于，与传统的生化分析技术相比，需要的样品量极少并且能够迅速地进行试验。然而，在诸如FCS和FIDA等这些光谱分析技术中，从原理上讲是基于荧光强度波动来计算被观测粒子的浓度和特性，所以，为了获得精确的测量结果，样品溶液中的被观测粒子的浓度或数密度应当处于如图8的（A）所示意性地绘出的那样在测量荧光强度的过程中光检测区域CV内总是存在大约一个被观测粒子的水平，使得如图中右手侧所示出的那样在测量时间内总是能够检测到显著的光强度（光子数）。当被观测粒子的浓度或数密度低于上述水平、例如处于如图8的（B）所绘出的被观测粒子很少进入到光检测区域CV内的水平时，如图中右手侧所示，在一部分测量时间中将不会出现显著的光强度（光子数），因此，精确地计算光强度波动会变得困难。另外，当被观测粒子的浓度显著地低于在测量过程中光检测区域内总是存在大约一个被 观测粒子的水平时，光强度波动的计算会受到背景的影响，为了获得足够用于计算的显著数量的光强度数据（光子数），应当延长测量时间。 

为此，在本发明中，提出了一种基于新的原理的光学分析技术，即使当被观测粒子的浓度低于诸如FCS和FIDA等上述光谱分析技术中所要求的水平时，该光学分析技术也能够检测被观测粒子的诸如数密度或浓度等特性。 

在本发明的光学分析技术中，简要地说，在进行处理时，与通过驱动用于使光检测区域的位置移动的机构（镜偏转器17或载物台位置改变装置17a）从而如图2中所示意性地绘出的那样使得光检测区域CV的位置在样品溶液中移动、即利用光检测区域扫描样品溶液的内部一起进行光检测。因此，例如，如在图2的（A）中，在使光检测区域CV移动的过程中（图中，时间t0至t2），当光检测区域CV通过存在一个发光粒子（图中为荧光染料）的区域时（t1），如图2的（B）所示将检测到显著的光强度（Em）。因此，通过在如上所述执行使光检测区域CV的位置移动和光检测的过程中逐个地检测如图2的（B）所示的那样出现的每个显著的光强度、即每个脉冲状的信号，而单个地检测发光粒子，并且通过对发光粒子数计数，能够获取关于测量区域内存在的发光粒子的数量、浓度或数密度的信息。应当理解的是，在本发明的光学分析技术的原理中，没有执行诸如计算荧光强度波动等统计计算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此，即使在发光粒子（被观测粒子）的浓度处于在FCS和FIDA中不能够进行足够精确的分析的低的水平的样品溶液中，也能够获取关于发光粒子的浓度或数密度的信息。 

在这方面，在如图2的（C）所示的实际的光强度数据（光子数数据）中，除了来自发光粒子的光之外还存在噪声（光电 检测器的热噪声、背景光），因此，需要在区分来自发光粒子的光信号和噪声的同时检测是否存在来自发光粒子的光信号。因此，作为提取来自发光粒子的光信号存在的方法之一，在本实施方式中，借助于各时间区间内的光强度值（光子数）而在时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内顺次地计算表示是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值。通过参照光强度的特征值的大小，可以检测每个预定宽度的时间区间中是否存在来自单个发光粒子的光信号，从而可以逐个地检测发光粒子。典型地，表示是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值可以是任意值，在存在来自单个发光粒子的光信号时，该任意值与不存在来自单个发光粒子的光信号（仅存在噪声）的情况相比增大，例如该特征值可以是预定宽度的时间区间内的光强度的累计值、光强度的中心值、光强度的平均值、光强度的标准偏差（SD值）、光强度的方差、光强度的熵（EP值）、光强度的最大值和根据光强度的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数等。特别地，在本实施方式中，由于光强度数据是根据光子计数的光子数数据，因此特征值可以是选自以下组的值：该组由预定宽度的时间区间内的光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。 

此外，优选地，用于计算上述特征值的时间区间的预定宽度被设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短。通过设定这样的预定宽度，存在发光粒子的光信号的一个时间区间对应于一个发光粒子的存 在，也就是在时间区间与存在发光粒子之间建立一对一的关系，由此，对发光粒子计数的处理变得有利地容易。如果时间区间的预定宽度比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度短，则一个发光粒子的光信号将存在于两个以上时间区间，因而需要使多个时间区间对应于一个发光粒子的处理。另一方面，如果时间区间的预定宽度比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度长，则多个发光粒子的光信号将存在于一个时间区间内，因而逐个地检测一个发光粒子变得困难。 

当假设发光粒子直线地通过光检测区域的中心时（见下述“（1）样品溶液的光强度的测量”和图4），例如，使用光检测区域的直径2Wo和移动速度u，上述预定宽度的下限ωlow可以被设定为： 

ωlow=2Wo/u    ---(1) 

预定宽度的上限ωhigh是这样的预定宽度：在该预定宽度中，每个时间区间中包含的发光粒子数实质上不大于一个。可以以下列方式中的一种来确定预定宽度的上限ωhigh。 

（1)假设发光粒子均匀分散在样品溶液中的情况 

在预定宽度ω的时间区间内、在光检测区域移动的过程中检测的发光粒子数n，通过下式给出 

n=cN_ASuω    ---(2a) 

其中，c是发光粒子的摩尔浓度，N_A是阿伏伽德罗数，S是光检测区域的横截面积。近似为S～πWo²，并且假设预定宽度ω的时间区间内存在一个发光粒子（n=1），预定宽度ω由下式给出， 

ω=1/(cN_AπWo²u)    ---(2b) 

因此，使用发光粒子的期望浓度c，可以将预定宽度ωhigh设定 为利用表达式（2b）算出的值ω，或者考虑到发光粒子的存在位置的离散度而设定为比利用表达式（2b）算出的值ω小的值。 

（2）假设发光粒子根据泊松分布进入预定宽度的时间区间内的情况 

在预定宽度ω的时间区间内、在光检测区域移动的过程中检测到的发光粒子的平均数n由上述表达式（2a）给出。另一方面，预定宽度ω的时间区间内出现的发光粒子数为k的几率pk为： 

【数学表达式1】 

$\mathrm{pk}=\frac{e^{-n}{n}^k}{k!}\·\·\·\left(2c\right)$

因此，在预定宽度ω的时间区间内出现的发光粒子数为两个以上的几率p_>1、即在一个预定宽度ω的时间区间内包括两个以上发光粒子的比率变成： 

【数学表达式2】 

$p_{>1}=1-\underset{k=0}{\overset{1}{\mathrm{\Σ}}}\frac{e^{-n}{n}^k}{k!}\·\·\·\left(2d\right)$

图2的（D）是示出表达式（2d）随预定宽度ω（利用c=10pM，u=15mm/s，Wo=1μm来计算）变化的示例的图。参照该图，在示出的示例中，能够理解的是，当预定宽度被设定为ω=200μ秒时，5%的时间区间包含多个发光粒子。因此，可以将预定宽度ωhigh设定为使用期望的发光粒子浓度c、在表达式（2d）中、提供容许的误差的预定宽度ω。 

本发明的光分析装置的操作和操作过程

具体地，在利用如图1的（A）所示的本发明的光学分析装置1的光学分析中，执行（1）测量包含发光粒子（被观测粒子）的样品溶液的光强度的过程和（2）分析测得的光强度的过程。 

（1）样品溶液的光强度的测量 

在本发明的光学分析技术中用作被观测对象的粒子可以是任意粒子，只要该粒子分散在样品溶液中并且在样品溶液中随机地移动即可、诸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸等或者这些生物分子的团聚体，也可以是病毒、细胞、金属胶体或其他非生物分子。当用作被观测对象的粒子不是发光粒子时，使用以任意方式将发光标记（荧光分子、磷光分子、化学发光分子或生物发光分子）贴附于被观测粒子而制备的粒子。样品溶液典型地为水溶液，然而不限于此，也可以使用有机溶剂和其他任意液体。 

除了在测量过程中驱动镜偏转器17或载物台位置改变装置17a以使光检测区域的位置在样品溶液内移动（在样品溶液中扫描）之外，可以以与FCS或FIDA中的光强度测量过程相同的方式在本发明的光学分析中进行光强度的测量。在操作过程中，典型地，在将样品溶液分注到显微感光板9的井10内并且将其放在显微镜的载物台上之后，当使用者向计算机18输入测量开始的命令时，计算机18执行存储在存储装置（未示出）中的程序（使光检测区域的位置在样品溶液中移动的进程，和在光检测区域的位置移动的过程中检测来自光检测区域的光并且产生时间序列光强度数据的进程），因此将启动利用激发光对样品溶液中的光检测区域的照明和测量光强度。在该测量过程中，根据程序在计算机18的操作过程的控制下，镜偏转器17或载物台位置改变装置17a驱动镜7（电流镜）或显微镜的载物台上的显微感光板9以使光检测区域的位置在井10内移动，与此同时，光电检测器16顺次地将检测到的光转换成电信号并将该电信号传输至计算机18，计算机18将传输的光信号生成时间序列光强度数 据并且以任意方式将该时间序列光强度数据存储起来。在这方面，光电检测器16典型地为能够检测单个光子的到达的超高灵密度光电检测器，因此，当通过光子计数来完成光检测时，时间序列光强度可以是时间序列光子数数据。 

在测量光强度的过程中光检测区域的位置的移动速度可以是例如通过实验或者为了满足分析的目的而任意设定的预定速度。在基于检测到的发光粒子数来获取关于数密度和浓度的信息的情况下，需要知道光检测区域通过的区域的尺寸或体积，因此，以使得能够掌握移动距离的方式进行光检测区域的位置的移动。在这方面，因为如果经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例，则测量结果的解释将变得容易，所以，基本上优选的是移动速度恒定，然而不限于此。 

顺便提一句，关于光检测区域的位置的移动速度，为了根据测得的时间序列光强度数据或者对发光粒子数的计数来定量地、精确地、单个地检测发光粒子，优选的是，将移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动中的移动速度快的值。由于本发明的光学分析技术中的被观测粒子是分散或溶解到溶液中并且自由地随机移动的粒子，所以其位置由于布朗运动而随时间移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度比粒子的由于布朗运动而移动的速度慢时，粒子将如图3的（A）中所示意性地绘出的那样在区域中随机地移动，从而如图3的（B）所示，光强度随机地变化（如已经指出的，光检测区域中的激发光强度从区域的中央处的峰值朝向外侧降低），使得确定与各发光粒子对应的显著的光强度变化变得困难。因此，优选地，如图4的（A）所绘出的那样，光检测区域的位置的移动速度被设定为比粒子的由于布朗运动而移动的平均移动速度（扩散移动速度）快，使得粒子将近似直线地横穿光检测区域，并且如图4 的（B）所示，与每个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓在时间序列光强度数据中变得几乎一致（当发光粒子近似直线地通过光检测区域时，光强度变化的轮廓与激发光强度分布类似），并且能够容易地确定每个发光粒子与光强度之间的对应关系。 

具体地，扩散系数为D的发光粒子由于布朗运动而通过半径为Wo的光检测区域（共聚焦体积）所需的时间Δt由均方位移关系的表达式： 

(2Wo)²=6D·Δt    ---(4) 

给出，为： 

Δt=(2Wo)²/6D    ---(5)， 

因此，发光粒子由于布朗运动而移动的速度（扩散移动速度）Vdif近似为： 

Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo    ---(6) 

因此，参照该公式，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为比Vdif充分快的值。例如，假设Wo为大约0.62μm，当被观测粒子的扩散系数预计大约为D=2.0×10^-10m²/s时，Vdif将为1.0×10^-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在这方面，当被观测粒子的扩散系数未知时，可以通过设定光检测区域的位置的各种移动速度而反复地执行预备试验以找出光强度变化的轮廓变成期望的轮廓（典型地，与激发光强度分布类似）的条件，以此来确定光检测区域的位置的适当的移动速度。 

（2）光强度的分析 

当通过上述处理获得了样品溶液的时间序列光强度数据时，通过根据存储在存储装置中的程序的处理（计算表示在时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来 自单个发光粒子的光的光强度的特征值的进程，以及基于每个预定宽度的时间区间内光强度的该特征值单个地检测每个发光粒子的光信号的进程），可以在计算机18中进行如下所述的光强度的分析。 

（i）一个发光粒子的检测 

当一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的（A）中所示近似为直线时，在时间序列光强度数据中与该发光粒子对应的光强度变化具有如图4的（B）中所示意性地绘出的、反映光检测区域（由光学系统确定）中的光强度分布的轮廓（通常近似为钟形），该光强度变化与没有发光粒子通过的期间内的数据中的变化（噪声随机产生的情况）显著地不同。因此，如已经指出的，在本实施方式中，对于时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间计算光强度的特征值。当时间序列光强度数据是时间序列光子数数据时，如上所述，光强度的特征值可以是选自以下组的值：该组由预定宽度的时间区间内的光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。 

关于各个特征值，更详细地，光子数的总值是预定宽度的时间区间内的光子数的总值。由于存在发光粒子的光信号的时间区间内的总值比其他时间区间内的总值增大，增大量为来自发光粒子的光子数，因此，当特定时间区间内的总值大小大于预定阈值时，能够判定为该特定时间区间内存在发光粒子的光信号。 

光子数的中心值和最大值分别是在预定宽度的时间区间内发现的光子数的中心值和最大值。由于在当发光粒子的光到达光电检测器的期间内的光子数与仅发生通常的噪声的情况相比 变大，因此中心值和最大值在存在发光粒子的光信号的时间区间内也增大。因此，当特定时间区间内中心值或最大值大于预定阈值时，能够判定为该特定时间区间内存在发光粒子的光信号。 

光子数的平均值是预定宽度的时间区间内的光子数的时间平均值。如上面所指出的，由于存在发光粒子的光信号的时间区间内的总值比其他时间区间内的总值增大，增大量为来自发光粒子的光子数，因此光子数的时间平均值在预定宽度的时间区间内也增大。因此，当特定时间区间的平均值的大小大于预定阈值时，能够判定为该特定时间区间内存在发光粒子的光信号。 

光子数的标准偏差值、方差值和熵值均是时间平均的标准偏差值、方差值和预定宽度的时间区间内光子数的信息量的熵，这些均是表示在预定宽度的时间区间内发现的光子数的时间变化的离散度的特征值。当发光粒子的光信号存在于特定时间区间时，光子数随时间的变化与其他时间区间相比更剧烈。因此，由于存在发光粒子的光信号的时间区间内的光子数的标准偏差值、方差值和熵值与其他时间区间的相应值相比增大，当特定时间区间内的各个值均大于预定阈值时，能够判定为该特定时间区间内存在发光粒子的光信号。在这方面，关于光子数的熵值，当特定时间（BIN TIME）的光子数为x的几率是px时，使用特定时间区间内的光子数为x的时间点的数量ix，光子数的熵值由下式给出： 

-log₂(p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·…·px^ix·…·pnⁱⁿ)    ---(7) 

通常，光子数为x的几率px满足p0>p1>p2>…>px…>pn。尽管仅存在噪声的区间内的熵值近似为-log₂(p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·p2ⁱ²)，但是在存在发光粒子的光信号的区间内熵值变为-log₂ (p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·p2ⁱ²·p3ⁱ³·p4ⁱ⁴)等，从而值增大。 

根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的预定宽度的时间区间内的粒子数，在数量上等于该时间区间内的粒子数。根据F C S的理论，光强度的自相关函数C(τ)由下式给出： 

【数学表达式3】 

$C\left(\mathrm{\τ}\right)=1+\frac{1}{N}{(1+\frac{\mathrm{\τ}}{\mathrm{\τD}})}^{-1}{(1+\frac{\mathrm{\τ}}{{\mathrm{AR}}^2\mathrm{\τD}})}^{-1/2}\·\·\·\left(8\right)$

（其中τ_D是平移扩散时间，AR是结构参数，N是粒子数）。在上述表达式中，使用相关时间τ=0时的C(0)，粒子数N由1/(C(0)-1)给出。由于考虑到该粒子数为各时间区间内发现的粒子的数量，所以，与上述特征值类似，能够判定粒子数大于预定阈值的时间区间内存在发光粒子的光信号。 

（ii）发光粒子的计数 

在上述检测发光粒子的处理中，当时间区间的预定宽度被设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短时，一个发光粒子对应于判定为存在发光粒子的光信号的一个时间区间，因此通过对这些时间区间的数量计数来确定发光粒子数。 

（iii）发光粒子的数密度或浓度的确定 

当完成了发光粒子的计数时，可以使用光检测区域通过的总区域的体积来确定发光粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的有效体积取决于激发光的或检测到的光的波长、透镜的数值孔径以及光学系统的调整状态而变化，因此，难以根据设计参数值来计算光检测区域的有效体积。因此，在本实施方式 中，在与测量待试验样品溶液的条件相同的条件下、利用发光粒子浓度已知的溶液（对照溶液）按照上述说明来进行光强度测量、发光粒子的检测以及发光粒子的计数，然后，根据检测出的发光粒子的数量和对照溶液中发光粒子的浓度，可以确定光检测区域通过的总区域的体积、即检测出的发光粒子的数量与发光粒子的浓度之间的关系。优选地，对照溶液的发光粒子可以是波长特征与被观测粒子相同的发光标记（荧光染料等）。具体地，例如，假设在发光粒子浓度为C的对照溶液中检测出的发光粒子的数量为N，那么光检测区域通过的总区域的体积Vt由下式给出： 

Vt=N/C    ---（9） 

可替代地，制备发光粒子浓度不同的多种溶液作为对照溶液，并且对各溶液进行测量，然后，将计算出的Vt的平均值确定为光检测区域通过的总区域的体积Vt。因此，当给定Vt时，发光粒子的计数结果为n的样品溶液的发光粒子的数密度c由下式给出： 

c=n/Vt    ---（10） 

在这方面，光检测区域的体积和光检测区域通过的总区域的体积可以通过任意方法给出，例如代替上述方法而使用FCS和FIDA。此外，在本实施方式的光学分析装置中，对于假设的光检测区域的移动图形，可以将与各种标准发光粒子的浓度C与发光粒子数N之间的关系（表达式（9））有关的信息预先存储在计算机18的存储装置中，使得装置的使用者在进行光学分析时能够适当地使用与该关系有关的存储信息。 

因此，根据不包括FCS、FIDA等中进行的诸如荧光强度波动的计算等统计处理的上述本发明的光学分析技术，通过使微小区域、即光检测区域的位置在样品溶液中移动，也就是扫描 样品溶液的内部，并且对横穿光检测区域的发光粒子单个地进行检测或者对发光粒子进行计数，能够对被观测粒子的浓度或数密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的样品溶液中的被观测粒子的状态和特性进行检测。 

在这方面，由于本发明的光学分析技术基本上使用与FCS、FIDA等相同的光学系统，所以可以与FCS、FIDA等一起进行。例如，在检测包含两种以上的物质的溶液中的这些物质之间的相互作用等的情况下，当物质之间的浓度差异大时，例如当一种物质的浓度是nM数量级而另一物质的浓度是pM数量级时，能够以如下方式进行测量和分析：对于高浓度的物质采用FCS或FIDA来进行测量和分析，而对于低浓度的物质采用本发明的光学分析技术来进行测量和分析。在这样的情况下，如图1的（A）所示，准备两个以上的光电检测器是有利的。 

为了验证上述本发明的有效性，进行下述实验。在这方面，应当理解的是，以下实施例仅说明本发明的有效性，并非试图限定本发明的范围。 

实施例1 

使用荧光染料ATTO633（西格玛奥德里奇（Sigma Aldrich）公司Cat.No.18620）作为发光粒子来检验能够利用本发明测量的样品溶液中的发光粒子的浓度范围。对于样品溶液，制备ATTO633的浓度分别为0fM（不含染料）、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM和1nM的包含ATTO633的磷酸盐缓冲液（包含0.05%的吐温20）。 

在根据本发明的光学分析技术的测量中，使用配备有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF-20（奥林巴斯公司）作为光学分析装置，并且根据上述“（1）样品溶液的光强度的测量”中说明的方式来获取上述各样品溶液的时间序列光强度数据。对于物镜，使用浸水式物镜（40×，NA=1.15，WD=0.26）。为此，光电检测器16使用能够检测单个光子的到达的超高灵敏度光电检测器，因此光检测是以对在每个预定的单位时间（BIN TIME）内到达光电检测器的光子数进行测量的方式在预定时间内顺次地对光子进行计数。因此，时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。此外，激发光使用633nm的激光，并且利用带通滤波器将检测到的光波长设定为从660nm到710nm。进行3次每次2秒的测量，其中光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度设定为15mm/s并且BINTIME设定为10μ秒。 

图5的（A）示出通过2秒的测量获得的全部时间序列光子数数据的示例，图5的（B）示出2秒测量的时间序列光子数数据的一部分的放大图。在光强度的上述测量之后，对于获取的各样品溶液的时间序列光子数数据中的发光粒子的光信号的检测，如图5的（B）所示将时间序列光子数数据的整个区域分为宽度为200μ秒的时间区间，在各时间区间内，计算光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差值（SD值）、光子数的方差值、光子数的熵值、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数，作为表示是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值。结果，例如，如图5的（B）所示，在能够在视觉上判定为存在发光粒子的光信号的时间区间（窗口#30、窗口#32）内，示出的特征值大于判定为不存在发光粒子的光信号的时间区间（窗口#31）内的特征值。 

因此，在对时间序列光子数数据的整个区域内的每个时间区间计算光强度的特征值之后，假设一个发光粒子的光信号存在于各特征值均超过相应阈值的时间区间内，对于各特征值而言，对超过预定阈值的特征值所在的时间区间的数量进行计数。图6示出对于各上述溶液、各个特征值超过相应的预定阈值的时间区间的数量。各特征值的阈值设定如下： 

光子数的总值        100个 

光子数的中心值      4.5个 

光子数的标准偏差值  3.5个 

光子数的方差值      12.5个 

光子数的熵值        105 

光子数的最大值      13个 

粒子数（根据自相关函数值计算）0.4个 

在这方面，作为对比，也描述了时间序列光子数数据中光子数超过2的连续时间域的数量（二值化域数）。 

参照图6，示出的各特征值随样品溶液中发光粒子浓度的增大而增大。然而，对于根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数，在发光粒子浓度小于1pM时看不出显著的变化。另一方面，对于二值化域数，对于用于测量的样品溶液未获得显著的浓度依赖性。因此，上述结果启示，根据本发明，单个地检测来自发光粒子的光并且参照光强度的特征值来确定发光粒子的浓度，其中，所述特征值表示是否存在来自单个发光粒子的光并且在通过测量光获得的时间序列光强度数据中对于每个预定宽度的时间区间计算得出。 

此外，在上述时间序列光子数数据中，检验在计算特征值时的时间区间的宽度对发光粒子的检测数量的影响。图7示出改变计算特征值（光子数的总值）时的时间区间宽度时、在发光粒子浓度为10pM的样品溶液的时间序列光子数数据中的发光粒子的检测数量（特征值超过预定阈值的时间区间的数量）。参照该图，在时间区间宽度为100μ秒至200μ秒的情况下，发光粒 子的检测数量稳定。另一方面，当时间区间宽度小于100μ秒时，发光粒子的检测数量明显增大。由于在该实验性示例的测量条件下，单个发光粒子直线地通过光检测区域所需时间计算为约74μ秒，这被认为是通过使时间区间宽度比单个发光粒子线性通过光检测区域所需时间长，遍及两个以上的时间区间检测到一个发光粒子的次数减小。此外，在上述结果中，当时间区间宽度超过200μ秒时，粒子的检测数量明显减少。这被认为是由于使时间区间宽度变长，增大了存在两个以上的发光粒子的光信号的时间区间的数量。实际上，在上述溶液条件和装置条件下，使用表达式（2d）在容许的误差约为5%的情况下计算的时间区间的预定宽度的上限ωhigh约为200μ秒（光检测区域的半径Wo被设定为~1μm）。这些结果启示，通过将时间区间的宽度设定为实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到该发光粒子离开光检测区域时的间隔所需的时间宽度长、并且实质上比从一个发光粒子进入光检测区域时到另一个发光粒子进入光检测区域时的时间宽度短，使得一个发光粒子对应于一个时间区间。 

因此表明，根据本发明的光学分析技术，在比使用荧光强度的传统方法能够测量的数密度或浓度的极限低的浓度范围，能够确定发光粒子的数密度或浓度。此外，诸如FCS、FIDA和PCH等、包含例如荧光强度波动的计算等统计处理的光学分析技术中的可测量的粒子浓度的下限约为1nM，而本实施例中可测量的粒子浓度的下限为~10fM，因此也表明，根据本发明，可以对浓度范围显著低于诸如FCS、FIDA和PCH等光学分析技术的情况的粒子进行测量。 

Claims (14)

1.一种光学分析装置，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述光学分析装置包括：

光检测区域移动部，其使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；

光检测部，其对来自所述光检测区域的光进行检测；和

信号处理部，其生成在所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的过程中利用所述光检测部检测到的来自所述光检测区域的光的时间序列光强度数据，并且在所述时间序列光强度数据中单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号；

其中，所述信号处理部计算表示在所述时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光的光强度的特征值，并且使用所述特征值单个地检测来自每个所述发光粒子的光信号，

所述预定宽度被设定为实质上比从一个发光粒子进入所述光检测区域时到所述一个发光粒子离开所述光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入所述光检测区域时到另一个发光粒子进入所述光检测区域时的时间宽度短。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述信号处理部通过对具有来自所述发光粒子的光信号的所述预定宽度的时间区间的数量计数，来对在所述光检测区域的位置移动的过程中检测到的所述发光粒子的数量计数。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述光检测部通过光子计数来检测来自所述光检测区域的光，并且所述时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。

4.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述光检测区域移动部使所述光检测区域的位置以比所述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。

5.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，存在来自所述单个发光粒子的光的所述预定宽度的时间区间内的所述光强度的特征值大于不存在来自所述单个发光粒子的光的所述预定宽度的时间区间内的所述光强度的特征值，并且当所述光强度的特征值大于预定阈值时，判定为所述预定宽度的时间区间内存在来自所述发光粒子的光信号。

6.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述光强度的特征值是选自以下组的值：所述组由所述预定宽度的时间区间内的光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。

7.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述信号处理部基于所述检测到的发光粒子的数量来确定所述样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

8.一种光学分析方法，其通过使用共聚焦显微镜的或多光子显微镜的光学系统对来自发光粒子的光进行检测，所述发光粒子分散在样品溶液中且在所述样品溶液中随机地移动，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样品溶液中移动；

在使所述光检测区域的位置在所述样品溶液中移动的同时对来自所述光检测区域的光进行检测，并且产生时间序列光强度数据；

计算光强度的特征值，其中，所述特征值表示在所述时间序列光强度数据中的每个预定宽度的时间区间内是否存在来自单个发光粒子的光；和

使用每个所述预定宽度的时间区间内的光强度的特征值，单个地检测来自每个发光粒子的光信号，

所述预定宽度被设定为实质上比从一个发光粒子进入所述光检测区域时到所述一个发光粒子离开所述光检测区域时的间隔所需的时间宽度长，并且实质上比从一个发光粒子进入所述光检测区域时到另一个发光粒子进入所述光检测区域时的时间宽度短。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：通过对具有来自所述发光粒子的光信号的所述预定宽度的时间区间的数量计数，来对在所述光检测区域的位置移动的过程中检测到的所述发光粒子的数量计数。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在检测来自所述光检测区域的光并产生时间序列光强度数据的步骤中，通过光子计数检测来自所述光检测区域的光，并且所述时间序列光强度数据是时间序列光子数数据。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在使所述光检测区域的位置移动的步骤中，使所述光检测区域的位置以比所述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，存在来自所述单个发光粒子的光的所述预定宽度的时间区间内的所述光强度的特征值大于不存在来自所述单个发光粒子的光的所述预定宽度的时间区间内的所述光强度的特征值，并且当所述光强度的特征值大于预定阈值时，判定为所述预定宽度的时间区间内存在来自所述发光粒子的光信号。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述光强度的特征值是选自以下组的值：所述组由所述预定宽度的时间区间内的光子数的总值、光子数的中心值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值和根据光子数的相关时间设定为0的自相关函数值计算的粒子数构成。

14.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：基于所述检测到的发光粒子的数量来确定所述样品溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

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