CN103119421B - 利用单个发光粒子检测的光分析方法 - Google Patents

Abstract

提供如下一种方法：在使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中，避免由于多个发光粒子暂时包含在光检测区域内而发光粒子的检测个数的精度恶化。在本发明的光分析技术中，在一边通过变更共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光路使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边在测量光的强度而生成的光强度数据中，在以选择性地将具有超过阈值的强度的信号检测为表示发光粒子的光的信号的方式个别检测表示发光粒子的光的信号时，设定阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。

Description

利用单个发光粒子检测的光分析方法

技术领域

本发明涉及一种光分析方法，其能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个的发光的粒子的光并进行各种光分析的方法。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是萤光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。

背景技术

由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或萤光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在萤光相关分光分析(Fluorescence CorrelationSpectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的萤光强度，根据由该测量得到的萤光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内萤光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，获取萤光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在萤光强度分布分析(Fluorescence-Intensity DistributionAnalysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的萤光分子等的萤光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算萤光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的萤光信号的时间经过来检测萤光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的萤光微粒子或固定在基板上的萤光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的萤光微粒子的存在。

特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的萤光测量的技术的方法，需要测量的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，期待成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。

专利文献1：日本特开2005-098876

专利文献2：日本特开2008-292371

专利文献3：日本特开2009-281831

专利文献4：专利第4023523号

专利文献5：国际公开2008-080417

专利文献6：日本特开2007-20565

专利文献7：日本特开2008-116440

专利文献8：日本特开平4-337446号公报

非专利文献1：金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、No.9、1431-1438页1999年

非专利文献2：F.J.Meyer-Alms、荧光相关谱(FluorescenceCorrelation Spectroscopy)、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、204-224页

非专利文献3：加藤则子及其它4名、遗传医学、Vol.6、No.2、271-277页

非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其它3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.Gall PNAS96,13756-13761(1999))

发明内容

发明要解决的问题

在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所计量的光是从萤光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的萤光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的萤光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个萤光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个萤光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对萤光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的萤光分子等的浓度或个数密度需要在平衡状态下是在一次的秒级长度的计量时间内能够进行统计性的处理的个数的萤光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的萤光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为1fL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的萤光分子等的浓度典型的是1nM左右或其以上，在大幅低于1nM时，在共焦区组织内不存在萤光分子等的时间产生而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6～8所记载的萤光分子等的检测方法中，不包括萤光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的萤光分子等小于1nM也能够检测萤光分子等，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的萤光分子等的浓度或个数密度之类的情况。

因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，即能够定量地观测比利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术对作为观测对象的发光粒子的浓度或个数密度进行处理的水平低的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在该新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动，即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或个数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，需要测量的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或个数密度的发光粒子的存在，定量地检测其浓度、个数密度或其它特性。

但是，在上述的扫描分子计数法中，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行计量而得到的光强度值(或光子计数值)的时序的数据中，在观测到相当于来自发光粒子的光的光强度增大、即某个阈值以上的光的强度(典型的是吊钟状的曲线地)增大时，判定为在光检测区域内包含一个发光粒子，由此进行一个发光粒子的存在的检测。但是，在该结构中，在由于样本溶液中的发光粒子的浓度比较高而在光检测区域内暂时包含两个以上的发光粒子从而产生同时观测这些发光粒子的光的时间的情况下，即在光强度数据上表示来自多个发光粒子的光的信号一部分在时间上重叠的情况下，难以分别对各个发光粒子区别地进行检测，有可能无法准确地获取发光粒子的个数、或浓度、或个数密度等信息。实际上，如后面所记载的实施例所示那样，发现了在样本溶液中的发光粒子的浓度高时(约1nM以上)，发光粒子的检测个数低于根据样本溶液中的发光粒子的浓度所预期的个数，发光粒子的检测个数的精度恶化。通过在显微镜的光学系统中变更激励光的聚光状态或针孔的直径而缩小光检测区域，使得暂时包含在光检测区域内的发光粒子的个数实质上始终为一个以下，由此能够解决由该光检测区域中暂时包含两个以上发光粒子的状态发生所引起的问题，但实际上，难以进行用于缩小光检测区域的光学系统的变更和调整，另外装置的结构有可能变得复杂。

但是，关于该点，本发明的发明人发现：在光强度数据中提高用于判别与发光粒子对应的光强度增大的阈值时，能够减小“表观的光检测区域”，能够得到与实际减小光检测区域的大小大致同等的作用效果。

一般，在实施扫描分子计数法的光分析装置中，从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度因发光粒子在光检测区域中的位置而不同，典型的是在发光粒子的位置位于光检测区域的大致中心区域时，光强度最大(以下将光检测区域内的发光粒子的光强度最大的位置称为“最大强度点”)，随着发光粒子的位置趋于接近光检测区域的周缘，光强度逐渐降低。即，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布具有强度从最大强度点向周缘降低的大致吊钟状的曲线，光检测区域移动过程中的发光粒子的通过路径越是接近光检测区域的最大强度点，则对应的光的信号的强度越高。因而，与某个阈值以上的强度的光的信号对应的发光粒子的通过路径位于包含光检测区域内的最大强度点的比光检测区域狭小的区域内，通过该比光检测区域狭小的区域以外的发光粒子的光的强度低于上述阈值。而且，越是增大在光强度数据上用于判别表示与发光粒子对应的光的信号的阈值，则与所选择的信号对应的发光粒子的通过位置越是限定在更狭小的区域内。换言之，通过增大或变更用于判别发光粒子的信号的阈值，能够进行“表观的光检测区域(即检测发光粒子的区域、或产生被检测为发光粒子的信号的信号的发光粒子通过的区域)”的缩小或调节(参照下述(注))。根据本发明人发现的见解，只要对测量数据的分析处理的校正，即使在样本溶液中的发光粒子的浓度高时，也能够划定使暂时包含的发光粒子的个数实质上始终为一个以下的区域，能够个别检测通过该区域内的单个发光粒子，能够高精度地获取发光粒子的个数、浓度、个数密度等信息。

(注)能够认为发光粒子在样本溶液中三维地均等分散，因此在移动中的光检测区域内包含两个以上的发光粒子时，发光粒子的信号的峰值点(信号强度的极大点)重叠的情况非常稀少，在大多数情况下，各个信号的峰值点相互错开，因此，重叠的信号的最大值并不比一个发光粒子的信号的峰值强度大。另外，通过表观的光检测区域以外的发光粒子越是远离表观的光检测区域，则其个数越多，但光的强度比通过表观的光检测区域内的发光粒子低。因而，能够认为即使通过与某个阈值对应的表观的光检测区域外的两个以上的发光粒子的光重叠，该光的信号的强度的最大值在大多数情况下低于阈值，不被检测为发光粒子的信号，检测为发光粒子的信号的信号在大多数情况下是通过了表观的光检测区域中的发光粒子的信号。

这样，本发明的一个课题是提供一种新的方法，其用于利用上述的见解避免在扫描分子计数法中由于在光检测区域内暂时包含多个发光粒子导致发光粒子的检测个数的精度恶化。

另外，本发明的另一个课题是利用上述的见解，在扫描分子计数法中，在样本溶液中的发光粒子的浓度高的情况下，避免发光粒子的检测个数的精度恶化，扩大能够良好地计量发光粒子的检测个数的发光粒子的浓度范围。

用于解决问题的方案

根据本发明，通过以下的方法达成上述的课题，该方法是一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，其特征在于，包括如下步骤：通过变更显微镜的光学系统的光路使光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边测量来自光检测区域的光的强度，来生成光强度数据；在光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号，其中，在个别检测表示发光粒子的光的信号的步骤中，选择性地检测具有超过阈值的强度的信号作为表示发光粒子的光的信号，设定上述阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。在该结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，就可以是任意的粒子。该发光粒子典型的是萤光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光)。另外，在本说明书中，在“信号”这样的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。

从上述可知，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，即一边通过光检测区域扫描样本溶液内，一边依次进行光的检测。这样，在移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时，检测来自发光粒子的光，由此，期待检测出一个发光粒子的存在。因此，在依次检测出的光中个别检测来自发光粒子的光的信号，由此依次个别检测每一个粒子的存在，获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。这时，在本发明中，基于以上所述的见解，即发光粒子的信号的强度因该发光粒子通过光检测区域的通过位置而不同这样的见解，设定阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。根据该结构，通过任意地变更阈值的设定，能够调整“表观的光检测区域”的大小，能够选择性地检测通过光检测区域内的任意特定区域的发光粒子的存在。另外，如已经说明的那样，典型的是，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布是从发光粒子释放而被检测出的光的强度从光检测区域内的最大强度点向光检测区域的周缘降低的分布，即发光粒子的位置从最大强度点越是接近光检测区域的周缘则光强度越是降低的分布(特别在发光粒子是被照射激励光而释放光的粒子、根据激励光的会聚区域划定光检测区域的情况下，从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布与光检测区域内的激励光的强度分布一致)。因而，越是增大阈值，则能够将“表观的光检测区域”锁定成(包含最大强度点的)越狭小的区域。

另外，优选的是在扫描分子计数法中，典型的是通过个别检测单个发光粒子的信号来得到发光粒子的个数、浓度等信息，因此，上述本发明的结构中，优选设定阈值使得暂时包含在比光检测区域狭小的区域(表观的光检测区域)中的发光粒子的个数实质上为一个以下。关于该点，例如可以基于理论上依设计估计出的光检测区域的大小确定阈值，使得暂时包含在表观的光检测区域中的发光粒子的个数为一个以下，但通常难以高精度地确定光检测区域的大小的理论值，因此可以通过多次反复进行试行实验，来确定给出暂时包含的发光粒子的个数为一个以下的表观的光检测区域的阈值。此外，从后文所示的实施例可知，即使不将阈值设定成使暂时包含在表观的光检测区域中的发光粒子的个数为一个以下，也能够获取发光粒子的个数、浓度等信息。在本发明中，重要的是应该理解到能够通过适当地设定阈值来适当地设定表观的光检测区域的大小这一点。

在上述的本发明的实施方式之一中，可以对选择性地检测出的信号的个数进行计数，来对包含在比光检测区域狭小的区域(表观的光检测区域)中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在该情况下，能够通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量相组合，得到与样本溶液中的鉴定出的发光粒子的个数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的个数密度或浓度的比、或者相对于作为浓度或个数密度的基准的标准样本溶液的相对的个数密度或浓度的比，或者使用相对于作为浓度或个数密度的基准的标准样本溶液的相对的个数密度或浓度的比确定绝对的个数密度值或浓度值。或者，只要通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等确定出光检测区域的位置的移动轨迹的全部体积和/或表观的光检测区域的全部体积，就能够具体地估算出发光粒子的个数密度或浓度。

另外，作为本发明的另一个方式，也能够基于从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，根据通过粒子的计数确定出的发光粒子的个数，计算在设定了与进行该粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数。如后文的具体实施方式部分所记载的那样，能够根据通过粒子的计数确定出的发光粒子的个数近似地确定从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布。而且，当确定了从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布时，能够预测与任意的阈值对应的表观的光检测区域的大小。能够认为通过表观的光检测区域内的发光粒子的个数与该表观的光检测区域的大小成比例，因此根据与进行粒子的计数时的阈值对应的表观的光检测区域的大小和与其它阈值对应的表观的光检测区域的大小之比，计算出在设定了其它阈值时应该检测出的发光粒子的个数。当得到了在设定了与进行该粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数时，容易比较使用互不相同的阈值检测出的粒子的个数，在得到与发光粒子的个数密度或浓度等有关的信息时有利。此外，可以使用在设定了与进行粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数，确定发光粒子的个数密度或浓度。

进一步地，作为本发明的再一个方式，也可以在设定阈值使得暂时包含在比光检测区域狭小的区域中的发光粒子的个数实质上为一个以下的情况下，检测选择性地检测出的表示来自发光粒子的光的信号的个数为规定个数的阈值，根据检测出的阈值的大小确定发光粒子的个数密度或浓度。如后文的具体实施方式部分所记载的那样，根据选择性地检测出的信号个数和表观的光检测区域的大小而给出发光粒子的个数密度或浓度，其中，信号个数和表观的光检测区域的大小都是阈值的函数(阈值越高，则信号个数和表观的光检测区域的大小均越降低)，能够通过从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数来表示表观的光检测区域的大小。因而，能够通过阈值、从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数以及选择性地检测出的信号个数，来表示发光粒子的个数密度或浓度，只要检测出给出某个选择性地检测出的信号个数的阈值，就能够确定发光粒子的个数密度或浓度。实际上，根据后文记载的实验例，可知能够根据给出某个选择性地检测出的信号个数的阈值来确定发光粒子的个数密度或浓度。该方式能够在扫描分子计数法中有利于检测任意的样本溶液中的发光粒子的个数密度或浓度地进行使用。

关于上述的本发明的结构中的使光检测区域的位置移动的步骤，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的个数密度或浓度，适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。从发光粒子检测出的光的形态能够根据其特性或样本溶液中的个数密度或浓度而变化。特别当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子所能得到的光量降低，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度，使得能够高精度或高灵敏度地计量来自一个发光粒子的光。

进一步地，关于上述的使光检测区域的位置移动的步骤，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的方法中，光检测区域检测从一个发光粒子发出的光，来个别检测发光粒子。但是，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测(表示其存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子与一个信号相对应。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性(特别是扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。

可以以任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜变更光路，来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动，由此光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体力学的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到力学作用的影响，能够在(没有伪像的状态且)稳定的状态下进行光的计量(例如在使样本发生流动的情况下，难以始终赋以一样的流速，并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加，并且由于流动所造成的流体力学的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能变质或变性)。另外，不需要构成为使样本溶液流通，因此能够与FCS、FIDA等的情况同样地在微量(1μL～几十μL左右)的样本溶液中进行计量和分析。

应该理解为：本发明的方法典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态，但也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，这样的情况也属于本发明的范围。

发明效果

总之，在本发明的方法中，在扫描分子计数法中，发光粒子的信号的强度因该发光粒子在光检测区域内的通过位置而不同，因此着眼于能够通过变更用于判别发光粒子的信号的阈值的设定来调整“表观的光检测区域”的大小这一点，尝试通过适当地设定阈值，由此划定“表观的光检测区域”(光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域)，选择性地检测表示来自包含在该“表观的光检测区域”中的发光粒子的光的信号。根据本发明的结构，在发光粒子的信号检测中所参照的区域(表观的光检测区域)与实际的光检测区域相比相对狭小，因此包含在该区域内的发光粒子的个数为两个以上的可能性比实际的光检测区域内的发光粒子的个数为两个以上的可能性低，因此能够更准确地计量单个发光粒子的个数，获取与发光粒子的浓度或个数密度等有关的信息。因而，即使在样本溶液中的发光粒子的浓度比较高、从而实际的光检测区域内的发光粒子的个数为两个以上的可能性变高的情况下，也能够通过适当地设定阈值来实现在发光粒子的信号检测中所参照的区域内暂时包含的发光粒子的个数为一个以下的状态，因此，能够个别检测单个发光粒子，对其个数进行计数，或者获取与浓度或个数密度等有关的信息。换言之，根据本发明，能够使可高精度地应用扫描分子计数法的发光粒子的浓度范围或个数密度范围扩大到高浓度或高密度侧。这样，根据本发明的方法，期待扩大能够利用扫描分子计数法的样本溶液的范围，扩大分子间相互作用的观测和分析等扫描分子计数法的应用范围。

通过以下的本发明的优选实施方式的说明，能够了解本发明的其它目的和优点。

附图说明

图1的(A)是执行本发明的方法的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。

图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的方法的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所计量的光强度的时间变化的示意图。

图3是说明依照本发明的方法通过适当地设定用于判别发光粒子的信号的阈值来设定表观的光检测区域的原理的图。(A)是从显微镜的光的行进方向观察到的光检测区域的截面的示意图，示意性地示出在光检测区域CV内暂时包含两个以上的发光粒子的状态。(B)是在(A)的情况下计量的时序的光强度数据的例子的示意图。(C)是说明从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布、阈值以及表观的光检测区域之间的关系的图。左上是从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，右下是光检测区域CV、表观的光检测区域qCV1、qCV2的示意立体图，左下是从光检测区域的移动方向观察到的光检测区域CV、表观的光检测区域qCV1、qCV2的示意截面图。

图4是以流程图的形式表示依照本发明的方法执行的扫描分子计数法的处理步骤的图。

图5的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时、和在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动的方式的模型图。图5的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所计量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。

图6示出所计量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。

图7是通过依照本发明的方法执行的扫描分子计数法(实施例1)针对包含各种浓度的发光粒子的样本溶液计量出的被检测为发光粒子的信号的脉冲数的图表。(A)、(B)分别是针对发光粒子的浓度绘制在检测发光粒子的信号时设定为阈值=0.5(pc/10μs)(在10μs期间检测出的光子个数)以及阈值=2.0(pc/10μs)的情况下的脉冲数所得到的图，(C)是针对发光粒子的浓度绘制各种阈值下的脉冲数所得到的图(横轴和纵轴是对数)。

图8的(A)是根据阈值与发光粒子的信号数之间的关系得到的从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，图8的(B)是针对发光粒子的浓度绘制根据图8的(A)的光的强度分布将设定高的阈值所得到的发光粒子的脉冲数换算为设定低的阈值时应该得到的脉冲数的情况下的脉冲数所得到的图。

图9是针对发光粒子的浓度绘制脉冲数为20时的阈值所得到的图。图中，黑点是阈值，实线是针对阈值的拟合曲线。

图10是在现有的计算萤光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的计量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。

附图标记说明

1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤；4：准直透镜；5、14a：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜；13：针孔；14：屏蔽滤波器；15：多模光纤；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。

具体实施方式

以下，详细说明本发明的优选实施方式。

光分析装置的结构

本发明的方法能够通过如下的光分析装置来实现：在基本结构中，如图1的(A)示意性地示例那样，由能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器组合而成。参照图1的(A)，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在该样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子，典型的是附加有萤光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间激励发光粒子而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，遮断来自焦点面以外的光。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是将光强度为1/e²的面作为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光经过分色镜14a，透过屏蔽滤波器14(在此只选择特定波长频带的光成分)，被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16，在被转换成时序的电信号后，输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个萤光色素分子的微弱光。

另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为该用于使光检测区域的位置移动的机构，例如如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。该反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所希望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以使得在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体力学作用，能够排除力学作用对观测对象物的影响，实现稳定的计量。

此外，作为追加的结构，也可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置17a，以变更所观察的皿10。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。

在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在该情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子通过化学发光、生物发光现象而与激励光无关地发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。进一步地，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以使得能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含波长不同的多种发光粒子的情况下，可以使得能够根据波长分别检测来自这些发光粒子的光。

本发明的方法的原理

如发明内容所记载的那样，本发明的方法如果清楚地进行描述，则如上所述，在共焦显微镜(或多光子显微镜)进行光检测时，发光粒子的信号的强度因该发光粒子在光检测区域内的位置而不同，基于通过设定用于判别发光粒子的信号的阈值来使“表观的光检测区域”的大小变化这样的原理，在扫描分子计数法中，通过适当地设定阈值来调整“表观的光检测区域”的大小。而且，优选的是，设定用于判别发光粒子的信号的阈值，使得暂时包含在“表观的光检测区域”内的发光粒子的个数为一个以下，即使得被检测为发光粒子信号的信号各自与单个发光粒子对应，或者使得可靠地个别检测单个发光粒子，在该状态下对通过光检测区域扫描样本溶液内的期间的发光粒子的个数进行计数，试着以更高精度获取发光粒子的浓度或个数密度等信息。以下，说明扫描分子计数法和本发明的方法的原理。

1.扫描分子计数法的原理

FCS、FIDA等分光分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。但是，在FCS、FIDA等分光分析技术中，在原理上，根据萤光强度的波动来计算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图10的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或个数密度在计量萤光强度的过程中始终是在光检测区域CV内存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。在发光粒子的浓度或个数密度更低的情况下，例如如图10的(B)所描绘的那样，在发光粒子只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所示例的那样，只在计量时间的一部分内出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精度地计算出光强度的波动。另外，在与计量中始终是在光检测区域内存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而计量时间变长。

因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的“扫描分子计数法”：即使在发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等分光分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的个数密度或浓度等特性。

作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如在图2中示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动，即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在时序的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，检测其间出现的每一个如图2的(B)所示例的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，对其个数进行计数，由此能够获取与存在于所计量的区域内的发光粒子的个数、浓度或个数密度有关的信息。在该扫描分子计数法的原理中，不进行如萤光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是检测每一个发光粒子，因此即使在应该观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或个数密度有关的信息。

2．本发明的“表观的光检测区域”的大小的调节的原理

在上述的扫描分子计数法中，在样本溶液中的发光粒子的个数密度高的情况下，在光检测区域内暂时包含两个以上的发光粒子的可能性变高。例如，如图3的(A)示意性地描绘的那样，在光检测区域CV的移动过程中发光粒子α溜出光检测区域之前，发光粒子β进入光检测区域内时，如图3的(B)的右方所示那样，在时序光强度数据上，发光粒子α的信号与发光粒子β的信号一部分相互重叠。在该情况下，发光粒子α、β的信号的曲线如在图中用虚线所示的那样，成为难以分别检测这两个发光粒子的信号的形状，有时将该相互重叠的两个以上的发光粒子的信号检测为一个发光粒子的信号。实际上，可知在样本溶液中的发光粒子的个数密度高的情况下，典型的是在高到约1nM程度时，通过扫描分子计数法检测为发光粒子的光的信号个数大幅地少于根据实际的浓度所预期的个数，能够认为该信号个数的降低是由于将相互重叠的两个以上的发光粒子的信号作为一个发光粒子的信号来进行计数。作为排除如上所述的相互重叠的两个以上的发光粒子的信号而个别检测各单个发光粒子来生成时序光强度数据的一个方法，能够考虑如在图3的(A)中用虚线所描绘的那样，缩小光检测区域，实现在光检测区域内暂时包含的发光粒子个数实质上始终为一个以下的状态。但是，光检测区域的缩小存在原理上的局限(无法将区域的大小缩小到光的波长以下)，另外装置的结构变得复杂，因此实际上缩小光检测区域是极其困难的。

但是，根据本发明，只要对根据时序光强度数据检测发光粒子的光的信号时的信号处理进行校正，就能够如在图3的(A)中用虚线描绘的那样，选择性地检测通过光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域的发光粒子的光的信号，将相互重叠的两个以上的发光粒子的信号检测为一个发光粒子的信号的可能性大幅降低。

在光检测区域中，从通过光检测区域的发光粒子释放并到达光检测器的光的强度因发光粒子在光检测区域中的位置而不同，例如，在发光粒子是被照射照明光而发光的粒子的情况下，照明光在光检测区域内的光的强度典型的是在光检测区域(聚光区域)的大致中心处最大，从该最大强度点向大致放射方向降低。因而，发光粒子的光强度在发光粒子横穿光检测区域的大致中心时为最大，随着发光粒子的位置趋于接近光检测区域的周缘，光强度逐渐降低。即，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布如图3的(C)的左上所示例的那样，呈吊钟状的分布，例如如图3的(A)所描绘的那样，通过在图中用虚线描绘的区域的发光粒子γ的光强度比通过用虚线描绘的区域以外的发光粒子α、β的光强度高(参照图3的(B))。这样，在清楚地描述时，如果参照发光粒子的信号的强度，则能够大致确定发光粒子在光检测区域内的通过范围。而且，在根据时序光强度数据检测发光粒子的信号时，设定阈值，如果只将具有超过该阈值的强度的信号检测为有意义的信号，则能够只“挑出”与通过了给出该阈值以上的光强度的区域的发光粒子对应的信号。另外，在如图3的(C)的左上那样按照Ith0→Ith1→Ith2的顺序提高阈值的情况下，挑出的发光粒子所通过的区域如图3的(C)的左下和右下的截面图和立体图所描绘的那样，按照CV→qCV1→qQV2的顺序缩小。换言之，在时序光强度数据的信号的分析处理中，通过设定某个阈值(例如Ith1、Ith2)，来划定检测单个发光粒子的区域、即“表观的光检测区域”(例如qCV1、qCV2)，能够选择性地只检测通过该表观的光检测区域内的发光粒子的信号。

此外，如上所述，在根据信号的强度的高低来选择发光粒子的信号的情况下，在两个以上的发光粒子同时进入到光检测区域且这些发光粒子的信号的峰值(最大值)的时间几乎没有错开时，无论这些发光粒子是否正在通过表观的光检测区域，这些发光粒子的信号都可能不相互区别地被检测为一个发光粒子的信号。但是，发光粒子在样本溶液中三维地分散，因此两个发光粒子同时进入光检测区域的情况(限于发光粒子的个数密度相当低)是稀少的，另外，光检测区域内的发光粒子的所检测出的光的强度分布是吊钟状的分布，发光粒子的位置越是接近光检测区域的周缘，则发光粒子的强度越是降低，因此即使假设两个发光粒子大致同时进入光检测区域而它们的信号所重叠的信号的强度的最大值增大，在大多数情况下，能够认为比位于光检测区域的中心附近的单个发光粒子的光的强度低(越是高光强度，则发光粒子个数越少，因此高光强度的发光粒子重叠的概率大幅地少于低光强度的发光粒子重叠的概率)。因而，如上所述，通过适当地设定阈值，来实质上排除被检测为一个发光粒子的信号的相互重叠的两个以上的发光粒子的信号。

在上述的本发明的适当地设定阈值来调节表观的光检测区域的大小的结构中，根据以下的关系式使阈值和表观的光检测区域的大小关联起来。即，如图3的(C)的左上所示例的那样，在能够用高斯函数来近似从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布的情况下，使用光强度分布的最大值Imax(Imax相当于单个发光粒子的最大光强度)、分布的半峰半宽w、强度的背景Ibg以及表观的光检测区域的截面半径(离最大强度点的距离)r，通过下式来表示阈值Ith。

[式1]

$I_{\mathrm{th}}=I_{\max }\exp (-\frac{r^2}{{2\mathrm{\πw}}^2})+I_{\mathrm{bg}}...\left(1\right)$

在通过S=πr²来近似地给出表观的光检测区域的(与移动方向垂直的方向的)截面积S时(更严谨地说，光检测区域的截面是椭圆，但为了简化运算，用圆来近似。以下相同)，通过下式给出表观的光检测区域的截面积S与阈值Ith之间的关系。

[式2]

$S={2w}^2\ln \left(\frac{I_{\max }}{I_{\mathrm{th}}-I_{\mathrm{bg}}}\right)...\left(2\right)$

另外，在能够用洛仑兹函数来近似从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布的情况下，通过下式表示阈值Ith。

[式3]

$I_{\mathrm{th}}={\mathrm{wI}}_{\max }\left(\frac{w}{r^2+w^2}\right)+I_{\mathrm{bg}}...\left(3\right)$

因此，通过下式给出表观的光检测区域的截面积S与阈值Ith之间的关系。

[式4]

$S=\frac{{\mathrm{\πw}}^2{I}_{\max }}{I_{\mathrm{th}}-I_{\mathrm{bg}}}-{\mathrm{\πw}}^2...\left(4\right)$

但是，在样本溶液内以扫描速度(移动速度)u移动光检测区域时，暂时包含在具有体积V的表观的光检测区域内的发光粒子个数始终是一个的情况下，在测量时间t检测出的发光粒子个数Pmax由下式给出。

Pmax=Sut/V   (5)

即，在测量时间t的光测量中，在发光粒子个数超过Pmax时，暂时包含在具有体积V的表观的光检测区域内的发光粒子个数有可能为两个以上。换言之，在本发明中，以使所检测的发光粒子个数Pth满足以下的条件的方式设定阈值，使得暂时包含在表观的光检测区域内的发光粒子个数实质上始终为一个以下。

Pth≤Pmax   (6)

因而，在能够用高斯函数来近似从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布的情况下，根据式(5)和式(2)，如果设定阈值使得下式成立，

[式5]

$\mathrm{Pth}\≤{2w}^2\ln \left(\frac{I_{\max }}{I_{\mathrm{th}}-I_{\mathrm{bg}}}\right)\·\frac{\mathrm{ut}}{V}...\left(7\right)$

则实现了暂时包含在表观的光检测区域内的发光粒子个数实质上始终为一个以下的状态。另外，在能够用洛仑兹函数来近似从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布的情况下，根据式(5)和式(4)，如果设定阈值使得下式成立，

[式6]

$\mathrm{Pth}\≤(\frac{{\mathrm{\πw}}^2{I}_{\max }}{I_{\mathrm{th}}-I_{\mathrm{bg}}}-{\mathrm{\πw}}^2)\·\frac{\mathrm{ut}}{V}...\left(8\right)$

则实现了暂时包含在表观的光检测区域内的发光粒子个数实质上始终为一个以下的状态。

关于上述的式(7)或式(8)的条件，应该注意的是样本溶液中的发光粒子的浓度越高，则满足式(7)或式(8)的条件的阈值Ith越高，另一方面，发光粒子的浓度越低，则检测出的发光粒子个数Pth越是降低。因而，为了在暂时包含在表观的光检测区域内的发光粒子个数实质上始终为一个以下的状态下以良好的精度得到(足够各种分析的)发光粒子个数，优选的是根据作为观测对象的样本溶液中的发光粒子的浓度选择适当的阈值。

扫描分子计数法的处理操作过程

在使用图1的(A)示例的光分析装置1的依照本发明的方法的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的过程，(1)包含发光粒子的样本溶液的调制过程，(2)样本溶液的光强度的测量处理过程，以及(3)测量出的光强度的分析处理过程。图4示出用流程图的形式表示的本实施方式中的处理过程。

(1)调制样本溶液

在本发明的方法中作为观测对象的粒子只要是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，就可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型的是水溶液，但并不限于此，也可以是有机溶剂之类的其它任意的液体)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自发光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了发光标识(萤光分子、磷光分子、化学/生物发光分子)的粒子。

(2)测量样本溶液的光强度

在本实施方式的扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量处理过程中，一边驱动反射镜偏转器17进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)，一边进行光强度的测量(图4的步骤100)。在操作处理中，典型的是在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(为了使光检测区域的位置在样本溶液内移动而变更光路的步骤以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的步骤)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射和光强度的计量。在开始计量时，首先在计算机18依照程序进行的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)，在皿10内执行光检测区域的位置的移动，与此同时，光检测器16将依次检测出的光转换为电信号并发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据所发送的信号生成时序的光强度数据并保存。典型的是光检测器16是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此，光的检测是以在规定时间内每隔规定的单位时间(BIN TIME)、例如每隔10μs依次计量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，时序的光强度的数据可以是时序的光子计数数据。

光强度的计量中的光检测区域的位置的移动速度可以是任意地、例如实验性地或以符合分析的目的的方式设定的规定速度。在根据检测出的发光粒子的个数获取与其个数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域所通过的区域的大小或体积，因此优选的是以掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，计量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离存在比例关系则容易解释测量结果，因此优选的是移动速度基本上是固定速度，但并不限于此。

但是，关于光检测区域的位置的移动速度，为了定量地高精度地执行如下动作，即根据计量出的时序的光强度数据个别检测发光粒子或者对发光粒子的个数进行计数，优选的是将该移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所造成的移动速度快的值。在本实施方式中作为观测对象的发光粒子是分散或溶解在溶液中自由地随机地进行运动的粒子，因此由于布朗运动而位置随着时间移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图5的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机移动，由此，光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是如图5的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域，由此，在时序的光强度数据中，如图5的(C)的上段所示例的那样，与各个粒子对应的光强度的变化的曲线大致相同(在粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的曲线与激励光强度分布大致相同)，将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动所进行的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。

具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δt根据以下的平均平方位移的关系式，

(2Wo)²=6D×Δt……(9)

成为

Δt=(2Wo)²/6D……(10)

因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为

Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo……(11)。

因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照该Vdif设定为比其充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D=2.0×10^-10m²/s左右的情况下，在Wo为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10^-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的曲线为预想的曲线(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来确定适合的光检测区域的位置的移动速度。

(3)分析光强度

在通过上述的处理得到样本溶液中的发光粒子的时序的光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序进行的处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测、发光粒子的计数、浓度计算等各种分析。

(i)检测与发光粒子对应的信号及确定个数密度或浓度

在时序的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图5的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的曲线。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值Io的光强度所持续的时间宽度ΔT处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的曲线的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值Io的光强度所持续的时间宽度ΔT不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即

I=A×exp(-2t²/a²)……(12)

在使式(12)拟合有意义的光强度的曲线(能够明确地判断为不是背景的曲线)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的曲线判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号判定为噪声或异物的信号，可以在其后的分析等中忽略)。

作为根据时序光强度数据进行发光粒子的统一的检测和计数的处理方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图5的(C)、最上段“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图4的步骤110、图5的(C)的中上段(平滑))。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过该平滑处理，能够如上所述忽略数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。

接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图5的(C)的中下段“时间微分”所示例的那样，在信号值的变化时刻的值的变化大，因此通过参照该时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。

然后，在时序光强度数据中，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的时序的时间微分值数据上，依次参照时间微分值来探索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。在确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图5的(C)的下段的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过了光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的曲线的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。此外，在该步骤中，针对脉冲的峰值强度，判断该强度是否超过阈值时，如后面详细说明的那样，在本发明的方法中，为了划定适当的“表观的光检测区域”而设定该阈值。这样，如图6的(A)的左边所示那样，将如下信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，即计算出的吊钟型函数的参数被判定为处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图6的(A)的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。

在时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～150的处理中的脉冲信号的探索和判断(步骤160)。此外，虽然没有图示，但也可以在时序光强度数据的整个区域的脉冲信号的探索中，对检测出的脉冲信号的个数进行计数。另外，根据时序光强度数据个别检测发光粒子的信号的处理并不限于上述步骤，可以通过任意的方法执行。

能够使用与发光粒子对应的信号的个数(计数值)和在获取时序光强度数据的期间光检测区域所通过的区域的总体积，来确定时序光强度数据中的发光粒子的个数密度或浓度。但是，光检测区域的有效体积依据激励光或检测光的波长、镜头的数值孔径、光学系统的调整状态而变动，因此一般难以根据设计值进行计算，因而，计算光检测区域所通过的区域的总体积也并不简单。因此，典型的是，可以在与要检查的样本溶液的测量相同的条件下，针对发光粒子的浓度已知的溶液(参照溶液)进行上述说明了的光强度的测量、粒子的检测和计数，根据检测出的发光粒子的个数和参照溶液的发光粒子的浓度确定光检测区域所通过的区域的总体积、即发光粒子的检测个数与浓度之间的关系。优选的是作为参照溶液的发光粒子，可以是具有与各发光粒子相同的波长特性的发光标识(萤光色素等)。具体地说，例如在发光粒子的浓度(个数密度)C的参照溶液的发光粒子的检测个数是N时，通过下式给出光检测区域所通过的区域的总体积Vt，

Vt=N/C……(13)

另外，可以准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积Vt。而且，在给出Vt时，通过下式给出粒子的计数结果为n的样本溶液的发光粒子的浓度(个数密度)c。

c=n/Vt……(14)

此外，也可以与上述的方法无关地通过任意的方法，例如利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，可以针对所设想的光检测区域的移动图案，预先将与各种标准粒子有关的浓度C与粒子的个数N之间的关系(式(13))的信息存储在计算机18的存储装置中，使得装置的使用者能够在实施光分析时适当地利用所存储的关系的信息。

(ii)设定阈值

在上述的步骤150中，在判断时序光强度数据上的有意义的脉冲信号是否是发光粒子的信号时，判断使吊钟型函数拟合时序光强度数据上的脉冲信号所得到的峰值强度是否超过阈值。在该阈值判断中，在本发明的方法中，并非只是单纯为了分清发光粒子的信号和噪声，而是为了划定“表观的光检测区域”而设定阈值，将通过了该“表观的光检测区域”的发光粒子的信号检测为发光粒子的信号。优选的是对该阈值进行设定，使得包含在表观的光检测区域内的发光粒子个数始终实质上为一个以下，即上述式(7)或式(8)的条件成立。

但是，难以立即确定使上述式(7)或式(8)的条件成立的阈值。因而，典型的是，可以在针对发光粒子的浓度不同的若干个参照溶液进行上述说明了的光强度的测量所得到的光强度数据中，一边对阈值进行各种变更一边执行粒子的检测和计数，探索给出检测为发光粒子的信号的脉冲数与发光粒子的浓度成比例的结果的阈值(在从发光粒子的低浓度区域到高浓度区域脉冲数与发光粒子的浓度成比例时，可解释为各脉冲信号与单个发光粒子对应)，由此预先确定与各种发光粒子的浓度相应的适当的阈值。在设定针对某样本溶液进行扫描分子计数法的检查时的阈值时，根据所设想的发光粒子的浓度选择预先确定的阈值中的适当的阈值。如后述的实施例1所记载的那样，在典型的实验条件下，在设定用于区别发光粒子的信号和噪声的阈值时，在发光粒子的浓度超过100pM时，上述式(7)或式(8)的条件不成立。因而，可以针对发光粒子的浓度为0～100pM采用用于区别发光粒子的信号和噪声的阈值，在发光粒子的浓度为100pM～1nM的情况下选择更高的阈值。

(iii)换算脉冲数

如上所述，在根据发光粒子的浓度选择不同的阈值来对发光粒子个数(脉冲数)进行计数的情况下，难以对使用互不相同的阈值得到的发光粒子个数的结果进行比较。如已经说明的那样，在发光粒子的浓度高时，满足上述式(7)或式(8)的条件的阈值变高，另一方面，发光粒子的浓度越低，则检测出的发光粒子个数越低，因此为了以良好的精度计量发光粒子个数，优选的是根据样本溶液中的发光粒子的浓度选择适当的阈值，而针对某个发光粒子浓度的样本溶液检测出的发光粒子个数根据阈值而变化，因此无法将使用不同的阈值检测出的发光粒子个数直接进行相互比较。例如，如上所述，在典型的测量条件下，对于发光粒子的浓度小于100pM的样本溶液和发光粒子的浓度为1nM左右的样本溶液适当的阈值互不相同，因此优选的是分别使用不同的阈值来对发光粒子个数进行计数。但是，在将与发光粒子的浓度小于100pM的样本溶液有关的发光粒子个数和与发光粒子的浓度为1nM左右的样本溶液有关的发光粒子个数进行比较时，无法直接检测发光粒子个数的差。因此，在本发明的方法的一个方式中，试着根据使用某个阈值得到的发光粒子个数计算在设定了别的阈值的情况下应该检测出的发光粒子个数。

如果详细地说明，则能够认为使用某阈值Ith2得到的脉冲数Pth2和使用别的阈值Ith1应该得到的脉冲数Pth1之比，与设定了阈值Ith2时的与表观的光检测区域的扫描方向垂直的方向的截面积Sth2和设定了阈值Ith1时的与表观的光检测区域的扫描方向垂直的方向的截面积Sth1之比相等，因此通过下式给出使用别的阈值Ith1应该得到的脉冲数Pth1。

Pth1=(Sth1/Sth2)×Pth2……(15)

分别通过式(2)(高斯函数的情况)或式(4)(洛仑兹函数的情况)来给出Sth1、Sth2，因此如果知道光检测区域内的光强度分布的最大值Imax、分布的半峰半宽w、阈值Ith、背景Ibg，则能够使用式(15)将使用阈值Ith2得到的脉冲数Pth2换算为使用别的阈值Ith1应该得到的脉冲数Pth1。

可以通过任意的方法确定光检测区域内的光强度分布的最大值Imax、分布的半峰半宽w以及背景Ibg。作为一个方法，例如，能够根据包含在光检测区域中的发光粒子个数始终为一个以下时的阈值与以该阈值得到的发光粒子个数之间的关系，确定光强度分布的最大值Imax、分布的半峰半宽w以及背景Ibg。具体地说，首先使用与表观的光检测区域的扫描方向垂直的方向的截面积S、扫描速度u以及发光粒子的浓度c，通过下式给出在测量时间t的光强度数据中设定阈值Ith而检测出的发光粒子个数P(Ith)。

P(Ith)=cN_ASut……(16)

在此，N_A是阿伏加德罗数。在通过S=πr²(r是表观的光检测区域的截面半径)给出与表观的光检测区域的扫描方向垂直的方向的截面积S时，根据式(16)得到下式。

[式7]

$r=\sqrt{\frac{P\left(\mathrm{Ith}\right)}{{\mathrm{cN}}_A\mathrm{ut\π}}}...\left(17\right)$

因而，针对某个发光粒子的浓度已知的溶液，如果能够得到阈值Ith和根据该阈值下的发光粒子个数P(Ith)而得到的表观的光检测区域的截面半径r的多个组，则能够使用式(1)或式(3)计算出光强度分布的最大值Imax和分布的半峰半宽w。更具体地说，例如，如后面的实施例2所示那样，在针对发光粒子的浓度已知的溶液得到的光强度数据中，一边变更阈值Ith，一边对各阈值下的发光粒子个数P(Ith)进行计数，根据发光粒子个数P(Ith)计算出表观的光检测区域的截面半径r。然后，使式(1)或式(3)拟合一连串的与表观的光检测区域的截面半径r对应的阈值Ith，由此能够确定光强度分布的最大值Imax和分布的半峰半宽w(也可以与拟合无关地参照光强度数据适当地设定背景)。

这样，如上所述，在能够将使用某阈值得到的发光粒子个数换算为使用别的阈值应该得到的发光粒子个数时，易于将使用互不相同的阈值得到的发光粒子个数的结果进行比较。

(iv)使用给出固定的发光粒子个数的阈值估计发光粒子浓度

根据上述的式(16)，通过下式给出发光粒子浓度c，

c=P(Ith)/(N_ASut)……(18)

表观的光检测区域的截面积S是通过式(2)或式(4)给出的阈值Ith的函数。因而，能够使用P(Ith)、Ith以及光检测区域内的光强度分布的参数Imax、w、Ibg计算发光粒子浓度c。关于该点，通过下式给出某阈值Ith、使用该阈值得到的发光粒子P(Ith)以及浓度c之间的关系，

(能够通过高斯函数近似光强度分布的情况)

[式8]

$I_{\mathrm{th}}=I_{\max }\exp (-\frac{P\left(I_{\mathrm{th}}\right)}{{2\mathrm{\πw}}^2\mathrm{ut}{N}_{A}c})+I_{\mathrm{bg}}...\left(19\right)$

(能够通过洛仑兹函数近似光强度分布的情况)

[式9]

$I_{\mathrm{th}}=\frac{{\mathrm{wI}}_{\max }\mathrm{ut}{N}_{A}c}{P\left(I_{\mathrm{th}}\right)+{\mathrm{\πw}}^2\mathrm{ut}{N}_{A}c}+I_{\mathrm{bg}}...\left(20\right)$

因此，在针对各种发光粒子浓度已知的溶液得到的光强度数据中，在探索到给出某个固定的发光粒子个数Po的阈值Itho后，使式(19)或式(20)对多个发光粒子浓度c和阈值Itho的组进行拟合，从而得到光强度分布的参数Imax、w、Ibg。然后，在根据针对任意的样本溶液测量到的光强度数据确定该样本溶液中的发光粒子的浓度时，在光强度数据中检测给出上述固定的发光粒子个数Po的阈值Itho，根据检测出的Itho和Po确定发光粒子的浓度。根据该方法，将固定的发光粒子个数Po设定为上述式(7)或式(8)在作为观测对象的样本溶液中的发光粒子浓度的整个区域中都成立的值，由此无论样本溶液中的发光粒子浓度如何，都能够一边避免由两个以上的发光粒子暂时包含在表观的光检测区域内造成的发光粒子个数的误差，一边确定发光粒子浓度。

这样，根据上述的本发明的方法，通过在扫描分子计数法中适当地设定根据光强度数据检测发光粒子的信号时的阈值，能够在实质上不存在两个以上的发光粒子的信号重叠的信号的状态下个别检测单个发光粒子，能够更高精度地获取发光粒子的个数、浓度或个数密度的信息。而且，根据本发明，能够特别将能够应用扫描分子计数法的发光粒子的浓度范围扩大到高浓度侧。

为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于示例本发明的有效性，而并不限定本发明的范围。

实施例1

变更用于检测发光粒子信号的阈值

验证了以下的情况，即在根据通过扫描分子计数法的光测量得到的时序光强度数据检测发光粒子的信号的过程中，通过变更用于判别发光粒子的信号的阈值，来调整“表观的光检测区域”。

作为样本溶液，调制在磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中分别包含1pM、10pM、100pM、1nM的萤光色素ATTO633(Sigma-Aldrich,Cat.No.18620)作为发光粒子的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，使用具备共焦点萤光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子萤光测量装置MF-20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)测量样本溶液的光强度”中说明的方式，针对上述各样本溶液获取时序光强度数据(光子计数数据)。这时，激励光使用633nm的激光，使用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光，生成时序光强度数据。光检测区域的位置在样本溶液中的移动速度为30mm/秒，BIN TIME为10μs，对各样本溶液均进行三次的2秒钟测量。在测量光强度后，依照在上述的“(3)(i)检测与发光粒子对应的信号”中记载的处理步骤，对针对各样本溶液获取到的时序光强度数据实施平滑处理，在平滑处理后的数据中，确定了脉冲信号的起点和终点后，通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。

然后，只将满足下述的条件的脉冲信号判定为与发光粒子对应的信号，

20μs<脉冲宽度<400μs

峰值强度>阈值Ith(pc/10μs)……(A)

相关系数>0.95，

另一方面，将不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略。此外，在0.5～3.0(光子/10μs)的范围内如以下说明的那样设定阈值Ith。(此外，光子个数出现小数点以下的表述是因为对光子计数数据进行平滑处理。即通过平滑处理将光子计数值处理为连续的值)。

图7的(A)和图7的(B)分别是针对发光粒子浓度绘制在上述的条件(A)下设为阈值Ith=0.5(pc/10μs)和阈值Ith=2.0(pc/10μs)时的脉冲数(检测为发光粒子的信号的信号个数)所得到的图，图7的(C)示出脉冲数相对于每次将阈值Ith变更0.5直到3.0为止时的浓度的变化(各点是三次测量的平均值)。参照这些图，在任意的情况下脉冲数都随着发光粒子浓度而单调地增加(这表示通过预先使用发光粒子浓度已知的溶液计量脉冲数，能够通过扫描分子计数法确定任意的溶液中的发光粒子浓度)。但是，从图7的(A)或图7的(C)可知，在阈值小的情况下(～1.5)，在浓度超过100pM时，低于根据浓度从1pM到100pM为止的脉冲数外插的直线，无法维持脉冲数相对于浓度的线性。可以认为这是因为发光粒子浓度高，从而将两个以上的发光粒子的重叠信号检测为一个发光粒子的信号。另一方面，从图7的(C)或图7的(B)可知，在增大阈值时(2.0～)，在所观测的整个浓度区域中，脉冲数与发光粒子浓度大致成比例。

在考虑到通过增大阈值来只选择光强度高的信号以及从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布大致为吊钟状(根据各个脉冲信号的形状是大致吊钟状，也能够理解该情况)时，根据上述的结果，能够认为通过增大阈值，检测出的发光粒子的存在区域(即表观的光检测区域)缩小为在光强度分布上强度高的区域，由此检测到两个以上的发光粒子的重叠信号的可能性大幅降低，实质上只将单个发光粒子的信号检测为发光粒子的信号。这样，根据上述的结果，确定了以下的情况，即根据发光粒子浓度适当地设定阈值，由此调整“表观的光检测区域”，划定“表观的光检测区域”使得所包含的发光粒子的个数实质上始终为一个以下，由此个别检测单个发光粒子，能够更高精度地获取发光粒子的个数、浓度或个数密度等信息。

实施例2

确定光检测区域内的发光粒子的光的强度分布

根据表观的光检测区域的(与移动方向垂直的方向的)截面半径r和阈值Ith确定从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数(峰值强度Imax、半峰半宽w、背景Ibg)。使用式(17)根据发光粒子个数P(Ith)计算出表观的光检测区域的(与移动方向垂直的方向的)截面半径r，其中，该发光粒子个数P(Ith)是在针对发光粒子浓度已知的样本溶液得到的光强度数据、即光检测区域内的发光粒子个数实质上始终为一个以下的数据上一边变更阈值Ith一边得到的。具体地说，在针对实施例1的10pM ATTO633的样本溶液得到的光强度数据中，一边变更阈值Ith一边检测发光粒子个数P(Ith)，根据各发光粒子个数P(Ith)利用式(17)计算出表观的光检测区域的截面半径r。图8的(A)是针对表观的光检测区域的截面半径r绘制阈值Ith所得到的图(此外，在该图中，实际得到的数据点是右半部分的□点，左半部分的数据点是以0点轴为对称轴将右半部分的数据翻转所得到的点)。应该理解为图8的(A)的绘制点表示(与光检测区域的移动方向垂直的方向的截面内的)从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的曲线。即，如根据式(1)或式(3)所理解的那样，表观的光检测区域的截面半径r划定与阈值Ith相等的强度的发光粒子所存在的线区域，因此，阈值Ith相对于表观的光检测区域的截面半径r的关系相当于发光粒子所存在的位置离光检测区域的中心(最大强度点)的距离与在该位置处从发光粒子释放而被检测出的光强度之间的关系。

图8的(A)的绘图的分布的形状表示出与洛仑兹函数的形状良好地一致。因此，在使用非线性最小二乘法使式(3)拟合图8的(A)的数据时(图中的实曲线)，估算出从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的峰值强度Imax是5.81(pc/10μs)，w是0.57(μm)，Ibg是0.0(pc/10μs)。

这样，根据上述的方法，能够确定以下情况，即使用阈值Ith和发光粒子个数P(Ith)计算从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数，能够近似地确定来自光检测区域内的发光粒子的光的强度分布。

实施例3

换算脉冲数

根据“(3)(iii)换算脉冲数”所记载的方法，将根据在实施例1中得到的光强度数据使用不同的阈值检测出的发光粒子个数换算为使用别的阈值的情况下应该检测出的发光粒子个数。具体地说，使用式(15)和式(4)，将对100pM ATTO633的样本溶液以阈值=2.0(pc/10μs)检测出的发光粒子个数和对1nMATTO633的样本溶液以阈值=3.0(pc/10μs)检测出的发光粒子个数，分别换算为以阈值=1.0(pc/10μs)进行发光粒子的信号检测的情况下应该检测出的发光粒子个数。此外，这时，式(4)中的各参数使用在实施例2中得到的值，即Imax=5.81、w=0.57、Ibg=0.0。

图8的(B)是针对发光粒子浓度绘制以阈值=1.0(pc/10μs)进行发光粒子的信号检测时的与发光粒子浓度对应的检测出的发光粒子个数(换算前)和换算后的值(换算后)所得到的曲线图，该换算后的值是将使用阈值=2.0(pc/10μs)检测出的与100pMATTO633的样本溶液有关的发光粒子个数以及使用阈值=3.0(pc/10μs)检测出的与1nM ATTO633的样本溶液有关的发光粒子个数，换算为使用阈值=1.0(pc/10μs)进行发光粒子的信号检测的情况下应该检测出的发光粒子个数所得到的值。使用阈值=2.0(pc/10μs)检测出的与100pM ATTO633的样本溶液有关的发光粒子个数，在阈值=1.0(pc/10μs)的情况下为2093.7个(三次测量的平均值)，与此相对地，将使用阈值=2.0(pc/10μs)的情况下的个数(917个(三次测量的平均值))换算为阈值=1.0(pc/10μs)的情况所得到的值为2316.3个。另外，使用阈值=3.0(pc/10μs)检测出的与1nM ATTO633的样本溶液有关的发光粒子个数，在阈值=1.0(pc/10μs)的情况下为8264.3个(三次测量的平均值)，与此相对地，将使用阈值=3.0(pc/10μs)的情况下的个数(6293.3个(三次测量的平均值))换算为阈值=1.0(pc/10μs)的情况所得到的值为32365.7个。另外，从图8的(B)可知，在阈值=1.0(pc/10μs)下进行发光粒子的信号检测的情况下，与实施例1所示的情况同样地，在发光粒子浓度为100pM～1nM时脉冲数大幅低于根据比其更低浓度区域的值线性地进行外插所得的值，与此相对地，通过上述换算得到的发光粒子浓度为100pM～1nM的脉冲数接近根据比其更低浓度区域的值线性地进行外插所得的值。

其结果是，揭示了能够通过使用式(15)以及式(2)或式(4)，来根据使用某阈值检测出的发光粒子个数估计在使用别的阈值的情况下应该检测出的发光粒子个数。根据该方法，即使在针对式(7)或式(8)成立的阈值不同的至少两个样本溶液分别使用各自的阈值检测出发光粒子个数的情况下，也能够通过将这些发光粒子个数换算为在使用相同的阈值的情况下应该检测出的发光粒子个数来进行相互比较。例如，能够进行以下之类的解析，即在针对发光粒子浓度高的样本溶液按照式(7)或式(8)成立的高阈值来执行发光粒子个数的检测后，将检测出的发光粒子个数换算为使用本来在式(7)或式(8)不成立的阈值的情况下应该检测出的发光粒子个数，将该换算后的发光粒子个数与针对发光粒子浓度低的样本溶液得到的发光粒子个数进行比较。

实施例4

使用给出固定的发光粒子个数的阈值估计发光粒子浓度

确定了以下的情况，即能够使用在实施例1中得到的针对各样本溶液的时序光强度数据，根据给出某固定的发光粒子个数的阈值估计发光粒子的浓度。具体地说，首先，在针对各样本溶液的时序光强度数据中，确定发光粒子个数为20个的阈值。图9示出与发光粒子浓度对应的发光粒子个数为20个的阈值(黑圈)以及使用非线性最小二乘法使式(20)(洛仑兹函数)拟合该阈值的点所得到的曲线(实线)。从图中可知，发光粒子个数为20个的阈值随着发光粒子浓度的增大而单调地增大，良好地与基于式(20)的拟合曲线一致。式(20)中的参数分别是Imax=8.7(pc/μs)、w=2.9μm。这样，确定了在浓度未知的样本溶液的光强度数据中，能够通过检测给出固定的发光粒子个数的阈值，来检测该样本溶液中的发光粒子浓度。

根据上述的实施例的结果可理解到，依照上述本发明的方法，能够通过在扫描分子计数法中适当地设定用于检测发光粒子的信号的阈值，来划定“表观的光检测区域”，实质上选择性地只检测通过了该表观的光检测区域内的发光粒子的信号。而且，“表观的光检测区域”比实际的光检测区域狭小，因此将两个以上的发光粒子的信号重叠而成的信号检测为发光粒子的信号的可能性大幅降低。因而，能够高精度地个别检测单个发光粒子的信号，来进行与样本溶液中的发光粒子浓度对应的发光粒子个数的检测。根据该结构，即使在样本溶液中的发光粒子浓度比较高、产生在实际的光检测区域中暂时包含两个以上的发光粒子的状态的可能性高的情况下，也能够良好地应用扫描分子计数法，因此扩大了能够利用扫描分子计数法的发光粒子浓度范围。

Claims (10)

1.一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，其特征在于，包括如下步骤：

通过变更上述光学系统的光路使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；

一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域的光的强度，来生成光强度数据；

在上述光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号，

其中，在上述个别检测表示发光粒子的光的信号的步骤中，检测具有超过阈值的强度的信号作为上述表示发光粒子的光的信号，设定上述阈值使得检测表示来自包含在上述光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。

2.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于，

从上述光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布是从上述发光粒子释放而被检测出的光的强度从上述光检测区域内的最大强度点向上述光检测区域的周缘降低的分布。

3.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于，

设定上述阈值使得暂时包含在比上述光检测区域狭小的上述区域中的发光粒子的个数实质上为一个以下。

4.根据权利要求3所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤：

对检测出的上述信号的个数进行计数，来确定包含在比上述光检测区域狭小的上述区域中的发光粒子的个数。

5.根据权利要求4所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤：

根据所确定的上述发光粒子的个数确定该发光粒子的个数密度或浓度。

6.根据权利要求4所述的光分析方法，其特征在于，

基于从上述光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，根据所确定的上述发光粒子的个数计算在设定了与上述阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的上述发光粒子的个数。

7.根据权利要求6所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤：

根据计算出的上述发光粒子的个数确定该发光粒子的个数密度或浓度。

8.根据权利要求3所述的光分析方法，其特征在于，

确定使检测出的表示来自发光粒子的光的上述信号的个数为规定个数的阈值，根据上述阈值的大小确定上述发光粒子的个数密度或浓度。

9.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于，

上述发光粒子是通过被照射激励光而释放光的粒子，从上述光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布与上述光检测区域内的上述激励光的强度分布一致。

10.根据权利要求1～9中的任意一项所述的光分析方法，其特征在于，

上述光检测区域的位置以比上述样本溶液中的发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。