CN103328955B - 利用来自单个发光粒子的光的检测的光分析方法和光分析装置 - Google Patents

利用来自单个发光粒子的光的检测的光分析方法和光分析装置 Download PDF

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Abstract

在使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中，不依赖于发光粒子的浓度而能够将结果的偏差抑制得小且将测量时间最优化。本发明的检测来自发光粒子的光并进行分析的技术重复进行一边通过变更显微镜的光学系统的光路使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光的强度并个别地检测发光粒子的光的信号的处理直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的发光粒子的浓度。

Description

利用来自单个发光粒子的光的检测的光分析方法和光分析 装置
技术领域
本发明涉及一种光分析方法和光分析装置，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的方法和装置。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
专利文献1：日本特开2005-098876
专利文献2：日本特开2008-292371
专利文献3：日本特开2009-281831
专利文献4：特許第4023523号
专利文献5：国际公开2008-080417
专利文献6：日本特开2007-20565
专利文献7：日本特开2008-116440
专利文献8：日本特开平4-337446号公报
非专利文献1：金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、No.9、1431-1438页1999年
非专利文献2：F.J.Meyer-Alms、荧光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、204-224页
非专利文献3：加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、No.2、271-277页
非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.Gall PNAS 96,13756-13761(1999))
发明内容
发明要解决的问题
在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性的处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为1fL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液的荧光分子等的浓度典型的是1nM左右或其以上，在大幅低于1nM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6～8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于1nM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
另外，在通过上述的“扫描分子计数法”个别地检测样本溶液中的发光粒子来确定浓度或其它特性的情况下，优选对达到其结果所要求的精度的个数的发光粒子进行检测。例如在通过扫描分子计数法确定样本溶液中的发光粒子的浓度时，进行以下处理：对个别检测出的发光粒子的个数进行计数，将该计数数除以在测量时间(执行光的检测的时间)中的光检测区域的通过区域的总体积。在这种情况下，发光粒子随机地分散在样本溶液中，因此为了高精度地确定浓度，而需要发光粒子的计数数达到足够的个数以使其偏差变小。样本溶液中的发光粒子的浓度越高，在短的时间内发光粒子的计数数越多，因此发光粒子的浓度越高，提供所要求的精度的个数的发光粒子检测的测量时间变得越短。换句话说，在通过“扫描分子计数法”确定样本溶液中的发光粒子的浓度或其它特性的情况下，依赖于发光粒子的浓度而所需要的测量时间不同。
然而，在作为观测对象的发光粒子在样本溶液中的浓度未知的情况下，提供所要求的精度的个数的发光粒子检测所需要的测量时间是不清楚的，因此将测量时间设定成在发光粒子的浓度低的情况下也能够进行提供所要求的精度的个数的发光粒子的检测。在这种情况下，关于发光粒子的浓度高的样本溶液，存在导致测量时间超过需要地变长的情况。另外，当不依据发光粒子的浓度而以相同的测量时间进行发光粒子的检测时，可能发生以下情况：在发光粒子的浓度高的情况下，结果的偏差小，但是在发光粒子的浓度低的情况下，结果的偏差变大。
这样，本发明的一个课题在于提供一种在上述的“扫描分子计数法”中能够在尽可能短的期间内结束达到结果所要求的精度的个数的发光粒子的检测的新方法和装置。
另外，本发明的另一个课题在于提供一种在上述的“扫描分子计数法”中不依赖作为观测对象的发光粒子的浓度而将结果的偏差抑制得小的新方法和装置。
并且，本发明的另一个课题在于提供一种在上述的“扫描分子计数法”中能够根据作为观测对象的发光粒子的浓度使测量时间最优化的新方法和装置。
用于解决问题的方案
根据本发明，通过以下的方法来达成上述的课题，该方法是使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：光检测区域移动步骤，通过变更光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测步骤，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光；以及发光粒子检测步骤，根据所检测到的光，个别地检测来自各个发光粒子的信号，其中，重复进行上述三个步骤直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，来确定样本溶液中的发光粒子的浓度。
在所述本发明的结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的”发光粒子是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子是没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为“信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边在使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行光的检测。这样，可以期待在移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。因而，在依次检测出的光中个别地检测来自发光粒子的光的信号，由此逐个地个别地依次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。在不依据样本溶液中的发光粒子的浓度而在某固定的测量时间内执行所述一系列的步骤、即光检测区域移动步骤、光检测步骤以及发光粒子检测步骤的情况下，如上所述那样根据发光粒子的浓度的不同而发光粒子的检测数的偏差不同，并且在发光粒子的浓度高时，有可能测量时间超过需要地变长，在发光粒子的浓度低时，有可能无法达成达到测量所要求的精度的个数的发光粒子的检测。
因此，在本发明的方法中，不是在某固定的测量时间内执行光检测区域移动步骤、光检测步骤以及发光粒子检测步骤，而是如上述那样重复进行以上步骤直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止。然后，计量检测到预先决定的个数的发光粒子为止所需要的时间，根据来自所述发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的发光粒子的浓度。根据所述结构，发光粒子的浓度越高，发光粒子的检测数在越短的时间内达到预先决定的个数，因此针对发光粒子的浓度高的样本溶液期待缩短测量时间，针对发光粒子的浓度低的样本溶液花费足够的时间执行测量。即，根据上述结构，能够根据发光粒子的浓度使测量时间最优化。另外，如果事先将预先决定的个数设定为达到结果所要求的精度的个数，则能够将针对发光粒子的浓度低的样本溶液的检测预先决定的个数的发光粒子所需要的时间或基于其导出的任意的结果的偏差抑制得小，从而满足结果的精度。
在上述的本发明的方法的结构中，发光粒子的浓度被反映为来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，因此应该理解到能够根据来自所述发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定发光粒子的浓度。具体地说，可以使用来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间的任意的函数来计算发光粒子的浓度。例如根据发光粒子的检测数(即，预先决定的个数)以及来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间而确定的发光粒子的检测速度(每单位时间的检测数)与发光粒子的浓度成比例，因此被有利地使用。
另外，如从后述的实施方式一栏的说明中理解的那样，在光检测区域移动步骤和光检测步骤中检测来自样本溶液的光并根据所得到的数据在发光粒子检测步骤中检测发光粒子的存在的上述的一系列的步骤中，需要进行从所得到的数据中去除噪声来确定发光粒子的信号的处理。能够通过下面的方法达成所述处理，即在某固定的测量时间内进行光的检测时，在所述固定的测量时间内的光的检测完成之后，将所得到的数据统一进行分析。然而，执行发光粒子的检测直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的情况下，需要在光检测区域移动步骤和光检测步骤的中途检测来自发光粒子的信号。因此，在上述的本发明的方法的结构中，可以在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内按每个规定的时间间隔重复进行光检测区域移动步骤、光检测步骤以及发光粒子检测步骤。对于所述规定的时间间隔，可以是固定的，还可以在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，根据到当时为止的发光粒子的检测数进行修正。特别是在后者的情况下，能够在实际开始测量之后根据样本溶液中的发光粒子的检测状况来调整重复上述一系列的步骤时的规定的时间间隔，能够进一步提高测量时间的最优化。
并且，作为上述的本发明的方法的一个实施方式，可以是在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，执行根据到当时为止的发光粒子的检测数来估计来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间的步骤。具体地说，例如在检测开始之后，能够根据检测开始后的经过时间和到当时为止的发光粒子的检测数来确定发光粒子的检测速度，根据所述发光粒子的检测速度估计来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间。根据所述结构，能够预测测量时间何时结束，对于实验者来说是便利的信息。
另外，关于上述的本发明的结构中的光检测区域的位置移动，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。
并且，关于上述的光检测区域的位置的移动，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的方法中，对从光检测区域所包含的一个发光粒子发出的光进行检测，来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测到(表示该发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性适当地变更光检测区域的移动速度。
可以通过任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)变更光路，来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路来使光检测区域的位置移动，由此光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在(没有伪像(artifact)的状态且)稳定的状态下进行光的测量(例如在使样本发生流动的情况下，难以始终赋予一样的流速，并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加，并且由于流动所造成的流体动力的作用而在溶液中的发光粒子或其它物质有可能发生改质或改性。)。而且，不需要使样本溶液流通的结构，因此能够与FCS等的情况同样地以微量(1～几十μL左右)的样本溶液进行测量和分析。
通过新的光分析装置来实现上述的本发明的方法，该光分析装置能够一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测各个发光粒子的光。这样，在本发明的另一个方式中，通过下面的光分析装置达成上述的本发明的课题，该光分析装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其对来自一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的各个发光粒子的信号个别地进行检测，其中，重复进行利用光检测区域移动部的光学系统的光检测区域的位置的移动、利用光检测部的对来自光检测区域的光的检测以及利用信号处理部的对来自发光粒子的信号的检测，直到信号处理部所检测出的来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的发光粒子的浓度。
在上述的本发明的装置中，也可以根据发光粒子的检测速度来确定发光粒子的浓度，该检测速度是根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间而确定的。另外，上述的本发明的装置可以构成为在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，按每个规定的时间间隔重复进行利用光检测区域移动部的光学系统的光检测区域的位置的移动、利用光检测部的对来自光检测区域的光的检测以及利用信号处理部的对来自发光粒子的信号的检测。规定的时间间隔可以是任意固定的时间间隔，或者可以设置在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内根据到当时为止的发光粒子的检测数来修正规定的时间间隔的单元，来提高规定的时间间隔和测量时间的最优化。并且，在上述的本发明的装置中，可以设置在来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内根据到当时为止的发光粒子的检测数来估计来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间的单元，实验者能够获知发光粒子的检测结束的时间。特别地，为此，在本发明的装置中，可以设置测量结束时间显示部和/或发光粒子检测数显示部，该测量结束时间显示部显示根据在来自发光粒子的信号的检测开始之后由信号处理部所检测出的来自发光粒子的信号的个数而估计出的、来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止的时间，该发光粒子检测数显示部显示在来自发光粒子的信号的检测开始之后由信号处理部所检测出的来自发光粒子的信号的个数，根据所述结构，实验者能够预计到发光粒子的检测结束为止的时间，因此是有利的。此外，在本发明的上述装置中也优选为以规定的速度或比发光粒子的扩散移动速度快的速度进行利用光检测区域移动部的光检测区域的位置的移动，可以任意地设定光检测区域的位置的移动速度。
本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解到这种情况也属于本发明的范围。
发明的效果
总而言之，根据本发明，在共焦显微镜或多光子显微镜中利用其光检测区域在样本溶液中进行扫描来个别地检测发光粒子的存在的扫描分子计数法中，能够根据样本溶液中的发光粒子的浓度使测量时间最优化。特别地通过将来自发光粒子的信号的个数应该达到的预先决定的个数与任意的实验或计量相应地设定为达成其结果所要求的精度的个数，期待在发光粒子的浓度未知的情况下，不依据实际的浓度，也能够得到高精度的检测结果。另外，根据所述特征，与在某固定的测量时间内进行光的检测以及发光粒子的检测的情况相比，能够期待通过更少的反复试验得到高精度的结果，并能够期待进行实验或计量所需要的工时、劳力、时间和/或费用的减少。此外，在本发明中，由于个别地检测发光粒子并确定其浓度，因此即使是在样本溶液中浓度相对较低且其光在以前的方法中埋没于来自其它的发光粒子的光的发光粒子，也能够检测出，能够观测其存在。还期待将所述特征应用于反应率比较低的反应的产物、数量相对较少的中间产物的检测。
本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清楚。
附图说明
图1的(A)是实现本发明的光分析技术的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是说明构成本发明的光分析技术的一部分的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所测量的光强度的时间变化的示意图。
图3是说明本发明的原理的图，示出了针对某样本溶液通过扫描分子计数法获得的按时间序列的光强度数据(光强度的时间变化)。(A)示意性地示出了样本溶液中的发光粒子的浓度低的情况下的光强度数据，(B)示出了样本溶液中的发光粒子的浓度高的情况下的光强度数据。图3的(C)是示意性地表示光检测区域CV的通过区域的图。
图4是以流程图的形式表示本发明的光分析技术中的处理过程的一个实施方式的图。
图5是以流程图的形式表示在图4或图8的流程图中的步骤30中执行的依照扫描分子计数法按每个解析时间间隔t执行的处理过程的例子的图。
图6的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图6的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的图5所记载的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
图7示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
图8的(A)是以流程图的形式表示本发明的光分析技术中的处理过程的另一个实施方式的图。图8的(B)是以流程图的形式表示在图8的(A)的步骤20’中执行的解析时间间隔t的设定以及修正处理的例子的图。
图9的(A)示出了依照扫描分子计数法针对分别包含100fM、1pM、10pM的荧光色素ATTO633的各个样本溶液执行的五次尝试性实验中所检测出的发光粒子的个数的偏差(CV值)的时间变化。图9的(B)示出了图9的(A)的针对各样本溶液的五次尝试性实验中的、按各发光粒子的检测数进行检测所需要的测量时间的偏差(粒子检测时间的CV值)相对于发光粒子的检测数的变化。
图10示出了相对于样本溶液中的发光粒子(荧光色素ATTO633)的浓度通过扫描分子计数法检测出的发光粒子的检测速度的变化的实验例。
图11是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中所得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。
附图标记说明
1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-mode opticalfiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenser lens)；13：针孔；14：屏蔽滤波器；14a：检测光用分色镜；15：多模光纤(multi-mode optical fiber)；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的优选实施方式。
光分析装置的结构
本发明的光分析技术能够通过如下的光分析装置来实现：在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照图1的(A)，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有荧光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自焦点面以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是以光强度为1/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光经过分色镜14a后透过屏蔽滤波器14(在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16，在被转换成按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个荧光色素分子的微弱光。
另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即，光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所期望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路来使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体动力的作用，能够排除力学作用对观测对象物的影响，实现稳定的测量。
此外，作为追加的结构，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更所观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。
在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据波长分别检测来自它们的光。
本发明的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则本发明的方法如下，即，“扫描分子计数法”通过如上所述的共焦显微镜(或多光子显微镜)逐个地检测来自发光粒子的光，在该“扫描分子计数法”中，重复进行光检测区域的移动、光的检测以及发光粒子的检测直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的发光粒子的浓度。下面，针对扫描分子计数法以及本发明的确定发光粒子浓度的原理进行说明。
1.扫描分子计数法的原理
FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图11的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在测量荧光强度的过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，则例如图11的(B)所描绘的那样，在发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精度地估算出光强度的波动。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。
作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如图2示意性地描述的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测、即光强度的测量。这样，例如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，并对其个数进行计数，从而能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
2.本发明的确定发光粒子浓度的原理
在如上所述的扫描分子计数法中，由于作为观测对象的发光粒子随机地分散在样本溶液中，因此在某测量时间的光检测中所得到的发光粒子的检测数存在偏差(每次执行测量时检测数都不同。)。因而，为了以能够允许的或满足的精度确定发光粒子的检测数除以测量时间中的光检测区域的通过区域的体积所得到的发光粒子的浓度等利用发光粒子的检测数导出的任意的特性，需要在检测出达到所述精度所要求的个数的发光粒子所需要的时间内执行光强度的测量。关于该点，样本溶液中的发光粒子的浓度越低，在某测量时间中得到的发光粒子的检测数当然越少，因此偏差变大，为了达到能够允许的或满足的精度，需要更长的测量时间。例如参照图3，在某测量时间α内通过扫描分子计数法针对发光粒子浓度比较低的溶液(A)和发光粒子浓度比较高的溶液(B)检测发光粒子的情况下，如将图3的(A)、(B)进行比较所理解的那样，在如图3的(B)所例示的那样针对发光粒子浓度比较高的溶液得到的按时间序列的光强度数据中检测到比图3的(A)所例示的那样的发光粒子浓度比较低的溶液的情况多的发光粒子的信号。因而，例如，对于用于获得达到能够允许确定浓度等特性的精度所要求的发光粒子的检测数的测量时间，在针对图3的(A)的溶液需要时间α的情况下，针对图3的(B)的溶液，时间β就足够。而且，假设在针对图3的(A)的溶液仅在时间β内执行测量的情况下，发光粒子的检测数的偏差变大，浓度等的结果的误差有可能大到不能允许的程度。
然而，在样本溶液中的发光粒子浓度未知时，在某固定的测量时间内进行光强度的测量的情况下，为了防备发光粒子的浓度低而将测量时间设定得足够长。在这种情况下，在样本溶液中的发光粒子的浓度高时，变成超过以能够允许的或满足的精度确定浓度等特性所需要的时间持续测量光强度。另外，在样本溶液中的发光粒子浓度低于实验者所假定的浓度而所设定的测量时间不足的情况下，导致结果的误差变大。
因此，在本发明中，并不是根据在某固定的测量时间内执行光强度的测量(即，光的检测)所得到的光强度数据检测发光粒子数，而是重复使光检测区域移动并且进行光强度的测量和发光粒子信号的检测直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止，计量来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，根据所述的来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定发光粒子的浓度。根据所述结构，在样本溶液中的发光粒子浓度高的情况下，能够缩短光强度测量所需要的时间，在样本溶液中的发光粒子浓度低的情况下，能够持续测量光强度直到得到达到结果(即，发光粒子浓度)所要求的精度的发光粒子数为止。而且，通过将来自发光粒子的信号的个数应该达到的预先决定的个数事先设定为达到结果所要求的精度的发光粒子数，将达到结果所要求的精度的发光粒子数反映为来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，因此能够期待根据该时间确定的发光粒子的浓度值具有能够允许的或满足的精度。
具体地说，如下面那样将依照本发明确定的发光粒子的浓度值与来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间关联起来。即，在某发光粒子的浓度C的样本溶液中，在时间τ内使光检测区域以扫描速度u移动的情况下，当将光检测区域的截面积设为S时(参照图3的(C))，所检测出的光的信号的个数X为
X＝CSuτNA…(1)。
在此，NA是阿伏加德罗数。因而，当设来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数XE需要时间T时，发光粒子的浓度C作为时间T的函数通过下式提供。
C＝XE/(STuNA)…(2)
此外，在式(2)中，根据来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数XE所需要的时间T和发光粒子检测数XE，通过下式提供每单位时间的粒子的检测速度V，
V＝XE/T…(3)
因此发光粒子的浓度C表示为
C＝V/(SuNA)…(4)。
在该式(4)中，发光粒子的浓度C与检测速度V成一阶比例，由于容易获知发光粒子的浓度C与检测速度V的对应关系，因此在实际的实验中，可以利用检测速度V确定发光粒子的浓度C。(参照下述的实施例)
处理操作过程
在使用图1的(A)所例示的光分析装置1的本发明的光分析的实施方式中，具体地说，执行以下的过程，(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，(2)样本溶液的光强度的测量和发光粒子的检测、计数处理，以及(3)浓度计算等分析。
(1)样本溶液的调制
在本发明的光分析技术中，作为观测对象的粒子只要是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型的是水溶液，但并不限于此，也可以是有机溶剂之类的其它任意的液体。)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自身发光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。
此外，在本实施方式中，由于能够确定样本溶液中的发光粒子浓度，因此例如可以将包含浓度未知的成分的溶液、在结合离解反应、分子间相互作用的前后发光粒子的浓度变化的溶液等用作样本溶液，进行溶液中的成分的浓度的确定，检测反应、相互作用的有无、进展的程度。
(2)样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数
图4是以流程图的形式表示利用图1的(A)所例示的光分析装置1执行的本实施方式中的样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数处理的一个例子。在该图的例子中，如果清楚地描述，则按每个解析时间间隔t(规定的时间间隔)重复执行光检测区域的位置的移动、来自光检测区域的光的检测、来自发光粒子的信号的检测以及所检测出的发光粒子的信号的计数这一系列处理直到所检测出的发光粒子数X达到结束粒子数XE(发光粒子数要达到的预先决定的个数)为止。此外，应该理解为通过计算机18的处理动作来实现下面所记述的一系列处理以及结构。[在(3)浓度计算等的分析、(4)样本溶液的光强度的测量和发光粒子的检测、计数处理的修正例子中相同。]
(i)初始设定
在操作处理中，具体地说，首先在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入光强度的测量和发光粒子的检测、计数处理的开始指示时，作为初始设定，计算机18进行结束粒子数XE的设定(步骤10)和解析时间间隔t的设定(步骤20)。结束粒子数XE和解析时间间隔t可以由使用者任意地设定。能够参考使用发光粒子的浓度已知的溶液进行能够达到发光粒子的浓度的结果值所要求的精度的预备实验所得到的结果来适当地确定结束粒子数XE(参照后述的实施例)。作为解析时间间隔t，可以考虑装置1中的后述图5的处理速度等来适当地设定与从处理开始至发光粒子数(X)达到结束粒子数(XE)的时间相比充分短的任意的时间间隔。另外，结束粒子数XE和解析时间间隔t也可以分别是将通过参考使用发光粒子的浓度已知的溶液进行预备实验所得到的结果来预先决定的值存储在装置1中，并自动地或通过使用者的选择来使用所存储的所述值。
(ii)发光粒子数的检测
这样，当进行了结束粒子数XE和解析时间间隔t的设定时，如下面那样在发光粒子的总数X(tn)达到结束粒子数XE之前(步骤50)，按每个解析时间间隔t重复进行以下步骤：解析时间间隔t内的利用扫描分子计数法进行的光强度的测量处理、基于所测量出的光强度数据的发光粒子信号的检测以及发光粒子数x的检测(步骤30)；以及对在步骤30中检测出的发光粒子数x进行累积并估算发光粒子的总数X(tn)的处理(步骤40)。此外，在重复执行步骤30～50的处理之前，可以存储一系列处理的开始时间Ts(步骤25)。下面，详细说明步骤30～50的处理。
(a)光强度的测量
图5是以流程图的形式表示步骤30中的处理过程的例子。参照该图，在步骤30的处理过程中，首先一边驱动反射镜偏转器17进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)，一边在解析时间间隔t内进行光强度的测量(图5的步骤100)。在所述处理中，典型的是依照存储在存储装置(未图示)中的程序(为了使光检测区域的位置在样本溶液内移动而变更光路的过程、向光检测区域照射激励光的过程(仅在需要时)以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的过程)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射(仅在需要时)和光强度的测量。当开始测量时，首先在计算机18依照程序进行的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)来执行光检测区域的位置在皿10内的移动，与此同时，光检测器16将依次接收到的光转换为电信号后发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据发送来的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。典型的是光检测器16是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此，光的检测是以每隔规定的单位时间(BIN TIME)、例如每隔10μs依次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，按时间序列的光强度的数据可以是按时间序列的光子计数数据。
关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，为了定量地高精度地根据测量出的按时间序列的光强度数据个别检测发光粒子，优选的是将光强度的测量过程中的光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。在光检测区域的位置的移动速度比粒子的因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图6的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此，光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是如图6的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域CV，由此，在按时间序列的光强度数据中，与各个粒子对应的光强度的变化的曲线是与图6的(C)最上部所例示的那样的激励光强度分布大致相同的大致吊钟状，将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动而进行的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δτ根据以下的平均平方位移的关系式，
(2r)2＝6D·Δτ…(5)
成为
Δ丁＝(2r)2/6D…(6)，
因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif＝2r/Δτ＝3D/r…(7)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D=2.0×10-10m2/s左右的情况下，在设r为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的例如15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的曲线为预想的曲线(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
(b)与发光粒子对应的信号的检测
当通过上述的处理在解析时间间隔t得到样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，通过计算机18依照被存储在存储装置中的程序进行处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测。
在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图6的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的曲线(参照图6的(C)最上部)。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的曲线的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即
I＝A·exp(-2t2/a2)…(8)，
在使式(8)拟合有意义的光强度的曲线(能够明确地判断为不是背景的曲线)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的曲线判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异物的信号，可以在其后的分析等中忽略。)
作为根据时序光强度数据进行发光粒子的检测的处理的更具体的方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图6的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图5的步骤110、图6的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图6的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值的变化时刻值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。
然后，在时序光强度数据上，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，参照时间微分值依次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图6的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是如式(8)那样的高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的曲线的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图7的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子，从而被计数为一个发光粒子(将粒子数x累加1。步骤160)。另一方面，如图7的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。
可以在解析时间间隔t内的时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～160的处理中的脉冲信号的搜索、判断以及计数(步骤170)。此外，根据时序光强度数据个别地检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。当在解析时间间隔t内的所有时序光强度数据中脉冲信号的搜索结束时，步骤30结束，执行步骤40。
(c)发光粒子的检测总数的计算
这样，当检测出解析时间间隔t内的时序光强度数据中的发光粒子数x时，通过下式计算发光粒子的检测总数X(tn)(图4的步骤40)。
X(tn)＝X(tn-1)+x…(9)
此外，X(tn-1)是直到前次的解析时间间隔t为止检测出的粒子的检测总数，其初始值是0。然后，按每个解析时间间隔t重复进行步骤30～40直到发光粒子的检测总数X(tn)达到结束粒子数XE为止，即直到下式成立为止(步骤50)。
X(tn)≥XE…(10)
这样，在反复进行步骤30～50的过程中，当式(10)成立时，结束样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理。当步骤30～50的反复处理结束时，可以存储结束时间TE(步骤60)。
(d)发光粒子数和测量结束时间的显示
可以在按每个解析时间间隔t反复执行步骤30～50的期间(直到式(10)成立为止)，在计算机18的监视器上等显示器上显示发光粒子的检测总数X(tn)和/或测量结束时间TE或测量剩余时间Tr。根据所述结构，在使用者通过观察这些显示能够预测正在执行的测量几时结束这一点上是有利的。
在执行如上所述的显示的情况下，在图4的步骤50的判断中式(10)不成立的情况下，执行图中虚线所示的各处理。具体地说，首先将在步骤40中估算出的最新的发光粒子的检测总数X(tn)显示在显示器上(步骤52)。此外，在已经反复执行了步骤30～50的情况下，更新到当时为止的发光粒子的检测总数X(tn)的值。接着，为了计算测量结束时间TE或测量剩余时间Tr而计算步骤30～50的处理开始后的发光粒子的检测速度v(步骤54)。可以通过下式提供到现在为止的发光粒子的检测速度v。
v＝X(tn)/(Tp一Ts)…(11)
在此，Tp是当前的时刻。这样，利用发光粒子的检测速度v，通过下式估计测量剩余时间Tr(到步骤30～50的处理结束的时间)，
Tr＝(XE-X(tn))/v…(12)
另外，通过下式估计测量结束时间TE(步骤30～50的处理结束的时间)(步骤56)。
TE＝Tp+Tr…(13)
然后，将所估计出的测量结束时间TE或测量剩余时间Tr显示在显示器上(步骤58)。此外，在已经反复执行了步骤30～50的情况下，更新已经显示的值。另外，在X(tn)=0时，不运算式(12)或(13)而可以将Tr和TE显示为不明。
此外，如已经记述过的那样，按每个解析时间间隔t重复进行上述的图4的步骤30～50、图5的步骤100～170的处理。关于该点，可以在从测量的开始到结束为止在执行步骤100以外的信号处理步骤的过程中也连续地执行图5的步骤100的光强度的测量。即，在图4～5的处理循环中，当一个循环的解析时间间隔t内的步骤100的光强度的测量完成时，直接连续地执行下一循环的解析时间间隔t内的步骤100的光强度的测量，同时在计算机18中根据在所完成的循环的解析时间间隔t内获取到的光强度数据执行发光粒子的信号的检测、计数的处理。由此，实时地达成发光粒子的检测、计数。
(3)浓度计算等的分析
这样，当发光粒子数达到结束粒子数时，可以利用发光粒子数达到结束粒子数为止的时间T(=TE-Ts)或根据所检测出的发光粒子的信号得到的其它信息，来执行浓度计算等的分析(步骤70)。
如已经记述过的那样，利用式(3)，根据达到结束粒子数为止的时间T和结束粒子数XE计算粒子的检测速度V，根据粒子的检测速度V，利用式(4)的关系来确定发光粒子的浓度。
此外，可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态，在理论上估算式(1)～(4)中的光检测区域的通过区域的截面积S，但是也可以根据通过如下方法检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来进行确定，该方法是通过实验，例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测、计数。具体地说，例如针对发光粒子的浓度C的对照溶液，当设以移动速度uo在某时间τo内执行的光强度的测量中发光粒子的检测数为N时，通过下式给出光检测区域的通过区域的截面积S。
S＝N/(C·NA·uo·τo)…(14)
另外，作为对照溶液，可以准备发光粒子的多个不同浓度的溶液，针对各个溶液执行测量，并采用所计算出的S的平均值作为光检测区域的截面积S。此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的截面积S。另外，在本实施方式的光分析装置中，关于所设想的光检测区域的移动模式，可以将关于各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(14))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。
(4)样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数处理的修正例
在上述的样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数处理中，作为其它的方式，解析时间间隔t也可以不是固定值而是根据发光粒子的检测状况对其进行修正。图8的(A)以流程图的形式表示构成为包括根据发光粒子的检测状况对解析时间间隔t进行修正的处理(步骤20’)的样本溶液的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数处理，图8的(B)以流程图的形式表示步骤20’中的解析时间间隔t的运算处理。此外，在图8的(A)中，对与图4相同的处理附加相同的步骤编号。
参照该图，在图8的处理中，每当解析时间间隔t内的光强度的测量完成时都修正解析时间间隔t(步骤20’)。另外，图示的例子的处理特别是构成为在从开始至发光粒子数达到结束粒子数XE为止的一次测量中，仅以预先决定的次数N(以下称为“更新预定次数”。)执行光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理循环。具体地说，首先，作为初始设定，在结束粒子数XE的设定(步骤10)和开始时间Ts的存储(步骤25)之后，在最初执行光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理时、即在光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理循环的执行次数k为0时，对解析时间间隔t赋予可以任意设定的初期值to(参照图8的(B)的步骤200、210)。然后，处理循环的执行次数增加1(步骤270)，与图4所记载的处理同样地执行解析时间间隔t内的光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理(步骤30～50)。这样，当得到最初的循环的发光粒子数x(=X(t1))时，依次估算粒子检测速度v(步骤54)、测量剩余时间Tr(步骤56)。此外，与图4的情况同样地，可以在计算机18的监视器上等显示器上显示发光粒子的检测总数X(tn)和/或测量结束时间TE或测量剩余时间Tr(步骤52、58)。另外，在最初的处理循环中发光粒子数达到了结束粒子数XE时，直接结束光强度的测量以及发光粒子的检测、计数的处理(步骤50)。
在最初的处理循环之后，反复进行解析时间间隔t的修正以及与图4的情况相同的光强度的测量和发光粒子的检测、计数的处理循环(步骤20’、30～58)直到发光粒子数达到结束粒子数XE为止。此时，在进行解析时间间隔t的修正的步骤20’中，首先，在判断到此时为止检测出的发光粒子数X(tn)是否为0(步骤220)。在X(tn)=0时，可以将前一循环的解析时间间隔t乘以m倍(m为1以上的正数)。在X(tn)>0时，利用测量剩余时间Tr、更新预定次数N以及处理循环的执行次数k，通过下式估算解析时间间隔t(步骤240)。
t＝Tr/(N-k)…(15)
此外，可以针对所估算的解析时间间隔t设定下限，可以在解析时间间隔t低于下限值tmin时将解析时间间隔t设定为下限值tmin(步骤250、260)。
如上所述，根据对解析时间间隔t进行修正的方式，作为观测对象的样本溶液中的发光粒子的检测状况被反映为测量剩余时间Tr，因此根据所述发光粒子的检测状况将解析时间间隔t最优化。
这样，根据上述的本发明，在利用光检测区域对样本溶液中进行扫描来个别检测发光粒子的扫描分子计数法中，由于是重复进行光强度的测量以及发光粒子的检测、计数直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的个数为止这样的方式，因此与样本溶液中的发光粒子的浓度相应地光强度的测量以及发光粒子的检测、计数所需要的时间(测量时间)增加或减少。而且，通过将来自发光粒子的信号的个数应该达到的预先决定的个数事先设定为能够达到结果所要求的精度的个数，无需超过需要的测量时间就能够得到能够允许的或满足的结果。
为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于例示本发明的有效性，而并不是限定本发明的范围。
实施例1
将溶解有荧光色素分子的溶液作为样本溶液，利用扫描分子计数法进行发光粒子的检测和计数，并确认所检测出的发光粒子的个数的偏差的特征，并且根据本发明的结构，验证了不依赖于发光粒子的浓度，而能够将结果的偏差抑制得小且能够在尽可能短的期间内高精度地检测发光粒子的浓度。
作为样本溶液，调制出将ATTO633(Sigma-Aldrich公司、Cat.No.18620)以浓度为100pM、10pM、1pM、100fM的方式溶解于包含0.05%Tween20的PBS缓冲液中所得到的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF-20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)(ii)(a)光强度的测量”中所说明的方式，针对上述的各个样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光，利用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光生成时序光强度数据。使样本溶液中的光检测区域以30mm/秒的移动速度进行移动。另外，将BIN TIME设为10μs，针对各溶液进行了五次测量。此外，本实验是用于确认发光粒子的个数偏差的特征的实验，因此不是按每个解析时间间隔执行光强度的测量，而是在足以捕捉到发光粒子的个数偏差的特征的时间内进行光强度的测量。(实际上，针对100pM、10pM、1pM的溶液，测量时间设为2秒，针对100fM的溶液，测量时间设为20秒。)
在上述的光强度的测量之后，依照上述的“(2)(ii)(b)与发光粒子对应的信号的检测”所记载的处理过程，对上述得到的时序光强度数据实施平滑处理，在平滑后的数据中确定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只将满足下述的条件的脉冲信号判定为与发光粒子对应的信号，
20μs<脉冲宽度<400μs
峰值强度>1.0[pc/10μs]…(A)
相关系数>0.95，
另一方面，将不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略。
图9的(A)示出了在扫描分子计数法中相对于测量时间的长度的检测出的发光粒子数的偏差的变化。图中的横轴是测量时间的长度，纵轴是在五次测量中检测出的发光粒子数的CV值(=标准偏差/平均×100%)，各点表示对应的测量时间的长度中的CV值。如从该图所理解的那样，针对上述的10pM、1pM、100fM的样本溶液，都是测量时间越长CV值越低。另外，将三个样本溶液的值进行比较明显可知，浓度越低，使CV值变得足够小所花费的时间越长。由此，示出了根据样本溶液中的发光粒子的浓度不同而使发光粒子检测数的偏差收敛于可允许的范围内的测量时间不同。
另一方面，图9的(B)示出了在扫描分子计数法中相对于发光粒子的检测数的获取各个检测数所需要的测量时间(粒子检测时间)的偏差的变化。图中的横轴是所检测出的发光粒子数，各点表示在五次测量中检测相对应的发光粒子数所需要的测量时间(粒子检测时间)的CV值(=标准偏差/平均×100%)。如从该图所理解的那样，关于上述三个样本溶液，当发光粒子数超过30时，几乎不存在粒子检测时间的CV值对发光粒子浓度的依赖性。该情形暗示了在扫描分子计数法中进行光强度的测量直到来自发光粒子的信号的个数变为能够达到结果所要求的精度的个数为止，通过根据获取此时的发光粒子检测数所需要的测量时间执行浓度等的分析，能够得到偏差少的结果。
另外，参照图9的(B)的结果，在针对色素分子浓度为100fM的溶液和10pM的溶液得到的光强度数据中，将发光粒子检测数达到130个为止的测量时间和粒子检测速度进行比较。结果如下。
[表1]
10pM ATTO633
[表2]
100fM ATTO633
如根据上述表所理解的那样，示出了以下情形：为了使结果的偏差收敛于能够允许的程度，在100fM的溶液的情况下，测量时间需要14秒以上，与此相对地，在10pM的溶液的情况下，测量时间0.18秒左右即可。该情形表示在扫描分子计数法中将偏差抑制得小且高精度地得到结果所需要的测量时间根据发光粒子浓度的不同而不同。而且，示出了以下情形：通过依照本发明的执行光强度的测量直到发光粒子的检测数达到预先决定的个数为止的方式，在与发光粒子浓度相应的测量时间内进行光强度的测量，能够避免花费超过需要的时间进行测量。特别是应该理解到在发光粒子浓度高的情况下能够大幅地缩短测量时间。
并且，图10示出针对各浓度绘制根据上述各样本溶液的检测数达到150个为止的测量时间计算出的粒子检测速度得到的图。如从该图理解的那样，暗示了以下情形：粒子检测速度与色素浓度成比例，上述的式(4)的关系成立。因而，根据粒子检测速度或检测预先决定的个数的发光粒子所需要的测量时间，能够确定样本溶液中的发光粒子的浓度。
这样，如从上述实施例的结果理解的那样，根据上述本发明，在扫描分子计数法中，不是在某固定的测量时间内一边使光检测区域移动一边执行光强度的测量以及发光粒子的检测，而是一边使光检测区域移动一边执行光强度的测量以及发光粒子的检测直到来自发光粒子的信号的个数达到预先决定的数为止，通过这样的方式，将结果的偏差抑制得小且将测量时间最优化，并能够使用于检测达到结果所要求的精度的个数的发光粒子的测量在尽可能短的期间内结束。特别地，本发明个别地检测发光粒子的信号，因此即使样本溶液的发光粒子浓度低于FCS等光分析技术所要求的浓度范围，也能够进行发光粒子的检测，所述特征在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下是有利的。另外，通过本发明，在样本溶液中的发光粒子浓度未知的情况下，也能够期待减少用于测量时间的反复试验的劳力、时间或费用，因此能够扩大扫描分子计数法的应用范围。例如，不需要由于样本溶液中发光粒子浓度是未知而设定超过需要的长的测量时间以防备发光粒子浓度极低的情况。

Claims (14)

1.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
光检测区域移动步骤，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；
光检测步骤，一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光；
时序光强度数据生成步骤，根据所检测到的来自上述光检测区域的光生成按时间序列的时序光强度数据；
平滑处理步骤，对上述时序光强度数据进行平滑处理，直到能够忽略上述发光粒子所发出的光在微小的时间内可能产生的数据值的缺失为止；以及
发光粒子检测步骤，在平滑处理后的上述时序光强度数据上，将具有大致吊钟状的曲线的、光强度随时间的变化逐个检测为来自各个上述发光粒子的光的信号，其中该大致吊钟状的曲线反映上述光检测区域内的光强度分布并且具有处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的参数，
其中，重复进行上述光检测区域移动步骤、上述光检测步骤、上述时序光强度数据生成步骤、上述平滑处理步骤以及上述发光粒子检测步骤直到来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，来确定上述样本溶液中的上述发光粒子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，按每个规定的时间间隔重复进行上述光检测区域移动步骤、上述光检测步骤、上述时序光强度数据生成步骤、上述平滑处理步骤以及上述发光粒子检测步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
根据上述发光粒子的检测速度来确定上述样本溶液中的上述发光粒子的浓度，该检测速度是根据来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间而确定的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
在来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，根据到当时为止的上述发光粒子的检测数来估计来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，按每个规定的时间间隔重复进行上述光检测区域移动步骤、上述光检测步骤、上述时序光强度数据生成步骤、上述平滑处理步骤及上述发光粒子检测步骤，
该方法还包括以下步骤：根据到当时为止的上述发光粒子的检测数来修正上述规定的时间间隔。
6.根据权利要求1～5中的任一项所述的方法，其特征在于，
在上述光检测区域移动步骤中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
7.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括：
光检测区域移动部，其通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；
光检测部，一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测来自上述光检测区域的光；
时序光强度数据生成部，其根据所检测到的来自上述光检测区域的光生成按时间序列的时序光强度数据；
平滑处理部，其对上述时序光强度数据进行平滑处理，直到能够忽略上述发光粒子所发出的光在微小的时间内可能产生的数据值的缺失为止；以及
信号处理部，其在由上述平滑处理部平滑处理后的上述时序光强度数据上，将具有大致吊钟状的曲线的、光强度随时间的变化逐个检测为来自各个上述发光粒子的光的信号，其中该大致吊钟状的曲线反映上述光检测区域内的光强度分布并且具有处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的参数，
其中，重复进行利用上述光检测区域移动部的上述光学系统的光检测区域的位置的移动、利用上述光检测部的对来自上述光检测区域的光的检测、利用上述时序光强度数据生成部的时序光强度数据的生成、利用上述平滑处理部的对上述时序光强度数据的平滑处理以及利用上述信号处理部的对来自上述发光粒子的光的信号的检测，直到上述信号处理部所检测出的来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定上述样本溶液中的上述发光粒子的浓度。
8.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，
按每个规定的时间间隔重复进行利用上述光检测区域移动部的上述光学系统的光检测区域的位置的移动、利用上述光检测部的对来自上述光检测区域的光的检测、利用上述时序光强度数据生成部的时序光强度数据的生成、利用上述平滑处理部的对上述时序光强度数据的平滑处理以及利用上述信号处理部的对来自上述发光粒子的光的信号的检测。
9.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，
根据上述发光粒子的检测速度来确定上述样本溶液中的上述发光粒子的浓度，该检测速度是根据来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间而确定的。
10.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，还包括以下单元：
该单元在来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，根据到当时为止的上述发光粒子的检测数来估计来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间。
11.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，
在来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的期间内，按每个规定的时间间隔重复进行利用上述光检测区域移动部的上述光学系统的光检测区域的位置的移动、利用上述光检测部的对来自上述光检测区域的光的检测、利用上述时序光强度数据生成部的时序光强度数据的生成、利用上述平滑处理部的对上述时序光强度数据的平滑处理以及利用上述信号处理部的对来自上述发光粒子的光的信号的检测，
该光分析装置还包括根据到当时为止的上述发光粒子的检测数来修正上述规定的时间间隔的单元。
12.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，
还具有发光粒子检测数显示部，该发光粒子检测数显示部显示在来自上述发光粒子的光的信号的检测开始之后由上述信号处理部所检测出的来自上述发光粒子的光的信号的个数。
13.根据权利要求7所述的光分析装置，其特征在于，
还具有测量结束时间显示部，该测量结束时间显示部显示根据在来自上述发光粒子的光的信号的检测开始之后由上述信号处理部所检测出的来自上述发光粒子的光的信号的个数而估计出的、来自上述发光粒子的光的信号的个数达到预先决定的个数为止的时间。
14.根据权利要求7～13中的任一项所述的光分析装置，其特征在于，
上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031309A1 (ja) 2011-08-26 2013-03-07 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
JP5996625B2 (ja) 2012-02-17 2016-09-21 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP5940651B2 (ja) * 2012-04-18 2016-06-29 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
KR102126032B1 (ko) * 2013-07-31 2020-07-08 삼성전자주식회사 다채널 형광 검출 모듈 및 이를 포함하는 핵산 분석 시스템
WO2015052965A1 (ja) 2013-10-07 2015-04-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP6157326B2 (ja) * 2013-11-11 2017-07-05 オリンパス株式会社 光検出を用いた単一発光粒子検出方法
JP6228858B2 (ja) * 2014-02-06 2017-11-08 日本電子株式会社 粒子解析装置、およびプログラム
JP7029903B2 (ja) * 2017-08-09 2022-03-04 シスメックス株式会社 試料処理装置、試料処理システム、および測定時間の算出方法
LU100777B1 (de) * 2018-04-23 2019-10-23 Cytena Gmbh Verfahren zum Untersuchen einer Flüssigkeit, die wenigstens eine Zelle und/oder wenigstens ein Partikel enthält
CN111157494A (zh) * 2019-12-24 2020-05-15 新绎健康科技有限公司 一种用于对延迟发光进行控制和分析的方法及系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5319575A (en) * 1991-01-22 1994-06-07 Trc Companies, Inc. System and method for determining and outputting airborne particle concentration
CN101946180A (zh) * 2007-12-19 2011-01-12 神谷来克斯公司 单分子检测用扫描分析器和使用方法

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
JPS63225145A (ja) 1987-03-16 1988-09-20 Sasakura Eng Co Ltd 流体中の不純微粒子計測方法及び計測装置
US4885473A (en) 1988-04-29 1989-12-05 Shofner Engineering Associates, Inc. Method and apparatus for detecting particles in a fluid using a scanning beam
US4979824A (en) 1989-05-26 1990-12-25 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High sensitivity fluorescent single particle and single molecule detection apparatus and method
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
EP0836090A1 (en) 1996-10-12 1998-04-15 Evotec BioSystems GmbH Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
DE19723999B4 (de) 1997-06-06 2008-04-10 Schwartz, Margit Vorrichtung zur Messung von Partikelabmessungen in Fluiden
US6710871B1 (en) 1997-06-09 2004-03-23 Guava Technologies, Inc. Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples
GB2326229A (en) 1997-06-13 1998-12-16 Robert Jeffrey Geddes Carr Detecting and analysing submicron particles
SE9800360D0 (sv) 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
KR100560588B1 (ko) 1998-03-16 2006-03-16 에머샘 바이오사이언시즈 코프 공초점 마이크로스코피 영상 시스템
DK1175602T3 (da) 1999-04-29 2003-05-26 Evotec Ag Fremgangsmåde til karakterisering af fluorescente molekyler eller andre partikler, der anvender frembringerfunktioner
US6376843B1 (en) 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
CA2307509A1 (en) 1999-05-04 2000-11-04 Laser Sensor Technology, Inc. Method and apparatus for particle assessment using multiple scanning beam reflectance
WO2000071991A1 (en) 1999-05-25 2000-11-30 Biometric Imaging, Inc. Apparatus and method for optical detection in a limited depth of field
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
DE10035190C5 (de) 2000-07-20 2009-07-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
DE10038528A1 (de) 2000-08-08 2002-02-21 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung
US6563583B2 (en) 2000-10-12 2003-05-13 Amnis Corporation Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects
HU226937B1 (en) 2000-11-17 2010-03-29 Mta Szegedi Biolog Koezpont Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope
JP3999662B2 (ja) 2000-12-14 2007-10-31 オリンパス株式会社 蛍光分析装置および蛍光分析方法
US6782297B2 (en) * 2001-05-24 2004-08-24 Eric Paul Tabor Methods and apparatus for data smoothing
US7668697B2 (en) 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
AU2003283860B2 (en) 2002-11-07 2009-09-17 Erasmus Universiteit Rotterdam Fret probes and methods for detecting interacting molecules
JP4315794B2 (ja) 2002-12-27 2009-08-19 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡
US7038848B2 (en) 2002-12-27 2006-05-02 Olympus Corporation Confocal microscope
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
AU2005290314A1 (en) 2004-09-28 2006-04-06 Singulex, Inc. System and method for spectroscopic analysis of single particles
CN101147055A (zh) 2005-01-31 2008-03-19 伊利诺伊大学评议会 用于表征清澈和混浊介质中的颗粒的方法和设备
JP4757103B2 (ja) 2005-06-13 2011-08-24 学校法人関西文理総合学園 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
WO2007010803A1 (ja) 2005-07-15 2007-01-25 Olympus Corporation 光測定装置
WO2007118209A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Kim Laboratories Apparatus and method for rapid detection of analytes
US8445655B2 (en) 2006-06-16 2013-05-21 Cornell Research Foundation, Inc. Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins
WO2008007580A1 (fr) * 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
US20080052009A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
JP5473202B2 (ja) * 2006-10-13 2014-04-16 滋賀県 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
JP4891057B2 (ja) 2006-12-27 2012-03-07 オリンパス株式会社 共焦点レーザー走査型顕微鏡
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
US7804594B2 (en) 2006-12-29 2010-09-28 Abbott Laboratories, Inc. Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream
JPWO2008099778A1 (ja) 2007-02-14 2010-05-27 株式会社ニコン スリット走査共焦点顕微鏡
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009145242A (ja) 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP5139885B2 (ja) 2008-05-21 2013-02-06 浜松ホトニクス株式会社 蛍光解析装置及び解析方法
JP2009288161A (ja) 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
EA021737B1 (ru) 2008-10-23 2015-08-31 Эм-Ай Эл.Эл.Си. Устройство для определения гранулометрического состава
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
JP5265408B2 (ja) 2009-02-18 2013-08-14 オリンパス株式会社 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2010276380A (ja) 2009-05-26 2010-12-09 Olympus Corp 蛍光相関分光分析装置及び方法並びにそのためのコンピュータプログラム
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP5325679B2 (ja) 2009-07-03 2013-10-23 富士フイルム株式会社 低コヒーレンス光源を用いた動的光散乱測定装置及び光散乱強度測定方法
JP5687684B2 (ja) * 2010-03-01 2015-03-18 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
EP2584343B1 (en) 2010-07-26 2017-05-10 Olympus Corporation Method for detecting dilute particles in solution using luminescent probe
EP2615445B1 (en) 2010-10-13 2014-05-21 Olympus Corporation Method of measuring a diffusion characteristic value of a particle
JP5885738B2 (ja) 2011-04-13 2016-03-15 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
EP2700935A4 (en) 2011-04-18 2014-10-22 Olympus Corp QUANTITATIVE PROCEDURE FOR TARGET PARTICLES, PHOTOMETRIC ANALYSIS DEVICE AND COMPUTER PROGRAM FOR PHOTOMETRIC ANALYSIS
WO2013024650A1 (ja) 2011-08-15 2013-02-21 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013031309A1 (ja) 2011-08-26 2013-03-07 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
CN103765194B (zh) 2011-08-30 2016-02-17 奥林巴斯株式会社 目标粒子的检测方法
JP6010114B2 (ja) 2012-04-18 2016-10-19 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5319575A (en) * 1991-01-22 1994-06-07 Trc Companies, Inc. System and method for determining and outputting airborne particle concentration
CN101946180A (zh) * 2007-12-19 2011-01-12 神谷来克斯公司 单分子检测用扫描分析器和使用方法

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Publication number Publication date
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