CN103930768B - 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序 - Google Patents

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序 Download PDF

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Abstract

提供一种在使用了利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中能够进行与各脉冲状信号对应的发光粒子的种类的识别或分类的方法。在本发明的检测样本溶液中的发光粒子的光的光分析技术中，使光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动，测量来自光检测区域的光的强度来生成光强度数据，在光强度数据上逐个地检测发光粒子的光的信号。然后，根据一个发光粒子的光的信号的强度值和按时间序列的光强度数据上从上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，确定表示发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值，能够利用该指标值进行发光粒子的分类。

Description

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
技术领域
本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”。)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测来自单个发光粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”。)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析技术。作为这样的光分析技术，例如已知有荧光相关光谱分析(FluorescenceCorrelationSpectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)、荧光强度分布分析(Fluorescence-IntensityDistributionAnalysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(PhotonCountingHistogram：PCH。例如专利文献5)等。另外，在专利文献6～8中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。
并且，本申请的申请人在专利文献9～11中提出了利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的、基于与FCS、FIDA等光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在上述的FCS、FIDA等光分析技术的情况下，如果清楚地进行描述，则针对通过连续地测量来自浮游于作为样本溶液内的光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的荧光分子的光而得到的光强度数据执行统计性的运算处理，来检测荧光分子的浓度和/或其它特性。对于此，在专利文献9～11所提出的新的光分析技术中，一边使光检测区域的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时逐个检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐一地进行检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短(在一次测量中反复进行多次秒级时间的测量。)，并且能够在作为观测对象的粒子的浓度低于FCS、FIDA等光分析技术能够良好地测量的水平(1nM左右)的样本溶液中检测发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。因而，期待“扫描分子计数法”在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查且能够检测无法良好地执行FCS、FIDA等的程度的更低浓度的粒子的浓度和/或特性的强力工具。
专利文献1：日本特开2005-098876
专利文献2：日本特开2008-292371
专利文献3：日本特开2009-281831
专利文献4：日本特许第4023523号
专利文献5：国际公开2008-080417
专利文献6：日本特开2007-20565
专利文献7：日本特开2008-116440
专利文献8：日本特开平4-337446号公报
专利文献9：国际公开第2011/108369
专利文献10：国际公开第2011/108370
专利文献11：国际公开第2011/108371
非专利文献1：金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、No.9、1431-1438页1999年
非专利文献2：F.J.Meyer-Alms、荧光相关谱(FluorescenceCorrelationSpectroscopy)、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、204-224页
非专利文献3：加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、No.2、271-277页
非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.GallPNAS96,13756-13761(1999))
非专利文献5：R.Rigler及其他3名、欧洲生物物理杂志、1993年、22卷、169-175页(R.Rigler,U.Mets,J.WidengrenandP.Kask,EuropeanBiophysicsJournal,1993,Volume22,Number3,Pages169-175)
非专利文献6：Machan及其他1名、InternationalJournalofMolecularSciences、2010年、11卷、427-457页(R.MachanandM.HofInt.J.Mol.Sci.2010,11,427-457)
发明内容
发明要解决的问题
另外，在上述的扫描分子计数法中，关于具有相同的发光波长的种类互不相同的发光粒子，很难例如根据发光粒子的明亮度(在同一条件下的观测中为发光强度)来相互区分它们的种类，或者很难进行“发光粒子的分类”(发光粒子的种类的确定或识别，或者检测出的发光粒子是什么样的发光粒子或是哪一种发光粒子的确认或确定)。在扫描分子计数法的情况下，如专利文献9～11也记载的那样，在一个发光粒子通过光检测区域时该发光粒子所发出的光在按时间序列的光强度数据上表现为脉冲状的信号，因此在一个脉冲状信号对应一个发光粒子的假定下，在时序光强度数据上逐个地检测脉冲状信号，从而逐个地检测各发光粒子的存在。在所述结构中，从共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域释放的检测光的强度(从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度)典型地由于激励光的空间分布和/或光学系统的特性而具有以光检测区域的大致中心为顶点的吊钟型的分布，因此即使是同一发光粒子，根据在光检测区域内的位置的不同，测量的发光强度也不同。而且，由于从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度根据发光粒子在光检测区域内的位置的不同而不同，因此无法根据脉冲状信号的发光强度的大小来区分明亮度弱的粒子通过激励光强度强的部位的情况和明亮度强的粒子通过激励光强度弱的部位的情况。即，扫描分子计数法所测量出的发光强度的绝对值不是发光粒子的固有的值，无法利用单个发光粒子的发光强度的差异来相互识别具有相同的发光波长但明亮度互不相同的发光粒子。因而，在多种发光粒子混合存在的样本溶液的情况下，在尽管各发光粒子的明亮度互不相同但这些发光粒子具有相同的发光波长时，无法按种类识别并检测发光粒子。
因而，本发明的主要课题在于提供一种在上述的扫描分子计数法中能够识别或分类与各脉冲状信号对应的发光粒子的种类的新方法。
关于上述课题，本发明的发明人等发现，在扫描分子计数法中，在多次检测到同一发光粒子的情况下，其信号的光强度发生变化，该光强度变化是由发光粒子的扩散所产生的移动引起的。即，多次的信号的光强度变化反映了发光粒子的扩散特性，因此根据多次的信号的光强度变化，能够依据扩散特性进行发光粒子的分类。所述知识在本发明中被有利地利用。
用于解决问题的方案
这样，根据本发明，通过下述装置来达成上述课题，该装置是利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析装置，该光分析装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据上逐个地检测表示来自单个发光粒子的光的信号，其中，信号处理部根据检测出的表示一个发光粒子的光的信号的强度值和按时间序列的光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，来确定表示发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值。
在上述本发明的结构中，“在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。另外，典型的是，光检测部通过对每个规定的测量单位时间(BINTIME)来到的光子数进行计数的光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。并且，“从表示一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域”是指针对表示某一个发光粒子的光的信号的产生时间加上或减去相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间所得到的时间区域。即，所述时间区域是反复巡回的光检测区域通过某一个发光粒子所存在的空间时的光的检测值出现的时间区域(彼此对应同一空间的数据)。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
在作为上述本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。因而，在逐次检测出的光的时序数据(时序光强度数据)中逐个地检测来自发光粒子的光的信号，由此逐个地逐一检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。
在所述结构中，如已经记述的那样，光分析装置中的从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度根据光检测区域内的发光粒子的位置的不同而不同，因此信号的光强度的绝对的值无法直接用于进行具有相同的发光波长但明亮度互不相同的发光粒子的种类的识别或分类。另一方面，在使光检测区域的位置沿着规定的路径巡回时检测的同一发光粒子的光强度的变化反映了在光检测区域的位置巡回的期间因该发光粒子的布朗运动所引起的在与光检测区域的移动方向垂直的面内的位置的变化(平移扩散移动)，如后面详细记述的那样，能够基于光检测区域的巡回移动中的发光粒子的光强度的变化来获取与该发光粒子的平移扩散特性有关的信息。而且，发光粒子的平移扩散特性能够在该发光粒子的种类的识别或分类中利用。因此，在本发明中，为了检测各个发光粒子的平移扩散特性，使光检测区域的位置沿着规定的路径周期性地移动来执行光测量以多次检测同一发光粒子。然后，参照检测出的表示一个发光粒子的光的信号的强度值和按时间序列的光强度数据上从表示一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，即参照在光检测区域的巡回移动的期间来自一个发光粒子所存在的空间的一系列的光的强度值、或光检测区域的巡回移动的期间的同一发光粒子的一系列的信号的强度值，根据这些多个光强度值来确定表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，由此，尝试进行所述各个发光粒子的种类的识别或分类。具体地说，可以根据如上述那样确定的表示发光粒子的平移扩散特性的指标值来确定发光粒子的种类。
在上述本发明的结构的一个方式中，表示发光粒子的平移扩散特性的指标值例如可以是一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比。也如后面的详细说明一栏中所示的那样，与一个信号对应的发光粒子所存在的空间在该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域中包含在光检测区域内。而且，一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值之间的关系、即从同一空间释放的光强度的变化表示光检测区域巡回期间由发光粒子的布朗运动引起的移动的大小程度。即，发光粒子的运动越慢，一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值之间的变化、即光检测区域巡回期间从同一空间释放的光强度的变化小。因而，如上所述，通过参照一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比，来掌握发光粒子的平移扩散特性。实际上，如后述的实施例所示的那样，发现一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比根据发光粒子的平移扩散的容易度而变化。这样，可以采用所述强度值之比作为用于进行发光粒子的种类的识别或分类的指标值。
另外，在本发明的结构的另一方式中，表示发光粒子的平移扩散特性的指标值可以是发光粒子的扩散系数或其函数值。如从上述说明理解的那样，按光检测区域的每次巡回检测的同一发光粒子的信号的光强度的变化对应于光检测区域巡回期间的发光粒子的位置的变化。而且，根据光检测区域每次巡回的同一发光粒子的信号的强度值估算的针对时间的自相关函数值在理论上是根据具有所给予的扩散系数的单个发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的，因此通过使根据所述平移扩散模型得到的理论公式拟合信号的强度值的针对时间的自相关函数值，能够估算单个发光粒子的扩散系数。因此，在本发明中，作为按时间序列的光强度数据上从表示一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，可以使用(在所述时间区域内产生的)表示与该一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值，作为用于进行发光粒子的分类的表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，可以采用通过使根据发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的理论公式拟合根据表示所述的一个发光粒子的光的信号的强度值和表示与该一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值估算的针对时间的自相关函数值而估算出的扩散系数或该扩散系数的函数值。即，每隔光检测区域的移动周期产生的发光粒子的信号是同一发光粒子的信号，因此可以通过使根据平移扩散模型导出的理论公式拟合这些强度值的自相关函数值来确定发光粒子的扩散系数或其函数值，采用所述扩散系数或其函数值作为用于进行发光粒子的分类的指标值。
在上述本发明的装置的信号处理部的处理中，可以根据由光检测部检测出的按时间序列的表示光的信号的轮廓，来进行基于逐次来自光检测部的检测值的信号判断是否一个发光粒子进入到了光检测区域的判断。关于该点，在实施方式中，典型的是，可以在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入到了光检测区域。更具体地说，如后面的实施方式一栏所说明的那样，通常来说，表示来自发光粒子的光的信号的轮廓为在光检测部的按时间序列的检测值、即光强度数据上具有某程度以上的强度的吊钟型的脉冲状，噪声的轮廓不是吊钟型的脉冲状或者其强度变小。因此，本发明的装置的信号处理部可以构成为将时序光强度数据上具有超过规定阈值的强度的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。
并且，本发明的装置的检测对象是来自单个发光粒子的光，因此光强度非常微弱，在一个发光粒子是荧光单分子或多分子等的情况下，发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生信号值的缺失。而且，当产生这样的缺失时，难以确定与一个发光粒子的存在对应的信号。因此，信号处理部可以构成为使按时间序列的光强度数据平滑化，在对数据进行加工以能够忽略微小的时间内的信号值的缺失之后，将平滑化后的时序光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。此外，通过目视等人为地检测在时序光强度数据中存在脉冲状信号的区域是非常麻烦的操作。因此，在实施方式中，信号处理部可以构成为在平滑化后的时序光强度数据的时间微分值中确定吊钟型的脉冲状信号的存在区域，将使吊钟型函数公式拟合脉冲状信号的存在区域中的平滑化后的时序光强度数据所得到的强度值超过规定阈值的脉冲状信号判断为表示来自单个发光粒子的光的信号，从而能够避免通过目视等人为地检测脉冲状信号存在的区域的麻烦。
可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度适当地变更上述本发明的装置中的样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。特别地，如果光检测区域的移动速度变快，则从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是能够适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。另外，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动引起的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，本发明的装置在光检测区域通过发光粒子的存在位置时对从该发光粒子发出的光进行检测来逐个检测发光粒子。然而，发光粒子在溶液中由于进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，导致从一个发光粒子多次检测到(表示发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个(表示发光粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此，如上所述，优选的是本发明的装置构成为能够根据发光粒子的特性(特别是扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。
并且，在本发明的情况下，需要使在光检测区域巡回多次的期间同一发光粒子能够周期性地包含在光检测区域内。因此，优选的是，将光检测区域的移动周期设定得比已被检测出一次的发光粒子通过布朗运动移动相当于光检测区域的大小的距离所需要的时间短。能够通过适当地调节上述移动速度和规定的路径的长度来设定光检测区域的移动周期。
可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动。例如，可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，或者可以(例如移动显微镜的台等)移动样本溶液的位置来移动光检测区域在样本溶液内的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。特别是在变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的情况下，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此作为检测对象的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。
在上述本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将所检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被分类的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来确定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等而能够确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算发光粒子的数密度或浓度。
通过通用的计算机也能够实现上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测来逐个地检测来自单个发光粒子的信号、多次检测同一发光粒子的光并根据其光强度的变化来确定表示该发光粒子的平移扩散特性的指标值的光分析技术的处理。
因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测量来自光检测区域的光的强度，并生成光强度数据；在光强度数据上逐个地检测表示来自单个发光粒子的光的信号；以及根据检测出的表示一个发光粒子的光的信号的强度值和按时间序列的光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，来确定表示上述发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值。此外，通过将计算机程序存储在计算机能够读取的存储介质中来提供。计算机通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现上述步骤。在此，计算机能够读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。另外，在上述结构中，典型的是，在检测来自光检测区域的光来生成按时间序列的光强度数据的步骤中，通过对每个测量单位时间(BINTIME)来到的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。另外，在这种情况下也同样，可以设置根据表示发光粒子的平移扩散特性的指标值来确定发光粒子的种类的步骤。
在上述结构中也同样，作为表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，采用一个发光粒子的信号的强度值与上述一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比。或者，作为按时间序列的光强度数据上从表示一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，可以使用在所述时间区域内产生的表示与一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值，作为表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，可以采用通过使根据发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的理论公式拟合根据表示上述一个发光粒子的光的信号的强度值和表示与该一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值估算的针对时间的自相关函数值而估算出的扩散系数或该扩散系数的函数值。
另外，在上述计算机程序中也同样，可以根据按时间序列的信号的轮廓来进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型的是，可以在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入到了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将平滑化后的时序光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。而且，更详细地说，可以在平滑化后的时序光强度数据的时间微分值中确定吊钟型的脉冲状信号的存在区域，将使吊钟型函数公式拟合所述脉冲状信号的存在区域中的平滑化后的时序光强度数据所得到的强度值超过规定阈值的脉冲状信号判断为表示来自单个发光粒子的光的信号。
并且，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。另外，优选的是，将光检测区域的位置的移动周期设定得比已被检测出一次的发光粒子通过布朗运动移动相当于光检测区域的大小的距离所需要的时间短。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
并且，在上述的计算机程序中也同样，可以包括以下步骤：对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
根据上述本发明的装置或计算机程序，实现如下一种新的光分析方法：一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行各个发光粒子的光的检测，该方法多次检测同一发光粒子的光，根据其光强度的变化来确定表示该发光粒子的平移扩散特性的指标值。
这样，根据本发明，还提供一种方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统测量在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的扩散特性值，该方法的特征在于，包括以下过程：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测量来自光检测区域的光的强度，并生成光强度数据；光强度数据上逐个地检测表示来自单个发光粒子的光的信号；以及根据检测出的表示一个发光粒子的光的信号的强度值和按时间序列的光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，确定表示上述发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值。在所述方法中也同样，典型的是，在检测来自光检测区域的光生成按时间序列的光强度数据的过程中，通过对每个测量单位时间(BINTIME)来到的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。另外，在这种情况下也同样，可以设置根据表示发光粒子的平移扩散特性的指标值来确定发光粒子的种类的过程。
而且，在上述结构中也同样，作为表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，可以使用一个发光粒子的信号的强度值与上述一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比。或者，作为按时间序列的光强度数据上从表示一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，可以使用在所述时间区域内产生的表示与一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值，作为表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，可以采用使根据发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的理论公式拟合根据表示上述一个发光粒子的光的信号的强度值和表示与该一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值估算的针对时间的自相关函数值而估算出的扩散系数或该扩散系数的函数值。
并且，在上述方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的轮廓来进行表示来自各个发光粒子的光的信号的逐个检测。在实施方式中，典型的是，可以在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入到了光检测区域。具体地说，可以将光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号，优选的是，可以使时序光强度数据平滑化，将平滑化后的时序光强度数据上具有超过规定阈值的强度的吊钟型的脉冲状信号检测为表示来自单个发光粒子的光的信号。而且，更详细地说，可以在平滑化后的时序光强度数据的时间微分值中确定吊钟型的脉冲状信号的存在区域，将使吊钟型函数公式拟合所述脉冲状信号的存在区域中的平滑化后的时序光强度数据所得到的强度值超过规定阈值的脉冲状信号判断为表示来自单个发光粒子的光的信号。
另外，可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
并且，在上述方法中也同样，可以包括以下过程：对逐个检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
发明的效果
总的来说，根据本发明，在扫描分子计数法中，能够根据发光粒子的平移扩散特性来进行发光粒子的种类的识别或分类。本发明的方法例如不需要进行发光粒子的调制以使每种粒子具有不同的发光波长，在包含多种发光粒子的样本溶液的存在检测、浓度确定等中是有利的。
另外，在样本溶液包含多种发光粒子的情况下，利用以往的FCS、FIDA也能够进行具有相同的发光波长而种类互不相同的发光粒子的识别。在FCS的情况下，计算平移扩散时间，平移扩散时间表示粒子的扩散特性，在扩散特性不同的多种发光粒子混合存在的样本溶液中，也能够通过参照平移扩散时间来估计多种发光粒子的比例、浓度。另外，在FIDA的情况下，估算每个单个发光粒子的平均的发光强度，在明亮度不同的多种发光粒子混合存在的样本溶液中，也能够按种类估计发光粒子的比例、浓度。关于该优点，本发明也相同，但应该理解的是在本发明的情况下，针对每个单个发光粒子掌握其扩散特性，由此能够针对每个发光粒子对其进行分类。另外，在本发明中，能够对浓度大幅低于FCS、FIDA的情况下的浓度的发光粒子进行分类。根据所述优点，在样本溶液中包含多种、存在数量少的发光粒子的情况，也能够检测各发光粒子的存在或浓度。
通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。
附图说明
图1的(A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动样本溶液内的光检测区域的位置的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是从显微镜的光的前进方向观察到的光检测区域的截面的示意图，示意性地示出通过光检测区域CV内的发光粒子。图2的(D)是在(C)的情况下测量的按时间序列的光强度数据的例子的示意图。图2的(E)表示从光检测区域中的发光粒子释放并被检测出的光的强度的空间分布。
图3的(A)是通过显微镜的光检测区域CV在样本溶液内沿着规定的路径的移动而被包含的空间区域的示意性的立体图。图3的(B)是示意性地在光检测区域巡回的期间发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的运动的例子的图。图3的(C)是针对时间示意性地表示光检测区域在规定的路径上循环的期间发光粒子几乎不移动的情况下检测出的来自发光粒子的光的强度的曲线图。图3的(D)是说明光检测区域的尺寸与发光粒子因布朗运动而引起的(光检测区域的每一个周期的)变位之间的关系的光检测区域的示意图。
图4是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的图。
图5的(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及通过以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图5的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测与单个发光粒子对应的信号的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
图6示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
图7的(A)是说明本发明的确定平移扩散特征量(一个发光粒子的信号强度与光检测区域的一个周期前和一个周期后的时间的光强度值的和之比)的处理的图。图7的(B)示出为了估算本发明的发光粒子的扩散系数而计算的光强度的自相关函数的公式和绘制点(plot)以及拟合曲线。
图8的(A)是以曲线图的形式表示依照通过本发明改进的扫描分子计数法(实施例1)测量出的质粒和荧光色素(TAMRA)的平移扩散特征量的平均值的图，图8的(B)是以曲线图的形式表示(A)的平移扩散特征量的直方图(频度)的图。
图9分别示出依照通过本发明改进的扫描分子计数法(实施例2)测量出的同一发光粒子的信号强度(A)和其自相关函数值以及拟合曲线(B)的例子。
附图标记说明
1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-modeopticalfiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenserlens)；13：针孔；14：屏蔽滤波器；14a：分色镜等；15：多模光纤(multi-modeopticalfiber)；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的优选实施方式。
光分析装置的结构
实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置：在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与通常的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是，在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是荧光性粒子或附加有荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14(在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为中心光强度的1/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个测量单位时间(BINTIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17(使光检测区域的绝对位置移动的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。或者，作为其它的方式，如图1的(D)所例示的那样，使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置来使光检测区域在样本溶液内的相对位置移动(使样本溶液的绝对位置移动的方式)。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。
在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，还可以具备多个光检测器16，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，能够根据来自它们的光的波长分别检测该光。并且，关于光的检测，也可以使用向规定的方向偏振的光作为激励光，选择与激励光的偏振方向垂直的方向的成分作为检测光。在这种情况下，在激励光光路中插入偏振片(未图示)，在检测光光路中插入偏振分束器14a。根据所述结构，能够大幅地降低检测光中的背景光。
计算机18具备CPU和存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的过程。此外，各过程也可以通过硬件构成。本实施方式所说明的处理的全部或一部分可以由计算机18使用存储有实现这些处理的程序的计算机能够读取的存储介质来执行。即，计算机18可以通过读出存储在存储介质中的程序执行信息的加工、运算处理来实现本发明的处理过程。在此，计算机能够读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等，或者也可以将上述程序通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
本发明的光分析技术的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，在本发明的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则在扫描分子计数法中，使光检测区域的位置沿着规定的路径周期性地移动，多次检测同一发光粒子的光，根据其光强度的变化确定表示该发光粒子的平移扩散特性的指标值，由此，根据所述的表示平移扩散特性的指标值，能够进行各发光粒子的种类的识别或分类。下面，说明本发明的扫描分子计数法以及表示平移扩散特性的指标值的估算的原理。
1.扫描分子计数法的原理
在扫描分子计数法所执行的基本处理中，如专利文献9～11所记载的那样，如果清楚地进行描述，则驱动用于移动光检测区域的位置的机构(反射镜偏转器17)来变更光路或者移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，如图2的(A)示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如图2的(B)所描绘的那样在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。通过这样执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测在该期间出现的如图2的(B)所例示那样的脉冲状的信号(有意义的光强度)，来逐个地检测发光粒子，通过对其数量进行计数，能够获取存在于所测量的区域内的发光粒子的数量、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理而是逐一检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过以往的FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
另外，在上述的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域中，由于光检测区域内的激励光的强度分布和/或从物镜通过针孔到达光检测器为止的光学系统的特性，而从通过光检测区域的发光粒子释放并到达光检测器的光的强度根据发光粒子在光检测区域CV内的位置的不同而不同。典型的是，从光检测区域释放并到达光检测器的光的强度的分布如图2的(E)所例示的那样形成为在光检测区域(聚光区域)的大致中心时最大(下面将最大强度的点称为“最大强度点”。)、相对于距最大强度点的放射方向距离(半径r)呈吊钟状的分布。即，即使是明亮度相同的发光粒子(在同一条件下的观测中发光强度实质相等的发光粒子)，根据其通过的位置的不同而检测出的光强度不同。例如图2的(C)那样，在相同明亮度的发光粒子α、β、γ在图示的位置横穿光检测区域CV的情况下，通过光检测区域的大致中心的发光粒子β的光强度高于发光粒子α、γ的光强度(参照图2的(D))。因而，发光粒子的信号的绝对的强度值不是发光粒子固有的值，无法将强度值的差异直接利用于发光粒子的种类的识别或分类。
2.发光粒子的平移扩散特性的检测
如上所述，发光粒子的信号的绝对的强度值无法直接利用于发光粒子的种类的识别或分类，但是如“发明内容”一栏中所提及的那样，同一发光粒子的信号的强度值的变化反映了发光粒子的位置的变化。发光粒子的位置的变化依赖于发光粒子的布朗运动，该位置的变化速度依赖于该发光粒子的平移扩散特性。因此，在本发明中，尝试在检测光检测区域的位置巡回移动的期间同一发光粒子的信号的强度的变化，根据所述的同一发光粒子的信号的变化估算表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，并利用于发光粒子的种类的识别或分类。
具体地说，首先，如图3的(A)示意性地描绘的那样，光检测区域(CV)在样本溶液中以通过规定的路径(例如半径R的圆环)的方式循环。此时，调整光检测区域的移动周期(tcycle)使得在已被检测出一次的发光粒子(在光检测区域中包含过一次的发光粒子)相距光检测区域所通过的空间区域之前，光检测区域到达发光粒子被检测出的空间。这样，在光检测区域沿规定的路径巡回的期间，只要同一发光粒子存在于光检测区域所通过的空间区域，其信号就如图3的(C)那样与光检测区域的移动周期tcycle对应地被周期性地检测到，其信号强度与发光粒子的位置因布朗运动引起的移动(参照图3的(B))对应地，根据发光粒子的位置的不同而变化。而且，发光粒子的位置的变化即运动越快，其信号强度的变化也越大，因此根据信号强度的变化能够确定发光粒子的平移扩散特性。稍后记述具体的表示发光粒子的平移扩散特性的指标值的估算处理。
另外，在发光粒子的扩散系数大到在光检测区域的移动周期tcycle中发光粒子的(平均的)变位超过光检测区域的大小的程度的情况下，难以在光检测区域的每次巡回中都捕捉到同一发光粒子的信号。原因是，对于由光检测区域包含过一次的发光粒子，如果其移动方向偶然地沿着光检测区域的通过区域(规定的路径)，则在光检测区域巡回之后再次被光检测区域包含，但是由于发光粒子在随机的方向上运动，因此在大到在光检测区域的一个周期中发光粒子的(平均的)变位超过光检测区域的大小的程度时，发光粒子被光检测区域包含过一次之后相距光检测区域的通过区域、在光检测区域巡回之后不会再次被光检测区域包含的可能性高。因而，为了捕捉周期性的信号以可靠地达成上述扩散系数D的估算，如图3的(D)例示的那样，优选调整光检测区域的移动周期tcycle以防止在光检测区域的移动周期tcycle中发光粒子的(三维的)变位l超过光检测区域的直径2r。即，在通过本发明的方法进行扩散系数的测量的情况下，优选的是，光检测区域的移动周期tcycle被调整为满足下式。
(2r)2＞2δ·D·tcycle…(1)
(在此，δ为维数，在此δ＝3。)
此外，在实际的测量中，可以在针对要检查的发光粒子设想的扩散系数下，调整光检测区域的移动周期tcycle以使上述式(1)的条件成立。
扫描分子计数法的处理操作过程
在依照使用了图1的(A)所例示的光分析装置1的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的处理：(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，(2)样本溶液的光强度的测量处理，(3)发光粒子信号的检测处理以及(4)表示发光粒子的平移扩散特性的指标值的估算处理。图4示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。
(1)样本溶液的调制
作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。在作为观测对象物的粒子不是发光的粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。样本溶液典型的是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。
(2)样本溶液的光强度的测量(图4-步骤100)
对于本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量，除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a来进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动(样本溶液内的扫描)以外，可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型的是，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，反射镜偏转器17或台位置变更装置17a驱动反射镜7(检电镜)或显微镜的台上的微板9，来执行皿10内光检测区域的位置的移动，与此同时地，光检测器16将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。此外，典型的是，光检测器16是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在通过光子计数进行光的检测的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。适当地设定光子计数中的BINTIME以防止失去信号的轮廓的吊钟状的特征。
关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，一般来说，为了定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据的发光粒子的逐个检测，优选的是，将光强度测量过程中的光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的由随机运动、即布朗运动引起的移动速度快的值。在光检测区域的位置的移动速度比粒子因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图5的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动而进行的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图5的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，与各个粒子对应的光强度的变化的轮廓大致相同(在粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓与激励光强度分布大致相同。参照图6的(A)上部。)，从而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δτ根据以下的平均平方位移的关系式，
(2r)2＝6D·Δτ…(2)
成为
Δτ＝(2r)2/6D…(3)，
因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif＝2r/Δτ＝3D/r…(4)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，在设r为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的例如15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
(3)发光粒子的信号的逐个检测(步骤110～160)
当生成时序光强度数据时，首先，在光强度数据上执行逐个地检测发光粒子的信号的处理。如已经提及的那样，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图5的(B)所示那样为大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号的在光强度数据上的光强度的变化具有反映由光学系统决定的光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。因而，在扫描分子计数法中，基本上在光强度数据上，在超过适当设定的阈值Ith的光强度值持续的时间宽度Δτ处于规定的范围时，判断为具有该光强度的轮廓的信号对应一个粒子通过光检测区域的情形，可以进行一个发光粒子的检测。而且，光强度不超过阈值Ith或者时间宽度Δτ不在规定范围的信号被判断为噪声或异物的信号。另外，在能够假设光检测区域的光强度分布是高斯分布时，
==A·e×p(-2t2/a2)…(5)
在使式(5)拟合有意的光强度的轮廓(能够清楚判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，判断为该光强度的轮廓对应一个粒子通过光检测区域的情形，可以进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判断为噪声或异物的信号，在之后的分析等中可以忽略。)
在时序光强度数据上的信号的检测处理的一个例子中，首先针对光强度数据(图5的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图4的-步骤110、图5的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BINTIME，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光强度数据的时间运算一次微分值(步骤120)。光强度数据的时间微分值如图5的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值的变化时刻值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。
然后，在光强度数据上，逐次检测有意义的脉冲信号(步骤130～160)。具体地说，首先在光强度数据的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图5的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。然后，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的轮廓的参数而设想的范围内、即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内，例如是否满足下述的条件等(步骤150)，即
20μs<脉冲宽度<400μs
峰值强度>1.0[pc/10μs]…(A)
相关系数>0.95。
这样，如图6的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判断为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图6的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。此外，可以与发光粒子的信号的检测同时地执行信号数的计数、即发光粒子的计数。
可以在光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。此外，根据光强度数据逐个检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。
(4)表示发光粒子的平移扩散特性的指标值的估算处理(步骤170)
如上所述，当进行发光粒子的信号的逐个检测时，利用光检测区域巡回移动的期间来自各发光粒子的光强度的变化，估算表示各发光粒子的平移扩散特性的指标值。作为所述指标值，可以采用(i)一个发光粒子的信号的强度值与该一个发光粒子的信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比(以下称为“平移扩散特征量”。)以及(ii)发光粒子的扩散系数中的任一个。下面说明各个指标值的估算处理。
(i)“平移扩散特征量”的估算处理
如与图3相关联地说明的那样，由于光检测区域沿规定的路径周期性地循环，因此在时序光强度数据中，按光检测区域的移动周期测量来自同一空间区域的光强度值。因而，从直到步骤160为止检测出的各发光粒子的信号的产生时间起进行计量的之前的相当于光检测区域的移动周期的时间的时间区域和之后的相当于光检测区域的移动周期的时间的时间区域中的光强度值分别反映了与各信号对应的发光粒子所存在的空间的一周期前和一周期后的状态，由空间内的发光粒子的位置决定。然后，通过将发光粒子的信号的光强度值与从该信号的产生时间起进行计量的之前的相当于光检测区域的移动周期的时间的时间区域和之后的相当于光检测区域的移动周期的时间的时间区域中的各个光强度值进行比较，由此估计光检测区域的移动周期中的发光粒子的位置变化的容易度、即发光粒子的平移扩散的容易度。
因此，在本实施方式中，作为表示发光粒子的平移扩散特性的指标值，对于直到步骤160为止检测出的各个发光粒子的信号，采用信号的光强度值与各信号前后的相距相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的光强度值的和之比(平移扩散特征量)。具体地说，可以根据一个发光粒子的信号的脉冲存在区域中的光子数pc、之前的相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域ΔTf中的光子数p-1以及之后的相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域ΔTr中的光子数p+1，通过下式定义平移扩散特征量。
(平移扩散特征量)＝(p-1+p+1)/pc…(6)
此外，时间区域ΔTf、ΔTr的宽度可以通过实验或在理论上任意地设定，典型的是，可以是光检测区域通过与光检测区域的最大直径相当的距离所需要的时间。根据该平移扩散特征量，如图7的(A)示意性地描绘的那样，在较大的粒子的情况下(左图)，布朗运动引起的移动速度慢，在同一空间区域内滞留的时间长，因此信号的光强度(光子数pc)与该信号的产生时间之前的光检测区域的位置的移动周期tcycle的时间区域和之后的光检测区域的位置的移动周期tcycle的时间区域内的光强度(光子数p-1、p+1)之差比较小，因而，通过式(6)定义的平移扩散特征量大。另一方面，在较小的粒子的情况下(右图)，布朗运动引起的移动速度快，在同一空间区域内滞留的时间短，因此信号的光强度(光子数pc)与该信号的产生时间之前的光检测区域的位置的移动周期tcycle的时间区域和之后的光检测区域的位置的移动周期tcycle的时间区域内的光强度(光子数p-1、p+1)之差比较大，或者还存在发光粒子不存在于同一空间内的情况，因而，通过式(6)定义的平移扩散特征量小。这样，平移扩散特征量表示发光粒子的平移扩散特性，是发光粒子所固有的值，因此能够利用于发光粒子的种类的识别或分类。
(ii)发光粒子的扩散系数的估算处理
再次参照图3的(A)～(C)，如图3的(A)那样，在使光检测区域循环的期间发光粒子滞留在光检测区域CV存在于某位置时被包含的空间内时，发光粒子的信号(脉冲状的信号)如图3的(C)所例示的那样大致在光检测区域的每个移动周期tcycle出现。在该期间，如已经记述的那样，发光粒子的位置因布朗运动而变化，因此一系列的信号的光强度发生变化。关于该点，所述光强度的变化反映了从发光粒子的光检测区域的最大强度点起在放射方向上的位置的变化时，光检测区域沿一个方向移动，因此各信号的峰值强度的变化如图3的(B)所例示的那样能够视为是由发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散运动引起的。
当假设在与光检测区域的移动方向垂直的面内发光粒子的平移扩散运动遵照二维的布朗运动的平移扩散模型时，通过下式给出扩散系数D的发光粒子的光强度的针对时间的自相关函数(非专利文献5、6)。
[数1]
G ( &tau; ) = 1 + 1 N 1 ( 1 + 4 D&tau; W O 2 ) 1 2 ( 1 + 4 D&tau; W Z 2 ) 1 2 &CenterDot; &CenterDot; &CenterDot; ( 7 )
在此，N为光检测区域内的平均粒子数，τ为延迟时间，Wo为光检测区域的短轴半径，Wz为光检测区域的长轴半径(参照图1的(B))。在本发明的情况下，N＝1，并且当设AR＝Wz/Wo时，式(7)为
[数2]
G ( &tau; ) = 1 + 1 1 1 ( 1 + 4 D&tau; W O 2 ) 1 2 ( 1 + 1 A R 2 4 D&tau; W 0 2 ) 1 2 &CenterDot; &CenterDot; &CenterDot; ( 8 ) .
另一方面，通过下式计算根据发光粒子的信号的光强度计算的针对时间的自相关函数。
[数3]
G ( &tau; ) = &lang; ( t ) I ( t + &tau; ) &rang; &lang; I ( t ) &rang; 2 &CenterDot; &CenterDot; &CenterDot; ( 9 )
这样，在本实施方式中，首先，在直到步骤160为止检测出的发光粒子的信号中，抽出在光检测区域的每个移动周期中出现的信号的组。在所述抽出中，可以在时序光强度数据中，选择一个发光粒子的信号，将存在于从该信号的产生时间起进行计量而相距相当于光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的发光粒子的信号视作同一发光粒子的信号而选择出来，形成为一个发光粒子的信号的组。另外，在时序光强度数据的整个区域中执行所述操作，因而，在一个时序光强度数据中，可以抽出多组单个发光粒子的信号的组。这样，当抽出发光粒子的信号的组时，如图7的(B)所示，通过式(9)计算各组的光强度的自相关函数值，之后，使基于上述所说明的平移扩散模型导出的理论公式(图中的虚线)拟合自相关函数值(图中的绘制点)来估算扩散系数D。在所述的一系列处理中，在计算光强度的自相关函数值时，可以设为Δt＝tcycle，如图7的(B)中所示的那样，在发光粒子的信号的组中，对于产生时间相距一个周期的信号的组(τ＝Δt)、相距两个周期的信号的组(τ＝2Δt)、相距三个周期的信号的组(τ＝3Δt)、…各组，与式(9)对应地计算自相关函数值(因而，随着τ的大小变大而式(9)的分子的项数减少。)。另外，关于基于平移扩散模型导出的理论公式，在本实施方式的情况下，计算自相关函数值的光强度值的个数和计算出的自相关函数值的个数比较少，难以良好地使式(7)、(8)进行拟合。因此，在本实施方式中，优选的是，可以仅使描述理论公式(8)中的变化的项即第二项拟合自相关函数值。即，作为拟合公式，可以采用如下述那样修正式(8)得到的公式。
[数4]
G ( &tau; ) = K ( 1 + 4 D&tau; W O 2 ) 1 2 ( 1 + 1 A R 2 4 D&tau; W 0 2 ) 1 2 &CenterDot; &CenterDot; &CenterDot; ( 10 )
在此，K为常数，通过拟合来决定。此外，在拟合中，例如也可以不是估算扩散系数D而是估算对扩散系数乘以常数得到的函数值等，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
这样，针对每个发光粒子确定上述的(i)平移扩散特征量或(ii)扩散系数(或其函数值)。如已经记述的那样，这些值能够设为发光粒子固有的值，因此能够利用这些值按每个发光粒子进行其种类的识别或分类。
(5)其它分析
当通过上述处理获得时序光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，还可以执行发光粒子浓度计算等各种分析。
例如在对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定发光粒子的个数的情况下，如果能够通过任意的方法估算出光检测区域所通过的区域的总体积，则能够根据其体积值和发光粒子的个数确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是可以通过实验，例如根据针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数所检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来确定。具体地说，例如当针对发光粒子的浓度C的对照溶液，将对照溶液的发光粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。
Vt＝N/C…(11)
具体地说，例如可以准备发光粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积Vt。而且，当给出Vt时，发光粒子的计数结果为n的样本溶液的发光粒子的浓度c通过下式给出。
c＝n/Vt…(12)
此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，对于所设想的光检测区域的移动图案，可以将针对各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(12))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。应该理解的是，根据本发明，能够利用平移扩散特征量或扩散系数，针对每个单个发光粒子进行种类的识别或分类，因此也能够针对(能够识别的)每种发光粒子确定浓度。
为了验证上述所说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，下面的实施例例示本发明的有效性，应该理解不是限定本发明的范围。
实施例1
在扫描分子计数法中，针对在时序光强度数据上检测出的各个发光粒子的信号，估算出通过式(6)定义的平移扩散特征量。
作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.05％Tween20)中包含100fM的荧光色素TAMRA(M.W.430.45Sigma-AldrichCat.No.C2734)作为发光粒子的溶液，以及在磷酸缓冲液中包含1pM的质粒(pbr3222.9MDatakara-bio株式会社Cat.No.3035)和10nM的DNA嵌入剂荧光色素SYTOXOrange(Invitrogen公司、Cat.No.S-11368)的溶液(SYTOXOrange与单个质粒结合形成单个发光粒子。)。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述两个样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用543nm的激光，利用带通滤波器测量560nm-620nm的波长频带的光，生成了时序光子计数数据。将样本溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为6000rpm(15mm/s)，将BINTIME设为10μs，进行了两秒钟的测量。
在光测量后的数据处理中，首先，在获取到的时序光子计数数据中，依照“(3)发光粒子的信号的逐个检测”和图4的步骤110～160所记载的要点，对时序光子计数数据实施光滑处理，在平滑后的数据中确定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只抽出满足下述的条件的脉冲信号作为发光粒子的信号，
20μs<脉冲宽度<400μs
峰值强度>1[pc/10μs]…(A)
相关系数>0.95。
接着，针对各发光粒子信号计算式(6)的平移扩散特征量。将之前的相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域ΔTf设为信号的峰值时之前的10.05ms～9.95ms的区间，将之后的相当于光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域ΔTr设为信号的峰值时之后的9.95ms～10.05ms的区间。
图8的(A)示出荧光色素分子TAMRA以及通过SYTOXOrange染色后的质粒的平移扩散特征量的平均值(直方图)和标准偏差(误差条)，图8的(B)示出了平移扩散特征量的产生频度(直方图)。参照该图，关于平移扩散特征量，大而运动慢的质粒的平移扩散特征量的平均值(0.87)为大幅地大于小而运动快的荧光色素分子TAMRA的平移扩散特征量的平均值(0.18)的值。另外，如参照直方图显而易见地，质粒的平移扩散特征量与荧光色素分子TAMRA的平移扩散特征量的直方图的重复部分少。实际上，当将从质粒的平移扩散特征量的平均值减去1SD得到的0.6设为基准值时，基准值以下的信号(被判断为荧光色素分子TAMRA的信号的信号)中荧光色素分子TAMRA的信号为85％，基准值以上的信号(被判断为质粒的信号的信号)中质粒的信号为89％。其结果，示出了能够通过平移扩散特征量实质地识别两个发光粒子的种类。
实施例2
在扫描分子计数法中，对于在时序光强度数据上检测出的各个发光粒子的信号，通过“(ii)发光粒子的扩散系数的估算处理”所记载的处理，针对每个发光粒子估算扩散系数。
作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.05％Tween20)中包含1pM的质粒(pbr3222.9MDatakara-bio株式会社Cat.No.3035)和10nM的DNA嵌入剂荧光色素SYTOXOrange(Invitrogen公司、Cat.No.S-11368)的溶液。与实施例1同样地进行了光的测量和发光粒子信号的逐个检测。其中，激励光使用633nm的激光。之后，从检测出的发光粒子信号中抽出同一发光粒子的信号的组，针对每个组计算式(9)的自相关函数值，使式(10)拟合计算出的自相关函数值，估算出扩散系数D和光检测区域的短轴半径Wo。此外，将式(10)中的AR设为3.5。
图9的(A)分别示出了在时序光强度数据中检测出的发光粒子信号中的、被确定为是同一发光粒子的信号的信号组中的各信号的峰值强度的例子，图9的(B)分别示出了对应的信号组的峰值强度的自相关函数值(绘制点)和拟合曲线(虚线)。参照该图，式(10)与自相关函数值良好地拟合。而且，在图示的例子中，估算出的扩散系数D和光检测区域的短轴半径Wo如下面那样。
[表1]
粒子 1 2 3 4 平均
D(×(1012m2/scc) 7.2 2.1 6.8 2.2 4.6
W(μm) 0.29 0.42 0.32 0.49 0.38
考虑在测量中使用的质粒在水溶液中的分子的形体介于球状与棒状之间，其扩散系数在理论上被估计为4.2～22×10-12m2/s，因此上述结果与理论上的估计一致。另外，光检测区域(共焦区组织)的半径(Wo)在设计上为大约0.4μm，因此上述结果与设计值大致一致。这些结果示出了在扫描分子计数法中，多次检测同一发光粒子的信号，能够估算发光粒子的扩散系数，由此，能够获得与粒子在水溶液中的动态特性、即大小(分子量、形态)有关的信息，能够进行发光粒子的分类。
这样，如从上述实施例的结果理解的那样，依照本发明的教导表明，能够在扫描分子计数法中针对各发光粒子逐个地确定表示发光粒子在与光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值，所述指标值能够在发光粒子的种类的识别或分类中利用。

Claims (8)

1.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光的光分析装置，该光分析装置的特征在于，包括：
光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；
光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及
信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据上逐个地检测表示来自单个发光粒子的光的信号，
其中，上述信号处理部根据检测出的表示一个发光粒子的光的上述信号的强度值和上述按时间序列的光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，来确定表示上述发光粒子在与上述光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
根据表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值来确定上述发光粒子的种类。
3.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值是一个发光粒子的信号的强度值与上述一个发光粒子的信号前后的相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比。
4.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
上述按时间序列的光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值是在上述时间区域内产生的表示与上述一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值，表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值是通过使理论公式拟合针对时间的自相关函数值而估算出的扩散系数或该扩散系数的函数值，其中，上述理论公式是根据上述发光粒子在与上述光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的，上述针对时间的自相关函数值是根据表示上述一个发光粒子的光的信号的强度值和表示与上述一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值估算出的。
5.一种利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统测量在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的扩散特性值的方法，其特征在于，包括以下过程：
使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；
一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域的光的强度，并生成光强度数据；
在上述光强度数据上逐个地检测表示来自单个发光粒子的光的信号；以及
根据检测出的表示一个发光粒子的光的上述信号的强度值和按时间序列的上述光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值，来确定表示上述发光粒子在与上述光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散特性的指标值。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
还包括以下过程：根据表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值来确定上述发光粒子的种类。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值是一个发光粒子的信号的强度值与上述一个发光粒子的信号前后的相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的时间的时间区域内的强度值的和之比。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
按时间序列的上述光强度数据上从表示上述一个发光粒子的光的信号的产生时间起进行计量而相距相当于上述光检测区域的位置的移动周期的整数倍的时间的时间区域内的强度值是在上述时间区域内产生的表示与上述一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值，表示发光粒子的平移扩散特性的上述指标值是通过使理论公式拟合针对时间的自相关函数值而估算出的扩散系数或该扩散系数的函数值，其中，上述理论公式是根据上述发光粒子在与上述光检测区域的移动方向垂直的面内的平移扩散模型导出的，上述针对时间的自相关函数值是根据表示上述一个发光粒子的光的信号的强度值和表示与上述一个发光粒子相同的发光粒子的光的信号的强度值估算出的。
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