CN105431759B - 利用单个发光粒子检测技术的光学显微镜装置、显微镜观察法以及用于显微镜观察的计算机程序 - Google Patents

利用单个发光粒子检测技术的光学显微镜装置、显微镜观察法以及用于显微镜观察的计算机程序 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用扫描分子计数法的方法能够检测在有厚度的样本中位置动态地变化的发光体或发光粒子的显微镜观察技术。在本发明的光学显微镜观察技术中，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在液体中运动的发光粒子(LP)的光来检测发光粒子(LP)。在处理操作中，一边使光检测区域(CV)的位置在将显微镜的观察对象区域(ObR)分割为多个所得到的每个观察小区域(OsR)内移动一边检测来自所述光检测区域(CV)的光，来逐个检测来自所述发光粒子(LP)的光的信号，决定与检测信号对应的发光粒子(LP)在观察对象区域(ObR)内的位置。另外，各个所述观察小区域(OsR)中的所述光检测区域(CV)的位置的移动在每个所述观察小区域(OsR)内沿至少两个方向连续地和/或沿同一方向连续地执行多次。

Description

利用单个发光粒子检测技术的光学显微镜装置、显微镜观察 法以及用于显微镜观察的计算机程序
技术领域
本发明涉及一种光学显微镜观察技术，该光学显微镜观察技术对液体中的原子、分子或者它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”。)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或者非生物学的粒子进行检测或者使它们图像化，更详细地说，涉及一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统来逐个地检测来自单个发光的粒子的光的利用单个发光粒子检测技术的光学显微镜装置、显微镜观察法以及用于显微镜观察的计算机程序。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”。)可以是其自身发出光的粒子以及附加有任意的发光标识或发光探针的粒子中的任一个，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术
由于近年来的光测量技术的发展，通过荧光单分子水平的微弱光的检测/测定能够进行光学显微镜观察以及显微镜像的图像化(二维或三维中的像的位置的确定)。例如专利文献1等所记载的那样，根据包括激光扫描型共焦显微镜和超高灵敏度的光检测器的显微镜装置，通过一边使作为显微镜的光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)在样本内以对样本内进行扫描的方式移动一边检测来自光检测区域的光，能够使样本内的状态图像化。在所述的共焦显微镜的光学系统的情况下，由于从光检测区域之外发出的光被遮断并未到达光检测器，因此能够进行荧光单分子水平或单光子水平的微弱光的检测/测定，因而，能够基于那样的微弱光进行图像化。另外，作为利用荧光单分子水平的微弱光进行的光学显微镜观察和显微镜像的图像化的其它方法，如专利文献2等所记载的那样，还提出了利用倏逝光的显微镜装置。在所述的利用倏逝光的显微镜装置的情况下，仅在玻璃盖片的表面附近的～100nm左右的较薄的区域提供激励光，不存在从该较薄的区域以外的光释放，因此显微镜像中的背景光被大幅地降低，由此能够获得荧光单分子水平或单光子水平的微弱光所成的像。
另外，本申请的申请人在专利文献3～8等提出了一种能够检测分散或溶解于液体中的发光粒子的新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”。)。在该扫描分子计数法中，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，一边使光检测区域的位置移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含有在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时逐个地检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。
专利文献1：日本特开2005-017642
专利文献2：日本特开2006-162994
专利文献3：国际公开第2011/108369
专利文献4：国际公开第2011/108370
专利文献5：国际公开第2011/108371
专利文献6：国际公开第2012/050011
专利文献7：国际公开第2012/053355
专利文献8：国际公开第2013/031439
发明内容
发明要解决的问题
在上述的激光扫描型共焦显微镜装置的情况下，典型地利用光栅扫描方式二维或三维地扫描观察对象区域，使检测出的光强度值与观察对象区域内的位置信息关联地构成显微镜像。在光栅扫描方式的情况下，通常一边使光检测区域在观察对象区域内沿某一个方向往复运动，一边使光检测区域的往复运动的路径沿另一个方向移位，来形成观察对象区域内的图像。而且，在检测出的光强度微弱的情况下，反复进行相同区域的扫描，执行光强度的累计。在所述结构的情况下，在扫描观察对象区域所需的时间内，在观察对象区域内实质上静止的发光体或发光粒子的图像能够清晰地形成，但是对于扩散、输送等处于动态的状态的发光体或发光粒子，在观察对象区域的多次扫描的期间发光体或发光粒子的位置发生移动，无法获得有效的累计效果。另一方面，在利用倏逝光的显微镜装置的情况下，观察对象区域被限定在玻璃盖片的表面，因此很难使有厚度的样本中的发光体或发光粒子的像图像化。
另外，如已经提及的那样，根据使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统一边使光检测区域在液体中移动一边检测发光粒子的存在的扫描分子计数法的方法，能够检测来自在有厚度的样本中位置动态地变化的发光体或发光粒子的微弱光。因而，在基于显微镜观察的图像化中，如果利用扫描分子计数法的方法，似乎能够达成在有厚度的样本中位置动态地变化的发光体或发光粒子的图像的形成。
这样，本发明的主要课题在于提供一种能够利用扫描分子计数法的方法形成在有厚度的样本中位置动态地变化的发光体或发光粒子的图像的显微镜装置、显微镜观察法以及用于该显微镜观察法的计算机程序。
用于解决问题的方案
根据本发明的一个方式，通过以下的装置来达成上述的课题，该装置为使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子的光学显微镜装置，包括：光检测区域移动部，其使光检测区域的位置按将显微镜的视野内的观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在各个观察小区域中移动一边由光检测部进行检测而得到的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个发光粒子的光的信号特征的信号，确定与检测出的信号对应的各个发光粒子在观察对象区域内的位置。
在上述结构中，“在样本液体中运动的发光粒子”可以是在任意的液体中、例如细胞内或细胞小器官内处于能够运动的状态的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子。发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜下检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜下，特别地根据物镜与针孔之间的位置关系来确定。)。“观察对象区域”是指显微镜的视野内的、在本装置中被图像化的二维或三维的区域，“观察小区域”是将“观察对象区域”虚拟地分割成格子状或栅格状所得到的多个区域的各个区域。另外，光检测部可以是使用通过对每隔规定的测量单位时间(BIN TIME)到来的光子数进行计数的光子计数检测来自光检测区域的光的形式的光检测器的结构，在该情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，就是指表示来自发光粒子的光的信号。
如从上述理解的那样，在本发明的基本结构中，如果激光扫描型的共焦显微镜或多光子显微镜那样，在样本液体中“光检测区域”(共焦区组织)的位置在规定的二维或三维空间内被移动，即通过光检测区域对样本液体内的二维或三维空间(“观察对象区域”)进行扫描，由此检测从“观察对象区域”发出的光。然而，在本发明的情况下，特别地，利用光检测区域对观察对象区域内进行扫描的方式和检测出的光的信号处理方式与通常情况不同。即，在本发明中，利用光检测区域的扫描在将“观察对象区域”虚拟地分割成格子状或栅格状所得到的每个“观察小区域”内连续地执行多次，在移动的光检测区域包含有液体中的发光粒子时检测出来自发光粒子的光(扫描分子计数法的光测量)。而且，在通过这样获得的检测光的时序光强度数据的处理中，以在每个“观察小区域”内检测有无来自发光粒子的光的信号的方式进行存在于该区域内的发光粒子的逐个检测(扫描分子计数法的发光粒子的逐个检测)，在存在发光粒子的情况下，进行在观察对象区域内的位置的确定。即，在本发明的结构中，在显微镜观察时，对每个观察小区域应用扫描分子计数法的原理，来对每个观察小区域检测发光粒子的存在。
根据所述结构，由于观察小区域的尺寸充分地小于观察对象区域的尺寸，因此以能够逐个地且有意地检测来自各个发光粒子的微弱的光来确定各个发光粒子的位置的扫描速度对各观察小区域进行扫描所需的时间变短。即，由于某一个发光粒子的检测所花费的扫描时间变短，因此即使在发光粒子的位置随时间而变化的情况下，也能够在其位置大幅变化之前更可靠地达成来自该发光粒子的光的有意的多次检测。另外，在本发明的结构中，在样本液体中的光检测区域的位置(与利用倏逝光的显微镜观察法不同)不被限定在样本容器的表面附近，因此即使是在有厚度的样本液体中的内部远离样本容器的表面附近的场所运动的发光粒子也能够进行其存在的检测以及位置的确定。应该理解的点在于，在本发明的结构中，由于能够确定检测出的发光粒子的位置，因此能够将观察对象区域内的发光粒子的存在位置表现为二维或三维的图像。此外，关于确定的发光粒子的位置，首先能够将观察对象区域内的观察小区域的位置确定为发光粒子的位置。另外或者进一步，根据发光粒子的检测的实施方式，而能够如后面的实施方式一栏说明的那样确定观察小区域内的发光粒子的位置。
在上述结构中，在各个观察小区域内的光检测区域的位置的连续多次的移动、即通过光检测区域对各观察小区域的多次的扫描，在一个方式中可以在每个观察小区域内沿至少两个方向连续地执行。例如可以连续地执行一个观察小区域内的X方向的扫描和Y方向的扫描、或者连续地执行X方向的扫描、Y方向的扫描以及Z方向的扫描。在该情况下，如在后面的实施方式一栏中详细说明的那样，能够确定一个观察小区域内的发光粒子的X方向和Y方向的位置或确定一个观察小区域内的发光粒子的X方向、Y方向以及Z方向的位置。另外，利用光检测区域对各观察小区域的多次扫描也可以沿同一方向连续地执行。在该情况下，在观察小区域内存在发光粒子时，能够进行其光的累计，或者能够基于多次扫描时的位置偏移来获得关于发光粒子的移动特性或平移扩散特性的信息。在此，应该理解的是，由于在尺寸小的每个观察小区域执行多次扫描，因此在该扫描时间内同一发光粒子从扫描中的观察小区域离开的可能性变低，因而，能够在多次扫描中检测出同一发光粒子的光的可能性变高(同一发光粒子的光的多次扫描中的检测的成立率变高)。
上述的观察小区域的尺寸决定光检测区域扫描观察小区域所需的时间，因此具体地说，可以根据光检测区域的尺寸来确定。关于该点，如上述所提及的那样，为了在光检测区域的多次扫描的期间更可靠地捕捉同一发光粒子的光，优选为事先调整观察小区域的尺寸使得在光检测区域的扫描时间中同一发光粒子不会离开。因而，较佳的是，观察小区域的尺寸被设定成在使光检测区域的位置在观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的(预测的)移动距离比观察小区域的尺寸小。
另外，在观察小区域内光检测区域沿某一个方向移动时，光检测区域通过一次的移动而能够网罗观察小区域的整个区域的方式会缩短扫描时间。因而，优选的是，观察小区域的一边的长度被设定为与光检测区域的直径大致相等。关于该点，如在后面的实施方式一栏中详细说明的那样，在利用扫描分子计数法的发光粒子的检测中，典型的是，在光检测区域通过发光粒子的存在位置时，具有吊钟型的轮廓的脉冲状的光强度的时间变化被捕捉为来自发光粒子的光的信号。所述吊钟型的轮廓是由于以下原因而形成的：从光检测区域内的发光粒子释放并被检测出的光的强度根据发光粒子在光检测区域内的位置而变化，该光的强度分布是随着发光粒子的位置从光检测区域内的大致中心朝向周缘移动而光的强度降低的吊钟型的分布。因而，为了更可靠地捕捉来自存在于观察小区域内的发光粒子的光的信号，优选在从检测光生成的按时间序列的光强度数据中出现来自发光粒子的光的信号的吊钟型的轮廓。另一方面，发光粒子可能存在于从观察小区域的中心偏移的位置。即，关于也包含存在于从观察小区域的中心偏移的位置的发光粒子在内的存在于观察小区域的整个区域的所有发光粒子，为了捕捉它们的信号的吊钟型的轮廓，需要使光检测区域的边缘部分在观察小区域的整个区域通过。因此，优选的是，光检测区域的行进方向的前边缘和后边缘通过观察小区域的在光检测区域的行进方向上的两条边(或两面)。因而，在上述的本发明中，更优选的是，关于各个观察小区域中的光检测区域的位置的一次移动，光检测区域的其行进方向的前边缘通过观察小区域一个边缘起直到光检测区域的其行进方向的后边缘到达观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。此外，优选的是，在执行扫描的全部方向(X、Y、Z)上应用所述的光检测区域的位置的一次移动的方式。根据所述结构，基于发光粒子的信号的吊钟型的轮廓的解析还能够确定存在于观察小区域内的发光粒子在观察小区域内的位置(参照后述的实施方式一栏)。
在上述结构中，关于扫描时光检测区域的位置的移动速度，可以根据成为观测对象的发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度适当地变更。特别地，当光检测区域的移动速度快时，检测出的光量降低，因此为了能够高精度地或高灵敏度地测量检测光量，优选的是能够适当地变更光检测区域的移动速度。关于该点，更佳的是，光检测区域的位置的移动速度被设定为比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动引起的粒子的平均的移动速度)高。如已经提及的那样，在采用了“扫描分子计数法”的方法的本发明的观察技术中，在光检测区域包含发光粒子时检测来自该发光粒子的光，在检测出该发光粒子的存在时，发光粒子由于布朗运动而随机地移动，在(一次的扫描中)多次出入光检测区域的情况下，从一个发光粒子多次检测到表示其存在的信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上所述，光检测区域的移动速度被设定为比发光粒子的扩散移动速度高，从而能够使一个发光粒子对应一个(表示发光粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度根据发光粒子的特性而改变，因此如上所述那样，优选的是能够与发光粒子的特性(特别是扩散常数)相应地适当变更光检测区域的移动速度。
可以通过任意的方式进行光检测区域的位置的移动。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，或者，可以(例如移动显微镜的台等来)移动样本溶液的位置，从而移动光检测区域的在样本溶液内的相对位置。能够通过调节物镜的高度方向位置或台的高度方向位置、或者使从物镜的后端出入的光束成为收敛光或扩散光(而非平行光)的机构来达成物镜的光轴方向的移动。
另外，在上述的本发明的显微镜观察技术中，在采用了扫描分子计数法的发光粒子的逐个检测的方法时，在扫描分子计数法中，能够通过任意的方法检测其光的特性、光的信号的产生时刻等，由此能够获取与所述发光粒子的状态或特性有关的信息、尤其是与发光粒子的大小有关的信息(专利文献6-7)。因而，在上述的本发明中，可以构成为信号处理部使用通过每个观察小区域的多次的光检测区域移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与发光粒子的大小有关的信息。作为所述的发光粒子的信号的特性，具体地说，可以是表示发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示发光粒子的旋转扩散特性的指标值。此外，在所述结构中，在本发明的情况下，应该理解的是，在观察对象区域内发光粒子的位置被确定的状态下、或者作为图像表现出发光粒子的位置的状态下，能够获得与各个发光粒子的大小有关的信息。
另外，如已经记述的那样，针对本发明所检测出的发光粒子确定其在观察对象区域内的位置，能够表现为图像。因而，能够将发光粒子的位置叠加在通过任意的方法生成的观察对象区域的显微镜图像(例如透过光像、落射荧光像等)中来表现。因而，在本发明的装置中，可以生成绘制图像，该绘制图像是将在观察对象区域内的位置已确定的发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的观察对象区域的显微镜图像中所得到的。根据所述结构，优点在于能够将发光粒子的位置与观察对象区域的通过其它方法得到的显微镜图像、例如细胞、细胞小器官的显微镜图像重叠来进行观察。另外，此时，在能够检测发光粒子的大小、其它特性的情况下，能够与细胞、细胞小器官的显微镜图像重叠地参照发光粒子的特性，由此能够期待获得更多种的信息。
另外，根据“扫描分子计数法”，对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域内的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)，或者能够获得与发光粒子的浓度有关的信息。因而，本发明的信号处理部可以构成为根据检测出的发光粒子的个数来确定观察对象区域中的发光粒子的个数或液体中的发光粒子的浓度。在所述结构中也同样地，优点在于能够将发光粒子的浓度与观察对象区域的通过其它方法得到的显微镜图像配合来进行观察。
使用通用的计算机也能够实现通过上述的本发明的装置进行的采用了扫描分子计数法的方法的显微镜观察技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光学显微镜观察用计算机程序，其用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子，该计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤：使光检测区域的位置按将显微镜的视野内的观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次；检测来自光检测区域的光；以及生成一边使光检测区域的位置在各个观察小区域中移动一边检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个发光粒子的光的信号特征的信号，确定与检测出的信号对应的各个发光粒子在所述观察对象区域内的位置。
在所述计算机程序中也可以为，各个观察小区域中的光检测区域的位置的移动在每个观察小区域内沿至少两个方向连续地和/或沿同一方向连续地执行多次。观察小区域的尺寸可以根据光检测区域的尺寸来确定，优选的是，观察小区域的尺寸可以被设定成在使光检测区域的位置在观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的移动距离比观察小区域的尺寸小。另外，在实施方式中，观察小区域的一边的长度可以被设定为与光检测区域的直径大致相等，关于各个观察小区域中的光检测区域的位置的一次移动，可以是光检测区域的其行进方向的前边缘通过观察小区域的一个边缘起直到光检测区域的其行进方向的后边缘到达观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。此外，优选的是，光检测区域的位置的移动速度被设定为比发光粒子的扩散移动速度高。
并且，在上述的计算机程序中也可以包括以下步骤：生成绘制图像，该绘制图像是将在观察对象区域内的位置已被确定的发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的观察对象区域的显微镜图像中所得到的；和/或使用通过使光检测区域在每个观察小区域多次移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与发光粒子的大小有关的信息，其中，在与发光粒子的大小有关的信息的确定中使用的发光粒子的信号的特性例如可以是表示发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示所述发光粒子的旋转扩散特性的指标值。另外，上述的计算机程序可以包括以下步骤：根据检测出的发光粒子的个数来确定观察对象区域中的发光粒子的个数或液体中的发光粒子的浓度。
另外，根据上述的本发明的装置或计算机程序，实现采用了扫描分子计数法的方法的新的显微镜观察方法。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光学显微镜观察方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子，该方法包括以下过程：使光检测区域的位置按将显微镜的视野内的观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次；检测来自光检测区域的光；以及生成一边使光检测区域的位置在各个观察小区域中移动一边检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个发光粒子的光的信号特征的信号，确定与检测出的信号对应的各个发光粒子在观察对象区域内的位置。
在所述方法中也可以为，各个观察小区域中的光检测区域的位置的移动在每个观察小区域内沿至少两个方向连续地和/或沿同一方向连续地执行多次。观察小区域的尺寸可以根据光检测区域的尺寸来确定，优选的是，观察小区域的尺寸可以被设定成在使光检测区域的位置在观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的移动距离比观察小区域的尺寸小。另外，在实施方式中，观察小区域的一边的长度可以被设定为与光检测区域的直径大致相等，关于各个观察小区域中的光检测区域的位置的一次移动，可以是光检测区域的其行进方向的前边缘通过观察小区域的一个边缘起直到光检测区域的其行进方向的后边缘到达观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。此外，优选的是，光检测区域的位置的移动速度被设定为比发光粒子的扩散移动速度高。
并且，在上述的方法中也可以包括以下过程：生成绘制图像，该绘制图像是将在观察对象区域内的位置已被确定的发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的观察对象区域的显微镜图像中所得到的；和/或使用通过使光检测区域在每个观察小区域多次移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与发光粒子的大小有关的信息，其中，在与发光粒子的大小有关的信息的确定中使用的发光粒子的信号的特性例如可以是表示发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示所述发光粒子的旋转扩散特性的指标值。另外，上述的方法可以包括以下过程：根据检测出的发光粒子的个数来确定观察对象区域中的发光粒子的个数或液体中的发光粒子的浓度。
上述的本发明的显微镜观察技术典型地被用于观察、分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物在液体中、例如细胞内或细胞小器官内的状态的用途，也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在任意的液体中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
发明的效果
这样，根据本发明，在利用扫描型光学显微镜的观察以及解析中，通过采用扫描分子计数法的方法，与以往相比能够更高精度地逐个地检测并观察存在于有厚度的样本液体的内部的运动的发光粒子。特别地，根据本发明的结构，由于能够确定检测出的发光粒子的位置，因此能够将发光粒子的分布表现为二维或三维的图像，通过更多方面的显微镜观察以及解析，能够期待以往所不能掌握的各种信息、知识的获取。特别地，在本发明的结构中，能够将发光粒子的存在分布叠加在细胞、细胞小器官的显微镜图像中进行观察，因此可以有利地用于逐个地观察细胞、细胞小器官的内部的任意的粒子的动作之类的实验中。
本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清楚。
附图说明
图1的(A)是采用了本发明的扫描分子计数法的光学显微镜装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察对象区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向来使光检测区域的位置在样本(细胞)内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动样本(细胞)内的光检测区域的位置的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是对应用本发明的扫描分子计数法中的光检测的原理进行说明的示意图以及测量出的光强度的时间变化的示意图。
图3的(A)是在显微镜的视野内设定的观察对象区域ObR和观察小区域OsR的示意性的平面图。图3的(B)是三维的观察对象区域和观察小区域的示意性的立体图。图3的(C)是对通过观察小区域的光检测区域的移动方式进行说明的示意性的立体图。
图4的(A)、(B)是示意性地表示用光检测区域对观察小区域进行扫描的情况下的观察小区域和光检测区域(上部)以及光强度的时间变化(下部)的例子的图。图4的(C)是对用于确定观察小区域内的发光粒子的位置(坐标)的原理进行说明的表示观察小区域与光检测区域的位置关系的示意性的平面图以及示意性地表示光强度的时间变化的例子的图。
图5是以流程图的形式表示按照本发明执行的显微镜观察法中的发光粒子的检测处理步骤的图。
图6的6(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时和由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本液体内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图6的(C)是对用于基于按照扫描分子计数法测量出的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的、检测信号的信号处理过程的例子进行说明的图。
图7示出所测量出的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
图8示出了按照本发明的显微镜观察法进行发光粒子的位置的检测的情况下的观察小区域的示意图(A、D)、能够得到的时序光强度数据(B、E)、光强度数据的累计数据(C、F)的仿真结果的例子。图8的(A)～(C)是使光检测区域沿X方向移动的情况，图8的(D)～(F)是使光检测区域沿Y方向移动的情况。
图9的(A)是示意性地表示以往的激光扫描型光学显微镜中的利用光栅扫描方式的扫描模式的例子的图，图9的(B)是对利用倏逝光的显微镜的可观察范围进行说明的示意图。
附图标记说明
1：共焦显微镜装置；2：光源；3：单模光纤(single-mode optical fiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7：检电镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本容器)；11：反射镜；12：聚光镜；13：针孔；14：屏障滤波器(barrier filter)；14a：分色镜；15：多模光纤(multi-modeoptical fiber)；16、17：反射镜偏转器；18：光检测器；19：台位置变更装置；20：计算机。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明的优选实施方式。
显微镜装置的结构
实现本发明的显微镜观察技术的显微镜装置的基本结构如图1的(A)示意性地例示的那样，其可以是将能够执行利用激光扫描的显微镜观察的共焦显微镜的光学系统与光检测器组合而成的装置。参照该图，显微镜装置1包括光学系统2～18以及用于对光学系统的各部的动作进行控制并且获取数据进行解析的计算机20。显微镜装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，从光源2放射的激光(Ex)通过准直器2a成为平行光，被分色镜5、反射镜(检电镜)6、7反射，入射到物镜8。典型的是，在物镜8的上方配置有微板9，该微板9上排列有注入了1μL～几十μL的样本(溶液、细胞等)的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本液体中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本中，当作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有荧光性粒子或荧光色素等发光标识的粒子进入激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏障滤波器14(在此，仅特定的波长频带的光成分被选择。)被导入到多模光纤15，到达光检测器18，在被转换为按时间序列的电信号之后，输入到计算机20，以后面说明的方式进行发光粒子的信号的检测、发光粒子的位置的确定、其它光分析的处理。此外，如本领域技术人员所知道的那样，在上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置处，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，遮断来自激励区域以外的光。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本显微镜装置中的光检测区域(典型的是，光强度为以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是将光强度为1/e2的面作为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器18，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，光强度的测定以在规定时间内每隔测量单位时间(BIN TIME)依次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行。因而，在该情况下，时序光强度的数据是时序光子计数数据。另外，也可以在显微镜的台(未图示)处设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置19以变更要观察的皿10。可以由计算机20控制台位置变更装置19的动作。根据所述结构，在存在多个检测体的情况下，也能够达成迅速的测量。
并且，在上述的显微镜装置的光学系统中，设置有通过光检测区域对样本液体内进行扫描的机构，即设置有用于使焦点区域、即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(A)示意性地例示的那样，可以是包括反射镜6、7以及变更它们的朝向的反射镜偏转器16、17的检电镜装置(移动光检测区域的绝对位置的方式)。在该情况下，在计算机20的控制下，如图1的(C)示意性地例示的那样变更反射镜6、7的朝向来使光检测区域的位置移动，由此能够通过光检测区域对例如细胞内进行扫描。此外，检电镜装置在结构上可以与配备在普通的激光扫描型显微镜中的检电镜装置相同，但是如后面详细说明的那样，光检测区域的位置的移动即扫描的方式与普通的激光扫描型显微镜不同。或者，作为其它的方式，也可以如图1的(D)所例示的那样，使台位置变更装置19进行动作以移动注入有样本液体的容器10(微板9)的水平方向的位置来例如移动光检测区域在样本中的细胞内的相对位置(移动样本液体的绝对位置的方式)。台位置变更装置19的位置的驱动通过计算机20的控制来执行。并且，虽然没有图示，但是可以设置用于使光检测区域的位置在样本液体中沿上下方向移动的机构。作为那样的机构，具体地说，可以采用使物镜8或台上下移动的装置。另外，通过使从物镜的后端出入的光束成为收敛光或扩散光而非平行光，也能够达成光检测区域的位置的上下方向的移动。因此，也可以构成通过在物镜的后端的光路上配置焦距可变的偏移透镜、焦点可变的变形镜(未图示)来使光检测区域的位置沿上下方向移动的机构。
在成为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述的光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在显微镜装置1中，如图示那样，可以设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器18，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，能够根据其波长分别地检测出来自它们的光。另外，虽然没有图示，但是也可以如专利文献7那样为了检测发光粒子的偏振特性而在光路上设置偏振分束器以能够将检测光的偏振成分分离来检测光。
计算机20具备CPU和存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的步骤。此外，各步骤也可以通过硬件构成。对于本实施方式中所说明的处理的全部或一部分，可以使用存储有用于实现那些处理的程序的计算机可读取的存储介质，通过计算机20执行。即，计算机20可以读出存储在记录介质中的程序来执行信息的加工/运算处理，由此实现本发明的处理步骤。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等，或者也可以将上述的程序经由通信线路传送至计算机，由接收到该传送的计算机执行程序。
本发明的显微镜观察技术的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，在本发明的显微镜观察技术中，如果清楚地进行描述，则在扫描型光学显微镜观察中，将观察对象区域分割为多个观察小区域，在每个观察小区域内按扫描分子计数法的要点多次对观察小区域进行扫描，确定发光粒子的有无以及其位置。而且，由于能够确定发光粒子在观察对象区域内的位置，因此发光粒子的存在分布被表现(图像化)为图像。以下说明扫描分子计数法和本发明的显微镜观察技术的原理。
1.扫描分子计数法的原理
在“扫描分子计数法”(专利文献3～8)中，基本上是驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路、或者移动注入有样本的容器10(微板9)的水平方向的位置，来如图2的(A)示意性地描绘的那样一边使光检测区域CV的位置在样本内移动、即一边通过光检测区域CV对样本溶液内进行扫描，一边执行光检测。这样，在光检测区域CV移动的期间(在图中为时间t0～t2)通过一个发光粒子所存在的区域时(t1)，从发光粒子释放光，如图2的(B)所描绘的那样在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。就这样执行上述的光检测区域CV的位置的移动以及光检测，通过逐个地检测在该期间出现的如图2的(B)所例示的那样的脉冲状的信号(有意义的光强度变化)，来逐个地检测发光粒子，通过对其个数进行计数，能够获取存在于所测量的区域内的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动计算那样的统计性的运算处理，能够逐个地检测发光粒子，因此即使是要观测的粒子的浓度低至以荧光相关谱分析(FCS)、荧光强度分布分析(FIDA)等无法以充分的精度进行分析的样本，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。在后面记述基于时序光强度数据检测发光粒子的信号的具体方法的例子。
2.本发明的显微镜观察技术的原理
(i)概要
如“发明内容”一栏所提及的那样，在普通的激光扫描型共焦显微镜装置的情况下，光检测区域CV在观察对象区域ObR的扫描典型的是光栅扫描方式，如图9的(A)示意性地描绘的那样，光检测区域CV的位置在整个观察对象区域ObR中依次移动。对于观察对象区域即扫描区域的位置，能够在光的像差的影响被允许的范围内设定为视野VF内的任意的位置、光轴方向的高度。而且，在检测的光强度微弱的情况等下进行光强度的累计时，光检测区域CV沿着相同的扫描路径被反复移动。然而，在该结构的情况下，如果在最初的扫描中检测出的发光粒子的位置在第二次以后的扫描时发生移动，则无法获得有意义的光强度的累计的效果。另一方面，在利用倏逝光的显微镜装置的情况下，并非通过利用微小的光检测区域CV的扫描来检测光，能够将视野或观察对象区域内的像一次摄入到摄像机等光检测器内，在该情况下，在摄像机等光检测器内能够连续地进行光强度或光量的累计，因此即使在位置变化的发光粒子的像的情况下也能够获得有意义的光强度的累计的效果。然而，在利用倏逝光的显微镜装置的情况下，如图9的(B)示意性地描绘的那样，样本中可观察的范围被限定在倏逝光所到达的玻璃盖片表面附近。
因此，在本发明中，为了能够在更广的范围内检测位置变化的发光粒子，在共焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的位置移动的形式的扫描型光学显微镜装置的结构中，如图3的(A)或(B)示意性地描绘的那样，将视野VF内的观察对象区域ObR(虚拟地)分割为多个观察小区域OsR，在每个观察小区域，例如图3的(B)那样，在区域(X1,Y1)、(X2,Y1)…的各个区域中执行多次光检测区域的扫描。在所述多次的扫描中，可以沿互不相同的至少两个方向、例如参照图3的(B)、(C)而沿X方向S1和Y方向S2各自移动光检测区域的位置至少各一次、沿X方向S1、Y方向S2以及Z方向(未图示)各自移动光检测区域的位置至少各一次，执行在该期间的来自光检测区域的光强度的测量。另外，所述多次的扫描可以沿一个方向、例如X方向S1或Y方向S2将光检测区域的位置移动至少两次，执行在该期间的来自光检测区域的光强度的测量。而且，在上述多次的利用光检测区域的扫描中按时间序列获得的来自光检测区域的光的强度数据中，按之前简单说明的扫描分子计数法的要点进行发光粒子的信号的检测。
在上述的本发明的显微镜观察技术中，光检测区域的位置的移动范围与普通的激光扫描型共焦显微镜装置的情况同样地，在光的像差的影响被允许的范围内能够任意地设定，因此没有如利用倏逝光的显微镜装置的情况那样的可观察范围的限制。另外，在各观察小区域内利用光检测区域进行多次扫描所需的时间与普通的激光扫描型共焦显微镜装置的光栅扫描方式相比大幅地缩短，因此能够更高精度地达成在样本内运动的发光粒子、例如在细胞内或细胞小器官内运动的发光粒子的检测和位置确定。特别地，在发光粒子的释放光微弱且为了有意义地检测该释放光而使光强度的累计有效的情况下，通过适当地设定观察小区域的尺寸与扫描速度的关系，能够将各观察小区域的扫描时间设定得短，能够在大致同一位置检测同一发光粒子的光，因此能够期待有意义的累计效果。并且，发光粒子的检测按照扫描分子计数法的原理，因此不进行如荧光强度的波动计算那样的统计性的运算处理，即使是要观测的粒子的浓度低至以FCS(荧光相关谱分析)、FIDA(荧光强度分布分析)等无法以充分的精度进行分析的样本，也能够进行粒子的存在的检测、获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
(ii)观察小区域的尺寸和光检测区域的移动范围的设定
如“发明内容”一栏所提及的那样，观察小区域的尺寸决定光检测区域对观察小区域进行扫描所需的时间，因此典型的是，根据光检测区域的尺寸来确定。关于该点，如果观察小区域的尺寸比光检测区域的尺寸大，则光检测区域一次通过观察小区域无法网罗观察小区域的整个区域，在该情况下，需要使光检测区域包含观察小区域中的最初未被光检测区域所包含的部分来再次通过观察小区域，相应地，扫描时间被延长。因而，关于观察小区域的尺寸，优选的是，如图3的(C)以及图4的(A)～(C)示意性地描绘的那样，其一边被设定为与光检测区域的直径2W相等。此外，观察小区域的形状优选为立方体，但是应该理解也可以是沿光检测区域的扫描方向较长的长方体(特别是仅沿一个方向扫描的情况)。
另外，如图4的(A)、(B)示意性地描绘的那样，优选的是，在一次的扫描中针对各观察小区域的光检测区域的移动范围被设定为是从光检测区域CV的行进方向Sd的前边缘在观察小区域OsR的外侧与该观察小区域OsR的一边相切的状态起直到光检测区域CV的后边缘在观察小区域OsR的外侧与该观察小区域OsR的相反侧的边相切的状态为止的范围。在利用共焦显微镜或多光子显微镜的测量中，在测量来自光检测区域所包含的区域的光的总量作为一个数据值时，在此处检测出的发光粒子的光强度根据发光粒子在光检测区域内的位置而增加或减少。即，通常来说，光检测区域内的发光粒子的光强度在发光粒子位于光检测区域的大致中央时最大，随着发光粒子向光检测区域的边缘移动而逐渐减小。所述的光检测区域内的发光粒子的光强度的分布宽度对应于光检测区域的大小，遵照由物镜的数值孔径、入射至物镜的激励光入射光束直径以及针孔直径等所决定的点像分布函数(PSF)。因而，在光检测区域通过发光粒子的存在位置时，如与图2关联地已经说明的那样，发光粒子的光强度呈吊钟型的脉冲状地变化。在扫描分子计数法中，将所述的脉冲状的光强度的时间变化检测为单个发光粒子的信号。即，在本发明的显微镜观察技术中也同样，如图4的(A)所描绘的那样，为了高精度地检测一个发光粒子LP的信号，优选为使发光粒子以从光检测区域的一个边缘到另一边缘的方式通过来获得吊钟型的脉冲状的光强度的时间变化LS(从一端的末端到另一端的末端的宽度为光检测区域的直径2W。)。另一方面，如图4的(B)描绘的那样，在存在于观察小区域OsR的周边的发光粒子α、β的情况下，如图示那样，通过使光检测区域CV从其一个边缘与观察小区域OsR的一边相切的状态(左侧的状态)移动到其另一边缘与观察小区域OsR的另一边相切的状态(右侧的状态)，能够分别获得吊钟型的脉冲状的光强度的时间变化α、β。因而，如上述那样，优选的是，如图4的(B)那样，针对各观察小区域的光检测区域的移动范围为光检测区域的行进方向的前边缘和后边缘各自在外侧与观察小区域的边相切的范围。即，针对一个观察小区域而言，光检测区域的移动距离为光检测区域的直径的2倍即4W。
(iii)发光粒子的位置的确定
如上述那样，在按每个观察小区域执行发光粒子的检测处理的情况下，观察小区域在观察对象区域内的位置在其设定时是预先已知的，因此在各观察小区域内检测出的发光粒子的位置由观察小区域的尺寸的分辨率决定。另外，还如已经记述的那样，在通过检测吊钟型的脉冲状的光强度的时间变化(发光粒子的信号)来在各观察小区域内检测发光粒子的信号的情况下，在时序光强度数据上能够确定发光粒子的信号的峰值的位置(时刻)。在所述发光粒子的信号的峰值的位置处，发光粒子存在于光检测区域的与行进方向垂直的方向的中心轴线上，因此通过检测信号的峰值的位置，还能够确定发光粒子在观察小区域内的位置。具体地说，如图4的(C)示意性地描绘的那样，当在沿X方向执行光检测区域的扫描时的时序光强度数据上确定了发光粒子的信号的峰值的位置时，根据峰值的位置从观察小区域的中心位置(或者，也可以是边的位置。)的偏移ΔX来确定发光粒子的X方向的坐标。同样地，当在沿Y方向执行光检测区域的扫描时的时序光强度数据上确定了发光粒子的信号的峰值的位置时，根据峰值的位置从观察小区域的中心位置(或者，也可以是边的位置。)的偏移ΔY来确定发光粒子的Y方向的坐标。而且，发光粒子在观察对象区域内的位置根据观察小区域的位置坐标以及ΔX、ΔY来确定。(虽然没有图示，但是在Z方向上也同样地，可以根据峰值的位置从观察小区域的特定的位置的偏移ΔZ来确定发光粒子的Z方向的坐标。)
显微镜观察的处理操作过程
在使用了图1的(A)所例示的显微镜装置1的遵照本发明的显微镜观察的实施方式中，具体地说，执行(1)包含发光粒子的样本的调制、(2)样本的光强度的测定处理以及(3)测定出的光强度的分析处理。图5示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。
(1)样本的调制
成为本发明的显微镜观察技术的观测对象物的粒子只要是存在于任意的液体中的粒子，就可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或者金属胶体、其它非生物学的分子等。在成为观测对象物的粒子不是发出光的粒子的情况下，使用在成为观测对象物的粒子上以任意的方式附加发光标识(荧光分子、磷光分子、化学/生物发光分子)而得到的粒子。样本典型的是水溶液，但是不限定于此，也可以是有机溶剂及其它任意的液体。另外，成为观测对象物的粒子可以是存在于细胞、细胞小器官中且由于扩散或者其它原因而运动的(位置变化的)粒子。即，可以是在普通的细胞、细胞小器官的显微镜观察中所利用的样本液体。
(2)样本液体的光强度的测定(图5-步骤100)
在本实施方式的显微镜观察中，如上述那样，在观察对象区域内的各观察小区域中一边使光检测区域的位置移动一边执行光强度的测定。光检测区域的位置的移动通过驱动检电镜装置16、17或者台位置变更装置19来进行。在操作处理中，典型的是，在向微板9的皿10注入样本并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机20输入开始测量的指示时，计算机20依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本内移动的步骤和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的步骤)，开始样本内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机20的程序的处理动作的控制下，检电镜装置16、17或台位置变更装置19驱动检电镜6、7或显微镜的台上的微板9，来执行皿10内的光检测区域的位置的移动，与此同时地，光检测器18将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机20，在计算机20中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。此外，光检测器16典型的是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在光的检测是利用光子计数来进行的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。
利用光检测区域对观察对象区域内的扫描如已经记述的那样在每个观察小区域都执行。具体地说，例如，在每个观察小区域，可以(a)沿X方向和Y方向至少执行一次光检测区域的移动，(b)沿X方向、Y方向以及Z方向至少执行一次光检测区域的移动，(c)沿X方向(或Y方向)和Z方向至少执行一次光检测区域的移动，或者(d)沿X方向、Y方向或Z方向至少执行两次光检测区域的移动。然后，当关于一个观察小区域的扫描完成时，可以在相邻的观察小区域内同样地执行光检测区域的移动。
光强度的测量中的光检测区域的位置的移动速度可以是任意地、例如通过实验或者为了符合分析目的而设定的规定的速度。由于测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系更容易解释测定结果，因此优选的是，移动速度基本上为恒定速度，但是不限定于此。
另外，关于光检测区域的位置的移动速度，为了定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据逐个检测发光粒子的检测、或者发光粒子的个数的计数，优选的是，所述移动速度被设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。本发明的显微镜观察技术的观测对象粒子是在液体中能够运动的粒子，因此存在由于布朗运动而位置随着时间而移动的情况。而且，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图6的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图6的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，如图6的(C)最上部所例示的那样，与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓为吊钟型(在发光粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓与激励光强度分布大致相同。)，从而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径W的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δt根据以下的平均平方位移的关系式，
(2W)2＝6D·Δt …(1)
成为
Δt＝(2W)2/6D …(2)
因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif＝2W/Δt＝3D/W …(3)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，在设W为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s等。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
并且，在各观察小区域中多次执行光检测区域的扫描的情况下，如果在其扫描时间内存在于观察小区域内的发光粒子从观察小区域脱离，则无法获得有意义的累计效果，另外，如后面说明的那样，无法有效地执行利用扫描时间内的位置的变化的解析(扩散常数的检测等)。因而，优选的是，观察小区域的尺寸被设定为在使光检测区域的位置在观察小区域移动的时间内应该检测出的发光粒子的(预想的)移动距离比观察小区域的尺寸小。然而，如上述那样，优选的是，观察小区域的一边被设定为与光检测区域的直径大致相等。因此，实际上，可以对扫描速度进行设定以成为发光粒子因扩散所产生的移动距离不超过观察小区域的尺寸的扫描时间。具体地说，以移动速度v在一次的扫描距离为4W的路径上扫描k次时的光检测区域的扫描时间ΔT通过下式提供。
ΔT＝4W·k/v …(4)
另一方面，在扫描时间ΔT因扩散所产生的发光粒子的移动距离x与式(1)同样地通过下式提供。
<x>2＝2DΔT …(5)
在此，由于x2≤W2的条件应该成立，因此，结果，优选的是对扫描速度进行设定使得下式成立。
v≥8D·k/W …(6)
(3)光强度的分析处理
当通过各观察小区域的扫描生成时序光强度数据时，可以使用时序光强度数据的光强度值，如下述那样执行发光粒子的信号的检测、发光粒子的计数、发光粒子的位置的确定、其它各种分析(浓度计算等)。
(i)发光粒子的信号的逐个检测(图5-步骤110～160)
如已经提及的那样，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图6的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的在光强度数据上的光强度的变化具有反映由光学系统决定的光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。因而，在扫描分子计数法中，基本上，在光强度数据上超过适当设定的阈值Ith的光强度值持续的时间宽度Δτ处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的轮廓的信号对应于一个粒子通过光检测区域，可以进行一个发光粒子的检测。而且，光强度不超过阈值Ith、或时间宽度不在Δτ规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够假定为光检测区域的光强度分布为高斯分布、即
I＝A·exp(-2t2/a2) …(7)时，
在使式(7)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景光的轮廓)而计算出的强度A以及宽度a处于规定的范围内时，判断为该光强度的轮廓对应于一个粒子通过光检测区域，可以进行一个发光粒子的检测。另一方面，强度A以及宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)
在光强度数据上的信号的检测处理的一个例子中，首先，对光强度数据(图6的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图5-步骤110、图6的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述的平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理直到能够忽略如上所述的数据值的缺失为止。此外，可以根据光强度数据获取时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当地设定执行平滑处理时的参数，例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光强度数据运算时间的一次微分值(步骤120)。光强度数据的时间微分值如图6的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值变化的时刻值的变化变大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利于确定有意义的信号的起点和终点。
然后，在光强度数据上，逐次检测有意义的脉冲信号(步骤130～160)。具体地说，首先，在光强度数据的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图6的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。然后，判定计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的轮廓的参数而设想的范围内，即判定脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图7的左边所示那样，将被判定为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图7的右边所示，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。此外，可以与发光粒子的信号的检测同时地执行信号数的计数、即发光粒子的计数。
上述的步骤130～150的处理中的脉冲信号的搜索以及判定可以在各观察小区域的光强度数据的整个区域反复执行(步骤160)。在分别地检测相互不同的成分的光并生成了多个时序光强度数据的情况下，可以对各个时序光强度数据执行步骤130～150的处理。此外，基于光强度数据逐个地检测发光粒子的信号的处理不限于上述的步骤，可以通过任意的方法执行。
(ii)同一发光粒子的信号的累计(图5-步骤170)
另外，在本实施方式的显微镜观察技术中，在各观察小区域内沿同一方向执行多次扫描的情况下，能够期待在时序光检测数据上反复地出现同一发光粒子的信号。在该情况下，通过沿着扫描路径并以扫描路径上的位置相互一致的方式对时序光检测数据上的数据值或作为发光粒子的信号检测出的区域的数据值进行累计，能够期待发光粒子的信号的精度的提高。在所述累计的具体方式之一中，如上述那样，可以在各观察小区域内逐个地检测时序光检测数据上的发光粒子的信号之后，对检测出的发光粒子的信号的光强度值进行累计，其总和或平均值等用作发光粒子的信号的光强度值。在所述的光强度值的累计时，抽出同一发光粒子的信号的处理可以按例如专利文献6～7所记载的要点执行。
作为时序光检测数据的累计的其它方式，可以在时序光检测数据上的发光粒子的信号的逐个检测之前进行沿着扫描路径的数据值的累计(步骤105)。在该情况下，特别是在一次的扫描中获得的发光粒子的光强度值微弱时，通过数据值的累计而发光粒子的光强度值增大，由此能够期待发光粒子的信号的逐个检测的精度的提高。图8是表示在沿着扫描路径的数据值的累计之后执行发光粒子的信号的逐个检测时的处理的仿真例子的图。此外，图8的(A)、(D)分别是示意性地表示在扩散常数D＝1μm2/sec的发光粒子LP在0.4μm见方的观察小区域OsR内进行布朗运动的状态下使光检测区域CV以速度6.4mm/sec沿X方向(图8的(A)中的S1+、S1-)和Y方向(图8的(D)中的S2+、S2-)反复移动(振幅0.8μm、周波数4kHz)时的粒子的运动的图，图8的(B)的上部、图8的(E)的上部是在所述扫描中获得的光子计数PC的例子。在该例子的情况下，扫描次数为5次，扫描时间为1.25m秒，因此扩散所引起的位移为0.09μm左右。
参照图8，如从图8的(B)的上部、(E)的上部理解的那样，当如上述那样一边扫描一边执行光检测时，在时序光子计数数据PC(光强度数据)中反复出现同一发光粒子LP的信号。然而，在图示的例子中，各偶数次的扫描中光检测区域的移动方向为相反的朝向。因此，在数据的累计之前，如图8的(B)的下部、(E)的下部所示那样，对与光检测区域的移动方向为相反的朝向的期间对应的数据区域执行时间轴的反转。之后，关于图8的(B)的下部、(E)的下部的时序光子计数数据，以扫描路径上的位置一致、即图8的(B)的下部、(E)的下部中的各箭头所对应的区域相互重叠的方式执行数据值的累计。这样，如图8的(C)、(F)所例示的那样，由于发光粒子LP的信号强度增大，因此能够期待发光粒子的信号的逐个检测的精度(区分信号与噪声的精度)的提高。此外，在各观察小区域的时序光子计数数据中，用于提高发光粒子的信号检测的精度的具体处理可以按专利文献8所记载的要点执行。
(iii)发光粒子的位置的确定(图5-步骤180)
如已经提及的那样，当在各观察小区域内检测发光粒子的信号时，由于观察对象区域ObR内的各观察小区域OsR的位置(坐标)已知，因此能够以观察小区域的尺寸的分辨率确定发光粒子的位置。并且，能够基于发光粒子的信号的峰值的出现位置与观察小区域的特定的位置(中心或边缘等)之间的距离更详细地确定发光粒子的位置(坐标)(参照图4的(C))。这样，当确定出发光粒子的位置时，利用其信息，能够将观察对象区域ObR内的发光粒子的存在分布表现为图像。另外，关于发光粒子的存在分布图像，可以使观察对象区域ObR与通过其它任意的显微镜观察法(位相差显微镜法、微分干涉显微镜法、落射荧光显微镜法等)获得的显微镜像叠加而被显示于计算机20的显示器。具体地说，可以生成在通过任意的显微镜观察法获得的显微镜像中绘制发光粒子的位置得到的绘制图像。
(iv)发光粒子浓度的确定
并且，在对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定发光粒子的个数的情况下，如果通过任意的方法估算光检测区域所通过的区域的总体积，则能够根据其体积值和发光粒子的个数确定样本中的发光粒子的浓度。光检测区域所通过的区域的总体积可以按例如专利文献1所记载的要点来确定。
(v)发光粒子的大小的估计
在扫描分子计数法中，如专利文献6所记载的那样，在多次检测到同一发光粒子的信号的情况下，利用那些信号的发生时刻(峰值的时刻)来检测扫描周期内的发光粒子的位移，能够基于所述位移估计发光粒子的平移扩散特性(例如扩散常数)。平移扩散特性是发光粒子的大小的函数，由此能够估计检测出的发光粒子的大小。因此，在本发明的显微镜观察技术中，也可以利用在各观察小区域内检测出的发光粒子的信号的产生时刻来估计发光粒子的平移扩散特性和发光粒子的大小。具体的处理可以按专利文献6所记载的要点执行。另外，如图8的例子那样，在发光粒子的信号的检测之前进行光强度的累计的情况下，通过参照累计得到的发光粒子的信号的宽度d能够估计平移扩散特性(扩散常数越大，扫描时间内的发光粒子的位移越大，累计信号的宽度d增大。)。
另外，在扫描分子计数法中，如专利文献7所记载的那样，通过对检测光的偏振成分分别地进行检测，能够进行发光粒子的偏振特性或旋转扩散特性(例如偏振度)的测量。特别地，由于旋转扩散特性是发光粒子的大小的函数，由此能够进行检测出的发光粒子的大小的估计。因此，在本发明的显微镜观察技术中，也可以将来自光检测区域的光分开为多个偏振成分进行检测，利用那些偏振成分的强度估计在各观察小区域内检测出的发光粒子的偏振特性或旋转扩散特性以及发光粒子的大小。具体的处理可以按专利文献7所记载的要点执行。
如上所述，在估计出发光粒子的浓度、平移扩散特性、偏振特性或旋转扩散特性和/或大小的情况下，它们的值可以与表示发光粒子的存在分布的图像关联地显示。或者，也可以将在各观察小区域获得的各特性值显示为表示发光粒子的浓度、平移扩散特性、偏振特性或旋转扩散特性和/或大小的分布图像。另外，发光粒子的这些特性可以叠加在通过其它任意的显微镜观察法获得的细胞或细胞小器官等的显微镜像上进行显示。由此，能够在确定了在细胞或细胞小器官内的位置的状态下掌握存在于细胞或细胞小器官内的发光粒子的特性。
这样，根据上述的本发明的显微镜观察技术，通过在观察对象区域内的每个观察小区域执行利用光检测区域的多次扫描，执行利用扫描分子计数法的对发光粒子的逐个检测，能够形成表示在有厚度的样本中位置动态地变化的发光粒子的存在分布的图像。根据所述特征，能够逐个地检测特别是细胞内或细胞小器官内的发光粒子的存在位置，能够期待有利地利用于细胞或细胞小器官等的研究等中。

Claims (30)

1.一种光学显微镜装置，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子，该光学显微镜装置包括：
光检测区域移动部，其使光检测区域的位置按将所述显微镜的视野内的被图像化的二维或三维的区域即观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次，当所述光检测区域的位置在一个观察小区域内的所述多次的移动完成时，在相邻的观察小区域内执行所述光检测区域的多次的移动；
光检测部，其检测来自所述光检测区域的光；以及
信号处理部，其生成一边使所述光检测区域的位置在各个所述观察小区域中移动一边由所述光检测部进行所述检测而得到的来自所述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在所述按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个所述发光粒子的光的光强度变化的轮廓的信号，确定与检测出的所述信号对应的各个发光粒子在所述观察对象区域内的位置。
2.根据权利要求1所述的光学显微镜装置，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿至少两个方向连续地执行。
3.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿同一方向连续地执行多次。
4.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
根据所述光检测区域的尺寸来确定所述观察小区域的尺寸。
5.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
所述观察小区域的尺寸被设定成在使所述光检测区域的位置在所述观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的移动距离比所述观察小区域的尺寸小。
6.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
所述观察小区域的一边的长度被设定为与所述光检测区域的直径大致相等，关于各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的一次移动，从所述光检测区域的其行进方向的前边缘通过所述观察小区域的一个边缘起直到所述光检测区域的其行进方向的后边缘到达所述观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。
7.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
生成绘制图像，该绘制图像是将在所述观察对象区域内的位置已被确定的所述发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的所述观察对象区域的显微镜图像中所得到的。
8.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
所述信号处理部使用通过使所述光检测区域在每个所述观察小区域内进行所述多次的移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与所述发光粒子的大小有关的信息。
9.根据权利要求8所述的光学显微镜装置，其特征在于，
在与所述发光粒子的大小有关的信息的确定中使用的所述发光粒子的信号的特性是表示所述发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示所述发光粒子的旋转扩散特性的指标值。
10.根据权利要求1或2所述的光学显微镜装置，其特征在于，
所述信号处理部根据检测出的所述发光粒子的个数来确定所述观察对象区域中的所述发光粒子的个数或所述液体中的发光粒子的浓度。
11.一种光学显微镜观察方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子，该光学显微镜观察方法包括以下过程：
使光检测区域的位置按将所述显微镜的视野内的被图像化的二维或三维的区域即观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次，当所述光检测区域的位置在一个观察小区域内的所述多次的移动完成时，在相邻的观察小区域内执行所述光检测区域的多次的移动；
检测来自所述光检测区域的光；以及
生成一边使所述光检测区域的位置在各个所述观察小区域中移动一边检测出的来自所述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在所述按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个所述发光粒子的光的光强度变化的轮廓的信号，确定与检测出的所述信号对应的各个发光粒子在所述观察对象区域内的位置。
12.根据权利要求11所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿至少两个方向连续地执行。
13.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿同一方向连续地执行多次。
14.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
根据所述光检测区域的尺寸来确定所述观察小区域的尺寸。
15.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
所述观察小区域的尺寸被设定成在使所述光检测区域的位置在所述观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的移动距离比所述观察小区域的尺寸小。
16.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
所述观察小区域的一边的长度被设定为与所述光检测区域的直径大致相等，关于各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的一次移动，从所述光检测区域的其行进方向的前边缘通过所述观察小区域的一个边缘起直到所述光检测区域的其行进方向的后边缘到达所述观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。
17.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，还包括以下过程：
生成绘制图像，该绘制图像是将在所述观察对象区域内的位置已被确定的所述发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的所述观察对象区域的显微镜图像中所得到的。
18.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，还包括以下过程：
使用通过使所述光检测区域在每个所述观察小区域进行所述多次的移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与所述发光粒子的大小有关的信息。
19.根据权利要求18所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，
在与所述发光粒子的大小有关的信息的确定中使用的所述发光粒子的信号的特性是表示所述发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示所述发光粒子的旋转扩散特性的指标值。
20.根据权利要求11或12所述的光学显微镜观察方法，其特征在于，还包括以下过程：
根据检测出的所述发光粒子的个数来确定所述观察对象区域中的所述发光粒子的个数或所述液体中的发光粒子的浓度。
21.一种计算机可读存储介质，其上存储有光学显微镜观察用计算机程序，所述光学显微镜观察用计算机程序用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自样本液体中的发光粒子的光来检测发光粒子，其特征在于，该光学显微镜观察用计算机程序使计算机执行以下步骤：
使光检测区域的位置按将所述显微镜的视野内的被图像化的二维或三维的区域即观察对象区域分割为多个所得到的每个观察小区域，在该观察小区域内连续地移动多次，当所述光检测区域的位置在一个观察小区域内的所述多次的移动完成时，在相邻的观察小区域内执行所述光检测区域的多次的移动；
检测来自所述光检测区域的光；以及
生成一边使所述光检测区域的位置在各个所述观察小区域中移动一边检测出的来自所述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在所述按时间序列的光强度数据中逐个地检测具有表示来自各个所述发光粒子的光的光强度变化的轮廓的信号，确定与检测出的所述信号对应的各个发光粒子在所述观察对象区域内的位置。
22.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿至少两个方向连续地执行。
23.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的移动在每个所述观察小区域内沿同一方向连续地执行多次。
24.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
根据所述光检测区域的尺寸来确定所述观察小区域的尺寸。
25.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
所述观察小区域的尺寸被设定成在使所述光检测区域的位置在所述观察小区域内移动的时间内应该被检测出的发光粒子的移动距离比所述观察小区域的尺寸小。
26.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
所述观察小区域的一边的长度被设定为与所述光检测区域的直径大致相等，关于各个所述观察小区域中的所述光检测区域的位置的一次移动，从所述光检测区域的其行进方向的前边缘通过所述观察小区域的一个边缘起直到所述光检测区域的其行进方向的后边缘到达所述观察小区域的另一边缘为止执行一次移动。
27.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，还执行以下步骤：
生成绘制图像，该绘制图像是将在所述观察对象区域内的位置已被确定的所述发光粒子的位置绘制在通过任意的方法生成的所述观察对象区域的显微镜图像中所得到的。
28.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，还执行以下步骤：
使用通过使所述光检测区域在每个所述观察小区域内进行所述多次的移动所得到的同一发光粒子的信号的特性来确定与所述发光粒子的大小有关的信息。
29.根据权利要求28所述的计算机可读存储介质，其特征在于，
在与所述发光粒子的大小有关的信息的确定中使用的所述发光粒子的信号的特性是表示所述发光粒子的平移扩散特性的指标值或表示所述发光粒子的旋转扩散特性的指标值。
30.根据权利要求21或22所述的计算机可读存储介质，其特征在于，还执行以下步骤：
根据检测出的所述发光粒子的个数来确定所述观察对象区域中的所述发光粒子的个数或所述液体中的发光粒子的浓度。
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