JP6010034B2 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents
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Description
本願は、2011年8月30日に、日本に出願された特願2011−187600号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ここで、走査分子計数法は、特願2010−044714において、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。
(1) 溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
(a)標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
(c)前記工程(b)において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記分離回収用粒子は、前記標的粒子及び前記発光プローブとからなる結合体と結合し、前記工程(c)における前記複合体の分子数の計数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記複合体から放出される光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記複合体から放出される光信号の検出及び前記複合体の検出を、検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの複合体に対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの複合体に対応する信号であると判定することによって、一つの複合体を検出することにより行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。
(2) 前記分離回収用粒子の前記試料溶液中における沈降速度が1×10−6m/s以下である前記(1)に記載の標的粒子の検出方法。
(3) 前記光検出領域の位置を移動する工程において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動する前記(1)又は(2)に記載の標的粒子の検出方法。
(4) 前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短い前記(3)に記載の標的粒子の検出方法。
(5) 前記光検出領域の位置の移動周期τ1と前記第二の経路の位置の移動速度v2と前記光検出領域の直径dとが、
v2・τ1>d
を満たす前記(3)又は(4)に記載の標的粒子の検出方法。
(6) 前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動し、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内における前記第二の経路の位置が移動する前記(3)〜(5)のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
(7) 前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線である前記(3)〜(6)のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
(8) 前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する前記(1)〜(7)のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
(9) 前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、1つの複合体が前記光検出領域に入ったことが検出される前記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
(10) 前記分離回収用粒子が磁性粒子である前記(1)〜(9)のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子(以下、「発光粒子」と称する。)が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。走査分子計数法は、FIDA等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量(例えば、数十μL程度)であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、FIDA等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
走査分子計数法は、基本的な構成において、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこにおいて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザ光(Ex)が、ファイバーの出射端において固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子(実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ)が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者において知られている如く、上記の構成において、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が1/e2 となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、1つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。従って、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、本実施形態の走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がFIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間(図2A中、時間t0〜t2)において1つの粒子(図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。)の存在する領域を通過する際(t1)には、図2Bに描かれている如く有意な光強度(Em)が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行う他は、FCS又はFIDAにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器17は、ミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BINTIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2 =6D・Δt …(1)
から、
Δt=(2Wo)2 /6D …(2)
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(3)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2 /s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3 m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略10倍の15mm/sと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
この点に関し、対物レンズの視野の周縁は、一般に収差が大きくなり、光検出領域の寸法や形状が場所によって異なる可能性があるため、光路の変更による光検出領域の位置の移動範囲は、対物レンズの収差の少ない視野の中心付近の領域内にて実行されることが好ましい。
v2・τ1>d …(4)
の関係が成立するよう設定される。これにより、光検出領域の位置が第二の経路を一周する間に第二の経路が少なくとも光検出領域の直径に相当する距離を移動することとなるので、光検出領域の位置の連続する周回において光検出領域が前回の周回で通過した領域に重複することが回避されることとなる。具体的には、光検出領域の直径dは、0.4〜30μmであり、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ1が0.6〜600m秒であるとすると、試料溶液の位置の移動速度v2は、0.67μm以上となる。実際には、通常、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ1は、6〜60m秒と設定されるので、その場合には、試料溶液の位置の移動速度v2は、17μm以上となる。光検出領域の走査軌道上での移動速度は、典型的には、10〜90mm/秒に設定されるので、試料溶液の位置の移動速度v2は、殆ど無視できるほど小さい。
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理(検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順)により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4Aに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図6Aに模式的に描かれている如く、(光学系により決定される)光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル(通常、略釣鐘状)を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ioが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Io及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体(又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ)の特性によって選択的に決定されてよい。
ガウス分布:
I=A・exp(−2t2 /a2 ) …(5)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(5)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。)
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図5及び図6Bに例示された処理により為されてよい。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される(ステップ130)。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ(図6B下段「釣鐘型関数フィッティング」)、釣鐘型関数のピーク強度Imax、ピーク幅(半値全幅)w、フィッティングにおける(最小二乗法の)相関係数等のパラメータが算出される(ステップ140)。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される(ステップ150)。かくして、図7左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる(粒子数がカウントアップされる。ステップ160)。一方、図7右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液(参照溶液)について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体(又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ)と同様の発光特性を有する発光標識(蛍光色素等)であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Cの参照溶液について、その粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、
Vt=N/C …(6)
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子の数密度cは、
c=n/Vt …(7)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(6))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
本実施形態の標的粒子の検出方法は、溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法であって、分離回収用粒子を用いて、標的粒子と結合した発光プローブから、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブを分離除去した後に、走査分子計数法によって発光プローブと結合した標的粒子を検出することを特徴とする。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、pMオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、発光プローブと結合した標的粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の標的粒子の検出方法は、発光プローブで標識された標的粒子を分離回収用粒子に結合させた後に、固液分離処理により分離回収用粒子を回収し、この回収された分離回収用粒子に対して走査分子計数法による計測を行う。発光プローブで標識された標的粒子は分離回収用粒子と結合しているため、固液分離処理により分離回収用粒子とともに回収されるが、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブは、分離回収用粒子から分離して除去される。すなわち、遊離の発光プローブを除去した後に走査分子計数法による計測を行うため、遊離の発光プローブからの光の検出が効果的に抑制され、標的粒子を高精度に検出することができる。
(a)標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
(c)前記工程(b)において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
具体的には、標的粒子とハイブリダイズし、かつ特殊な3’末端修飾塩基を有する核酸プローブ(Nプローブ)と、当該Nプローブの3’末端側に隣接して標的粒子とハイブリダイズし、かつ5’末端側に消光色素及び蛍光色素が修飾された核酸プローブ(Eプローブ)とを設計し、作製する。2つのプローブが標的粒子とハイブリダイズすると、非酵素的なライゲーション(Autoligation)反応が起こり、このときにEプローブから消光色素が脱離する。つまり、2つのプローブが標的粒子とハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
これらの化合物は、1種のみを添加してもよく、2種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
発光プローブをATTO(登録商標)488とし、発光プローブで標識された標的粒子をATTO(登録商標)488−ビオチンとし、分離回収用粒子として磁性粒子を用いて、本実施形態の標的粒子の検出方法により、溶液中のATTO(登録商標)488−ビオチンを検出した。
具体的には、1M NaCl及び0.05体積%濃度(V/V) pluoronic F127を含むTEバッファ(本実施例において、以下、バッファという。)を用いて、ATTO(登録商標)488−ビオチン(sigma−aldrich社製)及びATTO(登録商標)488(ATTO−TEC社)をそれぞれ0.2μMとなるように溶解させた。ATTO(登録商標)488−ビオチン及びとATTO(登録商標)488を体積比で0:1000、1:999、5:995、又は10:990となるように混合した溶液を、それぞれ0%(mol)、0.1%(mol)、0.5%(mol)、又は1%(mol)色素修飾ビオチン溶液とした。次いで、25μLの10mg/mL(≒10pM)ストレプトアビジン修飾磁性ビーズ(製品名:Dynabeads(登録商標) MyOne Streptavidin C1、invitorgen社製)と25μLの色素修飾ビオチン溶液を混合して懸濁液を調製した。各懸濁液を30分間インキュベートすることにより、磁性ビーズ上のストレプトアビジンに対してATTO(登録商標)488−ビオチン中のビオチンを結合させた。
具体的には、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF−20(オリンパス株式会社製)を用い、上記の各懸濁液を1000倍希釈した溶液を試料溶液とし、各試料溶液の時系列光強度データ(フォトンカウントデータ)を取得した。その際、励起光は、200μWの488nmのレーザ光を用い、バンドパスフィルターを用いて、510〜560nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中における光検出領域は、15mm/秒(6000rpm)の移動速度にて回転させ、BIN TIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間又は240秒間とした。測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が5以上となるもののピーク強度を抽出した。
実施例1において調製された試料溶液を、試料溶液の位置を移動する方式により、光検出領域の位置を、試料溶液内の平面内において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って移動させて、走査分子計数法による計測を行った。
具体的には、実施例1で走査分子計数法による計測に用いた各試料溶液に対して、実施例1で用いた1分子蛍光測定装置MF−20を用いて、以下の条件で走査分子計数法による計測を行った。励起光は、200μWの488nmのレーザ光を用い、バンドパスフィルターを用いて、510〜560nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中における光検出領域は、15mm/秒(6000rpm)の移動速度にて回転させた。さらに測定容器を1mm/秒で円形(OD:1mm)に駆動させた。また、BIN TIMEを10μ秒とし、測定時間は2秒間又は240秒間とした。測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が5以上となるもののピーク強度を抽出した。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
Claims (10)
- 溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
(a)標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
(c)前記工程(b)において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記分離回収用粒子は、前記標的粒子及び前記発光プローブとからなる結合体と結合し、前記工程(c)における前記複合体の分子数の計数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記複合体から放出される光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記複合体から放出される光信号の検出及び前記複合体の検出を、検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの複合体に対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの複合体に対応する信号であると判定することによって、一つの複合体を検出することにより行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。 - 前記分離回収用粒子の前記試料溶液中における沈降速度が1×10−6m/s以下である請求項1に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動する請求項1又は2に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短い請求項3に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置の移動周期τ1と前記第二の経路の位置の移動速度v2と前記光検出領域の直径dとが、
v2・τ1>d
を満たす請求項3又は4に記載の標的粒子の検出方法。 - 前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動し、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内における前記第二の経路の位置が移動する請求項3〜5のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線である請求項3〜6のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する請求項1〜7のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、1つの複合体が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記分離回収用粒子が磁性粒子である請求項1〜9のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
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