JP4315794B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

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本発明は、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、励起波長を用いて励起するとともに、試料より発する蛍光を検出する共焦点顕微鏡に関する。

従来、共焦点顕微鏡として、多波長蛍光検出の方式を採用した多色共焦点顕微鏡が知られている(例えば、特許文献1参照)。

この多色共焦点顕微鏡は、2つ以上の蛍光着色剤によって、部位毎に異なって着色されているサンプルに対して、それぞれの蛍光着色剤に対応する波長を有するレーザ光を照射し、これにより励起されて発生する蛍光波長を、これら蛍光波長に対応するダイクロイックミラーなどの波長分離手段を介して検出する。

蛍光色素の偏光の向きを見積もることができる共焦点顕微鏡も知られている。例えば、特許文献2に開示された共焦点顕微鏡は、レーザ光源からのレーザ光を対物レンズを介して試料に照射し、試料からの蛍光を対物レンズを通し、ダイクロイックミラーで2光路に分岐し、これら分岐された光を互いに直交する偏光板を通して蛍光色素の偏光に応じた2つの像を取得する。

ところで、最近、例えば、生きている細胞の目的とするタンパク質を蛍光標識して分布や移動を観察する場合等において、マーカートレーサーとして、GFP(Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパクを利用することが多くなっている。

このようなGFPにより標識した標本は、非特許文献1に記載されているように偏光特性を有している。これにより、GFPなどの蛍光タンパクを用いた標本について蛍光偏光を検出することで、タンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命などの解析が可能になる。また、光刺激、化学反応、電気刺激、PH、温度変化などによって、蛍光タンパクの分子構造が変化することにより、その偏光特性が変化する。そのため、蛍光タンパクの偏光特性を解析することで、タンパク質の機能を解析することも可能である。
特許第2824462号公報 特開平8−254654号公報 BIOPHOTONICS International May,2002,P.10

ところが、特許文献1は、一般的な多波長蛍光の検出方法が開示しているだけで、偏光成分を持った蛍光を検出することについて、何ら述べていない。また、特許文献2は、試料からの蛍光を互いに直交する偏光板を通して蛍光色素の偏光に応じた2つの像を取得することを開示しているが、光源として、蛍光を発生させる波長光を発する共焦点顕微鏡を開示しているのみである。そして、特許文献2には、蛍光標識としてGFPなどの蛍光タンパクを用いた場合に、偏光成分を持った蛍光を得るための励起方法などについて、具体的なことは、何ら述べていない。

本発明は、蛍光タンパクにより標識した標本を励起することができ、これにより得られる蛍光により標本の多様な機能解析を可能にした共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一局面に係る発明は、偏光成分を有する光を発する光源手段と、前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光を前記励起光の光路から分割する波長分割手段と、前記波長分割手段により分割された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該蛍光の波長を選択する波長選択手段および前記偏光特性抽出手段で偏光特性を抽出され前記波長選択手段で波長を選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段とを具備し、前記光源手段は、前記標本へ照射する光の偏光方向を可変する偏光方向可変手段を有することを特徴とする。

本発明の他の局面に係る発明は、偏光成分を有する光を発する光源手段と、前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光を前記励起光の光路から分割する波長分割手段と、前記波長分割手段により分割された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該蛍光の波長を選択する波長選択手段、および前記偏光特性抽出手段で偏光特性を抽出され前記波長選択手段で波長を選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段と、を具備し、前記光検出手段は、前記標本から発せられる蛍光のs偏光成分とp偏光成分を各別に検出する2個の光検出手段からなり、さらに、これら光検出手段より検出されるs偏光成分とp偏光成分のそれぞれの蛍光強度の時間変化に基づいて回転緩和時間と蛍光寿命を演算する演算手段を有することを特徴とする。

本発明によれば、蛍光タンパクなどにより標識した標本に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本を確実に励起させることができる。また、標本から発生する偏光成分を有する蛍光を波長分割手段、偏光特性抽出手段、波長選択手段を介して検出することにより、このときの検出情報からタンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命の解析などを行うことができる。さらに共焦点顕微鏡と組合せることで、細胞内の局所的な偏光蛍光特性の情報も得ることができる。

また、本発明によれば、偏光方向可変手段により標本の偏光方向に合わせてレーザ光の偏光の方向を変えることができるので、標本上の異なる偏光成分を有する蛍光のデータを選択的に取得することができる。

さらに、標本上の各部位の検出情報により偏光方向可変手段の偏光方向を制御可能にすることにより、標本上の各部位の偏光方向に応じた情報を表示させることができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

(第1の実施の形態)
図1は、本発明が適用される共焦点レーザ走査型顕微鏡の概略構成を示している。

図1において、レーザ光源1は、偏光成分を有するパルス状のレーザ光を発する。

レーザ光源1から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板2と、波長分割する手段としてのダイクロイックミラー3と、光走査手段としての走査光学ユニット4とが配置されている。

偏光板2は、レーザ光源1の偏光特性(消光比)を改善して最適化を図るために使用され、レーザ光源1とともに、偏光特性を有する光源手段を構成している。ダイクロイックミラー3は、必要な波長域を分割(検出する特性を有しており、レーザ光源1から入射するレーザ光を透過し、走査光学ユニット4側より入射する蛍光を反射(検出)する。走査光学ユニット4は、走査ミラー4a、4bを有しており、走査ミラー4a、4bはレーザ光を偏向する。

走査光学ユニット4により偏向されたレーザ光の光路には、リレーレンズ5およびミラー6が配置されている。また、ミラー6の反射光路には、結像レンズ7および対物レンズ8が配置されている。

ミラー6で反射し結像レンズ7を通ったレーザ光は、ステージ9に載置された標本10に照射する。また、標本10の断面10a上に照射される光は、走査ミラー4a、4bの動きにより断面10a上の所定の範囲で走査される。

標本10には、蛍光標識としてGFPなどの蛍光タンパクが用いられている。標本10は、焦点位置に集光される偏光成分を有するレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活する蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。

これにより、標本10から偏光成分を持った蛍光(以下、蛍光偏光)が発生する。この蛍光偏光は、対物レンズ8で光を集められ、結像レンズ7を通過して、ミラー6、リレーレンズ5、走査光学ユニット4を通ってダイクロイックミラー3に入射する。

ダイクロイックミラー3で90度曲げられた反射光路には、光検出手段を構成する偏光特性抽出手段としての偏光板11、波長選択手段としてのバリアフィルタ12、コンフォーカルレンズ13、共焦点ピンホール14および光検出器としてホトマル15が配置されている。

偏光板11は、所定の偏光特性の蛍光偏光を抽出する。バリアフィルタ12は、蛍光偏光の波長を選択する。バリアフィルタ12より選択された蛍光偏光は、コンフォーカルレンズ13を通って共焦点ピンホール14面で結像される。また、共焦点ピンホール14を通過した蛍光偏光は、ホトマル15で検出される。

この場合、偏光板11は、コンフォーカルレンズ13と共焦点ピンホール14の後でも同じ効果が得られる。また、偏光板11としては、偏光ビームスプリッタ(PBS)、1/2波長板、偏光ローテーター、液晶シャッター、ポッケルセルなどの偏光方向を検出できればよい。ここで、PBSの場合は、蛍光偏光を、P偏光とS偏光に分離することができる。1/2波長板の場合は、偏光方向を変えることができるため、バリアフィルタ12として同じ機能があるAO素子などを用いると、AOの偏光方向に合せて光を入れ、AOによる波長選択をさせることが可能となる。

次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。

レーザ光源1から偏光成分を有するレーザ光が出射すると、レーザ光偏光特性は、偏光板2で最適化され、ダイクロイックミラー3を透過して走査光学ユニット4に入射する。走査光学ユニット4に入射したレーザ光は、走査ミラー4a、4bにより偏向される。

走査光学ユニット4で偏向されたレーザ光は、リレーレンズ5、ミラー6を通って結像レンズ7に入射する。結像レンズ7を通ったレーザ光は、ステージ9に載置された標本10の断面10a上に集光される。

標本10は、焦点位置に集光される偏光したレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活に伴う蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。

標本10から発せられた蛍光偏光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ8、結像レンズ7、ミラー6、リレーレンズ5、走査光学ユニット4を通ってダイクロイックミラー3に入射する。

ダイクロイックミラー3で90度曲げられた蛍光偏光は、偏光板11に入射する。偏光板11は、所定の偏光特性の蛍光を抽出してバリアフィルタ12に導く。バリアフィルタ12は、蛍光偏光の中の所定の波長のみを選択し、コンフォーカルレンズ13を通って共焦点ピンホール14面に結像させる。共焦点ピンホール14を貫いた蛍光偏光は、ホトマル15に入射される。ホトマル15は、入射した蛍光偏光の輝度を検出するとともに、電気信号に変換することにより、偏光蛍光共焦点画像データとして出力する。

従って、このようにすれば、GFPなどの蛍光タンパクにより標識した標本10に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本10を確実に励起させることができる。

また、この励起により標本10から発生する蛍光偏光を、波長分割手段としてのダイクロイックミラー3、偏光特性抽出手段としての偏光板11、波長選択手段としてのバリアフィルタ12を介して検出することにより、この蛍光偏光のデータからタンパク質の分子運動の解析や偏光成分に関する蛍光寿命の解析などを行うことができる。この場合、蛍光タンパクは、光刺激、化学反応、電気刺激、PH、温度変化などによって、分子構造を変化し、偏光特性を変化させることが可能であることから、蛍光タンパクの偏光特性を解析することで、タンパク質の各種の機能を解析することができる。

さらに、GFPなどの蛍光タンパクを解析するには、細胞内部の特定部位にラベルすることもあるが、このように偏光成分が標本の厚さ方向によって異なる場合は、一般的な顕微鏡では検出したい部位以外の偏光成分も合成されてしまい、このような部位の偏光成分を検出することが困難である。ところが、この実施の形態では、共焦点顕微鏡のセクショニング効果により、サンプルの厚さ方向の特定部位を検出するようにできるので、細胞内の厚さ方向の特定部位の情報も確実に得ることが可能である。

なお、レーザ光源1としてIRパルスレーザを使用した場合、2光子吸収による偏光蛍光画像を取得することができる。この場合の2光子吸収現象は、結像位置のみで発生するので、共焦点ピンホール14は、理論的に不要になる。また、このとき用いられるダイクロイックミラー3は、IRレーザを透過し、可視蛍光偏光を反射してホトマル15側に導く短波長反射の特性を有する。

(変形例1)
第1の実施の形態では、標本10の蛍光偏光を検出する例を述べたが、図2に示す構成により、さらに蛍光寿命の測定を行うことも可能である。図2において、図1と同一部分には同符号を付している。

この場合、ダイクロイックミラー3の反射光路に、光分割手段としてハーフミラー20が挿入されている。そして、ハーフミラー20の透過光路に、上述した偏光板11、バリアフィルタ12、コンフォーカルレンズ13、共焦点ピンホール14およびホトマル15が配置され、また、反射光路に偏光板21、バリアフィルタ22、コンフォーカルレンズ23、共焦点ピンホール24およびホトマル25が配置されている。

ここで、偏光板11は、蛍光偏光のs偏光成分を抽出し、偏光板21は、p偏光成分を抽出するものとすると、これら偏光板11、21で抽出されるs偏光成分およびp偏光成分のそれぞれの蛍光強度がホトマル15、25で検出される。

また、ホトマル15、25には、演算手段としてのパーソナルコンピュータ(PC)26が接続されている。PC26は、ホトマル15、25で検出されるs偏光成分およびp偏光成分のそれぞれの蛍光強度に基づいて下式により異方性比r(t)を計算する。

r(t)=[Is(t)−Ip(t)]/[Is(t)+2・Ip(t)] …(1)
ここで、Is(t)はs偏光成分の蛍光強度、Ip(t)はp偏光成分の蛍光強度である。

異方性比r(t)は、回転緩和時間、揺動拡散速度などと一定の関係があり、異方性比r(t)により分子の様々な動的特性を知ることができる。また、同時に、Is(t)+Ip(t)を求めれば、その減衰曲線から回転運動とは無関係に蛍光タンパクなどの蛍光寿命も求めることができる。分子、蛍光タンパクの動的特性も蛍光寿命も周囲の様々な条件によって変化するので、これらの情報を同時に測定できれば、生命科学上の重要な解析ツールとなり得る。

(変形例2)
第1の実施の形態では、1個のレーザ光源と1個の光検出部を設けた例を述べたが、図3に示すように、2個のレーザ光源と2個の光検出部を設けるようにもできる。図3において、図1と同一部分には同符号を付している。

変形例2では、レーザ光源1とともに、レーザ光源31が設けられている。レーザ光源31は、レーザ光源1と波長の異なる偏光成分を有するレーザ光を発する。

レーザ光源1から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板2を介して合成ミラー32が配置されている。また、レーザ光源31から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板33を介してミラー34が配置されている。ミラー34で反射したレーザ光は、合成ミラー32に入射する。

合成ミラー32は、波長特性をもったダイクロイックミラーや偏光特性をもった偏光ビームスプリッタ(PBS)に置き換えることが可能である。また、AOTFなどの音響光学素子などを用いて合成することも可能である。

合成ミラー32で合成されたレーザ光の光路上には、偏光板35を介してダイクロイックミラー3および走査光学ユニット4が配置されている。

一方、ダイクロイックミラー3の反射光路には、偏光板36を介して光分割手段としてハーフミラー37が挿入されている。そして、ハーフミラー37の透過光路には、第1の光検出手段43として、偏光板11、バリアフィルタ12、コンフォーカルレンズ13、共焦点ピンホール14およびホトマル15が配置され、また、反射光路には、第2の光検出手段44として偏光板38、バリアフィルタ39、コンフォーカルレンズ40、共焦点ピンホール41およびホトマル42が配置されている。

このようにして、複数のレーザ光源1、31と光検出手段43、44を用意することで、多波長蛍光の標本や、部分的に偏光方向が異なる標本に対応させることが可能になる。

ここで、多波長蛍光の標本の場合は、各蛍光波長に対応させて、レーザ光源1、31の波長を設定すると共に、光検出手段43、44ごとに波長選択手段のバリアフィルタ12、39による選択波長を設定することにより対処可能である。また、部分的に偏光方向が異なる標本の場合は、偏光特性の異なるレーザ光源1、31を用意しておき、標本上の偏光方向が異なる部位毎にレーザ光源1、31の偏光方向を選択することにより対処可能である。

なお、本変形例では、2個のレーザ光源と2個の光検出手段を設ける例を述べたが、これらレーザ光源および光検出手段は、2個以上の場合であってもよい。

(第2の実施の形態)
次に、本発明の第2の実施の形態を説明する。

図4は、第2の実施の形態の概略構成を示す図であり、図1と同一部分には、同符号を付している。

第2の実施の形態において、レーザ光源1から出力されるレーザ光の光路上には、光ファイバ51の入力端511が配置されている。光ファイバ51は、レーザ光源1からの偏光成分を有するレーザ光を伝送する。光ファイバ51として、例えば、偏波面保存ファイバを用いるのが望ましい。

光ファイバ51の出力端512には、偏光方向可変手段として回転機構52が設けられている。回転機構52は、光ファイバ51の出力端512を回転可能とする構成になっていて、出力端512の回転角度によって、レーザ光の偏向方向を自由に変えられる。つまり、回転機構52は、標本10の偏光方向に合わせてレーザ光の偏向方向を変えられる。これにより、回転機構52を90度回転させることで、s偏光成分の励起とp偏光成分の励起による蛍光偏光のデータを選択的に取得できる。

回転機構52の前面には、偏光板2が設けられている。この偏光板2は、回転機構52の回転にあわせて回転可能になっていて、回転機構52より出射される光の偏光方向と同じ偏光方向になる。

回転機構52には、制御手段としてコントローラ53が接続されている。コントローラ53には、走査光学ユニット4とホトマル15が接続され、さらに、操作部54とモニタ55が接続されている。

コントローラ53は、操作部54の操作により回転機構52を回転制御し、レーザ光の偏向方向を任意に設定できる。また、コントローラ53は、走査光学ユニット4の走査ミラー4a、4bの動きに応じた標本10上の走査情報に基づいて標本10上の各部位を検出する手段(図示せず)を有していて、ここでの検出情報により回転機構52を回転制御するとともに、これにより取得されるホトマル15のデータによって、モニタ55上に標本10上の各部位の画像情報を表示させる。

このようにすれば、コントローラ53により、標本10の偏光方向に合わせて回転機構52を回転させ、レーザ光の偏光方向を変えることにより、標本10上のs偏光成分とp偏光成分の励起による偏光方向に応じた情報を選択的に取得することができる。

また、標本10上での偏向方向等の特性が、例えば、図5中のA(s偏光)、B(p偏光)、C(無偏光)に示すように、各部位で異なることが既知である場合は、走査光学ユニット4の走査ミラー4a、4bの動きに応じた標本10上での走査情報に基づいて、つまり標本10上のA、B、Cの各部位に合わせて回転機構52を回転させて、レーザ光の偏向方向を変えることにより、モニタ55上に標本10上の各部位の画像情報を表示させることができる(図5)。

さらに、ここでは、レーザ光源1から出力されるレーザ光を光ファイバ51を用いて回転機構52に導入することで、回転機構52の回転する部分をコンパクトにできる。この場合、光ファイバ51の入力端511側で、波長の異なる光や偏光方向の異なるレーザ光を合成して導入すれば、多数のレーザ光を一つの回転機構52で偏光方向を変えることができる。

なお、第2の実施の形態では、レーザ光の偏向方向を変える方法として、回転機構52というメカ的な構成を採用したが、偏光方向を変えることができれば、これ以外の方法でもよく、例えば、光学式の偏光ローテータを使用する方法や、光源にランダム偏光のレーザを使用して、このランダムな光から1/4波長板と偏光板を組み合わせて任意の偏光成分を抜き出して使用することも可能である。この場合は、1/2波長板などを組み合わせることでp偏光とs偏光に変えることも可能である。さらには、レーザ光源1全体を光軸を中心に回転させるようにしても、レーザ光の偏向方向を変えることができる。

(変形例)
第2の実施の形態では、1個のレーザ光源と1個の光検出手段を設けた例を述べたが、図4と同一部分には同符号を付した図6に示すように、2個のレーザ光源と2個の光検出手段を設けるようにもできる。

この場合、レーザ光源1とともに、レーザ光源60が設けられている。レーザ光源60は、レーザ光源1と同様に、偏光成分を有するレーザ光を発するものが用いられる。

レーザ光源1から出力されるレーザ光の光路上には、光学式の偏光ローテータ61を介して合成ミラー62が配置されている。また、レーザ光源60から出力されるレーザ光の光路上には、光学式の偏光ローテータ63を介してミラー64が配置されている。ここで、偏光ローテータ61、63は、レーザ光源1、60のレーザ光の偏向方向を任意に設定できる。

ミラー64で反射したレーザ光は、合成ミラー62に入射する。合成ミラー62は、波長特性をもったダイクロイックミラーや偏光特性をもった偏光ビームスプリッタ(PBS)に置き換えることが可能である。また、AOTFなどの音響光学素子などを用いて合成することも可能である。

合成ミラー62で合成されたレーザ光の光路上には、光ファイバ51の入力端511が配置されている。また、光ファイバ51の出力端512側には、偏光板65を介してダイクロイックミラー3および走査光学ユニット4が配置されている。

一方、ダイクロイックミラー3の反射光路には、偏光板66を介して光分割手段としてハーフミラー67が挿入されている。そして、ハーフミラー67の透過光路には、第1の光検出手段73として、偏光板11、バリアフィルタ12、コンフォーカルレンズ13、共焦点ピンホール14およびホトマル15が配置され、また、反射光路には、第2の光検出手段74として偏光板68、バリアフィルタ69、コンフォーカルレンズ70、共焦点ピンホール71およびホトマル72が配置されている。

このように、レーザ光源1、60について、それぞれの偏光ローテータ61、63を操作することにより、レーザ光の偏向方向を各別に設定することができる。つまり、偏光ローテータ61を操作してレーザ光源1のレーザ光をs偏光に、偏光ローテータ63を操作してレーザ光源60のレーザ光をp偏光に設定することが可能となり、これらs偏光とp偏光のレーザ光を合成したものを励起光として標本10に与えることができる。勿論、偏光ローテータ61を操作してレーザ光源1のレーザ光をp偏光に、偏光ローテータ63を操作してレーザ光源60のレーザ光をs偏光に設定することも可能である。

これにより、標本10の各部位で偏向方向が異なる場合も、これら偏光方向の違いに合わせて、レーザ光源1、60のレーザ光の偏光方向を最適な状態に設定することができる。この場合、偏光板65は、光路から退避させるか同期して回転させる。

また、2個のレーザ光源1、60を用いる場合、異なった蛍光波長を励起するためレーザ光の波長が異なっている場合と、レーザ光の波長が同じで偏光方向が異なる場合に適用できる。このうちレーザ光の波長が異なっている場合は、標本10の蛍光波長に対するレーザ光を選択して用いれば、多波長の蛍光標本に対応させることが可能である。また、レーザ光の波長が同じで偏光方向が異なる場合は、偏光ローテータ61、63により偏光方向を変えることで、蛍光波長ごとに偏光特性が異なる標本10に対応させることができる。

なお、上述では、2個のレーザ光源と2個の光検出手段を設ける例を述べたが、これらレーザ光源および光検出手段は、2個以上の場合であってもよい。

(第3の実施の形態)
次に、本発明の第3の実施の形態を説明する。

上述した第1および第2の実施の形態では、レーザ光をスポットで集光して、走査する共焦点レーザ走査型顕微鏡についで述べたが、共焦点顕微鏡には、その他にも方式があり、同様な効果を得ることが可能である。

図7は、第3の実施の形態の概略構成を示す。

図7において、光源81から出射される光は、コリメータレンズ82で平行光となって偏光板83に入射する。偏光板83は、光源81の光を偏光特性を有する光に変換する。偏光板83は、光源81とともに、偏光特性を有する光源手段を構成している。

偏光板83に入射した光は、偏光特性を持った光に変換され、波長分割素子84で、励起波長幅のものが選択される。ここで、波長分割素子84には、ダイクロイックミラーやAOMなどが用いられる。

波長分割素子84で、選択された光は、回転ディスク85を通り、結像レンズ86、対物レンズ87を介して標本88面の焦点位置に励起光として入射する。

回転ディスク85は、対物レンズ87のエアリー径もしくはエアリー径×0.5程度の大きさのピンホールやスリットなどの光を規制する機能を有する。回転ディスク85は、対物レンズ87と光学的に共役な位置である焦点面に配置されるとともに、回転軸851を介して図示しないモータの軸に連結され、一定の回転速度で回転する。

標本88は、励起光により偏光成分を持った蛍光を発生し、対物レンズ87を介し、結像レンズ86により回転ディスク85上に蛍光像を投影する。投影された像のうち焦点の合っている部分は、ピンホールやスリットを通過して共焦点効果を得て、さらに波長分割素子84を透過し、偏光板89で偏光成分が選択されたのち、結像レンズ90を介して撮像手段としてのCCDカメラ91で撮像される。

このように構成した共焦点顕微鏡によっても、上述した共焦点レーザ走査型顕微鏡と同じ効果を得ることが可能である。また、このような共焦点顕微鏡では、光源81に、白色光源やLEDあるいはレーザ光源などを使用することが可能であり、レーザ光源を使用した場合は、偏光成分をもったレーザ光源を使用することで、偏光板83を省略することが可能である。

(第4の実施の形態)
次に、本発明の第4の実施の形態を説明する。

第4の実施の形態は、本発明をさらに具体的に説明するための図で、図8は、第4の実施の形態が適用される共焦点レーザ走査型顕微鏡の概略構成を示している。

図8において、レーザ光源101は、偏光成分を有するパルス状のレーザ光を励起光として発生する。この場合、レーザ光源101には、小型で、しかもレーザ光のオンオフが容易な半導体レーザが用いられている。

レーザ光源101からのレーザ光の光路上には、コンデンサレンズ102、偏光板としてのポラライザ103およびダイクロイックミラー104が配置されている。

コンデンサレンズ102は、レーザ光源101からの励起光を最適な直径にコリメートする。ポラライザ103は、レーザ光源1の偏光特性(消光比)を改善して最適化を図るための。ダイクロイックミラー104は、必要な波長域を分割(検出する特性を有する。ダイクロイックミラー104は、レーザ光源101から入射するレーザ光を反射し、後述する走査光学ユニット105側より入射する蛍光を透過(分割(検出)する。なお、ダイクロイックミラー104は、励起光の波長や後述する標本110が発する蛍光の波長が必要に応じて変えられると、対応する特性のものに変更できるように着脱可能になっている。

ダイクロイックミラー104の反射光路には、走査光学ユニット105が配置されている。走査光学ユニット105は、走査ミラー105a、105bを有し、これら走査ミラー105a、105bによりレーザ光を偏向する。

走査光学ユニット105により偏向されたレーザ光の光路には、瞳投影レンズ106およびミラー107が配置されている。また、ミラー107の反射光路には、結像レンズ108および対物レンズ109が配置されている。

ミラー107で反射し結像レンズ108を通ったレーザ光は、走査ミラー105a、105bの動きにより対物レンズ109の視野全面にわたって走査される。

この場合も標本110には、蛍光標識としてGFPなどの蛍光タンパクが用いられている。標本110は、焦点位置に集光される偏光成分を有するレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活する蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。

これにより、標本110から偏光成分を持った蛍光(以下、「蛍光偏光」と称する)が発生し、この蛍光偏光は、対物レンズ109で光を集められ、結像レンズ108を通過して、ミラー107、瞳投影レンズ106、走査光学ユニット105を通ってダイクロイックミラー104に入射する。ダイクロイックミラー104は、蛍光偏光と励起光が混在した戻り光を分離し、蛍光偏光を透過する。

ダイクロイックミラー104の透過光路には、集光レンズ111、共焦点ピンホール112が配置されている。集光レンズ111は、標本110の一点から発せられた蛍光偏光を共焦点ピンホール112上に結像する。共焦点ピンホール112は、対物レンズ109の焦点と光学的に共役な位置に配置され、標本110からの蛍光偏光のうち合焦の成分を通過させるが、非合焦の成分を透過できない。この場合、共焦点ピンホール112の大きさは、共焦点効果が十分に実現されるために、集光レンズ111によって形成されるエアリディスクよりも小さいことが必要である。従って、対物レンズ109が交換されると、これに応じて異なった大きさのピンホールに変更される機構を持つことが望ましい。具体的には、例えば、異なる大きさのピンホールを有する円板状のターレットを、対物レンズ109の切換に用いられるレボルバ(不図示)と同期して回転させるようにすればよい。

共焦点ピンホール112を抜けた光の光路上には、偏光ビームスプリッタ113が配置されている。偏光ビームスプリッタ113は、共焦点ピンホール112を抜けた光を直交する2偏光成分、つまりp偏光成分とs偏光成分に分離する。この場合、偏光ビームスプリッタ113は、蛍光波長の種類が非常に多様であるため、できる限り広帯域であることが望ましい。できれば、ダイクロイックミラー104と同様に、蛍光の波長が変えられた場合、対応する特性のものに変更できるように着脱可能とするのが望ましい。

偏光ビームスプリッタ113より分離された一方の光路には、第1の検出系として、バリアフィルタ114a、アナライザ115a、光検出器116aが配置され、また、他方の光路には、第2の検出径として、バリアフィルタ114b、アナライザ115b、光検出器116bが配置されている。これら2つの検出系は、ほぼ同等な特性を有している。

ここで、バリアフィルタ114a、114bは、ダイクロイックミラー104で遮断しきれなかった励起光を完全にカットする。つまり、一般に蛍光の発光効率はそれほど高くなく、特に、パルス光励起によるホトンカウンティングの場合は、蛍光に含まれるレーザ光の漏れの蛍光測定の及ぼす影響が、他の顕微鏡観察と比べて大きいために用いられている。アナライザ115a、115bは、偏光ビームスプリッタ113を広帯域にしようとすると、透過光、反射光ともに反対方向の不要な偏光成分が混在する割合が大きくなる(1〜5%)ので、正確な測定を実現するために用いられている。光検出器116a、116bとして、ホトマルチューブ、アバランシェダイオードなどの高感度で低雑音の検出器が使用されている。

なお、図8では、共焦点ピンホール112を抜けた光が大きく広がるように書かれているが、集光レンズ111と瞳投影レンズ106の焦点距離の比を大きくして、共焦点ピンホール112上への結像倍率を上げれば、光検出器116a、116bの受光面に対して光の広がりを十分に小さく抑えることができる。勿論、空間的余裕があれば、共焦点ピンホール112の像を光検出器116a、116b上に投影する光学系を構成してもよい。

一方、結像レンズ108と対物レンズ109との間には、ハーフミラー116が配置され、反射ミラー107と結像レンズ108との間には、観察鏡筒117が配置されている。

ハーフミラー116には、観察照明ユニット118からの照明光が入射される。この照明光は、ハーフミラー116で反射し、対物レンズ109を介して標本110に照射され、また、標本110からの反射光は、ハーフミラー116を透過し、結像レンズ108を介して観察鏡筒117に入射し、一般の光学顕微鏡として標本像を目視またはTV観察できる。

次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。

レーザ光源101からパルス状のレーザ光が発せられると、レーザ光は、コリメータレンズ102でコリメートされ、ポラライザ103で偏光特性を最適化された後、ダイクロイックミラー104で反射して走査光学ユニット105に入射する。

走査光学ユニット105に入射したレーザ光は、走査ミラー105a、105bにより偏向され、瞳投影レンズ106、ミラー107を介して結像レンズ108に入射する。結像レンズ108を透過したレーザ光は、標本110に集光する。

標本110は、焦点位置に集光される偏光したレーザ光により励起された状態となる。この場合、励起状態から失活に伴う蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。

標本110から発せられた蛍光偏光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ109、結像レンズ108、ミラー107、瞳投影レンズ106、走査光学ユニット105を通ってダイクロイックミラー104に入射する。

ダイクロイックミラー104を透過した蛍光偏光は、集光レンズ111を通って共焦点ピンホール112上に結像される。共焦点ピンホール112を貫いた蛍光偏光は、偏光ビームスプリッタ113により直交する2偏光成分、つまりp偏光成分とs偏光成分に分離される。

偏光ビームスプリッタ113で分離された一方の偏光成分の蛍光は、バリアフィルタ114a、アナライザ115aを介して光検出器116aに入射され、また、他方の偏光成分の蛍光は、バリアフィルタ114b、アナライザ115bを介して光検出器116bに入射される。光検出器116a、116bは、入射した蛍光の輝度を検出するとともに、電気信号に変換し、共焦点画像データとして出力する。

そして、このようにして取得される標本110の各走査点に対応する光検出器116a、116bからの出力信号それぞれの偏光成分に対する比または差を考慮すれば、蛍光分子の回転緩和時間の画像を得ることができる。また、これらの和を計算すれば、分子回転の有無に関わらない蛍光寿命画像を得ることができる。さらに、光検出器116a、116bで光子数をカウントし、これら光子数の合計を画素ごとに係数すれば、蛍光強度画像を得ることができる。この場合、各画素ごとに照射する励起パルスの数は同一でなければならない。

なお、このような第4の実施の形態の直交する偏光成分に対する検出信号強度(光子数)は、偏光ビームスプリッタ113の透過率、反射率の違い、バリアフィルタ114a、114bの透過率の違い、アナライザ115a、115bの透過率の違い、光検出器116a、116bの感度の違いなどによって微妙に異なることがある。そこで、上述した計算を行う場合は、これらを補正係数として組み込んだ計算を行う必要がある。また、ダイクロイックミラー104を適当な波長特性のものに交換し、偏光ビームスプリッタ113をハーフミラーに交換し、アナライザ115a、115bに代えて異なった波長域のバンドパスフィルタ用いれば、異なる2波長の蛍光強度画像と蛍光寿命画像を同時に得ることができる。

従って、このようにすれば、標本110に対する1回の励起光走査により、共焦点効果による蛍光強度分布の断層像が取得できるとともに、ラベリングされた分子の回転緩和時間像と蛍光寿命像を取得することができる。また、僅かな光学部品を交換するのみで、様々な蛍光波長を発する蛍光による標本上の性質の違いなども観測することができる。

本発明の実施の形態によれば、蛍光タンパクなどにより標識した標本に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本を確実に励起させることができる。また、標本から発生する偏光成分を有する蛍光を波長分割手段、偏光特性抽出手段、波長選択手段を介して検出することにより、このときの検出情報からタンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命の解析などを行うことができる。さらに共焦点顕微鏡と組合せることで、細胞内の局所的な偏光蛍光特性の情報も得ることができる。

また、本発明の実施の形態によれば、偏光方向可変手段により標本の偏光方向に合わせてレーザ光の偏光の方向を変えることができるので、標本上の異なる偏光成分を有する蛍光のデータを選択的に取得することができる。

さらに、標本上の各部位の検出情報により偏光方向可変手段の偏光方向を制御可能にすることにより、標本上の各部位の偏光方向に応じた情報を表示させることができる。

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

本発明の実施の形態によれば、蛍光タンパクにより標識した標本を励起することができ、これにより得られる蛍光偏光により標本の多様な機能解析を可能にした共焦点顕微鏡を提供できる。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

本発明の第1の実施の形態の概略構成を示す図。 第1の実施の形態の変形例1の概略構成を示す図。 第1の実施の形態の変形例2の概略構成を示す図。 本発明の第2の実施の形態の概略構成を示す図。 第2の実施の形態の概略構成を示す図。 第2の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。 本発明の第3の実施の形態の概略構成を示す図。 本発明の第4の実施の形態の概略構成を示す図。

符号の説明

1.31、60…レーザ光源、2…偏光板、3…ダイクロイックミラー、4…走査光学ユニット、4a.4b…走査ミラー、5…リレーレンズ、6…ミラー、7…結像レンズ、8…対物レンズ、9…ステージ、10…標本、10a…断面、12…バリアフィルタ、13…コンフォーカルレンズ、14…共焦点ピンホール、15…ホトマル、20…ハーフミラー、21…偏光板、22…バリアフィルタ、23…コンフォーカルレンズ、24…共焦点ピンホール、25…ホトマル、26…PC、31…レーザ光源、32…合成ミラー、33、35、36、38…偏光板、34…ミラー、37…ハーフミラー、39…バリアフィルタ、40…コンフォーカルレンズ、41…共焦点ピンホール、42…ホトマル、43…第1の光検出手段、44…第2の光検出手段部、51…光ファイバ、511…入力端、512…出力端、52…回転機構、53…コントローラ、54…操作部、55…モニタ、60…レーザ光源、61.63…偏光ローテータ、62…合成ミラー、64…ミラー、65、66…偏光板、67…ハーフミラー、68…偏光板、69…バリアフィルタ、70…コンフォーカルレンズ、71…共焦点ピンホール、72…ホトマル、73…第1の光検出手段、74…第2の光検出手段、81…光源、82…コリメータレンズ、83…偏光板、84…波長分割素子、85…回転ディスク、851…回転軸、86…結像レンズ、87…対物レンズ、88…標本、89…偏光板、90…結像レンズ、91…CCDカメラ、101…レーザ光源、102…コリメータレンズ、103…ポラライザ、104…ダイクロイックミラー、105…走査光学ユニット、105a.105b…走査ミラー、106…瞳投影レンズ、107…反射ミラー、108…結像レンズ、109…対物レンズ、110…標本、111…集光レンズ、112…共焦点ピンホール、113…偏光ビームスプリッタ、114a.114b…バリアフィルタ、115a.115b…アナライザ、116a.116b…光検出器、116…ハーフミラー、117…観察鏡筒、118…観察照明ユニット。

Claims (11)

  1. 偏光成分を有する光を発する光源手段と、
    前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、
    前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、
    前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光を前記励起光の光路から分割する波長分割手段と、
    前記波長分割手段により分割された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該蛍光の波長を選択する波長選択手段および前記偏光特性抽出手段で偏光特性を抽出され前記波長選択手段で波長を選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段と
    を具備し
    前記光源手段は、前記標本へ照射する光の偏光方向を可変する偏光方向可変手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
  2. 記偏光方向可変手段によって、前記標本の偏光方向にあわせて当該標本へ照射する光の偏光方向を可変することを有することを特徴とする請求項1記載の共焦点顕微鏡。
  3. 前記偏光方向可変手段は、前記光源手段全体を該光源手段より発せられる光の光軸を中心に回転させることを特徴とする請求項1または2記載の共焦点顕微鏡。
  4. さらに前記光源手段から発せられる偏光成分を有する光を伝送する光ファイバを有し、前記偏光方向可変手段は、前記光ファイバに設けられることを特徴とする請求項1または2記載の共焦点顕微鏡。
  5. 前記偏光方向可変手段は、前記光ファイバの出力端を回転可能にした回転機構を有することを特徴とする請求項4記載の共焦点顕微鏡。
  6. 前記光走査手段の走査位置情報に応じて、前記偏光方向可変手段の偏光方向を制御する制御手段を備えたことを特徴とする請求項乃至5のうちいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
  7. 前記標本上の各部位の既知の偏光方向に関する特性情報に基づき、前記偏光方向可変手段の偏光方向を制御する制御手段を備えたことを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
  8. 偏光成分を有する光を発する光源手段と、
    前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、
    前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、
    前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光を前記励起光の光路から分割する波長分割手段と、
    前記波長分割手段により分割された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該蛍光の波長を選択する波長選択手段、および前記偏光特性抽出手段で偏光特性を抽出され前記波長選択手段で波長を選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段と、
    を具備し、
    前記光検出手段は、前記標本から発せられる蛍光のs偏光成分とp偏光成分を各別に検出する2個の光検出手段からなり、さらに、これら光検出手段より検出されるs偏光成分とp偏光成分のそれぞれの蛍光強度の時間変化に基づいて回転緩和時間と蛍光寿命を演算する演算手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
  9. 前記光源手段は、複数の光源を有し、それぞれの光源は、偏光成分を有する光の偏光方向を可変する偏光方向可変手段を有することを特徴とする請求項1または8のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
  10. 前記光走査手段は、複数のピンホールまたはスリットを有し、前記光源手段からの光を前記対物レンズに導くとともに、前記標本から発せられる蛍光像が前記対物レンズを介して投影される回転ディスクを備え、
    前記光検出器は撮像手段であることを特徴とする請求項1,2,3,4,5,8または9のいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡。
  11. 前記光源手段は、半導体レーザからなることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡。
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