JP6013328B2 - 標的粒子の定量方法 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子の濃度を求める方法に関する。
本願は、２０１１年０４月１８日に、日本に出願された特願２０１１−０９２１６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能である。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１〜３参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象が検出される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値とが算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測する。そして、微弱光によりフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６号公報 特開２００８−２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開第２００８／０８０４１７号 特開２００７−２０５６５号公報 特開２００８−１１６４４０号公報 特開平４−３３７４４６号公報

金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１〜１４３８ページ。 メイヤー−アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４〜２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１〜２７７ページ。

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生する。このため、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。この結果、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。

特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定できる。これにより、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができない。例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出し、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。したがって、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。これにより、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。

本発明は、上述した問題点に鑑み案出されたものであり、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている統計的処理を含まず、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、試料溶液中にて分散しランダムに運動する観測対象粒子（具体的には、標的粒子と結合した発光プローブ、または発光プローブをいう。以下同じ。）から放出される光を指標として検出する場合において、以下の２点を見出し、本発明を完成させた。すなわち、（１）観測対象粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、感度よく標的粒子を検出することができること、（２）観測対象の粒子の濃度が既知である標準試料溶液の測定結果から作成された検量線を用いることにより、走査分子計数法により求められた観測対象粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度を算出可能であること。
ここで、走査分子計数法は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。

すなわち、本発明の第１の態様に係る標的粒子の定量方法によれば、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、（ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と；（ｂ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の記発光プローブから放出される光信号を検出して、直接的、または、間接的に前記標的粒子を個別に検出する検出工程と；（ｃ）前記検出工程において検出された、前記標的粒子の数を計数する計数工程及び前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する算出工程と；を備え、前記工程（ｂ）において、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号の検出及び前記標的粒子の検出を、検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光プローブに対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの標的粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの標的粒子を検出することにより行うこと。前記発光プローブは、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し；前記発光プローブが前記標的粒子に結合した結合状態と前記標的粒子に結合していない非結合状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり；前記結合状態と、前記非結合状態との、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なる。
本発明の第２の態様によれば、前記第１の態様において、前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を所定の速度にて移動することが好ましい。

本発明の第３の態様によれば、前記第１の態様または前記第２の態様において、前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を、前記発光プローブ、又は前記発光プローブと結合した標的粒子のいずれか速い方の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することが好ましい。
本発明の第４の態様によれば、前記第１の態様から前記第３の態様のいずれか１態様において、前記検出工程に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光プローブ、又は発光プローブと結合した前記標的粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することが好ましい。
本発明の第５の態様によれば、前記第１の態様から前記第４の態様のいずれか１態様において、前記標的粒子が核酸であり；前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸であることが好ましい。

本発明の第６の態様によれば、前記第１の態様から前記第５の態様のいずれか１態様において、（ｄ）前記工程（ａ）の後、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を回収する工程を有することが好ましい。
本発明の第７の態様によれば、前記第６の態様の態様において、（ｅ）前記工程（ｄ）において回収された前記複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程を有することが好ましい。

上記の標的粒子の定量方法において、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。したがって、上記の標的粒子の定量方法により、解析対象である標的粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の標的粒子の濃度を求めることができる。さらに、上記の標的粒子の定量方法では、標的粒子の濃度既知の標準試料から作成された検量線を用いることにより、計数された標的粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度をより簡便に求めることができる。

走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 反射ミラーの向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 同走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 観測対象粒子に対応する光強度の変化を模式的に示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。 分離用プローブと、前記分離用プローブと結合する固相担体とを用いた態様を模式的に示した図である。 本発明の一実施形態に係る装置の表示部において表示されるデータの一態様を示した図である。 本発明の装置の表示部において表示されるデータの一態様を示した図である。 走査分子計数法による試料溶液中の発光粒子（発光プローブと結合した標的粒子）の計数から試料溶液中の標的粒子の濃度測定までの処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 参考例１において、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである（対数目盛表示）。 参考例１において、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである（通常目盛表示）。 実施例１において、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである。 実施例１において、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである。

まず、本発明の一実施形態に係る走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、走査分子計数法は、試料溶液中の複数の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。

発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法においては、標的粒子と発光プローブとが結合し、発光粒子となる。

本発明の一実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。この光検出領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。

試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。光の検出が行われると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される。このとき、検出したい粒子（標的粒子）の存在は、直接的に検出されてもよく、間接的に検出されてもよい。直接的に検出される場合とは、標的粒子と結合した発光プローブを検出することにより行うものである。間接的に検出される場合とは、発光プローブが一旦標的粒子と結合した後、粒子から解離した発光プローブの光を検出することにより行うものである。これらの場合、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出することにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、溶液内での粒子の状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。この構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。これにより、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である。このとき、試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。この発光プローブは、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実施の態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した場合の発光プローブを含む。以下同様である。
実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。ここで、所定の閾値とは、予め設定された光強度の値であり、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された値である。

また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。

更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる標的粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、検出したい粒子の存在を表す光信号が検出されてしまう。この結果、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定する。具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。また発光プローブから放出される光信号を検出して、間接的に標的粒子を検出する場合（つまり、観測対象粒子が発光プローブである場合）には、発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。すなわち、光検出領域の位置は、発光プローブ、又は発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度のいずれか速い方よりも速い速度にて移動されるように設定する。これにより、発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。拡散移動速度は、観測対象粒子によって変わるので、上記の如く、観測対象粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。

走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。

また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出する。これにより、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。発光プローブを個別に検出し、その数を計数して粒子濃度を決定する上記の標的粒子の定量方法によれば、試料溶液中の発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を定量的に測定することが可能である。

更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する形態によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測する。一般的に、試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。本実施形態によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに観測を行うため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。

＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されているように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａに示すように、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とを備えている。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射される。放射された光は、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、この粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実施の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光される。集光された光は、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器（光検出部）１６に到達する。そして、光検出器１６において、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後述する光分析のための処理が為される。当業者に於いて知られているように、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されているように、レーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出される。このため、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。この構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。この光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されているように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。このミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するためのミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい。すなわち、コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなる。この結果、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示するように、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出する構成でも良い。

＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。したがって、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすい。さらには、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。

走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（光検出領域移動部：ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。例えば、図２Ａに示すように、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとしての蛍光色素Ｆが対象粒子Ｔと結合）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれているように、有意な光強度（Ｅｍ）が検出される。上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブ、又は発光プローブの結合した標的粒子が個別に検出される。本実施形態では、直接的に検出される場合、すなわち、標的粒子と結合した発光プローブを検出する場合について説明するが、間接的に検出される場合、すなわち、発光プローブが一旦標的粒子と結合した後、粒子から解離した発光プローブの光も検出可能である。
検出された粒子の数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。この走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報を取得することが可能となる。

また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなる（Ｓ／Ｎ比の悪化）。この結果、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度が算出される。これにより、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できる。

＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラムに従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。このプログラムには、試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順（変更手順）と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順（光検出手順）とが含まれている。この計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングである。時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。したがって、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。観測対象粒子とは、より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブであり、本発明の一実施形態においては、発光プローブと結合した標的粒子である。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と共に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれているように、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が、図３Ｂに示すように、ランダムに変化し、個々の観測対象粒子Ｔに対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。具体的には、上述したように、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。そこで、好適には、図４Ａに描かれているように、粒子（蛍光色素Ｆ及び対象粒子Ｔ）が光検出領域を略直線に横切る。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示されるように、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となる。また、個々の観測対象粒子Ｔと光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。ここで、粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。

具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）^２ ＝６Ｄ・Δｔ …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）^２ ／６Ｄ …（２）
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、拡散移動速度Ｖdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

＜走査分子計数法による光強度の分析＞
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順（光信号検出手順））により、下記に示すように光強度の分析が実行されてよい。

（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されているように、略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれているように、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。

また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２ ／ａ^２ ） …（４）
であると仮定でき、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。一方、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。

（ii）観測対象粒子のカウンティング
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数する（発光粒子数計数手順）ことにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。

図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、かかる時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出され、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得るが、前記のデータ値の欠落は、スムージング処理によって無視することができる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されているように、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。したがって、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。

その後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われる（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）。そして、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号（「ノイズ」と付された信号）は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。

上記のステップ１３０〜１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。

（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行う。検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されてもよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、

Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（５）

により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されてもよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、

ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（６）

により与えられる。光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられてもよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できる構成であってもよい。

＜標的粒子の定量方法＞
本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、試料溶液中の標的粒子を発光プローブで結合させて標識させる。その後、走査分子計数法によって計数した発光プローブと結合した標的粒子の数から、標的粒子の濃度が既知の標準試料を用いて作成された検量線に基づいて、この試料溶液中の標的粒子の濃度を算出する（濃度算出手順）ことを特徴とする。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、標的粒子を高感度に計数することができる。さらに、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、標的粒子を、発光プローブとの結合を介して検出しているが、検量線を用いるため、より簡便かつ容易に、試料溶液中の標的粒子の濃度を求めることができる。
また、標的粒子の定量方法は、検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含んでいても良い。

具体的には、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する。
（ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された溶液中に存在する、前記標的粒子の数を計数する工程（ｃ）前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する工程。
さらに、前記工程（ｂ）が、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、を有する。 以下、工程ごとに説明する。

まず、工程（ａ）として、標的粒子と、この標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、この試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる。

本発明の一実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光する粒子又は発光しない粒子のいずれであってもよい）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。

標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であって、この試料溶液中の濃度を定量する目的の粒子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた高分子であってもよい。
核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾された物質や、タンパク質や低分子化合物等で標識された物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。

また、本発明の一実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なる物質であれば、特に限定されない。例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質に、発光物質を結合させてもよい。発光物質としては、典型的には、蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されず、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。

例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させた物質、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。このオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた高分子であってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含んでもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識した物質を用いることができる。核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。

本発明の一実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等する物質であってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等する物質であることが好ましい。標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合する物質であればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しない物質である必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。

また、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、発光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。

標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、発光プローブとして用いることができる。また、発光プローブは、それ自体が発光していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブを標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中にこの発光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加する。これにより、発光プローブが単独で存在している状態（非結合状態）と、標的粒子と結合した状態（結合状態）とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。

その他にも、例えば、発光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造が変化して強い蛍光を放出する蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。この構成によれば、いずれの場合も、発光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない発光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び発光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。

また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している発光プローブと、標的粒子に結合した状態である発光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、発光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、かつ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるような条件で、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーになる蛍光物質及びエネルギー・アクセプターになる物質（蛍光物質や消光物質）を結合させる。これにより、この結合物質は、発光プローブとして用いられることができる。標的粒子と結合した発光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している発光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している発光プローブと区別して検出することができる。

例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、かつ、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないような条件で、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーになる蛍光物質とエネルギー・アクセプターになる物質とを、結合させて分子ビーコンプローブが作られる。この分子ビーコンプローブは、発光プローブとして好ましく用いることができる。本発明の一実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム−ループ構造）を形成する物質が好ましい。分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。

また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、この蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している発光プローブと、標的粒子と結合している発光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識する蛍光物質とのいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方がこのＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している発光プローブからは、この発光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している発光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している発光プローブとは区別して検出することができる。

発光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、発光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。

その他、本発明の一実施形態においては、発光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の発光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計する。そして、一方の発光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の発光プローブをこのＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している発光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、前記２種類の発光プローブは互いに近接し（例えば、２種類の発光プローブの間隔が約１〜１０ｎｍ）、ＦＲＥＴが起こる。このため、このＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、標的粒子を検出することができる。

具体的には、工程（ａ）は、まず、標的粒子及び発光プローブを適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。この溶媒は、発光プローブから放出される光の検出、及び、走査分子計数法による発光プローブの検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されず、この技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。このバッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

標的粒子及び発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間、この試料溶液をインキュベートするだけで、この試料溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。

一方で、標的粒子や発光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、この発光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。

変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、この試料溶液を、高温処理をすることにより、この試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定されない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、この試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。

必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブを会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、この試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、この試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、この試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、この試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。

２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、この溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。

２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。

また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、この試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。

また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。

その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中の標的粒子の数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、標的粒子を標識用プローブと結合させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、標識用プローブから放出される光を検出し解析する。これにより、標的粒子の数を算出する。

工程（ａ）の後、工程（ｄ）として、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記複合体を回収する。発光プローブで標識された標的粒子を個別に検出する光分析技術を用いた本発明の一実施形態の方法においては、遊離の発光プローブをはじめとする標的粒子と結合していない発光プローブからの光が、発光プローブからの光と区別なく検出されてしまうと、標的粒子の検出精度が悪化してしまう。そこで、工程（ｄ）において、遊離の発光プローブをはじめとする標的粒子と結合していない発光プローブを、前記複合体から除去する。

標的粒子と結合していない発光プローブと分離して前記複合体を回収する方法は、特に限定されるものではなく、大きさ又は分子量、任意の物質に対する親和性、帯電状態等の違いを利用して複数の物質を物理的に分離する際に前記技術分野で通常行われる物質の分離方法の中から、適宜選択して実施することができる。前記分離方法としては、例えば、吸着・抽出又は洗浄を含む操作が挙げられる。具体的には、クロマトグラフィー（親水／疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、フィルター吸着等が挙げられる。

発光プローブとは独立して標的粒子と結合する分離用プローブを利用して、標的粒子と結合していない発光プローブから分離して前記複合体を回収することもできる。具体的には、工程（ａ）において、前記試料溶液にさらに分離用プローブを添加し、標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体を形成する。次いで工程（ｄ）において、前記複合体中の分離用プローブとその他の物質との相互作用を利用して、前記複合体を、標的粒子と結合していない発光プローブと分離して回収する。

分離用プローブは、標的粒子と、発光プローブとは独立して、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であれば、特に限定されるものではない。前記分離用プローブは、他の物質を介して間接的に標的粒子と結合してもよいが、標的粒子と直接結合するものが好ましい。分離用プローブとして使用可能な、標的粒子と直接、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質としては、発光プローブで挙げられたもののうち、発光物質が結合する前のものと同様である。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターである。

本発明の一実施形態において用いられる分離用プローブとしては、固相担体と結合する部位を有しており、標的粒子と結合した状態でさらに固相担体と直接的又は間接的に結合するものであることが好ましい。前記分離用プローブを用いた場合には、工程（ｄ）における複合体の回収、及び以降の工程（ｅ）における遊離の発光プローブの回収を、分離用プローブと直接的又は間接的に結合する固相担体を用いた固液分離処理により、より簡便に行うことができる。

固相担体としては、分離用プローブと結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。

例えば、分離用プローブがオリゴヌクレオチドの場合、前記オリゴヌクレオチド中の標的粒子とハイブリダイズする領域以外の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブが、固相担体と結合する部位として、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)を有している場合、アビジンやストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブ中の固相担体と結合する部位が、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇ)、ジゴキシン(ｄｉｇｏｘｉｎ)、２以上の糖からなる糖鎖、４以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、親水性有機化合物、及び、それらの類縁体等である場合、これらの物質に対する抗体、抗原、リガンド、若しくはレセプターが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。なお、固相担体は、分離用プローブと非特異的に結合等してもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等することが好ましい。

具体的には、前記試料溶液に固相担体を接触させ、必要に応じてインキュベートすることにより、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体が、前記複合体中の分離用プローブを介して固相担体と結合する。その後、固液分離処理を行うことにより、固相担体と結合した複合体を、遊離の発光プローブ等の、液相に存在する標的粒子と結合していない発光プローブと分離して回収することができる。

固液分離処理としては、試料溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して遠心分離処理を行い、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよい。また、前記試料溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、前記試料溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、前記容器の前記磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。内壁が分離用プローブと結合する物質で被覆された容器が固相担体である場合、前記複合体を含む試料溶液を前記容器内に注入し、必要に応じてインキュベートした後、前記容器内の液体を排出する。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記複合体を含む試料溶液を前記固相担体に透過させることにより、固相担体と前記複合体との結合と、標的粒子と結合していない発光プローブからの前記複合体の分離回収を、一の操作で行うことができる。

本発明の一実施形態においては、工程（ａ）において、固相担体を、標的粒子と発光プローブと分離用プローブと共に予め試料溶液に添加しておき、固相担体と結合した標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を形成し、その後に固液分離処理することにより、固相担体と結合した前記複合体を、標的粒子と結合していない発光プローブから分離して回収してもよい。また、工程（ａ）において、予め固相担体と結合した状態の分離用プローブと、標的粒子と発光プローブとを添加して試料溶液を調製してもよい。なお、この際に用いる分離用プローブは、固相担体と可逆的に結合していてもよく、不可逆的に結合していてもよい。

回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した複合体を含む試料溶液が調製される。回収された固相担体は、これを含む試料溶液として、工程（ｅ）に供される。前記溶媒は、後の工程において発光プローブから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されない。前記技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

回収された固相担体は、工程（ｅ）の前に、適当な溶媒により洗浄してもよい。洗浄により、遊離の発光プローブをより厳密に、固相担体と結合した複合体から分離して除去することができる。固相担体を洗浄する溶媒は、複合体と固相担体との結合を損なわなければ、限定されず、工程（ｅ）に供される固相担体と結合した複合体を含む試料溶液の調製に用いる溶媒と同種であってもよく、異なる溶媒であってもよい。

その後、工程（ｅ）として、工程（ｄ）において回収された複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する。

複合体中の発光プローブを解離させる方法は、前記複合体中の標的粒子と発光プローブとの結合を解消し得る方法であれば特に限定されない。
例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質からなるオリゴヌクレオチドであり、発光プローブ中の標的粒子と結合する部位が、核酸分子又は核酸類似物質からなり標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである場合、前記複合体を含む試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に高くしたり、前記複合体を含む試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に低くする。これにより、発光プローブと標的粒子の結合を解消させ、前記複合体から発光プローブを解離させることができる。

解離した発光プローブと、単体又は複合体を形成している標的粒子とを互いに分離して回収する方法は、特に限定されず、発光プローブと、単体の標的粒子又は標的粒子を含む複合体との大きさの差や、任意の物質に対する親和性の差等を考慮して、前記技術分野で通常行われる物質の分離方法の中から、適宜選択して実施することができる。具体的には、クロマトグラフィー（親水／疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、フィルター吸着等が挙げられる。

図８は、分離用プローブＤと、前記分離用プローブＤと結合する固相担体Ｓとを用いた態様を模式的に示した図である。まず、標的粒子Ｔと、発光プローブＥと、分離用プローブＤとが結合し、複合体Ｃを形成する。前記複合体Ｃを、分離用プローブＤを介して固相担体Ｓに結合させた後、洗浄により遊離の発光プローブＥを除去した後、複合体Ｃから発光プローブＥを解離させ、遊離の発光プローブＥと、分離用プローブＤを介して固相担体Ｓと結合した標的粒子Ｔとが分離回収される。

最後に工程（ｃ）として、溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と溶液から計数される発光プローブと結合した標的粒子の数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された標的粒子の数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する。本発明の一実施形態においては、検量線を用いることにより、発光プローブを介して検出された標的粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度を容易に求めることができる。

検量線は、具体的には、まず、標的粒子の濃度が異なる標準試料系列を調製する。標準試料系列は、例えば、標的粒子の濃度が既知の溶液を、水やバッファー等の溶媒で段階的に希釈することによって調製することができる。標準試料系列を構成する標準試料溶液の数は、特に限定されず、３〜２０種類程度であることが好ましい。また、各標準試料溶液の標的粒子の濃度も特に限定されず、標的粒子の種類や、発光プローブと標的粒子の親和性、解析対象の試料溶液中の期待される標的粒子の濃度等を考慮して、適宜調製することができる。標準試料系列は、各標準試料溶液の標的粒子の濃度が等間隔に設定されていてもよく、不等間隔に設定されていてもよい。

次いで、標準試料系列のそれぞれの標準試料溶液に対して、解析対象である試料溶液に対して同じ条件で、工程（ａ）及び（ｂ）を行い、各標準試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する。すなわち、解析対象の試料溶液と同種の溶媒に、各標準試料溶液と、この試料溶液と等濃度になるように発光プローブとを添加して測定用溶液を調製する。そして、工程（ａ）と同じ処理を行うことにより、各測定用溶液中で標的粒子と前記発光プローブとを結合させる。その後、工程（ｂ）と同じ装置、プログラムを用いて走査分子計数法による測定を行い、標識用プローブと結合した標的粒子の数を算出する。各標準試料溶液に対する一連の測定は、工程（ａ）及び（ｂ）と実質的に同時に行ってもよく、工程（ａ）の前に予め行っていてもよく、工程（ｂ）の後に行ってもよい。

各標準試料溶液に対して計数された発光プローブと結合した標的粒子の数、及び前記標準試料溶液の標的粒子の濃度から、両者の関係を近似する連続微分可能関数を求めることができる。得られた連続微分可能関数を検量線として用いる。検量線の作成方法は、特に限定されず、通常、２種類の量的データの関係の近似線を作成する際に用いられる演算解析方法のいずれを用いて作成してもよい。例えば、横軸を標的粒子の濃度とし、縦軸を標的粒子の数としたグラフに、各標準試料溶液から得られたデータをプロットする。各プロットに対して最小二乗法等を行うことにより、検量線を作成することができる。多くの場合には、標的粒子の濃度を対数表示した片対数グラフに測定値をプロットすることにより、シグモイド曲線に近い検量線を作成することができる。

＜本実施形態の装置及びプログラム＞
走査分子計数法のための光分析装置及びこの装置のためのプログラムに、さらに工程（ｃ）を行うための構成及び手順を追加した装置等を用いることにより、工程（ｂ）〜（ｃ）を上記の装置で行うことができる。

具体的には、前述の走査分子計数法に用いられる光分析装置、すなわち、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、光分析装置は、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の前記位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出し、前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する信号処理部とを有する。さらに、光分析装置は、試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量とこの試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線を記憶する記憶部と、前記検量線に基づいて、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を算出する濃度計算部と、前記濃度計算部により算出された前記試料溶液中の前記発光粒子の前記濃度を表示する表示部とを備える。
例えば、コンピュータ１８が、上記信号処理部、記憶部、濃度計算器を備えていても良い。

前記表示部においては、検量線より算出された試料溶液中の発光粒子の濃度が、数値、表、グラフ等、形式を問わず表示される。また、検量線自体や、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の数が表示されることも好ましい。図９及び図１０に、この表示部において表示されるデータの一態様を示す。この表示部にはその他にも、光検出領域からの光を検出する条件（試料溶液の量、測定環境時の温度、光学系から放射される光の波長や強度、光検出領域の位置、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）等）を表示させてもよい。この表示部としては、液晶ディスプレイ等の公知の画像表示装置を用いることができる。

例えば、図１に示すような、走査分子計数法に用いられる光分析装置にさらに、検量線を記憶する記憶装置と、検量線に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を算出する演算装置と、算出された試料溶液中の発光粒子の濃度を表示するディスプレイ（表示部）１９とを備えた装置により、工程（ｂ）〜（ｃ）を行うことができる。この記憶装置及び演算装置は、図１Ａに示すコンピュータ１８を利用することができる。

また、図１１に示したフローチャートで表されるように、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント光強度の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順に、さらに、試料溶液中の前記発光粒子の濃度（又は量）と試料溶液から計数される前記発光粒子の数との相関関係を近似する検量線を参照し、計数された発光粒子の数から、この溶液中の標的粒子の濃度を算出する手順を有するプログラムにより、工程（ｂ）〜（ｃ）を上記の装置で行うことができる。

次に実施例等を示して本発明の実施の形態をさらに詳細に説明するが、本発明の実施の形態は以下の実施例に限定されない。

［参考例１］
濃度が異なる蛍光色素を用いて、走査分子計数法の計測値に基づく検量線作成が可能であることを示す実験を行った。
計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムとを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。
まず、ＡＴＴＯ（登録商標）６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）を、リン酸緩衝液（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７を含む）を用いて１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、又は１０ｆＭとなるようにそれぞれ調製した。次に、光分析装置の光学調整を行った後、上記の各試料溶液について計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０〜７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、１００ｐＭ、１０ｐＭ、及び１ｐＭの試料については２秒間、１００ｆＭ及び１０ｆＭの試料については２０秒間（グラフ中のピーク数は２秒間換算）とした。また、測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象分子に対応する光信号であると判定した。一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。

図１２は、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットしたグラフである（対数目盛表示）。この結果、ＡＴＴＯ６３３の濃度とピーク数の関係は比例関係にあることが確認された。
また、図１３は、図１２のグラフを通常目盛表示としたグラフである。この結果、溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度と計数されるピーク数とは強い正の相関があり、各測定値から求められた検量線（図１３内に示す。）を用いることにより、濃度未知の試料の濃度を容易に決定できることがわかった。例えば、濃度未知の試料を測定した際のピーク数が１００だった場合には、この試料のＡＴＴＯ６３３の濃度は２．５ｐＭと算出することができる。

［実施例１］
標的粒子として、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸を用いた。以下、本実施例においては、この核酸を標的核酸という。また、この標的核酸と結合する発光プローブとして、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が付加され、３’末端にＢＨＱ−１が付加された分子ビーコンプローブを用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。標的核酸及び分子ビーコンプローブの塩基配列を表１に示す。表１において、分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。

上記の分子ビーコンプローブを１００ｐＭ、標的核酸を１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、若しくは１０ｐＭとなるように、トリス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解することにより、検量線作成のための標準試料溶液を調製した。
各標準試料溶液を、９５℃で５分間加熱することにより変性させた後、２０℃まで徐々に液温を低下させて、標的核酸と分子ビーコンプローブが結合した会合体を形成させた。具体的には、降温速度を０．１℃／秒とし、９０℃で５分間、８０℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、４０℃で１０分間、３０℃で１０分間の降温処理を行った。

降温処理後の各標準試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各標準試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５１０〜５６０ｎｍとした。標準試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。また測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各標準試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象核酸に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象核酸に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。

図１４は、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液から得られた計数値をプロットしたグラフである。この結果、標的核酸の濃度依存的にピーク数が変化していることが確認された。

各プロットの近似曲線を検量線とし、濃度未知の試料溶液の標的核酸濃度を求めた。具体的には、未知試料溶液に対して、上記標準試料溶液と同様にして分子ビーコンプローブを添加し、分子ビーコンプローブとの会合体を形成した後、光分析装置を用いて測定し、ピーク数を算出した。この結果、この未知試料溶液から計数されたピーク数は４２１であった。図１３に示す検量線を参照し、この未知試料溶液の標的核酸濃度は、１．４ｎＭであると算出することができた。

［実施例２］
標的粒子として、配列番号３で表される塩基配列からなる核酸を用いた。以下、本実施例においては、前記核酸を標的核酸２という。また、発光プローブとして、蛍光プローブを用い、分離用プローブとして、ビオチンプローブを用い、固相担体として、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを用いた。
また、前記標的核酸２と結合する発光プローブとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ ６４７Ｎが付加された蛍光プローブを用いた。さらに、前記標的核酸２と結合する、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの３’末端にビオチンが付加されたビオチンプローブを用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。標的核酸２及び蛍光プローブ、ビオチンプローブの塩基配列を表２に示す。

トリス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に標的核酸２が３０ｆＭ、１０ｆＭ、３ｆＭ、若しくは１ｆＭ、蛍光プローブが２０ｐＭ、ビオチンプローブが２００ｐＭ、Ｐｏｌｙ（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ）ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）が０．１Ｕ／ｍＬ（１Ｕは、水中(光路長は１ｃｍ)で２６０ｎｍの吸光度が１．０となる量）となるように試料溶液（１００μＬ）を調製した。標的核酸２を含まない試料も用意した。それらの試料溶液を９５℃で５分間加熱後、０．１℃／分の速度で２５℃にした。０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１μＬ加え、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｔ．ｎｏ．６５０）１０μｇと２５℃で９０分間、振とうさせながら反応させた。続いて、磁石を用いて５００μＬの洗浄バッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によって３回洗浄した後、１００μＬの溶出バッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を加え、５０℃で５分間放置した。磁石で磁気ビーズを集めた後、上清を回収し、それらを標準試料溶液として、走査分子計数法によって計測した。
計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の上清について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６４２ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０〜７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、６７．５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、６００秒間とした。また測定は各５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各上清について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は１１個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、
下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９０
を満たすピーク信号のみを蛍光プローブに対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、蛍光プローブに対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
図１４は、横軸を標準試料溶液中の標的核酸２の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液から得られた計数値をプロットしたグラフである。この結果、標的核酸２の濃度依存的にピーク数が変化していることが確認された。
各プロットの近似曲線を検量線とし、濃度未知の試料溶液の標的核酸濃度を求めた。具体的には、濃度未知試料溶液に対して、上記標準試料溶液と同様にして測定用試料を作製し、光分析装置を用いて測定し、ピーク数を算出した。この結果、前記濃度未知試料溶液から計数されたピーク数は７２４であった。図１４に示す検量線を参照し、前記濃度未知試料溶液の標的核酸濃度は、４．６ｆＭであると算出することができた。

上記の標的粒子の定量方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により定量的に測定することができるため、臨床検体等の、解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用が可能である。

Ｆ…蛍光色素（発光プローブ）
Ｔ…対象粒子（標的粒子）
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器（光検出領域移動部）
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
１９…ディスプレイ（表示部）

Claims (7)

1. 試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、
   （ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と；
   （ｂ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、直接的または間接的に前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、
   （ｃ）前記検出工程において検出された、前記標的粒子の数を計数する計数工程及び前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する算出工程と；
   を備え、
   前記工程（ｂ）において、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号の検出及び前記標的粒子の検出を、
   検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光プローブに対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの標的粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの標的粒子を検出することにより行い、
   前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し；
   前記発光プローブが前記標的粒子に結合した結合状態と前記標的粒子に結合していない非結合状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり；
   前記結合状態と、前記非結合状態との、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なる；
   標的粒子の定量方法。
2. 前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を所定の速度にて移動する
   請求項１に記載の標的粒子の定量方法。
3. 前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を、前記発光プローブ、又は前記発光プローブと結合した標的粒子のいずれか速い方の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する
   請求項１又は２に記載の標的粒子の定量方法。
4. 前記検出工程に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光プローブ、又は発光プローブと結合した前記標的粒子が前記光検出領域に入ったことを検出する
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
5. 前記標的粒子が核酸であり；
   前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸である；
   請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
6. （ｄ）前記工程（ａ）の後、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を回収する工程を有する
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
7. （ｅ）前記工程（ｄ）において回収された前記複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程を有する
   請求項６に記載の標的粒子の定量方法。

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