WO2013024637A1 - 蛍光粒子の検出方法 - Google Patents

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fluorescent particles
light
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秀孝 中田
田邊　哲也
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オリンパス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting fluorescent particles using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the fluorescence intensity is measured from fluorescent molecules that enter or exit the microregion in the solution or fluorescently labeled molecules. From the measured autocorrelation function value of the fluorescence intensity, the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region and the average number of staying molecules are determined. Acquisition of information such as the speed or magnitude of movement of fluorescent molecules, etc., concentration, or the structure of molecules based on the average residence time of fluorescent molecules, etc. and the average number of staying molecules in a minute region Alternatively, detection of various phenomena such as a change in size, a binding / dissociation reaction or dispersion / aggregation of molecules is achieved.
  • the micro area is a focal area where laser light from a microscope is collected, and is called a confocal volume.
  • fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA, for example, Patent Document 3
  • photon counting histogram Photon Counting Histogram: PCH, for example, Patent Document 4
  • FCS Fluorescence-Intensity Distribution Analysis
  • PCH Photon Counting Histogram
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique, and the fluorescent fine particles in the flow or on the substrate are measured.
  • a signal arithmetic processing technique for detecting the presence is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these techniques are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the fields of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for bioactive substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. It is preferable that the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time is adjusted so as to enter and exit the minute region.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is adjusted so that there is always about one fluorescent molecule or the like in a microscopic region in an equilibrium state. It is preferable.
  • the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more. In other words, when the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level at which statistical processing is possible, for example, when it is significantly lower than 1 nM, the observation target is within the minute region for the measurement time.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of fluorescent molecules to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of generation of a fluorescent signal with a significant intensity.
  • the frequency of the fluorescent signal with a significant intensity and the number of fluorescent molecules or the like in the sample It is disclosed that a correlation can be obtained.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • these methods are also limited to detecting the presence of fluorescent molecules or the like that enter the microregion stochastically by diffusion or random flow.
  • Patent Document 7 individually detects the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate.
  • the technique described in Patent Document 7 detects particles such as molecules or colloids dissolved or dispersed in a normal state in a sample solution, that is, particles moving randomly in the sample solution. It is not a technology for. Therefore, quantitative calculation of the concentration or number density of particles dissolved or dispersed in the sample solution has not been achieved.
  • Patent Document 7 since the technique of Patent Document 7 includes a process such as measurement in a flow cytometer or immobilization of fluorescent particles on a substrate, the amount of sample required for inspection is optical analysis such as FCS, FIDA, PCH, etc. It is considered to require a complicated and sophisticated operation technique for the practitioner as well as the number of techniques.
  • aspects of the present invention do not include statistical processing such as is performed with optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH. Therefore, a new photoanalysis technique capable of detecting the state or characteristics of the observation target particles in the sample solution in which the concentration or number density of the observation target particles is lower than the level handled by those photoanalysis techniques allows the fluorescent particles to be detected. It is an object of the present invention to provide a method for detecting a signal with higher sensitivity.
  • the fluorescent particles are detected by using the scanning molecule counting method. Fluorescent particles can be detected with high sensitivity even when the concentration of particles to be observed is very low, and furthermore, by performing measurement by scanning molecule counting method in the presence of a triplet excited state quencher It has been found that fluorescent particles can be detected with higher sensitivity.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed in Japanese Patent Application No. 2010-044714.
  • one embodiment of the present invention is (1) A method for detecting fluorescent particles dispersed and moving randomly in a sample solution, (A) preparing a sample solution comprising fluorescent particles and a substance that promotes the transition from a triplet excited state to a singlet ground state with respect to the fluorescent particles; (B) calculating the number of molecules of fluorescent particles present in the sample solution prepared in the step (a); Have Calculation of the number of molecules of fluorescent particles in the step (b) is as follows: Using one optical system of a confocal microscope and a multiphoton microscope, moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution; Detecting the light signal emitted from the fluorescent particles in the light detection region while moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution, and detecting the fluorescent particles individually; Counting the number of individually detected fluorescent particles and counting the number of fluorescent particles detected during the movement of the position of the light detection region, and a method for detecting fluorescent particles, (2) The method for detecting fluorescent particles according to (1), wherein the
  • Fluorescent particle detection method (6) The fluorescence according to any one of (1) to (5), wherein the step of moving the position of the light detection region includes moving the position of the light detection region at a predetermined speed.
  • Particle detection method (7) The step of moving the position of the light detection region includes the position of the light detection region being moved at a speed faster than the diffusion movement speed of the fluorescent particles.
  • the method for detecting fluorescent particles according to any one of (8) The step of detecting optical signals from the individual fluorescent particles from the detected light and detecting the individual fluorescent particles individually is based on the shape of the detected time-series optical signals.
  • the fluorescent particle detection method according to any one of (1) to (7), wherein it is detected that two fluorescent particles have entered the light detection region, Is to provide.
  • the fluorescent particle detection method can detect the fluorescent particles in the sample even when the analysis target fluorescent particles are present only in a very small amount. Furthermore, in the method for detecting fluorescent particles in the embodiment of the present invention, the measurement by the scanning molecule counting method is performed in the presence of the triplet excited state quencher, so that the fluorescent particles can be detected with very high sensitivity.
  • FIG. 6 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle.
  • Example of photon count (light intensity) change over time when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle.
  • FIG. It is a figure showing the processing procedure for counting particles from the time change of photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method in the form of a flowchart.
  • the reference example 1 it is the figure which showed the ratio of the triplet excited state in the fluorescent molecule in each sample solution containing Rhodamine Green (trademark). In the reference example 1, it is the figure which showed the brightness per molecule
  • Example 1 it is the figure which showed the result of having counted the number of peaks of each sample solution containing Alexa Fluor (trademark) 488.
  • Example 2 it is the figure which showed the result of having counted the number of peaks of each sample solution containing Alexa Fluor (trademark) 488.
  • Example 2 it is the figure which showed the result of having counted the number of peaks of each sample solution containing TAMRA (trademark).
  • Example 3 it is the figure which showed the result of having counted the peak number of each sample solution whose density
  • Example 3 it is the figure which showed the result of having counted the number of peaks of each sample solution whose concentration of Alexa Fluor (trademark) 488 is 100 pM.
  • the scanning molecule counting method will be described.
  • particles that emit light that moves in a sample solution and moves randomly while traversing the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region.
  • the light emitted from the light emitting particles in the minute region is detected.
  • the scanning molecule counting method to individually detect each luminescent particle in the sample solution and to obtain information about the counting of the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • the sample necessary for measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L), and the measurement time is short.
  • the luminescent particles mean particles that emit light by fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, and the like.
  • the fluorescent particles among the luminescent particles are targeted for detection.
  • the “light detection region” of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in the confocal microscope or the multiphoton microscope, and illumination light is given from the objective lens. In this case, it corresponds to a region where the illumination light is collected. In the confocal microscope, this region is determined particularly by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution with the light detection region. Then, when the moving light detection region includes a light emitting probe that is bound or associated with a randomly moving particle, light from the light emitting probe is detected. Thereby, the presence of one particle is detected.
  • the luminescent probe may once dissociate from the particle upon detection of light after binding to the particle to be detected. And the optical signal from a light emission probe is detected separately among the light detected sequentially. As a result, the presence of the particles or the particles bound to the luminescent probe is sequentially detected individually and various information regarding the state of the particles in the solution is acquired.
  • the number of particles detected individually may be counted to count the number of particles detected during movement of the position of the light detection region (particle counting). ).
  • information relating to the number density or concentration of particles in the sample solution can be obtained by combining the number of particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the total volume of the movement locus of the position of the light detection region is specified by an arbitrary method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the particles is concrete. Can be calculated automatically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the optical detection path is moved by changing the optical path of the optical system, so that the movement of the light detection area is quick and the mechanical movement of the sample solution is performed. Vibration and hydrodynamic action are not substantially generated. Therefore, it is possible to measure light in a stable state without affecting the mechanical action of the particles to be detected (the physical properties of the particles change when vibration or flow acts on the sample solution. there's a possibility that.). Further, since a configuration in which the sample solution is distributed is not necessary, measurement and analysis can be performed with a small amount (about 1 ⁇ L to several tens of ⁇ L) of the sample solution as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the luminescent probe bonded to one particle is a state where one luminescent probe is bonded to one particle, a state where a plurality of luminescent probes are bonded to one particle, and an experiment.
  • the embodiment includes a state in which the luminescent probe is bonded to one particle and then dissociated from the particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is based on the characteristics of the luminescent probe bound to the particles or the number density or concentration in the sample solution. It may be changed as appropriate. As will be appreciated by those skilled in the art, the manner of light detected from a luminescent probe bound to a particle can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution. In particular, when the moving speed of the light detection region is increased, the amount of light obtained from the light emitting probe bonded to one particle is reduced, so that light from the light emitting probe bonded to one particle is measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed of the light detection region is appropriately changed so that it can be performed.
  • the movement speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably the diffusion movement speed (Brown) of the luminescent probe bound to the particles to be detected. It is set higher than the average moving speed of the particles by the movement).
  • the scanning molecule counting method when the photodetection region passes through the position of the luminescent probe bonded to one particle, the light emitted from the luminescent probe is detected, and the luminescent probe is individually detected. To detect.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the light emitting probe bonded to the particle, and thereby the light emitting probe bonded to one particle is represented by one (representing the presence of the particle).
  • the movement speed of the light detection region is set to a speed higher than the diffusion movement speed of the fluorescent particles that are detection targets. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent probe bonded to the particle, as described above, the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics (particularly the diffusion constant) of the luminescent probe bonded to the particle. It is preferable.
  • the optical path of the optical system for moving the position of the light detection region may be changed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope, as in the case of the optical analysis technology such as FIDA, the light detection mechanism itself, The amount of sample solution may be trace as well.
  • the scanning molecule counting method statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, so the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is necessary for the optical analysis technique in which the particle number density or concentration is FIDA or the like. Applicable to sample solutions that are significantly lower than
  • each particle dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, using the information, it is possible to quantitatively count particles, calculate the concentration or number density of particles in the sample solution, or obtain information on the concentration or number density. That is, according to the scanning molecule counting method, the particles passing through the light detection region and the detected light signals are detected one by one so that the particles are detected one by one. Particle counting is possible. Therefore, according to the scanning molecule counting method, it is possible to determine the concentration or number density of particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • the concentration of the fluorescent particles in the sample solution is determined by the fluorescence spectrophotometer or the plate. Even if the concentration is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by the reader, the fluorescent particles can be detected.
  • the sample solution is not affected by mechanical vibration or hydrodynamic action.
  • the sample solution is observed in a mechanically stable state. Therefore, for example, the reliability of quantitative detection results is improved compared to the case where a flow is generated in the sample, and the influence or artifacts caused by the mechanical action on the particles to be detected in the sample solution. Measurement can be performed in a state where there is no. When a flow is given to a sample, it is difficult to always give a uniform flow rate, and the apparatus configuration becomes complicated. In addition, the amount of sample required is greatly increased. Furthermore, the hydrodynamic action of the flow can alter or denature particles, luminescent probes or conjugates or other materials in the solution.
  • the scanning molecule counting method is a combination of an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, etc. and a photodetector as schematically illustrated in FIG. 1A. It can be realized by an analyzer.
  • the optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA (Numerical Aperture) at the emission end of the light, and is collimated by the collimator 4 and reflected by the dichroic mirror 5 and the reflection mirrors 6 and 7. , And enters the objective lens 8.
  • a microplate 9 in which sample containers or wells 10 into which a sample solution of 1 ⁇ L to several tens ⁇ L is dispensed is arranged.
  • the laser light emitted from the objective lens 8 is focused in the sample solution in the sample container or well 10, and a region (excitation region) having a high light intensity is formed.
  • particles to be observed and luminescent probes that bind to the particles typically molecules to which a luminescent label such as a fluorescent dye is added are dispersed or dissolved.
  • a luminescent label such as a fluorescent dye is added
  • the luminescent probe When particles bound or associated with the luminescent probe (in some experimental modes, the luminescent probe once bound to the particle and then dissociated from the particle) enter the excitation region, the luminescent probe is excited and light is emitted during that time.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14.
  • the pinhole 13 is arranged at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8. Thereby, only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown in FIG. 1B, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 fL to 10 fL (typically, the light intensity is at the top of the center of the region).
  • the effective volume is a volume of a substantially elliptical sphere bounded by a surface where the light intensity is 1 / e 2), and is called a confocal volume.
  • light from a conjugate of one particle and a luminescent probe or light from a luminescent probe for example, faint light from one or several fluorescent dye molecules is detected.
  • an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the optical path of the optical system is changed to scan the sample solution with the light detection region, that is, the position of the focal region (ie, the light detection region) in the sample solution.
  • a mechanism for moving is provided.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. 1C.
  • the mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope. Further, in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region, the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (in the program in the computer 18, various movement patterns can be selected. Good.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • mechanical vibrations and hydrodynamic actions are substantially caused in the sample solution. It is possible to eliminate the influence of the dynamic action on the observation object and to achieve stable measurement.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided as shown in FIG. 1A, and the wavelength of the excitation light is appropriately determined according to the wavelength of the light that excites the combined particle or luminescent probe or the luminescent probe. You may be able to choose.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a combination of luminescent probes or a luminescent probe, the light from them is changed depending on the wavelength. It may be possible to detect them separately.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity.
  • the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is at a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. It is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, if the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV, a significant light intensity (photon count) is measured. It appears only in a part of the time, and it is difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy. Also, if the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the light intensity fluctuation calculation is affected by the background. It is easy to increase the measurement time for obtaining significant light intensity data sufficient for calculation. In contrast, the scanning molecule counting method can detect characteristics such as the number density or concentration of particles to be observed even when the concentration of particles to be observed is lower than the level required by spectroscopic techniques such as FIDA. It is.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • a mechanism for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • a region where one particle a fluorescent dye is bound as a luminescent probe in the drawing
  • t1 a significant light intensity
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is measured from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when doing so.
  • the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles when the concentration of the fluorescently labeled particles is sufficiently low, the amount of noise signal with respect to the amount of signal due to the light emitted from the fluorescently labeled particles increases (deterioration of the S / N ratio), and fluorescence The proportional relationship between the concentration of labeled particles and the amount of optical signal is broken. As a result, the accuracy of the determined density value is deteriorated.
  • the noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. calculate. As a result, it is possible to detect even a lower concentration than when the concentration is detected on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the fluorescence intensity is fluorescently labeled. Therefore, the measurement accuracy of the particle concentration on the higher particle concentration side is improved as compared with the conventional method of determining the concentration under the assumption that the concentration is proportional to the concentration of the generated particles.
  • the luminescent probe relatively binds to the particles when the concentration of the target target particle increases.
  • the number of since the fluorescence intensity per observation target particle is reduced, the proportional relationship between the concentration of the fluorescently labeled particles and the light amount is lost, and the accuracy of the determined concentration value is deteriorated.
  • the scanning molecule counting method in the step of detecting a signal corresponding to each particle from the detected optical signal, the influence of the reduction of the fluorescence intensity per particle is small, and the concentration is calculated from the number of particles. Therefore, it is possible to detect a higher concentration than when detecting the concentration on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement step in FCS or FIDA. In the operation process, typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 detects a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and light detection during the movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and light detection during the movement of the position of the light detection region).
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanometer mirror) to move the position of the light detection region in the well 10 under the control of the processing operation according to the program of the computer 18.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18.
  • the computer 18 generates and stores time-series light intensity data from the transmitted optical signal in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon. Therefore, the detection of light is executed in a mode in which the number of photons arriving at the photodetector is measured every predetermined unit time (BINTIME), for example, every 10 ⁇ s, over a predetermined time.
  • the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the moving speed is basically preferably a constant speed, but is not limited to this.
  • the position of the light detection region is moved.
  • the velocity is a random motion of the observation target particle (more precisely, a conjugate of the particle and the luminescent probe or a luminescent probe which is decomposed and released after the binding to the particle, in this embodiment, a fluorescent particle), that is, Brown It is preferably set to a value faster than the moving speed due to movement. Since the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in the solution and moves freely at random, the position moves with time by Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly in the region as schematically illustrated in FIG. 3A.
  • the light intensity changes randomly as shown in FIG. 3B (as already mentioned, the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), and the individual observation target particles. It becomes difficult to specify a significant change in light intensity corresponding to. Therefore, preferably, as illustrated in FIG. 4A, the moving speed of the position of the light detection region is set to an average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particle so that the particle crosses the light detection region in a substantially straight line. ) Is set faster.
  • the profile of the change in light intensity corresponding to each particle becomes substantially uniform, and the correspondence between each observation target particle and the light intensity is easy. Can be identified.
  • the light intensity change profile is substantially the same as the excitation light intensity distribution.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the Vdif.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 performs processing according to the program stored in the storage device (light signals from the individual luminescent particles are individually detected from the detected light). Depending on the detection procedure, the following light intensity analysis may be performed.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle). It is determined based on the profile assumed as the intensity of light emitted from a free luminescent probe.
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, and is selectively determined according to the characteristics of the conjugate of the observation target particle and the luminescent probe (or the luminescent probe that has been decomposed and released after binding to the particle). May be.
  • the light intensity distribution in the light detection region is Gaussian distribution:
  • I A ⁇ exp ( ⁇ 2t 2 / a 2 ) (4)
  • the equation (4) is fitted to a significant light intensity profile (a profile that can be clearly judged to be not background).
  • the calculated intensity A and width a are within a predetermined range, it is determined that the light intensity profile corresponds to that one observation target particle has passed through the light detection region, and one observation target particle Detection may be made.
  • the intensity A and the width a are outside the predetermined range, they may be ignored in the analysis as noise or foreign matter.
  • Counting of observation target particles may be performed by counting the number of particles detected by the above-described detection target particle detection method using an arbitrary method. However, when the number of particles is large, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B may be performed, for example.
  • time-series optical signal data (photon count data) is acquired by performing scanning and photon counting in the sample solution using the light detection region (step 100).
  • the time series optical signal data (FIG. 6B, uppermost “detection result (unprocessed)”) is subjected to smoothing (step 110, upper “smoothing” in FIG. 6B).
  • smoothing (step 110, upper “smoothing” in FIG. 6B).
  • the light emitted from the combination of the particle and the luminescent probe or the light emitted from the luminescent probe is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of optical signal data acquisition. , And may be set as appropriate according to BINTIME.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in value at the time when the signal value changes, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 6B. Therefore, it is possible to advantageously determine the start point and end point of a significant signal (peak signal) by referring to such time differential values.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • peak signal a significant signal
  • the start point and the end point of one peak signal are searched and determined, A peak presence region is identified (step 130).
  • a bell-shaped function is fitted to the smoothed time-series optical signal data in the peak existence region (“bell-shaped function fitting” in the lower part of FIG. 6B).
  • parameters such as the peak intensity Imax, peak width (full width at half maximum) w of the bell-shaped function, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range, that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range (step 150).
  • the range that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range
  • the calculated bell-shaped function parameter is within an expected range in the optical signal corresponding to the combination of one particle and the luminescent probe or the luminescent probe.
  • the determined signal is determined to be a signal corresponding to one observation target particle. Thereby, one observation target particle is detected and counted as one particle (the number of particles is counted up, step 160).
  • a peak signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly performed over the entire time-series optical signal data, and is counted as a particle every time one observation target particle is detected.
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of time-series optical signal data is used.
  • the number density or concentration of the particles is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. Accordingly, it is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution (reference solution) with a known particle concentration, the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed that is, the relationship between the number of detected particles and the concentration is determined from the number of detected particles and the concentration of the reference solution particles. It's okay.
  • the particles of the reference solution are preferably luminescent labels (fluorescent dyes or the like) having the same luminescent properties as the particles formed by the observation target particles and the luminescent probe conjugate (or the luminescent probe released after binding to the observation target particles). It may be. Specifically, for example, assuming that the number of detected particles for a reference solution having a particle concentration C is N, the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed is given by the following equation.
  • Vt N / C (5)
  • a plurality of solutions having different concentrations are prepared as reference solutions, and measurement is performed on each of the solutions.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be.
  • the number density c of the sample solution particles whose particle counting result is n is given by the following equation.
  • c n / Vt (6)
  • the volume of the photodetection region and the total volume of the region through which the photodetection region has passed are not limited to the above method, but use, for example, FCS or FIDA. Etc. may be given.
  • the optical analyzer of the present embodiment information on the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles (formula (5)) is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • the information stored in advance in the storage device of the computer 18 may be used by the user of the device when the optical analysis is performed.
  • the fluorescent particle detection method of the present embodiment is a method for detecting fluorescent particles that are dispersed and move randomly in a sample solution, and promotes the transition of the fluorescent particles from a triplet excited state to a singlet ground state. Detection is carried out by counting by scanning molecule counting in the presence of the substance to be made.
  • the scanning molecule counting method is a measurement method that can measure luminescent particles on a particle-by-particle basis when the molecules are in a discrete state. Therefore, it can measure even relatively low concentrations of luminescent particles below the pM order. Is possible.
  • the fluorescent particle detection method of this embodiment can count fluorescent particles with high sensitivity even when the concentration of the fluorescent particles to be analyzed in the sample solution is very low. Furthermore, in the method for detecting fluorescent particles of the present embodiment, the measurement by the scanning molecule counting method is performed in the presence of a substance (triplet excited state quencher) that promotes the transition from the triplet excited state to the singlet ground state. Thus, the fluorescent particles can be detected with very high sensitivity.
  • a substance triplet excited state quencher
  • a path that returns from the singlet excited state to the ground state via the triplet excited state generally takes on the order of microseconds or more.
  • some of the molecules excited to the singlet excited state return to the ground state via the triplet excited state, resulting in waste.
  • the triplet excited state quencher has a higher frequency of molecules in the triplet excited state than the singlet excited state due to the difference in the lifetime of the singlet excited state and the lifetime of the triplet excited state.
  • the fluorescence brightness is improved by utilizing the collision with the light source. Specifically, by performing measurement by scanning molecule counting method in the presence of a triplet excited state quencher, the fluorescent particles in the triplet excited state in the sample solution are returned to the ground state by the triplet excited state quencher. It is.
  • the fluorescent particles returned to the ground state are excited again to a singlet excited state by light irradiation. That is, by rapidly eliminating the triplet excited state that does not emit fluorescence, the fluorescence luminance is improved, and as a result, fluorescent particles can be detected with higher sensitivity.
  • the triplet excited state quencher used in the present embodiment is not particularly limited as long as it has a function of returning a molecule in a triplet excited state to a ground state.
  • a triplet excited state quencher is appropriately selected from known triplet excited state quenchers in consideration of the type of fluorescent particles, the wavelength of excitation light, the wavelength of fluorescence, and the like.
  • Examples of triplet excited state quenchers include potassium iodide (KI), cysteamine (2-aminoethanethiol), cyclooctatetraene (Cyclo-octatetraene), and the like. In this embodiment, it is preferable to use potassium iodide or cysteamine. Note that only one type of triplet excited state quencher may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the detected fluorescence wavelength when the detected fluorescence wavelength includes at least part of 510 nm to 560 nm, it is preferable to use one or more selected from potassium iodide and cysteamine as the triplet excited state quencher.
  • cysteamine is preferably used as the triplet excited state quencher when the detected fluorescence wavelength includes at least a part of 510 nm to 620 nm.
  • Examples of the fluorescent particles containing at least a part of the fluorescence wavelength of 510 nm to 560 nm include Rhodamine Green (registered trademark), Alexa Fluor (registered trademark) 488, fluorescein, FITC, 5-carbylfluorescein (5-FAM), Cy2 (registered). And fluorescent materials such as trade marks) and particles to which these fluorescent materials are bound.
  • Examples of fluorescent particles containing at least a part of the fluorescence wavelength of 560 nm to 620 nm include TAMRA (registered trademark), Rhodamine, Cy3 (registered trademark), Alexa Fluor (registered trademark) 546, Alexa Fluor (registered trademark) 555, and the like. Examples thereof include fluorescent substances and particles in which these fluorescent substances are bound.
  • the target particle quantification method of the present embodiment includes the following steps (a) to (b).
  • steps (a) to (b) A step of calculating the number of molecules of fluorescent particles present in the sample solution prepared in the step (a).
  • particles dispersed in a sample solution and moving randomly are particles such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution (one that emits light or one that does not emit light). It means a particle that is not fixed to a substrate or the like and is free to Brownianly move in the solution.
  • the fluorescent particles to be detected by the fluorescent particle detection method of the present embodiment are not particularly limited as long as they are substances that emit fluorescence by emitting light of a specific wavelength, such as fluorescent dyes and quantum dots And the like.
  • the fluorescent particle detection method of this embodiment can also detect a non-fluorescent substance by using a fluorescent probe.
  • a fluorescent probe that has a site that specifically or non-specifically binds or adsorbs to a target particle (non-fluorescent substance) to be detected and emits fluorescence in a state of being bound to the target particle is used.
  • a fluorescent probe is added to the sample solution containing the target particles to bind them together.
  • the formed fluorescent probe bound to the target particle is a fluorescent particle, and can be detected by the fluorescent particle detection method of the present embodiment.
  • Target particles are particles that are dispersed in a sample solution and move randomly.
  • biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, nucleic acid analogs, lipids, sugar chains, amino acids, or aggregates thereof, viruses, cells Particulate biological objects such as, or non-biological particles (for example, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.).
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or artificially amplified such as cDNA.
  • Nucleic acid analogues include those in which side chains of natural nucleotides (naturally occurring nucleotides) such as DNA and RNA are modified with functional groups such as amino groups, and labeled with proteins, low molecular compounds, etc. And the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups Nucleotides, Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the fluorescent probe that binds to the target particle is preferably a substance that has different emission characteristics of emitted light in a state where it is bound to the target particle and in a state where it exists alone.
  • the fluorescence emission characteristics of the fluorescent probe differ between the state bound to the target particle and the state where the target particle is present alone. It means that the strength is different.
  • the fluorescent probe is obtained by binding a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, a nucleic acid binding protein bound with a fluorescent substance, or a nucleic acid.
  • a fluorescent substance examples thereof include fluorescent dye molecules that bind.
  • the oligonucleotide may be DNA, RNA, artificially amplified, such as cDNA, and a nucleotide chain or base pair in the same manner as a natural nucleobase.
  • the nucleic acid-like substance capable of forming a part may be included in part or all.
  • the fluorescent probe can be an antigen or antibody against the target particle, or a ligand or receptor labeled with a fluorescent substance labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent substance can be bound to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to target particles such as nucleic acids and proteins by a conventional method.
  • the fluorescent probe to be bound to the target particle may be non-specifically bound to the target particle, but it must be specifically bound from the viewpoint of target particle detection and quantification accuracy. Is preferred.
  • the fluorescent probe that specifically binds to the target particle may be any probe that binds to the target particle preferentially rather than to other substances having similar physical or chemical properties to the target particle. It does not have to be completely unbound with substances other than particles.
  • the target particle is a nucleic acid
  • the oligonucleotide labeled with a fluorescent substance used as a fluorescent probe may have a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target particle. It may have a base sequence having a mismatch with the base sequence.
  • a dye for example, a fluorescent dye such as a hydrophobic probe ANS, MANS, or TNS
  • a fluorescent probe for example, a fluorescent dye such as a hydrophobic probe ANS, MANS, or TNS
  • the fluorescent probe itself may not emit fluorescence.
  • the fluorescent probe is an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, and fluorescence that specifically binds to a double-stranded structure in the sample solution together with the fluorescent probe.
  • the luminescence characteristics can be made different between a state where the luminescent probe is present alone and a state where it is bound to the target particle.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator and a groove binder to which a fluorescent substance is bound.
  • a fluorescent probe there is a substance composed of at least two components, and by binding to the target particle, a substance that emits fluorescence by changing the position of the at least two components relative to each other. It may be adopted. Examples of such substances are fluorescent proteins that change structure when bound to a certain particle and emit strong fluorescence, or aggregate when bound to a certain particle to form a fluorescent metal complex. Molecule (ligand of the complex). According to such a configuration, in any case, the fluorescent probe alone or the fluorescent probe that is not bound to the target particle emits little light, or even if it emits light, the wavelength of the conjugate of the target particle and the fluorescent probe is different. It becomes possible to selectively detect light from the conjugate of the target particle and the fluorescent probe.
  • a substance that binds to a target particle includes a fluorescent substance that serves as an energy donor in FRET and a substance that serves as an energy acceptor (fluorescent substance or quenching substance), and FRET occurs when a fluorescent probe is present alone, A fluorescent probe that is bound so that FRET does not occur in the state of binding to the target particle can be used. Since FRET does not occur from the fluorescent probe bound to the target particle, fluorescence is emitted from the fluorescent material serving as an energy donor.
  • fluorescence emitted from a fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from a fluorescent probe present alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the target particle bound to the fluorescent probe can be detected separately from the fluorescent probe present alone.
  • an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule a fluorescent substance that serves as an energy donor in FRET, and an energy acceptor Beacon probe in which FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule and so that FRET does not occur in the state of an aggregate formed by hybridizing with another single-stranded nucleic acid molecule can be preferably used as a fluorescent probe.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, one remaining on the 5 ′ end side is bound, and the 3 ′ end side It is preferable to have a base sequence complementary to each other in the region and the 5 ′ end side and to form an intramolecular structure (so-called stem-loop structure) by forming a base pair in these base sequences.
  • the complementary regions forming the intramolecular base pair of the molecular beacon probe may be present so as to sandwich the region that hybridizes with the target particle, and the 3 ′ end region and the 5 ′ end region. Each may be a region containing the 3 ′ end or 5 ′ end, or a region not containing it.
  • the number of bases and the base sequence in the region forming the base pair are lower than the stability of the formed base pair compared to the stability of the aggregate with the target particle, and can form a base pair under measurement conditions. Any degree is acceptable.
  • a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure is used, and FRET is caused between the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and a fluorescent substance labeled with a fluorescent probe. It is possible to distinguish between a fluorescent probe present alone and a fluorescent probe bound to a target particle. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the fluorescent probe serves as an FRET energy donor, and the other serves as the FRET energy acceptor. From the fluorescent probe present alone, the fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the fluorescent probe is detected.
  • the luminescent probe it is preferable to design the luminescent probe so that the region forming the double strand in the aggregate of the fluorescent probe and the target particle is 400 bp or less.
  • two types of fluorescent probes may be used.
  • two fluorescent probes are designed to hybridize adjacent to each other when the target particle is a nucleic acid or nucleic acid analog, and one fluorescent probe is used as an energy donor in FRET. And the other fluorescent probe is labeled with a substance serving as an energy acceptor in the FRET.
  • FRET does not occur with a fluorescent probe present alone, but by binding to the target particle, the two types of fluorescent probes are close to each other and FRET occurs. For this reason, the target particle
  • a sample solution containing fluorescent particles and a fluorescent probe that binds to a triplet excited state quencher for the fluorescent particles is prepared.
  • a sample solution is prepared by adding fluorescent particles and a triplet excited state quencher to an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the detection of light emitted from the fluorescent particles and the detection of the fluorescent particles by the scanning molecule counting method, and is generally used in the technical field. It can be used by appropriately selecting from among the existing buffers.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the triplet excited state quencher is added to the sample solution so as to have a concentration sufficient to exhibit the action of returning the triplet excited state to the ground state (hereinafter, quenching action).
  • concentration at which the quenching effect can be obtained can be determined experimentally.
  • triplet excited state quenchers are added at various concentrations to a measurement solution containing a predetermined amount of fluorescent particles (may be particles containing the same kind of fluorescent substance as the detection target fluorescent particles). The proportion of molecules in the triplet excited state of the fluorescent probe in the measurement solution is measured.
  • the concentration at which the proportion of molecules in the triplet excited state is significantly lower than that of the measurement solution not added with the triplet excited state quencher is a concentration at which the triplet excited state quencher exhibits a quenching effect. It is.
  • the proportion of molecules in the triplet excited state can be determined by FCS measurement.
  • the concentration of the triplet excited state quencher in the sample solution at the time of measurement by the scanning molecule counting method should be 0.1 mM to 20 mM. Is preferable, 0.3 mM to 10 mM is more preferable, and 0.5 mM to 5 mM is further preferable.
  • the combined concentration is preferably within the above range.
  • a triplet excited state quencher is contained in a solution containing fluorescent particles in which the target particle and the fluorescent probe are previously bound.
  • the sample solution may be prepared by adding Alternatively, after preparing a sample solution to which target particles, a fluorescent probe, and a triplet excited state quencher are added, the target particles and the fluorescent probe may be combined in the sample solution to form fluorescent particles.
  • target particles and the fluorescent probe can coexist in the same solution and both can be bound, after preparing the sample solution, simply incubating the sample solution for a predetermined time if necessary.
  • the target particle and the fluorescent probe can be bound in the solution.
  • the target particle or the fluorescent probe is a nucleic acid having a double-stranded structure or a nucleic acid-like substance
  • “denaturing a nucleic acid or a nucleic acid-like substance” means dissociating base pairs.
  • a base pair formed by mutually complementary base sequences in a molecular beacon probe is dissociated and the intramolecular structure is released to form a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted to a single-stranded nucleic acid molecule. It means to do.
  • the fluorescent probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the target particle is a double-stranded nucleic acid molecule, the association between the fluorescent probe and the target particle is performed without any special denaturation treatment. In some cases, coalescence can be formed.
  • the denaturation treatment examples include denaturation by high temperature treatment (thermal denaturation) and denaturation by low salt concentration treatment.
  • thermal denaturation high temperature treatment
  • low salt concentration treatment it is preferable to perform heat denaturation because the influence on the fluorescent substance is relatively small and the operation is simple.
  • the heat denaturation can denature nucleic acids and the like in the sample solution by subjecting the sample solution to high temperature treatment. Generally, it can be denatured by keeping it at 90 ° C. for DNA and 70 ° C. for RNA for several seconds to 2 minutes, but the temperature for denaturation varies depending on the base length of the target particle. If it can be modified, it is not limited to this temperature.
  • the denaturation by the low salt concentration treatment can be performed by adjusting the salt concentration of the sample solution to be sufficiently low, for example, by diluting with purified water or the like.
  • target particles in the sample solution and fluorescent probes are associated.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the target particles and the fluorescent probe can specifically hybridize, thereby appropriately associating both in the sample solution.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration at which the target particle and the fluorescent probe can specifically hybridize by adding a salt solution or the like.
  • the two in the sample solution can be appropriately associated.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can be determined from the melting curve of the aggregate composed of both.
  • the melting curve can be obtained, for example, by changing the temperature of a solution containing only both from a high temperature to a low temperature and measuring the absorbance and fluorescence intensity of the solution. From the obtained melting curve, the temperature ranges from the temperature at which the two denatured single-stranded nucleic acid molecules started to form an aggregate to the temperature at which almost all became an aggregate. It can be set as the temperature which can be soybean.
  • the salt concentration in the solution from a low concentration to a high concentration instead of the temperature, the melting curve is determined in the same manner, and the concentration at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize is determined. Can be sought.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can generally be substituted with a Tm value (melting temperature).
  • Tm value melting temperature
  • the Tm value 50% of double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA
  • Temperature can be calculated.
  • the temperature of the sample solution in order to suppress non-specific hybridization, it is preferable to lower the temperature of the sample solution relatively slowly when forming an aggregate. For example, after denaturing nucleic acid molecules by setting the temperature of the sample solution to 70 ° C. or higher, the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a temperature decrease rate of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant such as a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance.
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • step (b) the number of molecules of fluorescent particles present in the prepared sample solution is calculated. Specifically, a sample solution containing fluorescent particles and a triplet excited state quencher is placed in the optical analyzer for the scanning molecule counting method, and the light emitted from the fluorescent particles is detected by the method described above. And the number of fluorescent particles is counted. The counted number of particles is the number of fluorescent particles contained in the measurement sample.
  • FCS measurement was performed on each sample solution using a single-molecule fluorescence measurement apparatus MF20 (Olympus Corporation) capable of measuring the fluorescence intensity per molecule and the ratio of triplet excited states.
  • the FCS measurement conditions were an excitation wavelength of 488 nm, a laser intensity of 1 mW, and a measurement time of 10 seconds. The measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated.
  • FIG. 8A is a diagram showing a ratio (Frac. Triplet (%)) of triplet excited states of RhodamineGreen molecules in each sample solution.
  • FIG. 8B is a diagram showing the brightness CPP (Countrate Per Particle) per molecule of RhodamineGreen molecules in each sample solution.
  • the ratio of the triplet excited state was the lowest in the sample solution having a KI concentration of 3 mM. From this result, it was confirmed that KI acts as a triplet excited state quencher for RhodamineGreen.
  • the CPP was about 1.3 times brighter than the sample solution without KI (see FIG. 8B).
  • the fluorescence luminance was improved by adding a triplet excited state quencher.
  • the ratio of the triplet excited state is lower than that in the sample solution without addition of KI, but the CPP hardly changed. This is presumably because KI was added at a high concentration, so that the frequency at which KI and the fluorescent dye approach each other increased, and the singlet excited state was returned to the ground state.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 488 It was confirmed by FCS measurement that potassium iodide (KI) had a quenching action on Alexa Fluor (registered trademark) 488. Specifically, KI was used in the same manner as in Rhodamine Green (registered trademark) except that Alexa Fluor (registered trademark) 488 (manufactured by Invitrogen) was used instead of Rhodamine Green (registered trademark) (manufactured by AnaSpec). FCS measurement was performed on a sample solution containing Alexa Fluor (registered trademark) 488 added to a final concentration of 0 mM, 0.03 mM, 0.3 mM, 3 mM, and 30 mM.
  • FIG. 9A is a diagram showing the ratio of triplet excited states of Alexa Fluor 488 molecules in each sample solution.
  • FIG. 9B is a diagram showing the brightness per molecule of Alexa Fluor 488 molecules in each sample solution.
  • the ratio of the triplet excited state was clearly lower than that of the sample solution without addition of KI. From this result, it was confirmed that KI acts as a triplet excited state quencher for Alexa Fluor488.
  • the CPP is about 1.8 times that of the sample solution with no KI added, and a very large effect is obtained. (See FIG. 9B.) From these results, it was confirmed that KI has a quenching action on various fluorescent substances and has an effect of improving fluorescence luminance.
  • FIG. 10A is a diagram showing the ratio of triplet excited states of Alexa Fluor 488 molecules in each sample solution.
  • FIG. 10B is a diagram showing the brightness per molecule of Alexa Fluor 488 molecules in each sample solution.
  • the ratio of the triplet excited state was the lowest in the sample solution having a cysteamine concentration of 3 mM. From this result, it was confirmed that cysteamine acts as a triplet excited state quencher for Alexa Fluor488.
  • the CPP was about 1.5 times brighter than that of the sample solution without cysteamine added (see FIG. 10B). From this, it was confirmed that the fluorescence luminance was improved by the addition of cysteamine.
  • ⁇ TAMRA (registered trademark)> It was confirmed by FCS measurement that cysteamine has a quenching action against TAMRA (registered trademark). Specifically, a sample solution was prepared by adding cysteamine (manufactured by Sigma) to 1 nM TAMRA (registered trademark) (manufactured by AnaSpec) so that the final concentrations were 0 mM, 0.3 mM, 3 mM, and 30 mM. FCS measurement was performed on each sample solution using a single molecule fluorescence measurement apparatus MF20 (Olympus Corporation). The FCS measurement conditions were an excitation wavelength of 543 nm, a laser intensity of 0.5 mW, and a measurement time of 10 seconds. The measurement was performed 5 times for each sample, and the average was calculated.
  • FIG. 11A is a diagram showing the ratio of triplet excited states of TAMRA molecules in each sample solution.
  • FIG. 11B is a diagram showing the brightness per molecule of TAMRA molecules in each sample solution.
  • the ratio of the triplet excited state was the lowest in the sample solution having a cysteamine concentration of 3 mM. From this result, it was confirmed that cysteamine acts as a triplet excited state quencher for TAMRA.
  • the CPP was about 1.4 times brighter than the sample solution without cysteamine added (see FIG. 11B). From this, it was confirmed that the fluorescence luminance was improved by the addition of cysteamine. From these results, it was confirmed that cysteamine has a quenching action on various fluorescent substances and has an effect of improving fluorescence luminance.
  • Example 1 Fluorescent particles were detected by scanning molecule counting method using KI as a triplet excited state quencher.
  • a sample solution was prepared by adding KI to 10 pM Alexa Fluor (registered trademark) 488 (manufactured by Invitrogen) so that the final concentrations of KI were 0 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM, 3 mM, 10 mM, and 30 mM.
  • Each sample solution is measured by the scanning molecule counting method using a single-molecule fluorescence measuring apparatus MF20 (Olympus Corporation) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system to obtain time-series photon count data. did.
  • the excitation light was irradiated at 1 mW using 488 nm laser light, and the detection light wavelength was 510 nm to 560 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second, the BIN TIME was 10 ⁇ sec, and the measurement time was 2 seconds.
  • the measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated.
  • the optical signals detected in the time series data were counted from the time series photon count data acquired for each sample solution.
  • the number of data points averaged at a time was set to nine, and the moving average process was repeated five times.
  • a Gaussian function was fitted to the time series data by the least square method, and the peak intensity (in the Gaussian function), the peak width (full width at half maximum), and the correlation coefficient were determined. Furthermore, in the peak determination process, the following conditions: 20 ⁇ sec ⁇ peak width ⁇ 400 ⁇ sec, Peak intensity> 1 (photon / 10 ⁇ sec), Correlation coefficient> 0.95, Only the peak signal that satisfies the condition is determined to be an optical signal corresponding to the observation target molecule, while the peak signal that does not satisfy the above condition is ignored as noise, and the signal is determined to be the optical signal corresponding to the observation target molecule. Were counted as “peak number”.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of counting the number of peaks of each sample solution.
  • the KI concentration was 0.1 mM to 10 mM
  • the number of peaks was higher than that of the sample solution without addition of KI, and it was confirmed that the detection ability of fluorescent particles was improved.
  • the KI concentration was 0.1 mM to 3 mM
  • the number of peaks counted increased as the amount of KI added increased.
  • the sample solution having the highest number of peaks and a KI concentration of 3 mM increased by 30% or more compared to the sample solution without KI. This is presumably because Alexa Fluor 488 whose fluorescence luminance was increased by KI was newly detected. From these results, it is clear that by performing fluorescent particle counting by the scanning molecule counting method in the presence of KI, the detection ability of the fluorescent particles is improved and the fluorescent particles can be detected with higher sensitivity.
  • Example 2 Fluorescent particles were detected by scanning molecular counting using cysteamine as a triplet excited state quencher.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 488 First, a sample in which cysteamine (manufactured by Sigma) was added to 10 pM Alexa Fluor (registered trademark) 488 (manufactured by Invitrogen) to a final concentration of 0 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM, 3 mM, 10 mM, and 30 mM. A solution was prepared.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of counting the number of peaks of each sample solution.
  • the cysteamine concentration was 0.3 mM to 3 mM
  • the number of peaks counted increased as the amount of cysteamine added increased.
  • the sample solution with the highest number of peaks and the cysteamine concentration of 3 mM increased by 20% or more compared to the sample solution without cysteamine added.
  • ⁇ TAMRA (registered trademark)>
  • a sample solution was prepared by adding cysteamine (manufactured by Sigma) to 10 pM TAMRA (registered trademark) (manufactured by AnaSpec) so that the final concentrations were 0 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 3 mM, 10 mM, and 30 mM.
  • Each sample solution was scanned in the same manner as in Example 1 except that the excitation light was irradiated at 0.5 mW using a laser beam of 543 nm, and the detection light wavelength was 560 nm to 620 nm using a bandpass filter.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of counting the number of peaks of each sample solution.
  • the cysteamine concentration was 0.3 mM to 3 mM
  • the number of peaks counted increased as the amount of cysteamine added increased.
  • the sample solution with the highest number of peaks and the cysteamine concentration of 3 mM increased by 10% or more compared to the sample solution without cysteamine added.
  • Example 3 The relationship between the concentration of the fluorescent particles and the concentration at which the triplet excited state quencher has a quenching action was investigated. Specifically, the concentration at which the triplet excited state quencher exerts a quenching action was examined when the concentration of the fluorescent particles was 1 pM and 100 pM. First, a sample solution was prepared by adding 1 pM or 100 pM Alexa Fluor (registered trademark) 488 (manufactured by Invitrogen) so that the final concentration of KI was 0 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM, 3 mM, 10 mM, or 30 mM. did.
  • Alexa Fluor registered trademark
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of counting the number of peaks of each sample solution having an Alexa Fluor 488 concentration of 1 pM
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of counting the number of peaks of each sample solution having an Alexa Fluor 488 concentration of 100 pM.
  • the detection method of the fluorescent particles in the embodiment of the present invention can detect the concentration of the target particles present in the sample solution only at a very low concentration by the scanning molecule counting method with very high sensitivity. Therefore, the method for detecting fluorescent particles according to the embodiment of the present invention can be used in the field of analysis and inspection of samples in which the concentration of a substance to be analyzed such as a clinical specimen is very small.

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Abstract

蛍光粒子の検出方法は、蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製することと、調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出することとを含む。前記蛍光粒子の分子数を算出することは、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動することと、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号を検出して前記蛍光粒子を個別に検出することと、前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程とを含む。

Description

蛍光粒子の検出方法
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、蛍光粒子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１１年８月１２日に、日本に出願された特願２０１１－１７６６９９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出及び測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１～３参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子からの蛍光強度の測定が為される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値が決定される。微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。なお、前記微小領域とは、顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、蛍光強度分布分析(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Ｐｈｏｔｏｎ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学及び生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開第０８／０８０４１７号 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質核酸酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調整されていることが好ましい。好適には、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい。典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには、例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれる。これと共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものである。特許文献７に記載された技術は、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。そのため、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。
　かくして、本発明の態様は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まない。従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、蛍光粒子をより高感度に検出するための方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子検出する場合において、蛍光粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が非常に低い場合であっても感度よく蛍光粒子を検出することができること、さらには、走査分子計数法による計測を、三重項励起状態消光剤の存在下で行うことにより、より高感度に蛍光粒子を検出可能であることが見出された。
　ここで、走査分子計数法は、特願２０１０－０４４７１４に於いて提案されている新規な光分析技術である。
　すなわち、本発明の一態様は、
（１）　試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
（ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）における蛍光粒子の分子数の算出は、
共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の蛍光粒子から放出される光信号を検出して、蛍光粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、を含む蛍光粒子の検出方法、
（２）　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．１ｍＭ～２０ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（３）　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．３ｍＭ～１０ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（４）　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．５ｍＭ～５ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（５）　前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上である前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（６）　前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（７）　前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む前記（１）～（６）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（８）　前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
を提供するものである。
　本発明の態様における蛍光粒子の検出方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法により、解析対象である蛍光粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の前記蛍光粒子を検出することができる。さらに、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法では、走査分子計数法による計測を三重項励起状態消光剤の存在下で行うため、蛍光粒子を非常に高感度に検出することができる。
走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出において計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 参考例１において、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。 参考例１において、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさを示した図である。 参考例１において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。 参考例１において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合、及び蛍光分子の１分子あたりの明るさＣＰＰを示した図である。 参考例２において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。 参考例２において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさを示した図である。 参考例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。 参考例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさＣＰＰを示した図である。 実施例１において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。 実施例２において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。 実施例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。 実施例３において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の濃度が１ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。 実施例３において、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の濃度が１００ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
　まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、走査分子計数法は、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短い。しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
　なお、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本実施形態の蛍光粒子の検出方法においては、発光粒子のうちの蛍光粒子を検出対象とする。
　本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、この領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される。実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出されるべき粒子と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。そして、逐次的に検出された光のうち発光プローブからの光信号を個別に検出する。これにより、粒子又は発光プローブと結合した粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。この構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。そのため、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１μＬ～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。なお本実施形態において、１つの粒子に結合した発光プローブとは、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している状態、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している状態、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである状態を含む。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。本実施形態においては、具体的には、光検出領域の移動速度を検出対象である蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度に設定する。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
　例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっている。そのため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能とる。従って走査分子計数法によれば、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、蛍光粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の蛍光粒子の検出方法によれば、試料溶液中の蛍光粒子の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、蛍光粒子を検出することが可能である。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。なお、試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大する。さらに、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａを参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ａｐｅｒｔｕｒｅ）にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１μＬ～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１ｆＬ～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。この　光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図１Ａの如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るための計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
　走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
　そうすると、例えば、図２Ａの如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０～ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出する。これによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れる。その結果、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出する。これにより、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できることとなる。
　更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出する。そのため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。続いてコンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。この計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。よって、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。そのため、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となる。よって、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、光検出領域の位置の移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、蛍光粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が図３Ｂの如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。
　そこで、好適には、図４Ａに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切るよう、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できる。粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　…（１）
から、以下のように示される。
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　…（２）
従って、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、以下のように示される。
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　…（３）
そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなる。従って、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。その具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　…（４）であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
　図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例は、上記に説明された光強度の測定である。即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）を取得する（ステップ１００）。この時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得る。そのため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。そのため、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
　具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行わる（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）。これにより、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
　参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、以下の式で与えられる。
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　…（５）
　また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、以下の式によって与えられる。
ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　…（６）　なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
＜蛍光粒子の検出方法＞
　本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、蛍光粒子を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の存在下で走査分子計数法によって計数することにより検出する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の蛍光粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の蛍光粒子の濃度が非常に低い場合であっても、蛍光粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、走査分子計数法による測定を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質（三重項励起状態消光剤）の存在下で行うことにより、蛍光粒子を非常に高感度に検出することができる。
　基底状態にある分子に光を照射すると一重項励起状態になり、その後再び基底状態に戻る。一重項励起状態から基底状態に戻る経路は２つある。１つは、一重項励起状態から直接基底状態に戻る経路であり、この際放出される光が蛍光である。残る１つは、一重項励起状態から三重項励起状態を介して基底状態に戻る経路であり、前記経路によって基底状態に戻る分子からは、蛍光は発されない。蛍光の寿命は、多くの分子においてナノ秒オーダーであることが知られている。一方で、一重項励起状態から三重項励起状態を介して基底状態に戻る（蛍光が発されない）経路では、一般的にマイクロ秒オーダー以上かかる。
　つまり、蛍光発光という点からは、一重項励起状態に励起された分子のうちの一部が三重項励起状態を介して基底状態に戻ることによって無駄が発生している。
　本実施形態においては、一重項励起状態の寿命と三重項励起状態の寿命の長さの違いによって、三重項励起状態消光剤が一重項励起状態の分子よりも三重項励起状態の分子と高頻度に衝突することを利用して蛍光輝度を向上させている。具体的には、走査分子計数法による測定を三重項励起状態消光剤の存在下で行うことにより、試料溶液中の三重項励起状態にある蛍光粒子は三重項励起状態消光剤によって基底状態に戻される。基底状態に戻された蛍光粒子は、光照射により再び一重項励起状態に励起される。すなわち、蛍光を発しない三重項励起状態を迅速に解消することにより、蛍光輝度が向上する結果、蛍光粒子をより高感度に検出することができる。
　本実施形態において用いられる三重項励起状態消光剤としては、三重項励起状態にある分子を基底状態に戻す作用を有する物質であれば特に限定されるものではない。三重項励起状態消光剤として、蛍光粒子の種類、励起光の波長、蛍光の波長等を考慮し、公知の三重項励起状態消光剤の中から適宜選択して用いられる。三重項励起状態消光剤としては、例えば、ヨウ化カリウム（ＰｏｔａｓｓｉｕｍＩｏｄｉｄｅ、ＫＩ）、システアミン（２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、シクロオクタテトラエン（Ｃｙｃｌｏ－ｏｃｔａｔｅｔｒａｅｎｅ）等が挙げられる。本実施形態においては、ヨウ化カリウム又はシステアミンを用いることが好ましい。なお、三重項励起状態消光剤は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　例えば、蛍光粒子の検出において、検出蛍光波長が５１０ｎｍ～５６０ｎｍの少なくとも一部を含む場合、三重項励起状態消光剤としてヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上を用いることが好ましい。蛍光粒子の検出において、検出蛍光波長が５１０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一部を含む場合、三重項励起状態消光剤としてシステアミンを用いることが好ましい。蛍光波長が５１０ｎｍ～５６０ｎｍの少なくとも一部を含む蛍光粒子としては、例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　４８８、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５－ＦＡＭ）、Ｃｙ２（登録商標）等の蛍光物質、並びにこれらの蛍光物質が結合した粒子等が挙げられる。蛍光波長が５６０ｎｍ～６２０ｎｍの少なくとも一部を含む蛍光粒子としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５等の蛍光物質、並びにこれらの蛍光物質が結合した粒子等が挙げられる。
　具体的には、本実施形態の標的粒子の定量方法は、下記工程（ａ）～（ｂ）を有する。
（ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程。
　以下、工程ごとに説明する。
　本実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
　本実施形態の蛍光粒子の検出方法の検出対象となる蛍光粒子は、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、蛍光色素や量子ドット等の蛍光物質等が挙げられる。また、本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、蛍光プローブを用いることにより、非蛍光物質を検出することもできる。具体的には、検出対象である標的粒子（非蛍光物質）と特異的又は非特異的に結合又は吸着する部位を有し、かつ標的粒子と結合した状態で蛍光を発する蛍光プローブを用いる。標的粒子が含まれる試料溶液に、蛍光プローブを添加し、両者を結合させる。形成された標的粒子と結合した蛍光プローブは蛍光粒子であり、本実施形態の蛍光粒子の検出方法により検出することができる。
　標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であり、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
　また、標的粒子と結合させる蛍光プローブとしては、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なる物質であることが好ましい。標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、蛍光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。蛍光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させたもの、蛍光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する蛍光色素分子等が挙げられる。前記オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
　また、標的粒子がタンパク質である場合には、蛍光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを蛍光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への蛍光物質の結合は、常法により行うことができる。
　標的粒子と結合させる蛍光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出や定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する蛍光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、蛍光プローブとして用いる蛍光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、前記標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、前記標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、蛍光プローブとして用いることができる。また、蛍光プローブは、それ自体が蛍光を発していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブを前記標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中に前記蛍光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加することによっても、発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
　その他にも、例えば、蛍光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。かかる構成によれば、いずれの場合も、蛍光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない蛍光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び蛍光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び蛍光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。
　また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子に結合した状態である蛍光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）を、蛍光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるように結合させたものを、蛍光プローブとして用いることができる。標的粒子と結合した蛍光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している蛍光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している蛍光プローブと区別して検出することができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させた分子ビーコンプローブを、蛍光プローブとして好ましく用いることができる。本実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成するものが好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
　また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、前記蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子と結合している蛍光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が前記ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している蛍光プローブからは、前記蛍光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している蛍光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している蛍光プローブとは区別して検出することができる。
　なお、蛍光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、蛍光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。
　その他、本実施形態においては、蛍光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の蛍光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計し、一方の蛍光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の蛍光プローブを前記ＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している蛍光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、前記２種類の蛍光プローブは互いに近接し、ＦＲＥＴが起こる。このため、前記ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を検出することができる。
　まず、工程（ａ）として、蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対する三重項励起状態消光剤に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製する。具体的には、蛍光粒子と三重項励起状態消光剤を適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。該溶媒は、蛍光粒子から放出される光の検出、及び、走査分子計数法による蛍光粒子の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、前記技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。このバッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　三重項励起状態消光剤は、三重項励起状態を基底状態へ戻す作用（以下、消光作用）が奏されるために十分な濃度となるように、試料溶液に添加される。消光作用が奏される濃度は、実験的に求めることができる。具体的には、所定量の蛍光粒子（検出対象である蛍光粒子と同種の蛍光物質を含む粒子でもよい。）を含む測定溶液に、三重項励起状態消光剤を様々な濃度で添加し、各測定溶液中の蛍光プローブのうちの三重項励起状態にある分子の割合を計測する。三重項励起状態にある分子の割合が、三重項励起状態消光剤を添加していない測定溶液よりも有意に低下している濃度が、前記三重項励起状態消光剤によって消光作用が奏される濃度である。三重項励起状態にある分子の割合は、ＦＣＳ測定により求められる。
　具体的には、三重項励起状態消光剤としてヨウ化カリウム又はシステアミンを用いる場合、走査分子計数法による計測時における試料溶液の三重項励起状態消光剤の濃度は、０．１ｍＭ～２０ｍＭであることが好ましく、０．３ｍＭ～１０ｍＭであることがより好ましく、０．５ｍＭ～５ｍＭであることがさらに好ましい。ヨウ化カリウム及びシステアミンを併用する場合には、両者を合わせた濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　非蛍光性の標的粒子と蛍光プローブとの結合体を蛍光粒子として検出対象とする場合、予め標的粒子と蛍光プローブとを結合させた蛍光粒子が含まれている溶液に、三重項励起状態消光剤を添加することによって試料溶液を調製してもよい。また、標的粒子と蛍光プローブと三重項励起状態消光剤を添加した試料溶液を調製した後、前記試料溶液中で標的粒子と蛍光プローブとを結合させて蛍光粒子を形成させてもよい。
　標的粒子と蛍光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間前記試料溶液をインキュベートするだけで、前記試料溶液中で、標的粒子と蛍光プローブとを結合させることができる。
　一方で、標的粒子や蛍光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。蛍光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、前記蛍光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と蛍光プローブを会合させる。
　熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
　なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、蛍光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
　その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する。具体的には、蛍光粒子及び三重項励起状態消光剤を含む試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、蛍光粒子から放出される光を検出し解析することにより、蛍光粒子の数を計数する。計数された粒子数が、測定試料中に含まれている蛍光粒子の数である。
　次に実施例等を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　ヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
＜Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）の場合＞
　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）に対してヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
　具体的には、１ｎＭ　ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子あたりの蛍光強度と三重項励起状態の割合が測定可能な１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を４８８ｎｍとし、レーザ強度を１ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。
　測定結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。図８Ａは、各試料溶液中のＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ分子の三重項励起状態の割合（Ｆｒａｃ．Ｔｒｉｐｌｅｔ（％））を示した図である。図８Ｂは、各試料溶液中のＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ分子の１分子あたりの明るさＣＰＰ（Ｃｏｕｎｔｒａｔｅ　Ｐｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ）を示した図である。図８Ａに示されるように、ＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、ＫＩがＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎに対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、ＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液においては、ＫＩ無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．３倍程度明るくなっていた（図８Ｂ参照。）。このことから、三重項励起状態消光剤の添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。一方で、ＫＩ濃度が３０ｍＭの試料溶液では、三重項励起状態の割合がＫＩ無添加の試料溶液よりも低くなっているが、ＣＰＰはほとんど変化していなかった。これは、ＫＩを高濃度で添加したために、ＫＩと蛍光色素が近接する頻度が高まり、一重項励起状態のものまで基底状態に戻されたためと推察される。
＜Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に対してヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
　具体的には、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）に代えてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた以外は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）の場合と同様にして、ＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む試料溶液に対してＦＣＳ計測を行った。
　測定結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図９Ｂは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図９Ａに示されるように、ＫＩ濃度が０．３ｍＭ及び３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合がＫＩ無添加の試料溶液と比べて明らかに低かった。この結果から、ＫＩがＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８に対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、最も三重項励起状態の割合が低かったＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液においては、ＫＩ無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．８倍程度になっており、非常に大きな効果がでていた（図９Ｂ参照。）。
　これらの結果から、ＫＩが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。
［参考例２］
　システアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
＜Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に対してシステアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
　具体的には、１ｎＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を４８８ｎｍとし、レーザ強度を１ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。
　測定結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ａは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図１０Ｂは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図１０Ａに示されるように、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、システアミンがＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８に対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液においては、システアミン無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．５倍程度明るくなっていた（図１０Ｂ参照。）。このことから、システアミンの添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。
＜ＴＡＭＲＡ（登録商標）の場合＞
　ＴＡＭＲＡ（登録商標）に対してシステアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
　具体的には、１ｎＭ　ＴＡＭＲＡ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を５４３ｎｍとし、レーザ強度を０．５ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。
　測定結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。図１１Ａは、各試料溶液中のＴＡＭＲＡ分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図１１Ｂは、各試料溶液中のＴＡＭＲＡ分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図１１Ａに示されるように、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、システアミンがＴＡＭＲＡに対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液においては、システアミン無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．４倍程度明るくなっていた（図１１Ｂ参照。）。このことから、システアミンの添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。
　これらの結果から、システアミンが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。
［実施例１］
　三重項励起状態消光剤としてＫＩを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
　まず、１０ｐＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いて走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５１０ｎｍ～５６０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２秒間とした。また、測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象分子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
　図１２は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、ＫＩ濃度が０．１ｍＭ～１０ｍＭでは、ＫＩ無添加の試料溶液よりもピーク数が増大しており、蛍光粒子の検出能が向上したことが確認された。より詳細には、ＫＩ濃度が０．１ｍＭ～３ｍＭでは、ＫＩの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液では、ＫＩ無添加の試料溶液と比較して、３０％以上増加していた。これは、ＫＩによって蛍光輝度が高くなったＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８が新たに検出されるようになったためと推察される。
　これらの結果から、走査分子計数法による蛍光粒子の計数をＫＩ存在下で行うことによって、蛍光粒子の検出能が向上し、より高感度に蛍光粒子を検出できることが明らかである。
［実施例２］
　三重項励起状態消光剤としてシステアミンを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
＜Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
　まず、１０ｐＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
　図１３は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が０．３ｍＭ～３ｍＭでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が３ｍＭの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、２０％以上増加していた。
＜ＴＡＭＲＡ（登録商標）の場合＞
　まず、１０ｐＭ　ＴＡＭＲＡ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて０．５ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０ｎｍ～６２０ｎｍとした以外は実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
　図１４は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が０．３ｍＭ～３ｍＭでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が３ｍＭの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、１０％以上増加していた。
　これらの結果から、走査分子計数法による蛍光粒子の計数をシステアミン存在下で行うことによって、蛍光粒子の検出能が向上し、より高感度に蛍光粒子を検出できることが明らかである。
［実施例３］
　蛍光粒子の濃度と三重項励起状態消光剤が消光作用を有する濃度との関係を調べた。具体的には、蛍光粒子の濃度が１ｐＭの場合と１００ｐＭの場合とにおいて、三重項励起状態消光剤が消光作用を奏する濃度を調べた。
　まず、１ｐＭ又は１００ｐＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、測定時間を、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの試料溶液については２０秒間とし、１００ｐＭの試料溶液については２秒間とした以外は実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
　図１５は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図であり、図１６は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１００ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの試料溶液と１００ｐＭの試料溶液のいずれにおいても、実施例１（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１０ｐＭの試料溶液の場合）と同様にＫＩを添加することによって、走査分子計数法による計測時のピーク検出能（蛍光粒子の検出能）が向上した。また、いずれもＫＩ濃度が１ｍＭ～３ｍＭにおいて検出されたピーク数が最大となったことから、ＫＩが消光作用を有する濃度は、蛍光粒子の濃度にさほど影響を受けず、終濃度が０．１ｍＭ～２０ｍＭとなるように試料溶液中にＫＩを添加することにより、より高感度に蛍光粒子を検出できることがわかった。
　本発明の態様における蛍光粒子の検出方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により非常に高感度に検出することができる。そのため、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法は、臨床検体等の解析対象物質の濃度が微量である試料の解析や検査等の分野で利用が可能である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

Claims (8)

  1. 　試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
    （ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
    を有し、
    前記工程（ｂ）における蛍光粒子の分子数の算出は、
    共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    前記試料溶液内において前記光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程と、
    前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、
    を含む蛍光粒子の検出方法。
  2. 　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．１ｍＭ～２０ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
  3. 　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．３ｍＭ～１０ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
  4. 　前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．５ｍＭ～５ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
  5. 　前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上である請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
  6. 　前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
  7. 　前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
  8. 　前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを含む請求項１～７のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
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