JP4023523B2 - 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法 - Google Patents
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Description
蛍光強度のゆらぎについて最初に成功を収めた研究は、蛍光分子のゆらぎ数の検出の可能性を示し、且つ蛍光相関分光法(FCS)と呼ばれる研究分野を確立したマグデ(Magde)、エルソン(Elson)及びウェッブ(Webb)(Biopolymers, Vol. 13, 29-61, 1974)により行われた。FCSは、初めに化学速度論定数および拡散係数を決定する方法として研究されていた。実験は基本的に、特定のオープン(open)体積の溶液における特定反応物の分子数の時間的な変化を測定することからなっている。反応物濃度は、少ない測定体積からのその蛍光により測定される。測定体積は、蛍光を励起する焦点を合わせたレーザー光線と蛍光を収集する顕微鏡の画像板(image plane)のピンホール(pinhole)により決定される。蛍光放射強度は、測定体積中に拡散により入り、出る時、及び、化学反応により生成され又は除去される時に、蛍光分子数における変化に比例してゆらぐ。技術的には、FCS実験での直接的出力は、測定された蛍光強度の計算された自己相関(autocorrelation)関数である。
FCSの重要な応用は、混合物内において異なる拡散速度を有する蛍光スピーシーズ(species)の濃度の決定である。2つの種類の粒子の並進拡散に対応する蛍光強度の自己相関関数における2つの項(term)を分離するために、粒子についての8倍の質量差に相当する、拡散時間における少なくとも約2倍の差が必要である。更に、蛍光強度自己相関関数における2つの項を分離するのに成功したとしても、2つの異なるタイプの粒子の相対明度を知っていなければ、対応する濃度の決定に十分ではない。
従来のFCSが蛍光強度ゆらぎの単純な自己相関関数から凝集サイズについての比較的限定された情報を収集するのに対して、可能な生物物理的な応用においては、異なる種類の複雑な混合物の分析をする能力が要求される。その目的のために、パルマー(Palmer)とトンプソン(Thompson)は、蛍光強度ゆらぎの高次相関(higher order correlation)関数を研究し、異なる蛍光スピーシーズの蛍光の数密度及び相対分子明度を決定する方法を概説した(Biophys. J., Vol. 52, 257-270, August 1987)。彼らの技術は、原則としては、細胞表面レセプター等の蛍光標識された生物学的分子の凝集の検出及び特徴づけにおいて有用だとされているが、比較的複雑であるという大きな欠点があるため、高次相関の計算を含む実験のデータ処理に数時間を要する。
異なる比明度を有する蛍光スピーシーズの混合物の特徴づけをするための、高次自己相関関数の計算よりも比較的複雑でない方法は、実験的に決定された光子カウント数分布(distribution of number of photon counts)からの蛍光強度の高次モーメントの計算である。この方法は、キアン(Qian)とエルソン(Elson)により提供された(Biophys, J., Vol. 57, 375-380, February 1990; Proc. Natl. Acad, Sci. USA, Vol. 87, 5479-5483, July 1990)。彼らの論証実験において、約7分のシグナル獲得(acquisition)時間が、その比明度において30倍の違いがある2種類の蛍光粒子、モノマーと30マーとの混合物、の比較的好ましい実験系として使用された。このモーメント法は、比較的単純で計算が速いが、その実験からは、更なる分析に適当な精度では、通常、約3つ又は4つの第一モーメントしか計算することができないため、限定された数のサンプルを特徴付ける未知パラメーターしか決定することができない。
これらの理由から、モーメント法は複雑なサンプルの特徴づけ、競合するサンプルのモデル間での選択、又は与えられたモデルが適当であるかを確認するには適当な方法であるとは言いがたかった。
本発明の1つの目的は、ある成分について又はサンプルのある状態についてのサンプル分析を可能にする、光子を放出、散乱及び/又は反射するユニットを有するサンプルについて信頼できる情報を得ることである。
本発明の他の目的は、実験的に決定された関数、好ましくは、光子カウント数分布から得ることができる有用な情報を十分に拡張することである。
本発明の上記目的は、請求項1に記載の特徴を有する方法により解決される。
「サンプルのユニット」という言葉は、一般的に、放射を放出、散乱及び/又は反射することができるサンプルの一部分を言う。サンプルは、好ましくは、スピーシーズごとにまとめることができる同一のユニット又は異なるユニットを複数含んでいても良い。「異なるスピーシーズ」という言葉は、異なる状態、特に分子等のユニットの異なる構造状態を言う。水又は他の液体中の蛍光標識された又は天然蛍光性の分子、分子複合体、担体、細胞、ビーズ及び他の粒子は、液体サンプルの蛍光ユニットの例である。一方、固体サンプル中の蛍光ユニットの例は、不純物分子、原子若しくはイオン、又は他の蛍光核(centers)である。
本発明においてユニットの「比明度(specific brightness)」という言葉は、与えられたスピーシーズのユニットが放射、好ましくは光をどの程度放出、散乱及び/又は反射することができるかを表す物理的な特性を意味する。従って、それは、単一ユニット、好ましくは粒子を特徴付けると考えられ、よって、比明度の値はユニット濃度に依存せず、他のユニットの存在にも依存しない。よって、測定体積から放出、散乱及び/又は反射される光子の全計数率(count rate)の変化は、全ユニット数の濃度変化にのみよるものであれば、本発明により決定される比明度の測定値及び異なるスピーシーズのユニット数の比率の値に影響を与えることはない。比明度は、測定体積内のユニット座標における加重平均計数率であるユニット毎の平均計数率により通常表される。ある場合においては、比明度を計数率が最大値を示す位置に置いたユニットに対応する計数率で表すことが好ましい。これは、例えば、入射ビームの焦点の中心等である。
サンプル分析における本発明の重要性は、以下のように説明することができる。非限定サンプル:溶液が、対応する比明度(Ia)を有する分量(a)の1種類の粒子及び対応する比明度(Ib)を有する分量(b)の異なる種類の粒子(B)を含むと仮定すると、その溶液から放出される光子の全計数率は式Ia*a+Ib*bに依存する。従って、全計数率の単なる決定によっては、a及び/又はbの値を解くことは不可能ある。一般的には、蛍光的測定においては、少なくとも1種類の粒子の全計数率は、個々の実験において決定される。この測定について全粒子数a+bが変化しない場合、a/bの比率又はその逆は、第2の測定における混合物の全計数率の単なる(mere)決定により決定することができる。しかし、総数a+bは、2つの測定間において変化しないという仮定はしばしば当てはまらない。例えば、表面への粒子の吸着効果が起こることもある。蛍光的(fluorimetric)測定は、粒子総数a+bを個別に評価することはできない。本発明は、これらの限定を解決した。対応する比明度についてのいかなる先行情報も必要とせずに、粒子の数a及びbを1つの測定から決定することができる。
以下の説明は例示することを目的とし、限定することを目的とはしていないと捕らえられるべきである。多くの態様は、下記の説明を参考にすることにより当業者には明らかであろう。本発明は、例として、蛍光で標識されたサンプルの粒子によって放射された光からの光子カウント数の測定に関して主に説明されている。例えば、ある態様においては、蛍光ではなく他の源からの光子カウント数を測定することが望ましいであろう。
本発明は、予想される関数、好ましくは与えられた実在の機器及び与えられた組成のサンプルに対応する光子カウント数の分布の計算方法を提供する。与えられた組成のサンプルに対応するカウント数分布を推測するための能力は、未知の組成のサンプルを研究する時に、計算から得られる光子カウント数分布と実験的に決定される光子カウント数の間で最も適合する、サンプルのモデルを見つけることを可能にする。ここでサンプルの組成が意味するのは、比明度及びそのサンプル内に存在するユニットの濃度である。例えば、単一の蛍光色素の溶液は、2つのパラメーターである、濃度及び染色された分子の明度により特徴づけられる。2つの蛍光色素の混合物は、4つのパラメーター、つまり2種類の分子濃度及び比明度で特徴づけられる。複雑な混合物は、分子の濃度に対する比明度の分布関数により特徴づけられる。簡便には、濃度は測定体積当たりのユニット数の平均として表すことができ、比明度はユニット当たりの計数率の平均として表すことができる。好ましくは、前記ユニットは粒子である。
他の側面からみると、関数、例えば、光子カウント数分布は、サンプルの組成にのみ依存しているのではなく、機器にも依存している。第一に、光学的装備(optical setup)において特徴づけられる空間的明度関数(spatial brightness function)及び暗計数率(dark count rate)のような検出における幾つかの特徴に依存し、遊び時間(dead time)及びアフターパルシング(afterpulsing)の確率等にも依存する。実験的に決定された曲線と計算による曲線の間で最善適合に達成することにより示される分析の高い精度のためには、機器を適切に特性付けておくことが好ましい。
請求項1は、直接光子カウント数分布を比較するのではなく、光強度分布の予測されたモーメントと計算上のモーメントを比較するキアンとエルソンにより説明された方法を包含してはいない。キアンとエルソンの教示は、本発明を教示するものではない。
本発明によれば、放射、好ましくは光を放出、乱射及び/又は反射するユニット、好ましくは粒子を含むサンプルの新規な精度を有する分析が可能になる。第一の段階では、サンプル中のユニットにより放出、散乱及び/又は反射された放射からの光子カウント数が、適当なモードで所定の長さの時間間隔毎に測定された。一連の異なる時間間隔は、更に複雑な分析に使用することもできる。第一段階では、統計的に意味のあるデータを得るために、光子カウント数が適当なモードで、つまり検出された光子を好ましくは何回もカウントするモードで測定され、一連の好ましくは連続した時間間隔でその操作が繰り返される。時間間隔の長さは、光子カウント数が検出される間の時間間隔の継続時間である。時間間隔の長さは、通常ミクロ秒若しくはミリ秒又は他の時間単位により表される。
本発明の方法の第二段階では、関数、好ましくは前記時間間隔当たりの光子カウント数分布を決定し、これは、光子カウント数が何回得られたかを決定することを意味する。上記分布は、観察された(又は予測された)事象における特定数の光子カウント数が得られた(又は得られる)時の相対的又は絶対的光子カウント数を表す光子カウント数関数である。
第三の段階では、実験的に決定された光子カウント数分布が、中間の段階なしに直接分析され、関数、好ましくは、サンプル内のユニットの比明度分布を得る。
少なくとも1つの検出手段が上記光子カウント数をモニターすることが好ましい。サンプルのユニットにより放出、散乱及び/又は反射された放射を検出することができるいずれの検出器も使用することができ、前記放射は、好ましくは、少なくとも1つの測定体積から生成されることが好ましい。アバランシェフォトダイオード(avalanche photo-diode)、光電子増倍管又は通常のフォトダイオードのような適当な検出手段は、当業者に良くし知られているものである。特に、小型化された高容量スクリーニングの場合のように、並行して一群のサンプルを測定したい場合には、モノリシックに配置された多数の検出器からなる多重検出器を使用することが好ましい。2次元多重配列検出器を使用することが更に好ましい。
本発明の理解においては、粒子は、好ましくはルミネセンスにより標識される若しくはされていない、好ましくはそれ自体発光するものである、分子又はミクロ分子、若しくは色素分子、分子凝集体、複合体、担体、細胞、ウイルス、バクテリア、ビーズ、又はそれらの混合物である。
ユニットのルミネセンス性は、異なるリンカー分子を介して特異的発光体と複合させることにより変化させることができる。様々な数の同じ又は異なるモノマーからなる高分子リンカー分子を使用することが好ましい。
検出可能な性質を有する親和性物質に結合する特異的サイトを有する少なくとも1つのユニットを提供することは利点となることがある。
好ましい態様においては、少なくとも1つのユニットは、キレート複合体等の親和性物質が結合することができるヒスチジン残基のタグを有する。前記親和性物質としては、ニッケル-ニトリロトリ酢酸(Ni-NTA)及びルミネセンス標識の複合体を使用することが好ましい。更なる好ましい態様においては、前記複合体は2以上のキレート群及び少なくとも1つのルミネセンス標識を含む。
ユニットのルミネセンス性は、実施例3に詳細に説明されているように、ルミネセンス標識されたアビジン又はストレプトアビジン等のルミネセンス標識された第2分子に結合するビオチン等の第一分子又はその逆のものに複合させることにより変化させることができる。
ユニットのルミネセンス性は、エネルギー伝達によっても変化させることができる。ドナーに吸収されたエネルギーは、アクセプターの発光体に近接触した際伝達され、続いて放射される。
更なる好ましい態様においては、好ましくは粒子であるユニットは、それぞれ多数のルミネセンス粒子への結合サイトを有している。ルミネセンス粒子は、これらのサイトに直接又は第2分子を介して結合することができる。多数のルミネセンス粒子が第一粒子の結合サイトに結合する時、高率でルミネセンス粒子が生成されるため、本発明の方法によれば、ルミネセンス強度において大きな違いがある粒子間を容易に識別することができる。従って、少ない量の結合ルミネセンス粒子であっても、過剰濃度の遊離ルミネセンス粒子の存在下において測定することができる。この態様は、その明度が結合において変化しないルミネセンス標識された第2粒子に結合させることにより、ルミネセンス標識を担持しない粒子の新規分析を提供する。この方法の商業的に非常に重要な応用は、好ましくはビーズである粒子の少なくとも1つの多重結合サイトに結合している抗原又はその逆で結合している蛍光標識された抗体の測定である。この方法は、他の種類の相互作用、例えば、核酸ハイブリダイゼイション又はタンパク質/核酸相互作用においても応用することもできる。本発明は、粒子のポリマー又はオリゴマーの懸濁液における質の制御及びプロセス制御のような、前記粒子分布の特徴づけ分析のために応用することもできる。
好ましい態様においては、以下Aとして記載されている1種類の粒子は、1以上の結合サイトを有している。以下Cとして記載されているルミネセンス性粒子は、(i)粒子Aの少なくとも1つの結合サイトに直接結合することができるか、又は(ii)粒子Aの少なくとも1つの結合サイトに順に結合する分子Bの少なくとも1つの結合サイトに結合することができる。これらの結合は、自然界に存在する粒子上の結合サイトにより仲介されるか、又は粒子A、B及び/又はCへの特異的結合サイトの導入に仲介される。どちらの場合においても、1つ以上の粒子Cは粒子Aに結合するため、複合体は遊離粒子Cよりも多くの光子を放射する。この態様は、粒子Bはルミネセンス標識されていないけれども、粒子Bの粒子C又はAへの結合を測定する簡便な方法を提供する。
更なる好ましい態様においては、測定体積は、サンプルの総体積の一部分でしかなく、前記ユニット、好ましくは粒子は、拡散しているか及び/又は前記測定体積内へ又は内から活発に移送されているか、及び/又はサンプルが活発に移送されているか及び/又は光学的にスキャンされている。前記ユニット、例えば、蛍光粒子が十分に小さければ、拡散は多大な数の個別測定体積からのデータ取得するために十分な早さであり、時間平均を使用するデータ取得は全体平均とほぼ同等である。しかし、拡散の特性時間が、蛍光強度測定に必要な時間間隔(通常10から50μ秒)よりも実質的に長かった場合、活発な移送(流れ又はスキャニング)はデータ取得の時間を相当に節約する。
測定体積は、好ましくはウェルを有する膜又はシートのような2次元担体上に配置することができる。適当な担体系は、例えば、WO 94/16313(EVOTEC BioSystems GmbH)に説明されている。測定体積は、例えば、キャピラリー系のように線状に配置されていていても良い。
蛍光研究において、溶質物質内でのラマン(Raman)散乱や検出器の暗計数率から発生する粒子毎の計数率に関するバックグラウンド計数率を低減するために測定することが有利である場合がある。特に、ある場合においては、100μm3、より好ましくは約1μm3より小さい測定体積を使用することが好ましい。有利なことに、バックグラウンド計数率に対する高いシグナル及び小さい光学的測定体積は、入射レーザービームの集束及び前記サンプルのユニット、好ましくは粒子により放出、散乱及び/又は反射された放射、好ましくは光の収集の両方について焦点を共有する方法で、好ましくは、数値開口≧0.9を有する少なくとも1つの顕微鏡対物レンズを好ましくは用いることにより達成することができる。共焦顕微鏡の装備には、好ましくは少なくとも1つの顕微鏡対物レンズ、2色性鏡、前記顕微鏡対物レンズの画像板のピンホール、検出手段、データ取得手段、及び必要に応じて散乱及び/又はサンプルの活発な移送のための手段を含むものを使用する。適当な機器は、WO 94/16313(EVOTEC BioSystems GmbH)に開示されている。好ましい態様においては、ピンホールは、WO 94/16313に記載されているように、適当な検出器に置換することができる。用いる顕微鏡対物レンズ及び測定体積間の作動距離は、バックグラウンドの影響が最小化されるように選択することが好ましい。好ましくは、作動距離は1000μmよりも短くする。
本方法の好ましい態様においては、多重光子励起が粒子を励起させるのに使用される。多重光子励起は、サンプルの第2ルミネセンスの励起、例えば、発光又は第2次ラマン散乱に使用される2、3又はそれ以上の光子の波周波数の合計、相違又はその組み合わせを意味する。このような励起スキームは、励起の確率が励起強度には直線的に依存しておらず、2次又はより高次数的に依存しているという観点から有利である。従って、多重光子励起は、レーザーの焦点の体積に主に限定されており、レーザー焦点の外側では、見かけ上の(spurious)励起は生じない。ピコ秒又はサブピコ秒パルスの適当なレーザー焦点源は当業者に公知である。本発明は、バックグラウンドの生成が単独光子励起よりも少なく、測定体積を制限する必要があるピンホールのない励起系という観点から有利である。従って、ピンホール半径及び検出器における結像は、空間的明度関数におけるモデリングパラメーターとしては入力されない。
更なる好ましい態様において、測定体積は、近視野顕微鏡法(near field microscopy)の成分の使用により制限される。これらは、ユニットの励起放射の焦点を定めるために及び/又はユニットにより放出、散乱及び/又は反射された放射を収集するために使用することができる。ここで、近視野顕微鏡法は、使用される光の波長よりも短い少なくとも1つの寸法を有する、測定体積と直接接触するアパーチャーを光が通りぬけることを意味する。アパーチャーは、前記半径を有する少なくとも1つの穴又は少なくとも1つの適当な幅のスリットを有する不透明層及び/又はテーパーガラスファイバー又は必要により、不透明層の外層で被覆された前記幅のチップ半径を有する波ガイドを含むことができる。適する機器は、WO 96/13744及びドイツ特許44 38 391(EVOTEC BioSystems GmbH)に開示されている。
他の好ましい態様は、励起光路に近視野光学顕微鏡法を、及び放出光路に従来の光学顕微鏡法を組み合わせるか、又はその逆で組み合わせる。本発明は、測定体積のサイズが従来の共焦顕微鏡法に比べて低減されているという観点から実現するのにより有利である。従って、本発明は、他の光学スキームと共に高い粒子濃度を測定するために使用することができる。
サンプルは、通常、ユニットの1以上のスピーシーズ、例えば、数種類の蛍光粒子の濃度及び比明度の値により特徴付けられる。1以上のこれらの値が予めわかっている場合、分析の目的は未知の値、詰りそれらの濃度若しくは比明度又はその両方を決定することである。
実験的に決定された関数及び計算上の関数間での適合を与えるモデルの選択のための2つの代替方法は、好ましくは光子カウント数分布を使用することができる。1つの態様においては、サンプルは有限数(通常小さい)のパラメーターにより示される良く知られた最低平方適合法(least squares fitting method)を使用することができる。目的は、実験による曲線及び計算上の曲線間で最も適合するものを得ることができるパラメーター値を見つけることである。本発明によれば、多数のユニットスピーシーズ、例えば、数種類の蛍光粒子の濃度及び/又は比明度の値を評価することができる。更なる態様においては、直線的正規化(linear regularization)による逆変換(inverse transformation)(ITR)と呼ばれる他の一般的な方法を使用することができる。ITRは、ユニット、好ましくは粒子の比明度に対する半継続的分布関数を用いたサンプルを説明し、解答が滑らかな関数であるように要求する最適合するものを探索する(ITR法については、例えば、W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, B. P. Flannery, Numerical recipes in C: the art of scientific computing, second edition, Cambrige University Press, 1992, p. 808を参照)。拘束のある逆変換(inverse transformation with constraints)(ITC)又は調整および拘束のある逆変換(inverse transformation with regulation and constraints)(ITRC)を使用することは更に好ましい。統計的な間違いと制限された測定データのサイズとのため、逆変換は、度々、その出力における激しい振動(wild oscillations)により特徴付けられる数学的な問題を引き起こす。ITR、ITC及びITRCは、「通常の」(例えば、滑らかな)又は拘束された解答を探すこと、例えば、二乗された統計的データ標準分布と解答自身の関数の合計を最小化し、通常再現することができない出力内の構造「不規則」又は物理的な意味を持たない値を制約(penalizing)することにより数学的な問題を安定化させる。制約の例としては、濃度においてマイナスの値を許容しないことが挙げられる。
以下、本発明は、限定しない方法で更に例示される。特に、予想される光子カウント数分布がどのように決定されるのかを説明する。
光子カウント数確率分布の計算において、好ましくは多くの回数反復される段階は、空間的明度の一定値を有する測定体積の空間的断片からの単独スピーシーズ(species)により放出、散乱及び/又は反射された光子カウント数確率分布の計算である。オープン(open)体積における粒子数の確率分布は、ポアソン分布(Poissonian)として良く知られている。更に、空間的断片内の粒子数が与えられる場合、サンプリング時間間隔当たりの検出される光子カウント数はポアソン分布となる。結果として、一定明度の空間的断片からの単独スピーシーズにより放出、散乱及び/又は反射され、典型的な検出器により検出された光子カウント数の総計分布はポアソン分布の成分(compound)である。
次の段階として、測定体積が一定明度を有する多数の空間的断片に分割される場合を研究することができる。それぞれの断片の体積値及び空間的明度が知られている場合、それぞれの断片に対応する光子カウント数分布は別々に決定することができる。これら全ての分布はポアソン分布である。更に、全ての断片の光子カウント数分布が知られている場合、総合的な分布は、測定体積の異なる断片から発生するカウント数の合計がカウント数の合計であるという事実を用いて、たたみ込み(convolutions)を介して決定することができる。
続く段階では、異なる比明度を有するスピーシーズの混合物、例えば、蛍光粒子の混合物の研究をすることができる。測定体積のそれぞれの空間的断片は、それぞれ単一スピーシーズの粒子のみを含む多数の抽象副断片(subsections)に分割することができる。光子カウント数の総計分布を決定するために、測定体積の空間的断片について上記で説明されたように同じ手順を応用することができる。
実験的に決定された光子カウント数分布は、光ビームの性質のみに制御されているのではなく、光子検出器の非理想的(nonideal)な性質によっても影響を受ける。確率論的には、検出器の暗カウント(dark counts)は、一定強度を有するバックグラウンド光からの光子カウントと同じ様式(manner)で機能する。それらの寄与(contribution)はポアソン分布の光子カウント数である。更に、検出器の遊び時間(dead time)及びそのアフターパルシング(afterpulsing)がどのように光子カウント数分布をゆがめる(distort)かは、光子統計学の文献から公知である(例えば、B. Saleh, Photoelectron Statistics, Springer, Berlin, 1978を参照)。
まとめとして、光子カウント数の予想される分布は、一側面、詰りサンプルの特性(異なる種類の蛍光粒子の濃度及び比明度)と他の側面、詰り機器の特性(サンプリング時間間隔、空間的明度関数、バックグラウンド計数率、検出器の遊び時間及びアフターパルシングの確率)により決定される。
1つの態様においては、検出器の遊び時間及びアフターパルシングの確率の両方は、一定強度の光に対応する光子カウント数分布が決定される実験から決定される。検出器の遊び時間の訂正は、カンター(Cantor)とテイック(Teich)により導き出された公式(J. Opt. Soc. Am. 65, 786, 1975;以下も参照B. Saleh, p. 272-277)を基にして行うことができる。アフターパルシングの数学は単純である。それぞれの光子パルスには、もう一つの(理論上存在するartificial)パルスが続く。これは、通常一定の確率で起こる。
本発明によれば、空間的明度関数は、単一スピーシーズの粒子における実験を用いて特徴付けられることが好ましい。例えば、レーザー波長514.5nmが使用される場合、ローダミン6Gの溶液は空間的明度関数を特徴付けるために使用することができる簡便なサンプルである。
空間的明度関数の特性は、予想されるカウント数の分布が空間的明度値の選択された一群に対応する測定体積の断片の体積値であることを決定する時に用いることができる。典型的には、対数目盛でそれぞれが一定の距離に位置している一群の20又は30の空間的明度値が選択され、2又は3次数(order)の大きさ(magnitude)を包含する。低明度領域の寄与は、単一パラメーターにより蛍光強度へのそれらの相対的な寄与と説明することができる。この光の強度ゆらぎは無視することができる。測定体積の断片の膨大な数のため、それぞれの断片に対応する体積を個々の値として考慮することはあまり好ましくない。それらを幾つかの他のパラメーターに依存している変数として考え、実験的に決定された及び計算により得られた光子カウント数分布間で最も適合するものを与えるこれらのパラメーター値を決定することが簡便である。簡便には、使用した光学系における収差の原因とならず、且つ測定体積の断片の体積を決定する、比較的単純な光学的装備のモデルが応用される。例えば、断片の体積はレーザービームの収束角及びピンホール半径の値に依存する。従って、空間的明度関数のモデリングパラメーターとしてピンホール次元及び入射レーザービームの収束角を使用することが好ましい。
代わりに、形式パラメーターを用いた単純な数学的表現は、空間的断片の体積を決定する物理的モデルの代わりに使用することができる。形式パラメーターの値は、実験的に得られた光子カウント数分布と計算により得られたものとの間での最適合が得られるように選択することが好ましい。形式たわみ(flexible)式は、光子カウント数の実験的な及び理論的な分布の間で良い適合を与えることから有利である。第2に、単純な数式を基にした計算は、物理的なモデルを基にしたものと比較するととても早い。
本発明によれば、ユニット当たりのカウントが平均が1以上、好ましくは1から10となるようにサンプリング時間間隔の長さを選択することが好ましい。
時間間隔の長さが、平均で、放射強度のゆらぎの特性相関時間より小さいことが更に好ましい。
2以上の未知サンプルパラメーターを予測する必要がある場合、測定体積当たり数個以下、好ましくは1つのユニット、好ましくは粒子を有することが好ましい。
良いシグナル/ノイズ(noise)比を得るために、測定体積当たり10個未満のユニットを有することが好ましい。
1つの態様では、少なくとも1つの単独ユニットが、ゆらいだり、又は非確率論的に変化する比明度に関して統計学的に分析される。
本発明の方法は、情報の損失及び歪が最小限にとどめられるため特に有利である。更に、本発明により到達できる新規特色(quality)は、データ処理が従来技術である他の技術と比較して、サンプルの特定の数学的モデルに対する依存が少ないことである。これは、この方法が器具による実現の長期的な安定性に関してより信頼できること及び、例えば、レーザービーム内の濁ったサンプル又は粒子による測定体積の分布は実験結果に顕著に影響を与えないことを意味する。
本発明により到達される更なる新規特色(quality)は、シグナル/ノイズ比が従来技術の技術に比較してより良いことである。これは、実験が以前よりも顕著に短い時間(100倍まで短い)内で行うことができ、長期的実験と同じシグナル/ノイズ比を示すことを意味する。蛍光分子又は蛍光標識された分子のフォト-ブリーチング(photo-bleaching)は、この分野におけるいずれの応用測定技術によっても現在未解決の問題であるため、特に細胞に応用された場合、短い測定時間に制限されていた。従って、従来技術に比較すると本発明は細胞機構内での測定に有利である。
1つの好ましい態様では、本発明は蛍光強度のゆらぎの研究の分野において実現される。光学的な機器は、可視光cwレーザーを装備された従来の共焦(confocal)FCS顕微鏡である。励起レーザービームは、低濃度蛍光物質の均一な水溶液(典型的にはナノモル範囲のもの)であるサンプルの中で焦点を合わせる。約1μm3の顕微鏡の共焦体積からの蛍光放出は光子検出器により収集される。典型的には1から60秒である測定時間は、典型的な幅が10から50μ秒である数百から数千の時間間隔に分割される。ここに記載されている本発明の実験的な実現において得られる光子カウント数の最大数は10から100の範囲にある。
本発明の方法は、高処理量スクリーニング、診断学、重合反応のモニタリング、凝集及び崩壊のプロセス、又は核酸の分析における使用に特に適している。
スクリーニングの手順では、特異的なレセプターとの相互作用を介してルミネセンスにより標識されたリガンドのレセプターへの結合における前記相互作用を試験することにより、薬理学的に活性を有する可能性のある物質を分析することができる。ここで、担体細胞上の天然レセプターやレセプター過剰発現担体細胞のレセプター又は小胞上のレセプター、又は発現された分子又は分子複合体の形態のレセプターを使用することができる。更に、溶液中又はそれらの真性細胞環境内での酵素と物質との相互作用は、その酵素の基質の変化、例えば、明度の変化をモニターすることにより検出することができる。更なる応用、特にアッセイ操作に関する応用はWO 94/16313(EVOTEC BioSystems GmbH)に開示されている。
特異的な認識反応の検出のために、潜在的に活性のある物質は分析の前に分離される複雑な天然、合成又は半合成混合物に存在させることができる。これらの混合物は、好ましくは分離マトリックスの末端でキャピラリー中において「オンライン」(on line)で、官能化合物の存在について個々のフラクションを試験するために、最初に、例えばクロマトグラフィーによって分離することができる。フラクショネイション法とFCS検出の組み合わせは、WO 94/16313(EVOTEC BioSystems GmbH)において詳細に説明されている。本発明についても同様の装備を使用することができる。
しばしば、凝集及び崩壊はモニターされる現象となる。凝集はモノマーとは異なる明度を表示するが、本発明によりモニターすることができる。
サンガー(Sanger)の方法によるシークエンシングでは、終止核酸が色素で標識された異なる長さのオリゴマーが同定される。発展した技術、例えばDE 38 07 975 A1に開示されたものは、結合した塩基の種類によって異なる性質、例えば、異なる蛍光寿命を有する色素を使用する。塩基の決定は、幾つかの性質、例えば蛍光寿命及び明度又は他の特異的な物理的性質を決定してから、それらの一貫性をクロスチェックすることにより、より確かになる。好ましい態様では、シークエンスされるサンプルは、ゲル又はキャピラリー電気泳動により分離されるか、又は分離工程をキャピラリー電気クロマトグラフィー、エレクトロハイドロダイナミック(electrohydrodynamic)泳動又は関連する電気動力学的な方法で分離される。
実施例1
本発明の性質及び利点は、ローダミン色素の混合物が分析される以下の実施例により更に良く理解することができる。図1から7は、分析の連続的な段階及びそれらの結果を例示している。
図1 一定の光強度、10μ秒の時間間隔及び50秒のデータ収集時間において実験的に決定された光子カウント数分布。適合している曲線から、検出器の遊び時間は、28±4ns;アフターパルシングの確率0.0032±0.0008と予測された。下のグラフでは、曲線適合の加重残差(weighted residuals)が示されている。
図2 時間間隔40μ秒及びデータ収集時間50秒でのローダミン6G溶液について実験的に決定された光子カウント数分布。
図3 最高明度を有する測定体積の20の空間的断片体積の正規化サイズ。セクション0は、空間的明度の最大値を示し、セクション19は、約100分の1低い明度を示している。体積サイズは、単一の蛍光スピーシーズについての実験から決定された。
図4 ローダミン6G溶液についての実験の適合曲線の残差(図2にグラフが描かれている実験)。
図5 時間間隔40μ秒及びデータ収集時間50秒での3つのサンプルについての実験的に決定された光子カウント数分布。分布は、ローダミン6Gが図2と同様であることを示している。
図6 図5のデータに直線的な正規化をした逆変換の結果。
図7 ローダミン6Gとテトラメチルローダミンの混合溶液についての実験の分析に対応する残差(図5の測定データ)。グラフa:直線的正規化による逆変換により得られた予測曲線。グラフb:実験的データの最低平方適合により得られた予測曲線。グラフc:単一スピーシーズの間違った推測のもとでの最低平方曲線適合残差。
分析の第一準備段階として、光子検出器の遊び時間及びアフターパルシングの確率が統計的に評価された。これは、検出器の一定強度の光による照明下で、光子カウント数分布を決定することにより行われた。アフターパルシングの歪は低計数率においてより良く解析されるが、遊び時間の歪は高計数率において最も認識することが可能であるため、遊び時間及びアフターパルシングの値は、比較的高い及び比較的低い照明強度において決定された光子カウント数の合成適合分布により決定された。実験的に決定されたカウント数分布は、適合曲線の残差と共に図1に示されている。使用された予測光子検出器のパラメーター値は、遊び時間28ナノ秒、アフターパルシング確率0.003である。
機器のバックグラウンド計数率は、サンプルホルダーが純粋な水で満たされたときの測定計数率により決定される。
第2の準備段階としては、与えられた光学的装備に対応する空間的明度分布が特徴付けられた。この目的のため、ローダミン6Gの溶液に対する光子カウント数分布が実験的に決定された(図2)。空間的明度分布が適切に特徴づけされたら、計算された曲線は実験的に得られた曲線に適合する。我々のプログラムでは、光子カウント数の予想分布を数値的に計算するために、空間概観図を特徴付けるための21のパラメーター値が必要である。空間的明度の最高値の20の空間的断片に対応する20の体積サイズ、及び低空間的明度の領域から発生する蛍光光への相対寄与である。これらの未知パラメーター値を計算するために、収差について考慮していない光学機器の単純なモデルが使用された。図3に例示されているように、ローダミン6G以外のスピーシーズが使用される場合には、20の体積の決定されたサイズは再現可能である。
上記の方法による空間的明度分布を特徴付ける21のパラメーターの決定された値により、光子カウント数の計算された分布は実験的な曲線に確かに適合した(図4参照)。
上記の準備段階を終えると、機器は分析のための準備が完了する。図5では、3つの異なるサンプルに対応する光子カウント数分布が示されている。図6では、直線的正規化を用いる逆変換の結果がグラフにされている。単一スピーシーズ(ローダミン6G又はテトラメチルローダミン)に対応する両方のスペクトルは、単一のピークを有するが、これらのピークは異なる比明度値に中心を置いている。ローダミン6Gのピークは、約108kHz/分子に位置しているが、テトラメチルローダミンは約37kHz/分子に中心を置いている。これは、ローダミン6G分子はテトラメチルローダミン分子の約3倍明るいことを示している。2つのスピーシーズの混合物に対応するスペクトルは、2つのスピーシーズについて別々に得た値のほぼ中間に位置する2つのピークを実際に有する。
図7は、ローダミン6Gとテトラメチルローダミンの混合物の測定に対応する残差を例示している。異なるデータ処理方法は、僅かに異なる適合曲線(及び異なる残差)を与える。上のグラフは、直線的正規化を用いる逆変換により得られた比明度のスペクトルに対応している。真中のグラフは、2つのスピーシーズを仮定して得られた適合曲線を表している。これら2つのグラフは、ほぼ同一である。実験的に決定された光子カウント数分布は、単一スピーシーズの間違った仮定において形式的に適合され得るが(下のグラフに示されている)、この適合曲線は実験的に得られたものから明らかに離れている。
実施例2
本発明の有用性を更に証明するため、従来の共焦FCS顕微鏡を用いてハイブリダイゼイションプロセスの工程が研究された。共に蛍光色素TAMRA(5-(及び6-)カルボキシテトラメチルローダミン(carboxytetramethylrhodamine))により標識されている2つの32-塩基オリゴヌクレオチドの相互作用に基づいたモデル系が調査された。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、プライマーダイマーの切断を可能にする制限酵素EcoRIの切断部位を含んでいる。この制限酵素による分析は、本発明の方法により得られた結果の特異性を確認するために、参照として使用された。
ハイブリダイゼイションは、1mM EDTA及び100mM NaClを含む10mMトリス緩衝液(pH7.4)中で行われ、制限酵素による分析は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、100mM NaCl、0.2%トリトンX-100中で行われた。それぞれの分析の測定時間は30秒とした。
図8 比明度関数としての体積成分当たりの粒子数。
TAMRA-標識された単鎖オリゴヌクレオチドの分析は、543mmにおける励起において、45kHzにオリゴヌクレオチドA(図8a)及び20kHzにオリゴヌクレオチドB(図8b)の単一の特徴的な蛍光強度ピークを明らかにした。
オリゴヌクレオチドA及びBのハイブリダイゼイションは、ハイブリダイゼイションが完了したことを示す単一の強度ピーク35kHzを示した(図8c)。個々のオリゴヌクレオチドの強度値から、このプライマーダイマーについては65kHzの強度ピークが期待された。この強度における不一致は、色素とヌクレオチドの相互作用の発生及び電子移動により誘導された消光に由来すると説明することができる。
35kHzの単一の強度ピーク(図8c)がプライマーダイマーを表しているという更なる証拠は、EcoRIを用いた切断実験により得られる(図8d)。アニールしたプライマーの制限酵素による切断は、20kHzの強度ピークを示す。強度分布が広がったことは、反応が完了しなかったことを示している。
これらの実験は、本発明の方法が病原体の検出及び特徴づけにおいて重要な役割をするハイブリダイゼイションプロセスの研究に非常に適していることを証明している。本発明の方法におけるエンドヌクレア-ゼの活性を測定するための性能も、この一連の実験により証明することができる。
実施例3
ビオチンは、下記の異なる色素によって、スペーサー分子(省略記号、Sp.)と共に又はなしに標識された。
a) 5-(及び6-)カルボキシ−X-ローダミン(省略記号、ROX)
b) 5-(及び6-)カルボキシテトラメチルローダミン(省略記号、TAMRA)
c) ロドールグリーン(Rhodol Green)TM
d) ローダミングリーンTM
e) レゾルフィン(Resorufine)
f) テキサスレッド(Texas Red)▲R▼及び
g) ローダミンB
また、ストレプトアビジンとの結合における異なった標識のビオチンの消光効果をモニターするために、これらとストレプトアビジンとの混合物も本発明の方法により分析された。
図9は、異なる分子の比明度を示している。ストレプトアビジンの存在は、「+」により示され、存在しない場合には「−」で示される。
実施例4
以下の実施例は、本発明の方法が膜小胞のレセプター集合へ結合したリガンドの測定のために有効であることを証明する。
単一粒子蛍光検出分析により分析される組織又は細胞から得られる生物膜のような粗の生物学的材料のアッセイにおける使用は、この材料の性質及び不均質性に関する情報を提供する。膜調製物がレセプター過剰発現細胞から生成される時、最も可能性のある状況は、単一の膜小胞上に多くのレセプター分子があるということであろう。本発明の方法は、異なる蛍光強度を示す粒子間の識別を行うため、それらレセプターに結合する蛍光リガンドの分析に理想的に適している。膜小胞は、低濃度においてゆっくりと移動する粒子である(平均拡散時間γdiff>10ms)。従って、適当なシグナル/ノイズ比を得るためには、これらの希な事象のための測定時間をナノモルのフロロホア(fluorophore)溶液に比べて延長させなければならない。測定時間を短くし、統計的な精度を改善するために、分析される効果的な体積を、単一分子の検出の利点を失うことなしに、実質的に増加させる必要がある。これは、ビームスキャンニング機器を導入することにより達成される。ビームスキャナーの使用は、単一小胞の平均励起時間がレーザービームの動きにより最小化されるため、漂白効果も迂回される。
本発明の方法による生物学的な相互作用を計量する可能性は、A431ヒト腫瘍細胞から得られた膜小胞に結合した上皮増殖因子(省略記号、EGF)を用いて証明することができる。これらの細胞は、細胞当たり105から106の上皮増殖因子レセプターを発現する。
膜小胞の調製
膜の調製は、タンパク質分解酵素阻害剤(ロイペプチン(leupeptin)、アプロチニン(aprotinin)及びPMSF)を含む低張液(20mM Tris/HCl, pH7.5, 5mM MgCl2)中でのガラスホモジナイザーを用いた細胞破壊及び低い重力での核除去の後の高スピン遠心分離により行われた。10%スクロースが第一遠心分離の段階で添加された。膜は、EGP結合緩衝液(20mM HEPES pH7.4, 140mM NaCl, 5mM MgCl2, 1.8mM CaCl, 4.2mM NaHCO3 5.5mMグルコース)中で、ブランソン(Branson)ソニファイヤー(sonifyer)を用いて実験の前に均質化された。タンパク質含量はビシンコニニック酸(bicinchoninic acid)(PIERCE)を用いて0.504mg/ml(A431)と決定された。
EGF結合研究
テトラメチルローダミン(省略記号、TMR)により標識されたEGF及びA431膜を用いた結合実験は、キャラウェイ(Carraway)ら(J. Biol. Chem. 264:8699, 1989)の方法により行われた。簡略して言うと、前記の混合物はEGF結合緩衝液により希釈され、サンプル20μl中の標識されたリガンドと共に40分間室温でインキュベイトされた。競合実験では、膜は標識されていないEGFと共にインキュベイトされた。30秒間の測定は、1次元ビームスキャンニングを用いて25Hzで幅700μmで行われた。
図10は、全リガンド濃度に関連するリガンド-レセプター複合体の量のプロットを示している。
図11は、A431小胞のある濃度で測定された強度分布の例を示している。
図11中の強度分布のy-軸は、強度格子(grid)中のそれぞれの強度についての格子点強度のために得られた粒子数を積分することにより構築され、従って、全強度に対するある強度での粒子の寄与を示している。高強度を有する粒子を強調するためには、この変換(transformation)を選択することが好ましく、低濃度はリガンドに結合した小胞の場合である。粒子数(濃度)に関しては、小胞は無視することができる程度の寄与を与えるのみである。
図11aは、リガンドのみの強度分布を示している。リガンドは、約40kHz/粒子の強度を有している。図11b-dでは、小胞濃度の増加に伴う強度分布がプロットされている。明るい粒子からの蛍光の増加、即ち、多数のリガンドレセプター複合体を有する小胞は、はっきりと可視化されている。
結合程度を評価するために、結合していないリガンドとリガンド-レセプター複合体を区別しなければならない。幾つかのリガンドが結合した小胞は、リガンド自体よりも明るい。従って、ある識別強度Idが選択される。この強度より下で検出された粒子はリガンド分子であると仮定され、この強度より上で検出された粒子はレセプター-リガンド複合体を有する小胞として数えられた。
遊離リガンドの濃度CLは、識別強度より下の全濃度を合計することにより決定された。
リガンド-レセプター複合体の濃度CRLは、n個の結合リガンドを有する小胞がリガンド強度のn倍の強度を有するとすることにより得られる。従って、ある強度Iにおける強度成分は、n=I/ILigandリガンド-レセプター複合体を有する小胞から得ることができ、これらの複合体の濃度は下記より得られる。
複合体形成の程度は、以下で得られる。
これはA431小胞への標識されたEGFの結合として図10でグラフにプロットされている。
Claims (28)
- 少なくとも1つの測定体積中の粒子により放出、散乱及び/又は反射された放射のゆらぎ強度のモニターにより、粒子を有するサンプルの特徴づけをする方法であって、モニターが少なくとも1つの検出手段により行われ、以下の段階
a) 所定の長さの時間間隔当たりの光子カウント数を反復モードにおいて測定し、
b) 前記時間間隔当たりの光子カウント数分布関数を決定し、
c) 実験的に決定された光子カウント数分布関数と光学的装備の空間的明度関数特性のパラメーターを考慮する理論的な光子カウント数分布関数との間での近接適合を見つけることにより、前記光子カウント数分布関数に基づき、前記粒子の比明度分布関数を決定すること
を含む方法。 - 測定体積の断片の体積値が、光学的装備の前記空間的明度関数を特徴付ける手段となる選択された一群の明度値に対応する請求項1に記載の方法。
- 光学的装備の空間的明度関数特性のパラメーターが、所定の時間間隔当たりの光子カウント数を単一スピーシーズにより放出、散乱及び/又は反射された放射から反復モードで測定することにより決定される請求項1及び/又は2に記載の方法。
- 前記粒子が液体又は気体内の分子、マクロ分子、色素、分子凝集体、複合体、小胞、細胞、ウイルス、バクテリア、ビーズ、又はそれらの混合物である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子をその比明度により区別することができるスピーシーズに分類することができる請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのスピーシーズがルミネセンス、好ましくは蛍光及び/又はルミネセンス標識されているものである請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 粒子のルミネセンス性が、ルミネセンス標識された第二分子、特にルミネセンス標識されたアビジン又はストレプトアビジンに結合する第一分子、特にビオチンと複合する又はその逆で複合することにより変化する請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 第一分子が(6xHis)タグであり、第二分子がルミネセンスで標識されたNi-NTA-誘導体である請求項7に記載の方法。
- 粒子のルミネセンス性は、前記粒子に吸収されたエネルギーが発光体のアクセプターと近接触することにより伝達され、次いで放出される、エネルギー伝達により変化する請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子はそれぞれがルミネセンス粒子のための多数の結合サイトを有している請求項1から9に記載の方法。
- 測定体積がサンプルの全体積の一部でしかなく、≦10-12リットル、好ましくは≦10-14リットルの体積を有する請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が拡散及び/又は活発に前記測定体積内へ及び外へ移送され、及び/又はサンプルが活発に移送及び/又は光学的にスキャンされる請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 測定体積が2次元担体、特にウェルを有するシート若しくは膜に、又は直線的に、好ましくはキャピラリーシステムに配置される請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 好ましくは数値開口≧0.9を有し、入射レーザービームの焦点を合わせるため及び前記サンプルの前記粒子により放出、散乱及び/又は反射された放射を収集するための少なくとも1つの顕微鏡対物レンズ、2色性鏡、前記顕微鏡対物レンズの画像板上のピンホール、検出手段、データ獲得手段、及び所望により前記サンプルをスキャン及び/又は活発に移送するための手段を含む共焦顕微鏡装備を使用する請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定体積が、近視野光学顕微鏡の成分又はそれらと従来の顕微鏡光学との組み合わせの使用により制限される請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光が多重光子励起を用いて誘導される請求項1から15に記載の方法。
- 顕微鏡の焦平面に位置するピンホールの次元及び2次元形態が空間的明度関数のモデリングパラメーターとして使用される請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 入射レーザービームの収束角が空間的明度関数のモデリングパラメーターとして使用される請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子の少なくとも1つのスピーシーズの濃度及び/又は比明度が決定される請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光子カウント数分布がサンプルの予備情報を用いて適合される請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光子カウント数分布が直線的正規化及び/又は拘束を用いる逆変換を適用することにより処理される請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 検出手段の実験的パラメーター、特に検出器の遊び時間及びアフターパルシングの確率が、検出手段を一定強度の光又は高周波数レーザーパルスに暴露しつつ、反復モードで、所定の時間間隔当たりの光子カウント数を測定することにより決定される請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 機器のバックグラウンド計数率が決定される請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記時間間隔の長さが平均で放射強度のゆらぎの特性相関時間よりも短い請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記時間間隔の長さが、前記粒子当たりの光子カウント数が平均1以上、好ましくは1から10となるように選択される請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルの濃度又は測定体積のサイズが、測定体積当たりの粒子数が平均で数粒子、好ましくは約1粒子より多くならないように選択される請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの単独粒子が、ゆらいだり、又は非確率論的に変化することがある比明度に関して統計的に分析される請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 高容量スクリーニング、診断学、重合、凝集及び崩壊プロセスのモニタリング、又は核酸分析における使用のための請求項1から27に記載の方法。
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